CN101487052B - Cyp2c9、cyp2c19基因突变检测液相芯片及其检测方法 - Google Patents
Cyp2c9、cyp2c19基因突变检测液相芯片及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了CYP2C9、CYP2C19基因突变检测液相芯片及其检测方法，该液相芯片包括有：分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16中的序列；野生型和突变型ASPE引物，所述野生型及突变型特异性序列分别选自：SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ IDNO.6、和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；引物。所述液相芯片检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及苯妥英钠代谢相关基因CYP2C9、CYP2C19突变检测液相芯片及其检测方法。
背景技术
苯妥英钠为抗癫痫药、抗心律失常药，常用于颅脑手术后癫痫的预防，以及癫痫尤其是癫痫大发作的治疗。这种药物始用于20世纪初，长期作为治疗癫痫的一线药物，其疗效虽好但有较多与剂量相关的不良反应，且个体差异很大。患者若使用剂量不足，药物不能达到预期疗效；而稍有过量，又会对患者的神经系统造成严重的毒副作用。苯妥英钠的毒副作用常见为齿龈增生，儿童发生率高；对神经系统的不良反应常见为眩晕、头痛，严重时可引起眼球震颤、共济失调、语言不清和意识模糊；此外，血液系统、骨骼系统以及消化系统亦会受到用药剂量不当的影响。
大量的临床研究已经证实，苯妥英钠的疗效与患者体内两个基因的突变关系密切，即CYP2C9和CYP2C19。苯妥英钠70％～90％由CYP2C9代谢；而CYP2C19是其代谢过程中最重要的次级代谢酶，CYP2C19的作用随药物浓度的升高而增强。CYP2C9和CYP2C19对降低苯妥英钠毒性和促使其排泄出体外具有关键作用。
在中国人群中，CYP2C9常见的功能减弱等位基因突变型为CYP2C9*2和CYP2C9*3，其中CYP2C9*3基因分布频率约2.5％；CYP2C19常见的功能减弱等位基因突变型为CYP2C19*2和CYP2C19*3，基因分布频率分别约为29.7％和3.5％。其中，CYP2C9*2为C430T突变，发生在外显子3；CYP2C9*3为A1075C突变，发生在外显于7；CYP2C19*2为G681A突变，发生在外显子5；CYP2C19*3为G636A突变，发生在外显子4。这些等位基因的突变使酶活性降低，对药物代谢的能力随着等位基因的不同组合而呈现出一定的规律性，表现出正常基因纯合子>正常基因与突变基因杂合子>突变基因纯合子或杂合子的变化趋势，即我们通常所说的基因剂量效应。大量研究表明，携有一个或以上功能减弱等位基因突变的患者，在接受苯妥英钠治疗时，如果不适当减少剂量，将面临较大的毒副作用风险。
目前已建立了若干以PCR为基础的检测CYP2C9和CYP2C19基因SNPs的技术，如直接测序法，半定量PCR技术，PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，以上技术具有灵敏度低，样品易污染、假阳性率高等缺点，普通PCR方法和荧光定量PCR由于检测通量的局限性不能满足临床的需要。而聚合酶链式反应-限制性片段长度多态(PCR-RFLP)分析技术和基于TaqMan技术的等位基因差异分析法一次只能进行一种突变的检测，耗时费力；传统的固相芯片价格昂贵，而且敏感性不高，检测结果的可重复性差。基于芯片的原理，美国Luminex公司开发出了以微球为载体的悬浮液相芯片技术。该项技术利用聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸和蛋白质等生物大分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的蛋白质或核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，其中红色激光检测微球表面红色分类荧光的强度，并根据微球中不同色彩而编号分类，从而确定反应的类型；绿色激光检测样本中荧光标记物的荧光强度，再通过机器与计算机自动统计分析激光所检测到微球种类、数量，从而判定待测样本多种目标测试物各自的浓度。因此，液相芯片技术既满足了高通量检测的要求，同时具备了快速准确，灵敏度高，特异性好，结果重复性好等优点。我们采用x-Taq液相芯片技术可以同时检测多种突变，实现高通量快速简便化操作，大大提高了检测效率，在同类检测技术中处于领先地位。
发明内容
本发明的目的之一是提供与苯妥英钠疗效密切相关的CYP2C9和CYP2C19基因突变检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP2C9基因的两种常见突变等位基因CYP2C9*2和CYP2C9*3，以及CYP2C19基因的两种常见突变等位基因CYP2C19*2和CYP2C19*3。
一种CYP2C9和/或CYP2C19基因突变检测液相芯片，包括有：
(1).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，每种微球具有不同颜色编码，anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16中的序列；
(2).针对每种型别的突变分别设计的野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因突变位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述tag序列能相应地与(1)中所选的微球上anti-tag序列互补配对；所述野生型及突变型特异性序列分别选自：SEQID NO.1及SEQID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；
(3).用于扩增出需要检测的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突变位点的目标序列的引物。优选地，一种CYP2C9和/或CYP2C19基因突变检测液相芯片，包括有：
(1).包被有特异的anti-tag序列的8种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列分别为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16中的序列；
(2).针对每种型别突变设计的4对野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因突变位点的特异性序列组成，所述tag序列能分别相应地与(1)中所述微球上anti-tag序列互补配对；所述野生型及突变型特异性序列分别为：SEQID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；
(3).用于扩增出需要检测的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突变位点的目标序列的引物。
更优选地，所述4对由tag序列和特异性序列组成的特异ASPE引物的为：SEQ ID NO.9的互补序列和SEQ ID NO.1组成的引物、及SEQ ID NO.10的互补序列和SEQ ID NO.2组成的引物；SEQ ID NO.11的互补序列和SEQ ID NO.3组成的引物、及SEQ ID NO.12的互补序列和SEQID NO.4组成的引物；SEQ ID NO.13的互补序列和SEQ ID NO.5组成的引物、及SEQ ID NO.14的互补序列和SEQ ID NO.6组成的引物；和SEQ ID NO.15的互补序列和SEQ ID NO.7组成的引物、及SEQ ID NO.16的互补序列和SEQ ID NO.8组成的引物。
优选地，(3)中所述引物为针对CYP2C9Exon3突变的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、针对CYP2C9 Exon7突变的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、针对CYP2C19 Exon5突变的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、和/或针对CYP2C19 Exon4突变的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24.
以上所述间隔臂为用于将特异性的探针与微球表面间隔开来或是将特异性探针置于亲水性环境中的序列。通过在探针序列与氨基之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-30个T。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP2C9和/或CYP2C19基因突变进行检测的方法。
一种使用上述液相芯片对CYP2C9和CYP2C19基因突变检测的方法，主要包括以下步骤：
(一)PCR扩增待测DNA样品，得需要检测的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突变位点的PCR反应产物；
(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT酶进行酶切处理；
(三)酶切处理后的产物用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(六)通过荧光检测仪检测。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法、液相芯片与测序法的吻合率高达100％。所制备的CYP2C9和CYP2C19基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。
3.本发明的检测方法步骤简单，四种突变检测可通过一步多重PCR即可完成四个具有突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合临床需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1CYP2C9和CYP2C19基因突变检测液相芯片试剂盒，主要包括有：
一、ASPE引物
针对CYP2C9和CYP2C19基因的各两种常见突变等位基因分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由Tag+特异性序列组成，特异性序列设计的原则是：特异性序列的3’末端为突变位点；用于检测一个基因突变位点野生型与突变型的特异性引物应当来自DNA的同一条链；特异性引物的退火温度应当在51℃-56℃之间；引物长度一般在18-22bp之间。ASPE引物序列如下表所示：
表1ASPE引物序列
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列(如表2所示)，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的八种tag序列及其微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2ASPE特异性引物右端的Tag序列及微球上对应的anti-tag序列
选择的八种微球(FlexMAP微球)购自美国Luminex公司，也可自己合成tag序列，购买Luminex公司的羧基化微球进行包被。包被的过程如下：
根据所选择的tag序列合成对应于每种微球的anti-tag序列，每个anti-tag序列前加上一段5-30个T的间隔臂序列(通常选为10个T，其效果都一致)。，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/L EDTA]中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有突变位点的目标序列的引物：
CYP2C9基因的两种常见突变等位基因为CYP2C9*2和CYP2C9*3，CYP2C19基因的两种常见突变等位基因为CYP2C19*2和CYP2C19*3。它们的点突变发生在不同的外显子上。CYP2C9*2为C430T突变，发生在外显子3；CYP2C9*3为A1075C突变，发生在外显子7；CYP2C19*2为G681A突变，发生在外显子5；CYP2C19*3为G636A突变，发生在外显子4。设计四对引物(见表3)，分别扩增出四条具有突变位点的目标序列。
表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物
实施例2运用CYP2C9和CYP2C19基因突变检测液相芯片对临床样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| 5M NaOH | Fisher SS256-500 | --- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取抗凝静脉血或胸腔积液约2.5ml，3000rpm离心15分钟，取300μl上清加到一个1.5ml干净无菌的离心管中；
2.向离心管中加入500μl AP1缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
3.加入100μl AP2缓冲液，涡旋振荡充分混匀；
4.室温下12,000rpm离心10分钟；
5.小心吸取上清加入放在2ml收集管上的吸附柱AxyPrep中，盖上盖子，以6,000rpm离心1分钟；
6.倒掉废液收集管中的废液，用800μl缓冲液W1洗涤1次，以6,000rpm离心1分钟；
7.倒掉废液收集管中的废液，加入800μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟；倒掉废液收集管中的废液，加入500μl缓冲液W2，以12,000rpm离心1分钟，弃掉废液；
8.将吸附柱AxyPrep放回空收集管中，12,000rpm离心1分钟；
9.将吸附柱AxyPrep置于一干净无菌的1.5ml离心管中，加入40μl TE缓冲液，室温下放置1分钟，12,000rpm离心1分钟洗脱DNA，电泳检测，-20℃保存。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计的四对引物，多重PCR一步扩增出CYP2C9的外显子3和外显子7，以及CYP2C19的外显子5和外显子4共四条具有突变位点的目标序列，产物大小分别为306bp、399bp、322bp、374bp。引物序列(SEQ NO.17-24)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ NO.17-24的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
10×缓冲液(含Mg2+) 5ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.5ul
多重PCR引物工作液(各12.5pmol/mL) 8ul
模板DNA(10ng/ul) 1ul
ddH2O 31.5ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 20s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取C430T-w、C430T-m、A1075C-w、A1075C-m、G681A-w、G681A-m、G636A-w、G636A-m相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10.ul
共 20ul
PCR程序为：96℃ 2min；94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的八种FlexMAP微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物3’端的tag序列特异结合；本实施例每组样品检测中都分别选择LUA45，LUA16，LUA17，LUA40，LUA55，LUA32，LUA23，LUA31共八种微球；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃ 60s，37℃ 15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链酶亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4和表5所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的CYP2C9和CYP2C19基因突变，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为突变型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP2C9和CYP2C19基因突变型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的CYP2C9和CYP2C19基因突变检测液相芯片能够准确地检测出CYP2C9和CYP2C19基因突变类型，且结果稳定可靠。
表4样本检测结果(MFI)
| 序号NO. | C430T-w | C430T-m | A1075C-w | A1075C-m | G681A-w | G681A-m | G636A-w | G636A-m |
| 阴性对照 | 13 | 10 | 5 | 13 | 16 | 4 | 4 | 20 |
| 1 | 1802 | 16 | 1253 | 8 | 852 | 933 | 959 | 12 |
| 2 | 3036 | 11 | 1630 | 33 | 1207 | 2 | 2019 | 17 |
| 3 | 1028 | 27 | 1122 | 0 | 547 | 1 | 1427 | 13 |
| 4 | 1970 | 15 | 1305 | 21 | 528 | 599 | 1055 | 9 |
| 5 | 2549 | 64 | 1422 | 12 | 551 | 526 | 1478 | 17 |
| 6 | 2003 | 10 | 621 | 578 | 803 | 18 | 1011 | 20 |
| 7 | 2180 | 7 | 1378 | 23 | 858 | 21 | 1182 | 6 |
| 8 | 2418 | 20 | 730 | 639 | 751 | 8 | 558 | 635 |
| 9 | 4128 | 88 | 1172 | 32 | 37 | 853 | 844 | 29 |
| 10 | 5861 | 51 | 1301 | 40 | 29 | 2825 | 2637 | 78 |
| 11 | 4589 | 63 | 1485 | 46 | 474 | 641 | 914 | 46 |
| 12 | 3934 | 17 | 1438 | 35 | 2973 | 13 | 2878 | 27 |
| 13 | 4167 | 10 | 1767 | 16 | 1045 | 918 | 2231 | 24 |
| 14 | 2892 | 19 | 992 | 24 | 1967 | 20 | 793 | 837 |
| 15 | 1584 | 8 | 1015 | 18 | 1741 | 15 | 1751 | 24 |
| 16 | 2341 | 23 | 1713 | 8 | 1006 | 967 | 1781 | 13 |
| 17 | 2017 | 24 | 1251 | 18 | 1539 | 14 | 859 | 910 |
| 18 | 2945 | 20 | 1349 | 11 | 1542 | 18 | 1346 | 15 |
| 19 | 3663 | 18 | 1852 | 54 | 63 | 1154 | 1978 | 27 |
| 20 | 2138 | 19 | 1547 | 27 | 991 | 10 | 6432 | 33 |
表5样本CYP2C9和CYP2C19突变类型分析结果
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>CYP2C9、CYP2C19基因突变检测液相芯片及其检测方法
<160>24
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aagaggagca ttgaggacc 19
<210>2
<211>19
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aagaggagca ttgaggact 19
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tggtggggag aaggtcaat 19
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tggtggggag aaggtcaag 19
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agtaatttgt tatgggttcc c 21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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agtaatttgt tatgggttcc t 21
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<212>DNA
<213>人工序列
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attgtaagca ccccctgg 18
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<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
attgtaagca ccccctga 18
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ttgagtaatt gaattgtgaa atga 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
tgatgatttg aatgaagatt gatt 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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tgataaagtg ataaaggatt aaag 24
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taatgttgtg aataatgtag aaag 24
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<213>人工序列
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gttagttatt gagaagtgta tata 24
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<213>人工序列
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gtagattagt ttgaagtgaa taat 24
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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aaagttgaga tttgaatgat tgaa 24
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gattaaagtt gattgaaaag tgaa 24
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<213>人工序列
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ggatggaaaa cagagactta c 21
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<213>人工序列
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aaggtcagtg atatggagta g 21
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<211>21
<212>DNA
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<400>19
ccatcctctc tttaagtttg c 21
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<211>21
<212>DNA
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actatgaatt tggggacttc g 21
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agtaaacaca aaactagtca atg 23
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<213>人工序列
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ggaattcata ggtaagatat tac 23
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
aaaatgtact tcagggcttg g 21
Claims (4)
1.一种CYP2C9、CYP2C19基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有：
(1).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，每种微球具有不同颜色编码，anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16中的序列；
(2).针对每种型别的突变分别设计的野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由3’端的针对目的基因突变位点的特异性序列和5’端的tag序列组成，所述tag序列能相应地与(1)中所选的微球上anti-tag序列完全互补配对；所述野生型及突变型特异性序列分别选自：针对CYP2C9 Exon3突变的SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2、针对CYP2C9 Exon7突变的SEQ IDNO.3及SEQ ID NO.4、针对CYP2C19 Exon5突变的SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和/或针对CYP2C19 Exon4突变的SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；
(3).用于扩增出需要检测的与(2)中ASPE引物所对应、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突变位点的目标序列的引物；所述引物为针对CYP2C9 Exon3突变的SEQ ID NO.17及SEQ IDNO.18、针对CYP2C9 Exon7突变的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、针对CYP2C19 Exon5突变的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、和/或针对CYP2C19 Exon4突变的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
2.根据权利要求1所述的CYP2C9、CYP2C19基因突变检测液相芯片，其特征是，包括有：
(1).包被有特异的anti-tag序列的8种微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列分别为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16中的序列；
(2).针对每种型别突变设计的4对野生型和突变型ASPE引物，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因突变位点的特异性序列组成，所述tag序列能分别相应地与(1)中所述微球上anti-tag序列互补配对；所述野生型及突变型特异性序列分别为：SEQID NO.1及SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；
(3)用于扩增出需要检测的、具有CYP2C9和/或CYP2C19基因突变位点的目标序列的引物，所述引物为针对CYP2C9 Exon3突变的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、针对CYP2C9 Exon7突变的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20、针对CYP2C19 Exon5突变的SEQ ID NO.21及SEQ ID NO.22、和针对CYP2C19 Exon4突变的SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24。
3.根据权利要求2所述的CYP2C9、CYP2C19基因突变检测液相芯片，其特征是，所述4对由tag序列和特异性序列组成的特异ASPE引物为：SEQ ID NO.9的互补序列和SEQ ID NO.1组成的引物、及SEQ ID NO.10的互补序列和SEQ ID NO.2组成的引物；SEQ ID NO.11的互补序列和SEQ ID NO.3组成的引物、及SEQ ID NO.12的互补序列和SEQ ID NO.4组成的引物；SEQID NO.13的互补序列和SEQ ID NO.5组成的引物、及SEQ ID NO.14的互补序列和SEQ ID NO.6组成的引物；和SEQ ID NO.15的互补序列和SEQ ID NO.7组成的引物、及SEQ ID NO.16的互补序列和SEQ ID NO.8组成的引物。
4.根据权利要求1-3任一项所述的CYP2C9、CYP2C19基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-30个T。
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