CN102021236B - Agt1r基因snp检测液相芯片和特异性引物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了AGT1R基因SNP检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片主要包括：由5’端的tag序列和3’端的针对SNP位点的特异性引物序列组成的ASPE引物，所述特异性引物序列分别选自：SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4中的序列；微球；扩增引物。所制备的AGT1R基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体地是涉及一种AGT1R基因SNP检测液相芯片和特异性引物。
背景技术
血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rennin-angiotensinaldosterone system，RAAS)中调节血管收缩、维持血容量的主要效应分子，血管紧张素II受体(angiotensin II receptor，ATR)介导Ang II的生理学效应，分为I型血管紧张素II受体(angiotensinII type 1receptor，AT1，AT1R)和II型血管紧张素II受体(AT2R)两种亚型，其中，主要发挥生物学效应的是AT1R，AT1R主要调节Ang II的活性，参与Ang II的缩血管作用和正性肌力作用，包括血管收缩、加压反应、肾小管钠离子转运和醛固酮分泌，是RAAS作用的关键环节。目前，关于AT1R的编码基因AGT1R的多态性研究较多，AGT1R位于染色体3q21-q25区域，包括3个外显子，而且全部编码区都位于第3外显子。目前已经发现了至少50种多态性位点，特别是与严重类型的原发性高血压相关的A1166C(rs5186)多态性位点备受关注，A1163C位于3’非编码区(3’UTR)，A1163C与高血压、大动脉硬化、左心室肥胖、糖尿病性肾病变和缺血性心脏病等发生风险的提高相关，此位点与氯沙坦对肾素水平和肾脏血流动力学的影响相关，A1166C基因型与AA型相比，在小剂量血管紧张素II(Ang II)滴注时，尽管肾血流量也减少但肾小球滤过率不减少。此外，有研究表明，AGTR1基因启动子-153位A被G取代后可能增加原发性高血压患者合并冠心病可能性。AGT1R基因的A-153G(rs275653)位点突变，将使携带-153G等位基因的高血压老年患者(年龄大于55岁)比野生型携带者更大可能患上动脉硬化，而与1166AA野生型携带者相比任何年龄携带1166C等位基因的高血压患者，其患上动脉硬化的几率更大，同时携带1166C和-153G等位基因其患动脉硬化的几率呈相加效应。
目前对AGT1R多态性的检测产品一般是基于PCR技术的PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)及直接测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供AGT1R基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测AGT1R基因两种常见基因型A1166C(rs5186)和/或A-153G(rs275653)的野生型和突变型。
一种AGT1R基因SNP检测液相芯片，包括有：
(1)针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对，每种ASPE引物对由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自：SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4中的序列；
(2)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12中的序列，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(3)用于扩增具有A1166C和/或A-153G SNP位点的AGT1R基因目标序列的引物。
优选地，所述野生型及突变型ASPE引物对选自：针对A1166C SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6组成的序列、和/或针对A-153GSNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8组成的序列。
优选地，所述用于扩增的引物包括：针对A1166C SNP位点的SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14；和/或针对A-153G SNP位点的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
本发明的另一目的是提供AGT1R基因SNP检测的特异性引物，该引物特异性强，能准确区分各种基因型，并且多位点同步检测不存在交叉反应率。
用于AGT1R基因SNP检测的特异性引物，包括有：针对A1166C SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；和/或针对A-153G SNP位点的野生型和突变型的SEQID NO.7和SEQ ID NO.8。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达100％。所制备的AGT1R基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。
3.运用本发明所述的液相芯片的的检测方法步骤简单，两种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成两个含有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1AGT1R基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对AGT1R基因两种常见基因型A1166C和A-153G的野生型和突变型，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1AGT1R的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的特异性引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的4种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的四种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对AGT1R基因两种常见基因型A1166C和A-153G的SNP突变位点，利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出两条含有SNP位点的目标序列。
表3扩增出AGT1R基因中具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2：运用实施例1所述AGT1R基因检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) | Sigma M-2933 | 0.05M | 2.44g |
| 5MNaOH | Fisher SS256-500 | --- | 5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5MNaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计两对引物，多重PCR一步扩增出分别含有AGT1R基因的两种常见基因型A1166C和A-153G的SNP突变位点共两条的目标序列，产物大小分别为336bp和595bp，引物序列(SEQ ID NO.13-16)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.13-16的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测AGT1R基因的两种常见基因型A1166C和A-153G SNP位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为：96℃2min；94℃30s，54℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的AGT1R基因SNP位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的AGT1R基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的AGT1R基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出AGT1R的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本AGT1R基因突变比值(％)
表6 样本AGT1R基因突变类型分析结果
| 样本号 | 液相芯片检测结果 | 测序结果 |
| A1166C | A-153G | A1166C | A-153G | |
| 1 | AA | AA | AA | AA |
| 2 | AA | AA | AA | AA |
| 3 | AA | AA | AA | AA |
| 4 | AA | AA | AA | AA |
| 5 | AA | AA | AA | AA |
| 6 | AA | AA | AA | AA |
| 7 | AA | AA | AA | AA |
| 8 | AA | AA | AA | AA |
| 9 | CC | AA | CC | AA |
| 10 | AA | AA | AA | AA |
| 11 | AA | AA | AA | AA |
| 12 | AA | AA | AA | AA |
| 13 | AA | AA | AA | AA |
| 14 | AA | AA | AA | AA |
| 15 | AA | AA | AA | AA |
| 16 | AA | AG | AA | AG |
| 17 | AA | AA | AA | AA |
| 18 | AA | AA | AA | AA |
| 19 | AA | AA | AA | AA |
| 20 | AA | AA | AA | AA |
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对AGT1R基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(TAg序列及Anti-Tag序列的选择)
以AGT1R基因A1166C位点突变检测液相芯片为例，分别针对A1166C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8 样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例4不同间隔臂液相芯片对AGT1R基因SNP检测
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)
以AGT1R基因A1166C位点突变的检测液相芯片为例，探明不同的间隔臂液相芯片对AGT1R基因SNP检测的影响。针对A1166C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。探明不同的间隔臂液相芯片对AGT1R基因SNP检测的影响，其中，不同的间隔臂为(CH2)12或5-10个T，具体设计如下表(表10)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表10 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：
表11 样本检测结果与基因多态性分析
实施例4的间隔臂为(CH2)12的液相芯片，其检测结果稳定可靠(其它间隔臂的检测结果也如此，具体数据省略)，而优选5-10个T的间隔臂的杂交反应率和杂交特异性均优于间隔臂为(CH2)12的液相芯片，本发明所采用的5-10个T的间隔臂均优于其他间隔臂。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>AGT1R基因SNP检测液相芯片和特异性引物
<160>16
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tcatttcaca attcaattac tcaa 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aatctacaaa tccaataatc tcat 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttactcaaaa tctacacttt ttca 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caattcattt cattcacaat caat 24
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
acttcactac caaatgagca 20
<210>6
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
acttcactac caaatgagcc 20
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<211>20
<212>DNA
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atcatccttg ctgccgtcaa 20
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<211>20
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atcatccttg ctgccgtcag 20
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<400>9
ttgagtaatt gaattgtgaa atga 24
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atgagattat tggatttgta gatt 24
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<400>11
tgaaaaagtg tagattttga gtaa 24
<210>12
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<400>12
attgattgtg aatgaaatga attg 24
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
caaatcccac tcaaaccttt c 21
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<211>20
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<400>14
gcagccgtca tctgtctaat 20
<210>15
<211>19
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<213>人工序列
<400>15
gaatctccgc aggaaatga 19
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ccagcagtta ggacaccgt 19
Claims (5)
1.一种AGT1R基因SNP检测液相芯片，其特征在于：主要包括有：
(1)针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对，每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别选自：SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4中的序列；
(2)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12中的序列，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(3)用于扩增具有A1166C和/或A-153G SNP位点的AGT1R基因目标序列的引物；所述用于扩增的引物包括：针对A1166C SNP位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；和/或针对A-153GSNP位点的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
2.根据权利要求1所述的AGT1R基因SNP检测液相芯片，其特征在于：所述野生型及突变型ASPE引物对选自：针对A1166C SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6组成的序列、和/或针对A-153G SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQID NO.7组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8组成的序列。
3.根据权利要求1所述的AGT1R基因SNP检测液相芯片，其特征在于：主要包括有：
(1)所述野生型及突变型ASPE引物对为：针对A1166C SNP位点的由SEQ IDNO.1和SEQ IDNO.5组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6组成的序列；和针对A-153G SNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8组成的序列；
(2)分别包被有特异的anti-tag序列的微球，所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对；所述anti-tag序列为SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12中的序列，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(3)用于扩增的引物包括：针对A1166C SNP位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；和针对A-153G SNP位点的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
4.根据权利要求1-3任一项所述的AGT1R基因SNP检测液相芯片，其特征在于：所述间隔臂序列为5-10个T。
5.用于AGT1R基因SNP检测的特异性引物，其特征在于：该特异性引物为：针对A1166C SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；和/或针对A-153G SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8。
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