发明内容
本发明的目的之一是提供AGT1R基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测AGT1R基因两种常见基因型A1166C(rs5186)和/或A-153G(rs275653)的野生型和突变型。
一种AGT1R基因SNP检测液相芯片,包括有:
(1)针对每种型别的SNP位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对,每种ASPE引物对由5’端的tag序列和3’端的针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成,所述特异性引物序列分别选自:SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6、和/或SEQ ID NO.7及SEQ ID NO.8;所述tag序列选自SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.4中的序列;
(2)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球,所述anti-tag序列能相应地与(1)中所选tag序列互补配对,所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.12中的序列,且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列;
(3)用于扩增具有A1166C和/或A-153G SNP位点的AGT1R基因目标序列的引物。
优选地,所述野生型及突变型ASPE引物对选自:针对A1166C SNP位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6组成的序列、和/或针对A-153GSNP位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.7组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.8组成的序列。
优选地,所述用于扩增的引物包括:针对A1166C SNP位点的SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14;和/或针对A-153G SNP位点的SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
本发明的另一目的是提供AGT1R基因SNP检测的特异性引物,该引物特异性强,能准确区分各种基因型,并且多位点同步检测不存在交叉反应率。
用于AGT1R基因SNP检测的特异性引物,包括有:针对A1166C SNP位点的野生型和突变型的SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;和/或针对A-153G SNP位点的野生型和突变型的SEQID NO.7和SEQ ID NO.8。
本发明的主要优点在于:
1.本发明所提供的液相芯片与测序法的检测结果吻合率高达100%。所制备的AGT1R基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比,并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应,tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合,能够避免交叉反应,实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性,能准确区分各种型别的基因型。
3.运用本发明所述的液相芯片的的检测方法步骤简单,两种SNPs检测可通过一步多重PCR即可完成两个含有SNP位点的目标序列的扩增,避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素,因而可大大提高检测准确率,体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明所提供的检测方法所需要的时间远远低于常用的测序技术,特别符合实际应用需要。
5.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高,检测结果的可重复性差的缺陷,同时对现有的液相芯片技术进行改进,使得所制备微球能适用于不同的检测项目,具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高,从而使得检测的灵敏度进一步得到提高,信噪比增强,检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1AGT1R基因SNP检测液相芯片,主要包括有:
一、ASPE引物
针对AGT1R基因两种常见基因型A1166C和A-153G的野生型和突变型,分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示:
表1AGT1R的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分,5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列,3’端为突变型或野生型特异的特异性引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段,选择tag序列,最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构,选择的4种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示:
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的四种微球购自美国Luminex公司,将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列,即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列,anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列,可减少空间位阻,提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT,即poly(dT),寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(≥3),如(CH2)12、(CH2)18等。另外,如果存在poly(dA)干扰,还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T,微球包被的过程如下:
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5),加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液,恒温孵育30分钟,再加入2.5ul的EDC工作液,再恒温孵育30分钟。反应结束后,用0.02%的Tween-20洗涤一次,再用0.1%的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)],1mmol/LEDTA中,2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对AGT1R基因两种常见基因型A1166C和A-153G的SNP突变位点,利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3),分别扩增出两条含有SNP位点的目标序列。
表3扩增出AGT1R基因中具有SNP位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2:运用实施例1所述AGT1R基因检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下:
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml):
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
MES(2[N-Morpholino]ethanesulfonic acid) |
Sigma M-2933 |
0.05M |
2.44g |
5MNaOH |
Fisher SS256-500 |
--- |
5滴 |
2×Tm杂交缓冲液
试剂 |
来源 |
终浓度 |
每250ml的用量 |
1MTris-HCl,pH8.0 |
SigmaT3038 |
0.2M |
50ml |
5MNaCl |
Sigma S5150 |
0.4M |
20ml |
Triton X-100 |
Sigma T8787 |
0.16% |
0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取:
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法,得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计两对引物,多重PCR一步扩增出分别含有AGT1R基因的两种常见基因型A1166C和A-153G的SNP突变位点共两条的目标序列,产物大小分别为336bp和595bp,引物序列(SEQ ID NO.13-16)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液:分别各取SEQ ID NO.13-16的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中,混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下:
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为:95℃3min;94℃30s,56℃30s,72℃40s,30个循环;72℃10min;4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物,加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶;
2.37℃孵育15min,80℃孵育15min,灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应,在反应过程中掺入生物素标记的dCTP,从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液:分别取待检测AGT1R基因的两种常见基因型A1166C和A-153G SNP位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中,加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul,混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下:
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为:96℃2min;94℃30s,54℃1min,72℃2min,30个循环;4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物,每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)。每种微球分别带有不同颜色编码,同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag),这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合;
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中;
3.微球于≥10000g离心1-2min;
4.弃去上清,微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中,涡旋混匀;
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中,对照孔加25ul的ddH2O;
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中,用ddH2O补足至50ul;
7.用锡箔纸包住96孔板以避光,95℃60s,37℃15min孵育杂交;
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min;
9.去上清,将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中;
10.微球于≥3000g离心2-5min;
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中,加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE);
12.37℃孵育15min,于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求:
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI;
2.NET MFI=样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示);
3.满足以上两个条件的数据,按下列公式计算突变比值:
突变比值=突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值),以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的AGT1R基因SNP位点,实验数据符合上述要求,因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下:突变比值范围在0%-20%视为野生型纯合子;30%-70%视为杂合子;80%-100%视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照,计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的AGT1R基因型检测结果与测序结果吻合率达到100%。可见本发明所提供的AGT1R基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出AGT1R的SNP类型,且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本AGT1R基因突变比值(%)
表6 样本AGT1R基因突变类型分析结果
|
A1166C |
A-153G |
A1166C |
A-153G |
1 |
AA |
AA |
AA |
AA |
2 |
AA |
AA |
AA |
AA |
3 |
AA |
AA |
AA |
AA |
4 |
AA |
AA |
AA |
AA |
5 |
AA |
AA |
AA |
AA |
6 |
AA |
AA |
AA |
AA |
7 |
AA |
AA |
AA |
AA |
8 |
AA |
AA |
AA |
AA |
9 |
CC |
AA |
CC |
AA |
10 |
AA |
AA |
AA |
AA |
11 |
AA |
AA |
AA |
AA |
12 |
AA |
AA |
AA |
AA |
13 |
AA |
AA |
AA |
AA |
14 |
AA |
AA |
AA |
AA |
15 |
AA |
AA |
AA |
AA |
16 |
AA |
AG |
AA |
AG |
17 |
AA |
AA |
AA |
AA |
18 |
AA |
AA |
AA |
AA |
19 |
AA |
AA |
AA |
AA |
20 |
AA |
AA |
AA |
AA |
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对AGT1R基因SNP位点的检测
一、液相芯片制备的设计(TAg序列及Anti-Tag序列的选择)
以AGT1R基因A1166C位点突变检测液相芯片为例,分别针对A1166C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列,而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.4,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.12。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测,检测结果如下:
表8 样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的SNP位点的液相芯片,ASPE引物运用不同的Tag序列,其结果依然稳定可靠,具体数据省略。
实施例4不同间隔臂液相芯片对AGT1R基因SNP检测
一、液相芯片制备的设计(间隔臂的选择)
以AGT1R基因A1166C位点突变的检测液相芯片为例,探明不同的间隔臂液相芯片对AGT1R基因SNP检测的影响。针对A1166C的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列,而ASPE引物5’端的Tag序列则分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2,相应的,包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。探明不同的间隔臂液相芯片对AGT1R基因SNP检测的影响,其中,不同的间隔臂为(CH2)12或5-10个T,具体设计如下表(表10)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表10 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片,按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测,检测结果如下:
表11 样本检测结果与基因多态性分析
实施例4的间隔臂为(CH2)12的液相芯片,其检测结果稳定可靠(其它间隔臂的检测结果也如此,具体数据省略),而优选5-10个T的间隔臂的杂交反应率和杂交特异性均优于间隔臂为(CH2)12的液相芯片,本发明所采用的5-10个T的间隔臂均优于其他间隔臂。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明,但该实施例并非用以限制本发明的专利范围,凡未脱离本发明的等效实施或变更,均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>AGT1R基因SNP检测液相芯片和特异性引物
<160>16
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
tcatttcaca attcaattac tcaa 24
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
aatctacaaa tccaataatc tcat 24
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ttactcaaaa tctacacttt ttca 24
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
caattcattt cattcacaat caat 24
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
acttcactac caaatgagca 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
acttcactac caaatgagcc 20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
atcatccttg ctgccgtcaa 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
atcatccttg ctgccgtcag 20
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ttgagtaatt gaattgtgaa atga 24
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
atgagattat tggatttgta gatt 24
<210>11
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
tgaaaaagtg tagattttga gtaa 24
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
attgattgtg aatgaaatga attg 24
<210>13
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
caaatcccac tcaaaccttt c 21
<210>14
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gcagccgtca tctgtctaat 20
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gaatctccgc aggaaatga 19
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<213>人工序列
<400>16
ccagcagtta ggacaccgt 19