CN102399899A - 一种检测cyp1a2基因多态性的液相芯片方法及其试剂盒 - Google Patents
一种检测cyp1a2基因多态性的液相芯片方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种CYP1A2基因多态性的液相芯片检测方法及检测试剂盒，通过对CYP1A2基因多态性CYP1A2*1F(-163C＞A)、CYP1A2*1D(-2467delT)设计引物和探针，将探针与微球共价结合形成的探针微球混合物，与PCR扩增产物杂交，加入链霉亲和素藻红蛋白后，可检测出不同微球的荧光信号，从而确定待检测样品中CYP1A2基因多态性的类型。本发明所述的方法及试剂盒具有高灵敏度、高通量性、检测快速、准确等优点，能够对CYP1A2基因多态性进行检测和鉴定分型，同时为药物代谢方面及个性化用药提供重要的参考依据。
Description
技术领域
本发明涉及体外检测技术、医学和生物技术领域，具体涉及CYP1A2基因多态性的液相芯片检测方法及其检测试剂盒。
背景技术
CYP1A2是一种重要的细胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)，基因定位于人类第15号染色体上，包括7个外显子和6个内含子。CYP1A2参与多种药物在体内的生物转化，以及一些环境毒素的代谢和致癌物质的激活过程。目前已知CYP1A参与咖啡因、华发林、茶碱、普萘洛尔、美西律、维拉帕尔、硝苯地平、他克林等几十种药物的代谢过程。CYP1A2基因多态性是导致是CYP1A2酶活性及可诱导性产生个体差异的基础，是引起药物疗效和毒性出现个体及种族差异的重要原因。因此，对CYP1A2基因多态性的鉴定分型在个性化用药和安全用药中具有重要的指导意义。CYP1A2的基因多态性主要包括CYP1A2*1F(-163C＞A)的点突变和CYP1A2*1D(-2467delT)的缺失突变等基因突变类型。
当前国内外广泛使用的分子生物学检测CYP1A2基因多态性的方法中，荧光定量PCR存在着检测通量的局限性，所以都还不能真正满足临床诊断检测的需要。传统的固相生物芯片(Biochip)技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐的突出弱点。因此临床上需要有一种检测方法，能够迅速、稳定、准确地对前列腺疾病相关的特异基因进行联合检测，液相芯片(xMAP)技术正是这样一种新型检测技术。
液相芯片又称液态芯片，能够对少量样本进行定性、定量检测，具有高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点。该系统是由许多微球为主要基质构成的，在微球的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光，根据这两种荧光的比例不同，把球形基质分为100种，可以标记上100种不同的探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同的目标分子进行检测。根据检测物的不同，微球表面可以共价结合各种各样的核酸检测探针，在杂交反应进行时再加上荧光标记。在同一反应体系中可以同时加入不同的检测微球，这样就可以利用少量的样本进行快速、高通量的检测。反应结束后，通过微流体技术将微球排成单列快速流经液相芯片检测仪，每个微球可同时被两束激光检测到，红色激光激发微球上的红色分类荧光，将各个不同的反应区分开来而定性；绿色激光则激发结合在待测样本上的荧光标记进行定量。当标记好的待测样本与特定微球上的探针结合在一起时，两束激光所激发的光均可被检测到。最后，通过计算机的高速数字信号处理器，可以自动统计分析得出特定微球上的平均荧光强度，从而确定检测物的种类和数量。
本发明基于液相芯片技术的高通量、操作简便、重复性好、灵敏度高、线性范围宽等突出优点，对CYP1A2的基因多态性进行联合并行检测，能够在实验和临床检测上得到更好的应用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法及检测试剂盒。该方法及试剂盒包含对多种CYP1A2基因多态性的联合检测，并可以对药物代谢方面和个性化用药提供重要的参考依据。本检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高准确度、检测迅速等优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
在本发明的一方面，提供一种检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法，包括以下步骤：
(1)包含多种不同荧光编码的微球(Beads)(如羧基(-COOH)微球)，每种微球上分别共价结合针对CYP1A2的基因多态性位点所设计的特异性核酸探针；所述的CYP1A2的基因多态性位点包含以下突变基因的任意一种或两种或加上其它突变基因的组合：CYP1A2*1F(-163C＞A)、CYP1A2*1D(-2467delT)；
(2)针对CYP1A2的多种突变基因，分别设计上下游引物，其中一条引物含有生物素(Biotin)标记；对不同的突变基因的DNA，通过PCR扩增出相应的产物；
(3)将步骤(1)含有特异性核酸探针的微球与步骤(2)CYP1A2突变基因的PCR扩增产物混合杂交，加入链霉亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-PE)后，通过液相芯片xMAP方法检测荧光信号；
(4)根据检测到的荧光信号，从而确定检测样品中是否存在CYP1A2突变基因，并对其基因多态性进行鉴定分型。
以上检测方法的步骤(1)中，所述的微球可以是平均直径为5.6μm，结合了不同荧光染料的聚苯烯微球，即颜色编码微球(Color-coded beads)。
步骤(1)中，所述的共价结合于微球上的针对CYP1A2的基因多态性位点所设计的特异性核酸探针，包括如下序列，其中5’端含氨基修饰：
野生型CYP1A2*1F-wt：5’-AminolinkerC12 ATGCGTCCTGGGCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
突变型CYP1A2*1F-mut：5’-AminolinkerC12 ATGCGTCCTGTGCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
野生型CYP1A2*1D-wt：5’-AminolinkerC12 GTTGGGGTTCATGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
突变型CYP1A2*1D-mut：5’-AminolinkerC12 GTTGGGGTTCTGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.4所示；
或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
步骤(2)中，所述的针对CYP1A2的多种突变基因所设计的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’端含生物素Biotin标记：
CYP1A2*1F：上游引物5’-biotin CAGCGTTCATGTTGGGAATCTT-3’，如SEQ ID NO.5所示；下游引物5’-GCTGAGGGTTGAGATGGAGACAT-3’，如SEQ ID NO.6所示；
CYP1A2*1D：上游引物5’-biotin AGGCTGAGGCAAGAGGATTGT-3’，如SEQ ID NO.7所示；下游引物5’-AGGAGGAGGACAAGCCTTAAATTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；
或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
在本发明的另一方面，提供一种检测CYP1A2基因多态性的试剂盒，包含共价结合了针对CYP1A2基因多态性位点的特异性探针的微球混合物、所述的CYP1A2突变基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白和质控品。
以上试剂盒中所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种CYP1A2基因多态性位点的质粒的混合液；阴性对照为不含有CYP1A2基因多态性位点的质粒溶液；所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
在本发明的另一方面，提供一种检测CYP1A2基因多态性的试剂盒在检测体外样品中的应用；以及通过检测体外样品，对药物代谢方面及个性化用药进行指导中的应用。
由于本发明利用了液相芯片技术，使检测方法及试剂盒具有高灵敏度、高特异性、高通量、稳定性好、检测迅速、准确等突出优点，能够对CYP1A2基因多态性进行检测和鉴定分型，能在实验和临床检测上得到更好的应用。此外，本发明可以对药物代谢方面及个性化用药提供重要的参考依据。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明，但并不能理解为对本发明的限制。所述的实施例只提供阐明核酸探针、试剂盒及其制作和应用方法而不为其所限制。期间各种变化形式在本发明和所述的权项的范围内是可预期的。
实验材料：
引物和探针均由invitrogen公司合成；DNA提取试剂盒QIAamp DNA Blood Mini Kit和Gentra Puregene Buccal Cell Kit、多重Multiplex PCR试剂盒、不同编号的微球(表面羧基修饰)、链霉亲和素-藻红蛋白均购置于QIAGEN公司；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)购置于Pierce公司；2-(N-吗啉)-乙磺酸(MES)、N-月桂酰基氨酸钠(Sarkosyl)、四甲基氯化铵(TMAC)均购置于sigma公司。
缓冲液和杂交液的配置：
实施例1：CYP1A2基因多态性CYP1A2*1F(-163C＞A)的液相芯片联合检测方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测CYP1A2基因多态性的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
CYP1A2*1F-wt：5’-AminolinkerC12 ATGCGTCCTG(G)GCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
CYP1A2*1F-mut：5’-AminolinkerC12 ATGCGTCCTG(T)GCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
2. 将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、15号的2种羧基微球偶联
2.1 取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2 用dH2O分别溶解CYP1A2*1F-wt和CYP1A2*1F-mut的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3 分别全速涡旋编号为11、15号的2种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4 分别取2.5×106微球储存悬液到2个离心管中；
2.5 10,000g，离心，1-2min；
2.6 移除上清液，用50μl 0.1M MES，pH4.5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2.7 将2种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释，使其浓度为0.1nmol/μl；
2.8 每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里，涡旋混合；
2.9 用dH2O配置10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意：保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC的使用)；
2.10 加入2.5μl 10mg/ml EDC的新鲜EDC溶液分别到2种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀；
2.11 室温避光孵育30min；
2.12 用dH2O配置第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意：EDC粉末如果潮解，则应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；
2.13 2种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混匀；
2.14 室温避光孵育30min；
2.15 2种偶联微球中各加入1ml 0.02％Tween-20；
2.16 10,000g，离心，1-2min；
2.17 移除上清，分别用1ml 0.1％SDS重悬2种偶联微球，振荡混匀；
2.18 10,000g，离心，1-2min；
2.19 移除上清，分别加入100μl TE，PH8.0，涡旋混合20s，重悬微球；
2.20 用细胞计数器计数2种偶联了寡核苷酸探针的微球；
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释；
b.涡旋震荡充分混匀；
c.取10μl到细胞计数器上；
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；
e.微球/μl＝(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配置
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：CYP1A2*1F-wt探针微球11和CYP1A2*1F-mut探针微球15，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-10号样本为中国人外周静脉血(EDTA或肝素抗凝)或唾液及口腔粘膜采集的样本。对于外周静脉血(EDTA或肝素抗凝)样本，按照QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒的说明提取DNA。对于唾液及口腔粘膜采集的样本，按照QIAGEN公司的Gentra PuregeneBuccal Cell Kit试剂盒的说明提取DNA。
三.多重PCR
按照如下方法对上述的1-10号样本的DNA进行多重PCR扩增：
1.按照如下序列合成引物：
CYP1A2*1F：上游引物5’-biotin CAGCGTTCATGTTGGGAATCTT-3’，如SEQ ID NO.5所示；下游引物5’-GCTGAGGGTTGAGATGGAGACAT-3’，如SEQ ID NO.6所示；
2.多重PCR反应：
采用的是QIAGEN公司的多重Multiplex PCR试剂盒，体系如下
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTP Mix。)
PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配置的寡核苷酸探针微球混合物；
2.涡旋震荡20s，混匀微球；
3.制备微球工作液，用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。(注：每个反应需要33μl的微球工作液)；
4.涡旋震荡20s，混匀微球工作液；
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液；
6.向每个样品孔内分别加入1-10号临床样本、阳性及阴性对照的PCR扩增产物和TE溶液(PH为8.0)，总体积为17μl；
7.用排枪上下吸打，温柔混匀反应液；
8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100℃下孵育1-3min，使样品中的寡核苷酸去掉二级结构；
9.在杂交温度下孵育反应板15min；
10.制备新鲜的检测混合液，用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液)；
11.向每孔加入25μl的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混匀；
12.在杂交温度下孵育5min；
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并：
95℃，1-3min；
杂交温度，forever；
13.在液相芯片仪(Luminex)上，保持杂交温度，对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表1所示：
表1
| 临床样本 | CYP1A2*1F-wt | CYP1A2*1F-mut |
| 1 | 1836 | 47 |
| 2 | 51 | 2105 |
| 3 | 45 | 1738 |
| 4 | 1069 | 927 |
| 5 | 1861 | 53 |
| 6 | 812 | 1329 |
| 7 | 56 | 2054 |
| 8 | 1128 | 796 |
| 9 | 1592 | 34 |
| 10 | 60 | 2413 |
| 阳性对照 | 2367 | 1905 |
| 阴性对照 | 42 | 36 |
通过等位基因突变率的计算，来确定基因多态性的类型：
其中净MFI值＝样本MFI值-背景(阴性对照)MFI值
等位基因突变率≥0.75，为突变型纯合子；等位基因突变率在0.25和0.75之间，为杂合子；等位基因突变率≤0.25，为野生型纯合子。
结果分析如表2所示：
表2
| 临床样本 | CYP1A2*1F基因多态性 |
| 1 | 野生型纯合子 |
| 2 | 突变型纯合子 |
| 3 | 突变型纯合子 |
| 4 | 杂合子 |
| 5 | 野生型纯合子 |
| 6 | 杂合子 |
| 7 | 突变型纯合子 |
| 8 | 杂合子 |
| 9 | 野生型纯合子 |
| 10 | 突变型纯合子 |
1、5、9号样本的类型为野生型纯合子；
2、3、7、10号样本的类型为突变型纯合子；
4、6、8号样本的类型为杂合子。
所有样本都经过DNA测序方法证实，与以上的液相芯片检测结果完全一致。
实施例2：CYP1A2基因多态性CYP1A2*1D(-2467delT)的液相芯片联合检测方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测CYP1A2*1D-wt、CYP1A2*1D-mut基因多态性的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
CYP1A2*1D-wt：5’-AminolinkerC12 GTTGGGGTTCATGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
CYP1A2*1D-mut：5’-AminolinkerC12GTTGGGGTTCTGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.4
2.将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为17、21号的2种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解CYP1A2*1D-wt、CYP1A2*1D-mut的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3 分别全速涡旋编号为17、21号的2种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4 分别取2.5×106微球储存悬液到2个离心管中；
2.5 10,000g，离心，1-2min；
2.6 移除上清液，用50μl 0.1M MES，pH4.5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2.7 将2种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释，使其浓度为0.1nmol/μl；
2.8 每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里，涡旋混合；
2.9 用dH2O配置10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意：保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC的使用)；
2.10 加入2.5μl 10mg/ml EDC的新鲜EDC溶液分别到2种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀；
2.11 室温避光孵育30min；
2.12 用dH2O配置第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意：EDC粉末如果潮解，则应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；
2.13 3种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混匀；
2.14 室温避光孵育30min；
2.15 2种偶联微球中各加入1ml 0.02％Tween-20；
2.16 10,000g，离心，1-2min；
2.17 移除上清，分别用1ml 0.1％SDS重悬2种偶联微球，振荡混匀；
2.18 10,000g，离心，1-2min；
2.19 移除上清，分别加入100μl TE，PH8.0，涡旋混合20s，重悬微球；
2.20 用细胞计数器计数2种偶联了寡核苷酸探针的微球；
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释；
b.涡旋震荡充分混匀；
c.取10μl到细胞计数器上；
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；
e.微球/μl＝(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配置
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：CYP1A2*1D-wt探针微球17、CYP1A2*1D-mut探针微球21，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-10号样本为中国人外周静脉血(EDTA或肝素抗凝)或唾液及口腔粘膜采集的样本。对于外周静脉血(EDTA或肝素抗凝)样本，按照QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒的说明提取DNA。对于唾液及口腔粘膜采集的样本，按照QIAGEN公司的Gentra PuregeneBuccal Cell Kit试剂盒的说明提取DNA。
三.多重PCR
按照如下方法对上述的1-10号样本的DNA进行多重PCR扩增：
1.按照如下序列合成引物：
CYP1A2*1D：上游引物5’-biotin AGGCTGAGGCAAGAGGATTGT-3’，如SEQ ID NO.7所示；下游引物5’-AGGAGGAGGACAAGCCTTAAATTG-3’，如SEQ ID NO.8所示。
2.多重PCR反应：
采用的是QIAGEN公司的多重Multiplex PCR试剂盒，体系如下
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTP Mix。)
PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配置的寡核苷酸探针微球混合物；
2.涡旋震荡20s，混匀微球；
3.制备微球工作液，用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。(注：每个反应需要33μl的微球工作液)；
4.涡旋震荡20s，混匀微球工作液；
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液；
6.向每个样品孔内分别加入1-10号临床样本、阳性及阴性对照的PCR扩增产物和TE溶液(PH为8.0)，总体积为17μl；
7.用排枪上下吸打，温柔混匀反应液；
8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100℃下孵育1-3min，使样品中的寡核苷酸去掉二级结构；
9.在杂交温度下孵育反应板15min；
10.制备新鲜的检测混合液，用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液)；
11.向每孔加入25μl的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混匀；
12.在杂交温度下孵育5min；
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并：
95℃，1-3min；
杂交温度，forever；
13.在液相芯片仪(Luminex)上，保持杂交温度，对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表3所示：
表3
| 临床样本 | CYP1A2*1D-wt | CYP1A2*1D-mut |
| 1 | 1036 | 1149 |
| 2 | 2275 | 61 |
| 3 | 38 | 1948 |
| 4 | 1607 | 59 |
| 5 | 881 | 1236 |
| 6 | 1762 | 54 |
| 7 | 2329 | 63 |
| 8 | 1203 | 972 |
| 9 | 46 | 2256 |
| 10 | 1983 | 47 |
| 阳性对照 | 1817 | 2014 |
| 阴性对照 | 43 | 52 |
通过等位基因突变率的计算，来确定基因多态性的类型：
其中净MFI值＝样本MFI值-背景(阴性对照)MFI值
等位基因突变率≥0.75，为突变型纯合子；等位基因突变率在0.25和0.75之间，为杂合子；等位基因突变率≤0.25，为野生型纯合子。
结果分析如表4所示：
表4
| 临床样本 | CYP1A2*1D基因多态性 |
| 1 | 杂合子 |
| 2 | 野生型纯合子 |
| 3 | 突变型纯合子 |
| 4 | 野生型纯合子 |
| 5 | 杂合子 |
| 6 | 野生型纯合子 |
| 7 | 野生型纯合子 |
| 8 | 杂合子 |
| 9 | 突变型纯合子 |
| 10 | 野生型纯合子 |
1、5、8号样本的类型为杂合子；
2、4、6、7、10号样本的类型为野生型纯合子；
3、9号临床样本的类型为突变型纯合子。
所有样本都经过DNA测序方法证实，与以上的液相芯片检测结果完全一致。
实施例3：CYP1A2基因多态性CYP1A2*1F(-163C＞A)、CYP1A2*1D(-2467delT)的液相芯片联合检测方法
具体的检测方法包括如下步骤：
一.检测CYP1A2*1F-wt、CYP1A2*1F-mut、CYP1A2*1D-wt、CYP1A2*1D-mut基因的微球混合液的制备
1.按照以下序列合成寡核苷酸探针：
CYP1A2*1F-wt：5’-AminolinkerC12ATGCGTCCTG(G)GCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
CYP1A2*1F-mut：5’-AminolinkerC12ATGCGTCCTG(T)GCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
CYP1A2*1D-wt：5’-AminolinkerC12GTTGGGGTTC(A)TGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
CYP1A2*1D-mut：5’-AminolinkerC12GTTGGGGTTC()TGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.4所示
2.将以上含有氨基修饰的寡核苷酸探针分别与编号为11、15、17、21号的4种羧基微球偶联
2.1取出一小份-20℃保存的新鲜干粉状EDC平衡到室温；
2.2用dH2O分别溶解CYP1A2*1F-wt、CYP1A2*1F-mut、CYP1A2*1D-wt、CYP1A2*1D-mut的寡核苷酸探针，浓度为1mM(1nmol/μl)；
2.3分别全速涡旋编号为11、15、17、21号的4种羧基微球储存悬液至少3min，产生均一的微球悬液；
2.4 分别取2.5×106微球储存悬液到4个离心管中；
2.5 10,000g，离心，1-2min；
2.6移除上清液，用50μl 0.1M MES，pH4.5的偶联缓冲液，重悬微球，涡旋震荡20秒；
2.7将4种浓度为1mM寡核苷酸探针分别用dH2O以1∶10的比例稀释，使其浓度为0.1nmol/μl；
2.8每种探针各加入2μl(浓度为0.1nmol/μl)到混匀的相应的微球里，涡旋混合；
2.9用dH2O配置10mg/ml的新鲜EDC溶液(注意：保持EDC粉末干燥，便于下一步EDC的使用)；
2.10 加入2.5μl 10mg/ml EDC的新鲜EDC溶液分别到4种微球中(25μg终浓度约为0.5μg/μl)涡旋混匀；
2.11 室温避光孵育30min；
2.12 用dH2O配置第二份10mg/ml的EDC新鲜溶液(注意：EDC粉末如果潮解，则应丢弃，建议每一步偶联过程都使用新鲜的EDC粉末)；
2.13 4种微球中各加入2.5μl 10mg/ml的EDC新鲜溶液，涡旋混匀；
2.14 室温避光孵育30min；
2.15 4种偶联微球中各加入1ml 0.02％Tween-20；
2.16 10,000g，离心，1-2min；
2.17 移除上清，分别用1ml 0.1％SDS重悬4种偶联微球，振荡混匀；
2.18 10,000g，离心，1-2min；
2.19 移除上清，分别加入100μl TE，PH8.0，涡旋混合20s，重悬微球；
2.20 用细胞计数器计数4种偶联了寡核苷酸探针的微球；
a.用dH2O将偶联微球以1∶100稀释；
b.涡旋震荡充分混匀；
c.取10μl到细胞计数器上；
d.数细胞计数器上4个角大格的微球总量；
e.微球/μl＝(4大格微球总量)×2.5×100(稀释倍数)。
3.微球混合液的配置
将上述偶联了寡核苷酸探针的微球，如下列：CYP1A2*1F-wt探针微球11、CYP1A2*1F-mut探针微球15、CYP1A2*1D-wt探针微球17和CYP1A2*1D-mut探针微球21，等比例混合，各种微球的终浓度为1500个/μl，2-8℃避光保存。
二.样本的制备
1-15号样本为中国人外周静脉血(EDTA或肝素抗凝)或唾液及口腔粘膜采集的样本。对于外周静脉血(EDTA或肝素抗凝)样本，按照QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒的说明提取DNA。对于唾液及口腔粘膜采集的样本，按照QIAGEN公司的Gentra PuregeneBuccal Cell Kit试剂盒的说明提取DNA。
三.多重RT-PCR
按照如下方法对上述的1-15号样本的DNA进行多重PCR扩增：
1.按照如下序列合成引物：
CYP1A2*1F：上游引物5’-biotin CAGCGTTCATGTTGGGAATCTT-3’，如SEQ ID NO.5所示；下游引物5’-GCTGAGGGTTGAGATGGAGACAT-3’，如SEQ ID NO.6所示；
CYP1A2*1D：上游引物5’-biotin AGGCTGAGGCAAGAGGATTGT-3’，如SEQ ID NO.7所示；下游引物5’-AGGAGGAGGACAAGCCTTAAATTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；。
2.多重PCR反应：
采用的是QIAGEN公司的多重Multiplex PCR试剂盒，体系如下
(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix中含热启动TaqDNA酶、MgCl2和dNTP Mix。)
PCR扩增程序：95℃15min；94℃30s，55℃90s，72℃90s，35个循环；72℃10min；4℃保温。
四.寡核苷酸探针和PCR产物的杂交
1.选取步骤一中配置的寡核苷酸探针微球混合物；
2.涡旋震荡20s，混匀微球；
3.制备微球工作液，用1.5×TMAC杂交溶液稀释偶联微球至浓度为150个微球/μl。(注：每个反应需要33μl的微球工作液)；
4.涡旋震荡20s，混匀微球工作液；
5.向样本孔、阳性对照孔、阴性对照孔内分别加入33μl微球工作液；
6.向每个样品孔内分别加入1-15号临床样本、阳性及阴性对照的PCR扩增产物和TE溶液(PH为8.0)，总体积为17μl；
7.用排枪上下吸打，温柔混匀反应液；
8.盖上反应盖避免蒸发，在95-100℃下孵育1-3min，使样品中的寡核苷酸去掉二级结构；
9.在杂交温度下孵育反应板15min；
10.制备新鲜的检测混合液，用1×TMAC杂交溶液稀释链霉亲和素藻红蛋白溶液至10μg/ml(每个反应需要25μl的检测混合液)；
11.向每孔加入25μl的检测混合液，用排枪上下吸打，温柔混匀；
12.在杂交温度下孵育5min；
上述步骤可以通过PCR仪按以下方案编程将其合并：
95℃，1-3min；
杂交温度，forever；
13.在液相芯片仪(Luminex)上，保持杂交温度，对各反应孔进行检测分析，测定荧光MFI值。
五.检测结果及分析
检测结果(荧光MFI值)如表5所示：
表5
通过等位基因突变率的计算，来确定基因多态性的类型：
其中净MFI值＝样本MFI值-背景(阴性对照)MFI值
等位基因突变率≥0.75，为突变型纯合子；等位基因突变率在0.25和0.75之间，为杂合子；等位基因突变率≤0.25，为野生型纯合子。
结果分析如表6所示：
表6
| 临床样本 | CYP1A2*1F基因多态性 | CYP1A2*1D基因多态性 |
| 1 | 杂合子 | 野生型纯合子 |
| 2 | 突变型纯合子 | 杂合子 |
| 3 | 野生型纯合子 | 野生型纯合子 |
| 4 | 野生型纯合子 | 杂合子 |
| 5 | 突变型纯合子 | 野生型纯合子 |
| 6 | 杂合子 | 突变型纯合子 |
| 7 | 野生型纯合子 | 野生型纯合子 |
| 8 | 突变型纯合子 | 突变型纯合子 |
| 9 | 突变型纯合子 | 野生型纯合子 |
| 10 | 野生型纯合子 | 野生型纯合子 |
| 11 | 野生型纯合子 | 突变型纯合子 |
| 12 | 杂合子 | 杂合子 |
| 13 | 杂合子 | 野生型纯合子 |
| 14 | 野生型纯合子 | 野生型纯合子 |
| 15 | 野生型纯合子 | 杂合子 |
CYP1A2*1F基因多态性：
1、6、12、13号样本的类型为杂合子；
2、5、8、9号样本的类型为突变型纯合子；
3、4、7、10、11、14、15号样本的类型为野生型纯合子。
CYP1A2*1D基因多态性：
1、3、5、7、9、10、13、14号样本的类型为野生型纯合子；
2、4、12、15号样本的类型为杂合子；
6、8、11号样本的类型为突变型纯合子。
所有样本都经过DNA测序方法证实，与以上的液相芯片检测结果完全一致。
在阅读了以上关于本发明的陈述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改或变化，其中包括引物或探针的各种变化、引物或探针标记的各种变化，这些等价形式同样归属于本申请所附权利要求书中所限定的范围。
Claims (9)
1.一种检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)包含多种不同荧光编码的微球Beads，每种微球上分别共价结合针对CYP1A2的基因多态性位点所设计的特异性核酸探针；所述的CYP1A2的基因多态性位点包含以下突变基因的任意一种或两种或加上其它突变基因的组合：CYP1A2*1F(-163C＞A)、CYP1A2*1D(-2467delT)；
(2)针对CYP1A2的多种突变基因，分别设计上下游引物，其中一条引物含有生物素Biotin标记；对不同的突变基因的DNA，通过PCR扩增出相应的产物；
(3)将步骤(1)含有特异性核酸探针的微球与步骤(2)CYP1A2突变基因的PCR扩增产物混合杂交，加入链霉亲和素-藻红蛋白Streptavidin-PE后，通过液相芯片xMAP方法检测荧光信号；
(4)根据检测到的荧光信号，从而确定检测样品中是否存在CYP1A2突变基因，并对其基因多态性进行鉴定分型。
2.如权利要求1所述的检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的微球是一种颜色编码微球Color-coded Beads，且结合了不同荧光染料的聚苯烯微球。
3.如权利要求1所述的检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的共价结合于微球上的针对CYP1A2的基因多态性位点所设计的特异性核酸探针，包括如下序列，其中5’端含氨基修饰：
野生型CYP1A2*1F-wt：5’-AminolinkerC12ATGCGTCCTGGGCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.1所示；
突变型CYP1A2*1F-mut：5’-AminolinkerC12ATGCGTCCTGTGCCCACAGAG-3’，如SEQ ID NO.2所示；
野生型CYP1A2*1D-wt：5’-AminolinkerC12GTTGGGGTTCATGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.3所示；
突变型CYP1A2*1D-mut：5’-AminolinkerC12GTTGGGGTTCTGTGCCACAA-3’，如SEQ ID NO.4所示
或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
4.如权利要求1所述的检测CYP1A2基因多态性的液相芯片方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的针对CYP1A2的多种突变基因所设计的上下游引物，包括如下序列，其中上游引物5’端含生物素Biotin标记：
CYP1A2*1F：上游引物5’-biotin CAGCGTTCATGTTGGGAATCTT-3’，如SEQ ID NO.5所示；下游引物5’-GCTGAGGGTTGAGATGGAGACAT-3’，如SEQ ID NO.6所示；
CYP1A2*1D：上游引物5’-biotin AGGCTGAGGCAAGAGGATTGT-3’，如SEQ ID NO.7所示；下游引物5’-AGGAGGAGGACAAGCCTTAAATTG-3’，如SEQ ID NO.8所示；
或者包含有上述序列或其互补序列的向5’端或/和3’端延长的序列；
或者与上述序列或其互补序列的同源性大于85％的序列；
或者与上述序列的碱基互补序列；
或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。
5.一种检测CYP1A2基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含：权利要求1-4任一项中所述的共价结合了针对CYP1A2基因多态性位点的特异性探针的微球混合物、权利要求1-4任一项中所述的CYP1A2突变基因的上下游引物、链霉亲和素-藻红蛋白和质控品。
6.如权利要求5所述的检测CYP1A2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述的微球混合物，根据不同检测样品的需要自由组合。
7.如权利要求5所述的检测CYP1A2基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述的质控品包含阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为含有各种CYP1A2基因多态性位点的质粒的混合液；阴性对照为不含有CYP1A2基因多态性位点的质粒溶液。
8.一种如权利要求5-7任一项所述的检测CYP1A2基因多态性的试剂盒在检测体外样品中的应用。
9.一种如权利要求5-7任一项所述的检测CYP1A2基因多态性的试剂盒通过检测体外样品，对药物代谢方面及个性化用药进行指导中的应用。
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