CN101955994B - Npm1基因突变的联合检测方法及诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核磷蛋白NPM1基因突变的联合检测方法及诊断试剂盒，通过对NPM1突变基因NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD设计引物和探针，将探针与微球共价结合形成的探针微球混合物，与逆转录PCR扩增产物杂交，加入链霉亲和素藻红蛋白后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中是否含有NPM1基因突变及突变基因的表达状况。本发明所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点，能够对NPM1基因突变进行定性和定量检测，为急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断、复发、治疗方案的确定以及预后的判断提供重要的参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断检测技术领域，具体涉及NPM1基因突变的液相芯片联合检测方法及其诊断试剂盒。
背景技术
核磷蛋白(nucleophosmin，NPM)基因定位于人类染色体5q35，含有12个外显子，编码由294个氨基酸组成的NPM蛋白。NPM1参与核糖体的合成和中心体复制以调控细胞增殖和周期进程。NPM1突变仅累及第12号外显子，目前有超过40种不同的突变亚型，其中绝大多数包含了12号外显子4个碱基的插入。其中最常见的是NPM1-mutA，占所有突变的75％-80％，它是在野生型NPM1核苷酸序列上第956-959位上插入1个TCTG4个核苷酸而形成串联重复序列。NPM1-mutB和NPM1-mutD各占10％和5％，分别插入的是CATG和CCTG；其余突变较少见。
NPM1基因突变是目前急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中最常见的突变形式，约占所有AML的35％，而在正常核型的AML中可占46％-62％。AML是一组高度异质性疾病，正常核型AML约占成人原发AML患者的40％-50％，是中危组细胞遗传学分类中人数最多的一个亚型，也是目前研究的热点之一。最近国外几个大规模的多中心研究相继显示，在具有分子异质性的正常核型AML患者中，46％-62％可检测到核磷蛋白成员NPM1基因突变及(或)表达的改变，它在AML的诊断、分型及判断预后与监测微小残留病灶等方面有重要价值。
另外，近来有报道显示在骨髓增生异常综合症(MDS)患者中，也存在着NPM1突变。
目前，白血病和骨髓增生异常综合症主要是依靠细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学等检测方法来进行诊断和检测分型。细胞形态学受主观因素影响，临床诊断的一致率仅为70％左右。核型分析和显带技术等细胞遗传学方法是在全基因组水平筛查染色体易位，容易漏检许多染色体的微小异常。免疫学方法具有较高的假阳性率和假阴性率，并且无法做到早期诊断。当前国内外广泛使用的分子生物学检测白血病基因突变的方法中，荧光原位杂交技术(FISH)只能进行定性检测、操作复杂；荧光定量PCR存在着检测通量的局限性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。因此临床上需要有一种检测方法，能够迅速、稳定、准确地对白血病的多种基因突变进行联合并行检测，液相芯片(xMAP)技术正是这样一种新型检测技术。
液相芯片能够对少量样本进行定性、定量检测，具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点。该系统是由许多微球为主要基质构成的，在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。根据检测物的不同，微球表面可以共价结合各种各样的核酸检测探针，在杂交反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。反应结束后，通过微流体技术将微球排成单列快速流经液相芯片检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球上的红色分类荧光，将各个不同的反应区分开来而定性；绿色激光则激发结合在待测样本上的荧光标记进行定量。当标记好的待测样本与特定微球上的探针结合在一起时，两束激光所激发的光均可被检测到。最后，通过计算机的高速数字信号处理器，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度，从而确定检测物的种类和数量。
本发明基于液相芯片技术的高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点，对NPM1的多种基因突变进行联合并行检测，能够在临床检测上得到更好的应用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种NPM1基因突变的联合检测方法及诊断试剂盒。该方法及试剂盒包含对多种NPM1基因突变的联合检测，可以对急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断提供重要的参考依据，同时对患者进行疗效观察、预后及微小残留疾病进行动态监测。本检测方法及诊断试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
在本发明的一方面，提供一种NPM1基因突变的联合检测方法，包括以下步骤：
(1)包含多种不同荧光编码的羧基微球beads；每种微球上分别共价结合针对NPM1的多种突变基因的mRNA所设计的特异性核酸探针；所述NPM1的多种突变基因包含以下任意一种基因或任意组合的多种基因：NPM1-mutA(即NPM1 mutation·A)、NPM1-mutB(即NPM1 mutation B)、NPM1-mutD(即NPM1 mutation D)，即所述NPM1的多种突变基因可以是NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD中的任意一种或加上其它基因，也可以是NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD中的任意两种基因组合或加上其它基因，也可以是NPM1-mutA、NPM1-mutB和NPM1-mutD三种基因组合或加上其它基因；
(2)针对多种不同的NPM1突变基因的mRNA，分别设计上下游引物，对不同的突变基因的mRNA，通过逆转录PCR扩增出相应的产物；
(3)含有特异性核酸探针的微球与NPM1突变基因mRNA的逆转录扩增产物杂交后，加入链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)，通过液相芯片xMAP法检测荧光信号；
(4)将检测到的荧光信号与内参基因的荧光信号进行比较，从而确定检测样品中是否含有NPM1突变基因，和/或样品中突变基因的表达状况。
以上检测方法的步骤(1)中，所述的微球是平均直径为5.6μm，结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即色彩编码微球(color-coded beads)。
步骤(1)中，所述的共价结合于微球上的针对NPM1的多种突变基因的特异性核酸探针，包括如下序列(其中5’端含氨基修饰)：
NPM1-mutA：5’-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
NPM1-mutB：5’-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.2所示；
NPM1-mutD：5’-AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
步骤(2)中，所述的针对NPM1不同突变基因的mRNA所设计的上下游引物，包括如下序列(其中上游引物5’端含生物素标签)：
NPM1-mutA：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
NPM1-mutB：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.7所示；
NPM1-mutD：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.9所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
步骤(4)中，所述的内参基因Abelson基因的引物和探针序列如下：
上游引物5’-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3’，如SEQ ID NO.10所示；
下游引物5’-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如SEQ ID NO.11所示；
探针5’-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
或者包含有上述序列(含互补序列)的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列(含互补序列)同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
在本发明的另一方面，提供一种检测多种NPM1基因突变的诊断试剂盒，包含共价结合了NPM1突变基因mRNA特异性探针的微球混合物、结合了Abelson基因探针的微球、NPM1突变基因mRNA的上下游引物、Abelson基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白Streptavidin-PE、质控品(阴性对照和阳性对照)。
以上试剂盒中所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种突变基因质粒的混合液(包括含Abelson基因的质粒)，阴性对照品为不含有突变基因及Abelson基因的质粒溶液；所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
在本发明的另一方面，提供一种检测多种NPM1基因突变的诊断试剂盒在检测体外样品，对急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断、复发、治疗方案的确定以及预后判断中的应用。
由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对NPM1突变基因进行定性和定量检测，能在临床检测上得到更好的应用。此外，本发明可以对急性髓系白血病(AML)和骨髓增生异常综合症(MDS)的早期诊断提供重要的参考依据，同时对患者进行疗效观察，预后与微小残留疾病的动态监测提供重要的依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明，但并不能理解为对本发明的限制。所述的实施例只提供阐明核酸探针、试剂盒及其制作和应用方法而不为其所限制。期间各种变化形式在本发明和所述的权项的范围内是可预期的。
实验材料：
引物和探针均由invitrogen公司合成；Trizol购自invitrogen公司；逆转录cDNA合成试剂盒购自Fermentas公司；多重PCR试剂盒、不同编号的微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于QIAGEN公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购置于Pierce公司；2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂酰基氨酸钠(Sarkosyl)、四甲基氯化铵(TMAC)均购置于sigma公司。
缓冲液和杂交液的配置：
偶联缓冲液，PH4.5 250ml
MES 4.88g；
1.5×TMAC杂交溶液 250ml
5M TMAC 225ml
20％Sarkosyl 1.88ml
1M Tris-HCl，PH8.0 18.75ml
0.5M EDTA，PH8.0 3.0ml
dH2O 1.37ml；
1.5×TMAC杂交溶液 250ml
5M TMAC 150ml
20％Sarkosyl 1.25ml
1M Tris-HCl，PH8.0 12.5ml
0.5M EDTA，PH8.0 2.0ml
dH2O 84.25ml；
TE缓冲液，PH8.0 500ml
1M Tris-HCl，PH8.0 5ml
0.5M EDTA，PH8.0 1ml
dH2O 444ml
实施例1：1种NPM1基因突变的液相芯片检测方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测NPM1-mutA突变基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
NPM1-mutA：5’-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
Abelson基因：5’-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
2.将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、21号的2种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解NPM1-mutA和Abelson的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、21号的2种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到2个离心管中；
2.5 10,000g，离心，1-2min；
2.6移除上清液，用50μl 0.1M MES，pH4.5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2.7将2种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释，使其浓度为0.1nmol/μl；
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里，涡旋混合；2.9用dH2O配置10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意：保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC的使用)；
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的新鲜EDC溶液分别到2种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀；
2.11室温避光孵育30min；
2.12用dH2O配置第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意：EDC粉末如果潮解，则应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；
2.13 2种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混匀；
2.14室温避光孵育30min；
2.15 2种偶联微球中各加入1ml 0.02％Tween-20；
2.16 10,000g，离心，1-2min；
2.17移除上清，分别用1ml 0.1％SDS重悬2种偶联微球，振荡混匀；
2.18 10,000g，离心，1-2min；
2.19移除上清，分别加入100μl TE，PH8.0，涡旋混合20s，重悬微球；
2.20用细胞计数器计数2种偶联了寡核苷酸探针的微球；
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释；
b.涡旋震荡充分混匀；
c.取10μl到细胞计数器上；
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；
e.微球/μl＝(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配置
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：NPM1-mutA探针微球11和Abelson探针微球21，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
取1-5号AML或MDS患者的临床样本，分别按照下面的步骤提取RNA：
1.淋巴细胞提取：取新鲜全血2ml加1ml 3％柠檬酸钠，混匀后3000r/min离心，10min，4℃，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞；
2.取1个离心管(经DEPC水处理)加入淋巴细胞液150μl.然后加1ml TRIZOL，室温放置5min，使其充分裂解；
3. 12,000rpm离心5min，取上清；
4.每1ml Trizol中加入200μl氯仿，剧振荡混匀后室温放置15min；
5.4℃12,000g离心15min；
6.吸取上层水相，至另一离心管中；
7.每1ml Trizol中加入500μl异丙醇混匀，室温放置5-10min；
8.4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
9.按每1ml Trizol中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
10.4℃8,000g离心5min，尽量弃上清；
11.室温晾干或真空干燥5-10min；
12.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min；
13.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-5号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管，置于冰上，建立下列反应体系；
Total RNA 5～10μg/3μl
Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl) 1μl
RNase-free water forward to 12μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
②离心管于70℃温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；
5×react ion buffer 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTPs Mix 2μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
④离心管于37℃温育5分钟；
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl)，终体积为20μl；
⑥离心管于42℃反应60分钟；
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却；
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
NPM1-mutA：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
Abelson基因：上游引物5’-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3’，如SEQ ID NO.10所示；下游引物5’-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如SEQ ID NO.11所示。
2.2多重PCR反应：
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒，体系如下
Template cDNA 10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μl
10×Primer mix 5μl
RNase-free water 10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTPMix。)
PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配置的寡核苷酸探针微球混合物；
2.涡旋震荡20s，混匀微球；
3.制备微球工作液，用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。
(注：每个反应需要33μl的微球工作液)；
4.涡旋震荡20s，混匀微球工作液；
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液；
6.向每个样品孔内分别加入1-5号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(PH为8.0)，总体积为17μl；
7.用排枪上下吸打，温柔混匀反应液；
8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100℃下孵育1-3min，使样品中的寡核苷酸去掉二级结构；
9.在杂交温度下孵育反应板15min；
10.制备新鲜的检测混合液，用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液)；
11.向每孔加入25μl的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混匀；
12.在杂交温度下孵育5min；
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并：
95℃，1-3min；
杂交温度，forever；
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN和Luminex公司)上，保持杂交温度，对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表1所示：
表1
结果分析如表2所示：
表2
1-5号患者类型均为NPM1基因突变NPM1-mutA阳性，
同时，将患者阳性基因突变的荧光MFI值与内参Abelson基因的荧光MFI值相比，可得出基因突变的表达状况。
实施例2：2种NPM1基因突变的液相芯片联合并行检测方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测NPM1-mutA、NPM1-mutB突变基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
NPM1-mutA：5’-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
NPM1-mutB：5’-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.2所示；
Abelson基因：5’-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
2.将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、15、21号的3种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解NPM1-mutA、NPM1-mutB和Abelson的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、15、21号的3种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到3个离心管中；
2.5 10,000g，离心，1-2min；
2.6移除上清液，用50μl 0.1M MES，pH4.5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2.7将3种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释，使其浓度为0.1nmol/μl；
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里，涡旋混合；
2.9用dH2O配置10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意：保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC的使用)；
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的新鲜EDC溶液分别到3种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀；
2.11室温避光孵育30min；
2.12用dH2O配置第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意：EDC粉末如果潮解，则应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；
2.13 3种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混匀；
2.14室温避光孵育30min；
2.15 3种偶联微球中各加入1ml 0.02％Tween-20；
2.16 10,000g，离心，1-2min；
2.17移除上清，分别用1ml 0.1％SDS重悬3种偶联微球，振荡混匀；
2.18 10,000g，离心，1-2min；
2.19移除上清，分别加入100μl TE，PH8.0，涡旋混合20s，重悬微球；
2.20用细胞计数器计数3种偶联了寡核苷酸探针的微球；
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释；
b.涡旋震荡充分混匀；
c.取10μl到细胞计数器上；
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；
e.微球/μl＝(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配置
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：NPM1-mutA探针微球11、NPM1-mutB探针微球15、和Abelson探针微球21，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
取1-5号AML或MDS患者的临床样本，分别按照下面的步骤提取RNA：
1.淋巴细胞提取：取新鲜全血2ml加1ml 3％柠檬酸钠，混匀后3000r/min离心，10min，4℃，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞；
2.取1个离心管(经DEPC水处理)加入淋巴细胞液150μl.然后加1ml TRIZOL，室温放置5min，使其充分裂解；
3. 12,000rpm离心5min，取上清；
4.每1ml Trizol中加入200μl氯仿，剧振荡混匀后室温放置15min；
5.4℃12,000g离心15min；
6.吸取上层水相，至另一离心管中；
7.每1ml Trizol中加入500μl异丙醇混匀，室温放置5-10min；
8.4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
9.按每1ml Trizol中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
10.4℃8,000g离心5min，尽量弃上清；
11.室温晾干或真空干燥5-10min；
12.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min；
13.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-5号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管，置于冰上，建立下列反应体系；
Total RNA 5～10μg/3μl
Oligo(dT)18 Primer(0.5μg/μl) 1μl
RNase-free water forward to 12μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
②离心管于70℃温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；
5×reaction buffer 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTPs Mix 2μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
④离心管于37℃温育5分钟；
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl)，终体积为20μl；
⑥离心管于42℃反应60分钟；
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却；
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
NPM1-mutA：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
NPM1-mutB：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.7所示；
Abelson基因：上游引物5’-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3’，如SEQ ID NO.10所示；下游引物5’-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如SEQ ID NO.11所示。
2.2多重PCR反应：
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒，体系如下
Template cDNA 10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μl
10×Primer mix 5μl
RNase-free water 10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTPMix。)
PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配置的寡核苷酸探针微球混合物；
2.涡旋震荡20s，混匀微球；
3.制备微球工作液，用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。
(注：每个反应需要33μl的微球工作液)；
4.涡旋震荡20s，混匀微球工作液；
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液；
6.向每个样品孔内分别加入1-5号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(PH为8.0)，总体积为17μl；
7.用排枪上下吸打，温柔混匀反应液；
8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100℃下孵育1-3min，使样品中的寡核苷酸去掉二级结构；
9.在杂交温度下孵育反应板15min；
10.制备新鲜的检测混合液，用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液)；
11.向每孔加入25μl的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混匀；
12.在杂交温度下孵育5min；
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并：
95℃，1-3min；
杂交温度，forever；
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN和Luminex公司)上，保持杂交温度，对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表3所示：
表3
结果分析如表4所示：
表4
1、3、4和5号患者类型为NPM1基因突变NPM1-mutA阳性
2号患者类型为NPM1基因突变NPM1-mutB阳性
同时，将患者阳性基因突变的荧光MFI值与内参Abelson基因的荧光MFI值相比，可得出基因突变的表达状况。
实施例3：3种NPM1基因突变的液相芯片联合并行检测方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD突变基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
NPM1-mutA：5’-AminolinkerC12 CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
NPM1-mutB：5’-AminolinkerC12 CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.2所示；
NPM1-mutD：5’-AminolinkerC12 TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
Abelson基因：5’-AminolinkerC12 CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
2.将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、15、17、21号的4种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解NPM1-mutA、NPM1-mutB、NPM1-mutD、Abelson的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、15、17、21号的4种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4分别取2.5×106微球储存悬液到4个离心管中；
2.5 10,000g，离心，1-2min；
2.6移除上清液，用50μl 0.1M MES，pH4.5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2.7将4种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释，使其浓度为0.1nmol/μl；
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里，涡旋混合；
2.9用dH2O配置10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意：保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC的使用)；
2.10加入2.5μl 10mg/ml EDC的新鲜EDC溶液分别到4种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀；
2.11室温避光孵育30min；
2.12用dH2O配置第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意：EDC粉末如果潮解，则应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；
2.13 4种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混匀；
2.14室温避光孵育30min；
2.154种偶联微球中各加入1ml 0.02％Tween-20；
2.16 10,000g，离心，1-2min；
2.17移除上清，分别用1ml 0.1％SDS重悬4种偶联微球，振荡混匀；
2.18 10,000g，离心，1-2min；
2.19移除上清，分别加入100μl TE，PH8.0，涡旋混合20s，重悬微球；
2.20用细胞计数器计数4种偶联了寡核苷酸探针的微球；
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释；
b.涡旋震荡充分混匀；
c.取10μl到细胞计数器上；
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；
e.微球/μl＝(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配置
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：NPM1-mutA探针微球11、NPM1-mutB探针微球15、NPM1-mutD探针微球17和Abelson探针微球21，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
取1-20号AML或MDS患者的临床样本，分别按照下面的步骤提取RNA：
1.淋巴细胞提取：取新鲜全血2ml加1ml 3％柠檬酸钠，混匀后3000r/min离心，10min，4℃，取血球层上浅黄色层即为淋巴细胞；
2.取1个离心管(经DEPC水处理)加入淋巴细胞液150μl.然后加1ml TRIZOL，室温放置5min，使其充分裂解；
3. 12,000rpm离心5min，取上清；
4.每1ml Trizol中加入200μl氯仿，剧振荡混匀后室温放置15min；
5.4℃12,000g离心15min；
6.吸取上层水相，至另一离心管中；
7.每1ml Trizol中加入500μl异丙醇混匀，室温放置5-10min；
8.4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底；
9.按每1ml Trizol中加入1ml 75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
10.4℃8,000g离心5min，尽量弃上清；
11.室温晾干或真空干燥5-10min；
12.用50ul RNase-free dH2O溶解RNA样品，55-60℃，5-10min；
13.测OD值定量RNA浓度。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-20号样本的mRNA进行多重逆转录PCR扩增：
1.cDNA第一链的合成
①取一经DEPC处理过的微量离心管，置于冰上，建立下列反应体系；
Total RNA 5～10μg/3μl
Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl) 1μl
RNase-free water forward to 12μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
②离心管于70℃温育5分钟，之后迅速取出置于冰中冷却，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
③将离心管放置于冰上，按顺序加入以下反应液；
5×reaction buffer 4μl
RNase Inhibitor(20U/μl) 1μl
10mM dNTPs Mix 2μl
轻轻混匀反应液，用冷冻离心机稍微离心收集管壁上的反应液到管底；
④离心管于37℃温育5分钟；
⑤加入1μl RevertAidTM Reverse Transcriptase(200U/μl)，终体积为20μl；
⑥离心管于42℃反应60分钟；
⑦离心管于70℃加热10分钟终止反应，之后迅速取出置于冰中冷却；
2.多重PCR
2.1按照如下序列合成引物：
NPM1-mutA：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
NPM1-mutB：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.7所示；
NPM1-mutD：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.9所示；
Abelson基因：上游引物5’-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3’，如SEQ ID NO.10所示；下游引物5’-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如SEQ ID NO.11所示。
2.2多重PCR反应：
采用的是QIAGEN公司的Multiplex PCR试剂盒，体系如下
Template cDNA 10μl
2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μl
10×Primer mix 5μl
RNase-free water 10μl
终体积为50μl
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTPMix。)
PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配置的寡核苷酸探针微球混合物；
2.涡旋震荡20s，混匀微球；
3.制备微球工作液，用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。
(注：每个反应需要33μl的微球工作液)；
4.涡旋震荡20s，混匀微球工作液；
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液；
6.向每个样品孔内分别加入1-20号患者样本的PCR扩增产物和TE溶液(PH为8.0)，总体积为17μl；
7.用排枪上下吸打，温柔混匀反应液；
8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100℃下孵育1-3min，使样品中的寡核苷酸去掉二级结构；
9.在杂交温度下孵育反应板15min；
10.制备新鲜的检测混合液，用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μgml(每个反应需要25μl的检测混合液)；
11.向每孔加入25μl的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混匀；
12.在杂交温度下孵育5min；
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并：
95℃，1-3min；
杂交温度，forever；
13.在液相芯片仪(LiquiChip 200，QIAGEN和Luminex公司)上，保持杂交温度，对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表5所示：
表5
| 阴性对照 | 87 | 91 | 83 | 94 |
结果分析如表6所示：
表6
1，2，4，5，6，8，9，10，11，13，14，15，16，17，18，20号患者类型为NPM1基因突变NPM1-mutA阳性
3，12，19号患者类型为NPM1基因突变NPM1-mutB 阳性
7号患者类型为NPM1基因突变NPM1-mutD 阳性
同时，将患者阳性基因突变的荧光MFI值与内参Abelson基因的荧光MFI值相比，可得出基因突变的表达状况。
在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。
序列表
<110>江苏迈迪基因生物科技有限公司
<120>NPM1基因突变的联合检测方法及诊断试剂盒
<130>NP-10-14282
<160>12
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(22)
<400>1
cctccactgc cagacagaga tc 22
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(21)
<400>2
ctccactgcc atgcagagat c 21
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(20)
<400>3
tccactgcca ggcagagatc 20
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>4
attgcttccg gatgactg 18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>5
acacggtagg gaaagttctc 20
<210>6
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>6
attgcttccg gatgactg 18
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>7
acacggtagg gaaagttctc 20
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>8
attgcttccg gatgactg 18
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>9
acacggtagg gaaagttctc 20
<210>10
<211>19
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<220>
<221>misc_feature
<223>引物
<400>10
gcgcaaaatg ttggagatc 19
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<223>引物
<400>11
ggagcttttc acctttagtt atgc 24
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>(1)...(20)
<400>12
ctgaagggct tcttccagat 20
Claims (2)
1.一种检测NPM1基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，包含了共价结合了NPM1突变基因特异性探针的微球混合物及结合了内参基因Abelson基因探针的微球、NPM1突变基因mRNA的上下游引物及内参基因Abelson基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白和质控品；
所述的共价结合于微球上的针对NPM1的多种突变基因的特异性核酸探针，采用如下序列，其中5’端含氨基修饰：
NPM1-mutA：5’-Aminol inkerC12CCTCCACTGCCAGACAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.1所示；
NPM1-mutB：5’-Aminol inkerC12CTCCACTGCCATGCAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.2所示；
NPM1-mutD：5’-Aminol inkerC12TCCACTGCCAGGCAGAGATC-3’，如SEQ ID NO.3所示；
所述的针对不同NPM1突变基因的mRNA所设计的上下游引物，采用如下序列，其中上游引物5’端含生物素标签：
NPM1-mutA：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.4所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.5所示；
NPM1-mutB：上游引物5’-biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.6所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.7所示；
NPM1-mutD：上游引物5’biotin ATTGCTTCCGGATGACTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；下游引物5’-ACACGGTAGGGAAAGTTCTC-3’，如SEQ ID NO.9所示；
所述的内参基因Abelson基因，其引物和探针序列如下：
上游引物5’-biotin GCGCAAAATGTTGGAGATC-3’，如SEQID NO.10所示；
下游引物5’-GGAGCTTTTCACCTTTAGTTATGC-3’，如SEQ ID NO.11所示；
探针5’-Aminol inkerC12CTGAAGGGCTTCTTCCAGAT-3’，如SEQ ID NO.12所示；
所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种NPM1突变基因质粒及内参基因Abelson基因质粒的混合液；阴性对照为不含有NPM1突变基因及Abelson基因的质粒溶液。
2.如权利要求1所述的检测NPM1基因突变的诊断试剂盒，其特征在于，所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
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- 2010-06-17 CN CN 201010202653 patent/CN101955994B/zh active Active
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