CN102021240B

CN102021240B - 一种gstm1、gstt1和gstp1基因突变检测液相芯片

Info

Publication number: CN102021240B
Application number: CN 201010292633
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 刘志明
Original assignee: Guangzhou Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2010-09-21
Filing date: 2010-09-21
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2030-09-21
Also published as: CN102021240A

Abstract

本发明公开了一种GSTP1基因突变检测液相芯片，主要包括有：由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物是：针对A313G突变位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、和针对C341T突变位点的SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；扩增引物。本发明所制备的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

Description

一种GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种GSTM1、GSTT1和GSTP1基因检测液相芯片。

背景技术

谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S transferases，GSTs)是一个多功能的二相代谢酶家族，主要催化GSH(还原型谷胱甘肽)与亲电子化合物间的结合反应，使后者失去结合机体DNA的活性，它是细胞抗损伤，抗癌变的主要解毒系统。另外，GSTs还可以和一些配体如胆红素、甾族化合物等结合，参与人体的生理反应。肿瘤细胞通过表达GSTs来保护自身不受化疗药物的伤害，而基因突变可改变GSTs的活性，从而改变药物的药动力学特征。近年来，GSTs与肿瘤和化疗、GSTs与其他严重疾病之间的关系已引起了研究者的注意。

按照染色体定位和序列同源性，迄今为止，已发现了8种GSTs，研究较多的主要有GSTM，GSTP，GSTT亚家族。其中，谷胱苷肽S转移酶M1(GSTM1)定位于染色体1P13.3，主要对多环芳烃类，乙烯环氧化物，苯乙烯等的中间产物进行代谢，存在GSTM1a、GSTM1b和null三个等位基因，null等位基因即整个基因的缺失，其个体在肝脏中不能表达GSTM。GSTM的null基因型在不同种族人群中的频率范围变动很大，非洲人为23％～48％，亚洲人为33％～63％，欧洲人为39％～62％，美国人群为23％～62％。此外，谷胱苷肽S转移酶T1(GSTT1)基因缺失也是研究的热点。人谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)是细胞内降解生物异源物质的一组超家族同工酶GSTs中的一个重要的亚型，能催化谷胱甘肽与亲电子物质发生反应，在肺脏中的含量尤其丰富，是肺脏中重要的解毒酶，对芳香族化合物具有较高降解性，在预防肿瘤发生的过程中起重要作用，但同时也是肿瘤细胞对化疗药物耐受的原因，研究表明，GSTP1基因的多态性位点A313G和C341T与肿瘤的耐药性相关。

目前对GSTM1、GSTT1和GSTP1多态性的检测产品一般是基于PCR技术的多重PCR、PCR-RFLP、实时荧光定量PCR和DNA测序法等，存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种GSTP1基因突变检测液相芯片，该液相芯片可用于检测GSTP1基因两种常见基因型A313G和C341T的野生型和突变型。

实现上述目的的技术方案如下：

一种GSTP1突变检测液相芯片，主要包括有：

(A)针对GSTP1基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对A313G突变位点的SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、和针对C341T突变位点的SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；

(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO.15～SEQ ID NO.20中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)用于扩增出具有A313G和/或C341T的突变位点的GSTP1基因目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和SEQ ID NO.27及SEQ IDNO.28。

进一步地，本发明还提供了一种除GSTP1基因外，还包括GSTM1和/或GSTT1基因突变检测的液相芯片，其具体组成如下：

(A)还包括有针对GSTM1和/或GSTT1基因的缺失区域，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对突变位点的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对GSTM1基因缺失区域的SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8、和/或针对GSTT1基因缺失区域的SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10；相应的所述tag序列选自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.6；

(B)还包括有分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.20中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)还包括有用于扩增出具有GSTM1和/或GSTT1的突变区域的目标序列的扩增引物。

优选地，所述扩增引物为：针对GSTM1基因突变位点的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、和/或针对GSTT1基因突变位点的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。

优选地，所述间隔臂序列为5-10个T。

本发明的主要优点在于：

1.本发明所提供的液相芯片，其与测序法得到的检测结果吻合率高达100％。所制备的GSTP1基因突变检测液相芯片，以及GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片都具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测。

2.本发明设计的ASPE型特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型。

3.本发明的所述液相芯片的检测方法步骤简单，四种基因多态性(包括两种缺失型和两种单核苷酸突变型)检测可通过一步多重PCR即可完成的目标序列的扩增(如果GSTM1、GSTT1为基因缺失纯合子，则没有扩增条带)，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。

4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。

具体实施方式

实施例1

GSTM1、GSTT1和GSTP1基因多态性检测液相芯片，主要包括有：

一、ASPE引物

针对GSTM1和GSTT1基因缺失型、GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val，rs1695)和C341T突变(Ala114Val，rs1138272)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：

表1ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)

每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。

二、anti-tag序列包被的微球

根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的6种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：

表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列

选择的六种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH₂O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：

分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。

三、扩增出目标检测序列的引物

针对GSTM1和GSTT1基因缺失型、GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val，rs1695)和C341T突变(Ala114Val，rs1138272)，利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出目标序列，当GSTM1和GSTT1基因为缺失型纯合子，则没有相应扩增条带，当GSTM1和GSTT1为缺失型杂合子或野生型的时候，则有相应的扩增条带。

表3扩增出具有多态性位点的目标序列的引物

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L TrisBuffer配制成100pmol/mL的贮存液。

实施例2运用GSTM1、GSTT1和GSTP1基因检测液相芯片对样本的检测

所述各种溶液的配方如下：

50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

2×Tm杂交缓冲液

试剂	来源	终浓度	每250ml的用量
				1MTris-HCl，pH8.0	SigmaT3038	0.2M	50ml
5MNaCl	Sigma S5150	0.4M	20ml
				Triton X-100	Sigma T8787	0.16％	0.4ml

过滤后贮存于4℃。

ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。

生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

一、样本的DNA提取：

参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。

二、待测样品的PCR扩增

利用Primer5.0设计四对引物，多重PCR一步扩增出分别含有GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val，rs1695)和C341T突变(Ala114Val，rs1138272)的目标序列，产物大小分别为315bp和269bp；针对GSTM1和GSTT1基因缺失型，当GSTM1和GSTT1基因为缺失型纯合子，则没有相应扩增条带，当GSTM1和GSTT1为缺失型杂合子或野生型的时候，则有相应的扩增条带，产物大小分别为219bp和511bp，引物序列(SEQ ID NO.21-28)见上述表3所示。

首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.21-28的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：

2×缓冲液(含Mg²⁺) 25ul

dNTP(各2.5mmol/L) 4ul

Taq酶(5U/ul) 0.2ul

多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul

模板DNA(10ng/ul) 2ul

ddH₂O 12.8ul

共 50ul

PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。

三、PCR产物的酶切处理

1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；

2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。

四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)

利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。

首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。其中，ASPE引物分别为：

ASPE反应的体系如下：

10×缓冲液 2ul

MgCl₂(50mmol/L) 0.5ul

Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul

dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul

Tsp酶(5U/ul) 0.25ul

混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul

酶切处理的PCR扩增产物 5ul

ddH₂O 10ul

共 20ul

反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。

五、杂交反应

1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×10⁵个/ml)；

2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；

3.微球于≥10000g离心1-2min；

4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；

5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH₂O；

6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH₂O补足至50ul；

7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；

8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；

9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；

10.微球于≥3000g离心2-5min

11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；

12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。

六、结果检测与数据分析

反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。

针对GSTP1基因的A313G突变(Ile105Val)和C341T突变(Ala114Val)，对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：

1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；

2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；

3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：

突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)

4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。

针对GSTM1和GSTT1基因缺失型，当NET MFI值小于100，GSTM1和GSTT1基因为缺失型纯合子；当NET MFI值大于100，GSTM1和GSTT1为缺失型杂合子或野生型。

使用本方法检测20份样本的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因的多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。其中，GSTP1阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变检测液相芯片能够准确地检测出GSTM1、GSTT1和GSTP1基因类型，且结果稳定可靠。

表4样本检测结果(MFI)

表5样本GSTM1、GSTT1和GSTP1基因

表6样本GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变类型分析结果

实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对GSTM1、GSTT1和GSTP1基因突变的检测

一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)

以GSTP1基因A313G位点突变检测液相芯片为例，分别针对A313G的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.15～SEQID NO.20。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表7液相芯片制备的设计

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：

表8样本检测结果与基因多态性分析

其它针对不同的多态性目标检测位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，而ASPE引物选用实施例2中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳，具体数据省略。

实施例4不同的ASPE引物的液相芯片对GSTM1、GSTT1基因多态性的检测

一、液相芯片制备的设计(GSTM1、GSTT1基因缺失检测特异性引物序列的选择)

以GSTM1和GSTT1基因缺失检测液相芯片为例，ASPE引物5’端的Tag序列分别为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列分别为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16；分别针对GSTM1和GSTT1基因缺失区域设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，其中，针对GSTM1基因缺失的特异性引物序列选自SEQ ID NO.7～SEQ IDNO.8，针对GSTT1基因缺失的特异性引物序列选自SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10，具体设计如下表(表9)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。

表9液相芯片制备的设计

二、样品检测

采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品41-60进行检测，检测结果如下：

表10样本检测结果与基因多态性分析

表11样本检测结果与基因多态性分析

其它针对GSTM1、GSTT1基因缺失的液相芯片，ASPE引物运用不同的特异性引物序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims

1.一种GSTP1基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有：

(C)用于扩增具有A313G和C341T的突变位点的GSTP1基因目标序列的扩增引物；所述扩增引物为SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28。

2.根据权利要求1所述的GSTP1基因突变检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为：针对GSTP1基因A313G突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列，及由SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.12组成的序列；和针对GSTP1基因C341T突变位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列，及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.4组成的序列。

3.根据权利要求1所述的GSTP1基因突变检测液相芯片，其特征是，还包括有：(A)针对GSTM1和/或GSTT1基因的缺失突变，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对缺失区域的特异性引物组成，所述特异性引物是：针对GSTM1基因缺失区域的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8中的至少一种、和/或针对GSTT1基因缺失区域的SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10中的至少一种；相应的所述tag序列选自SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.6；

(B)针对GSTM1和/或GSTT1基因的分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.15～SEQ ID NO.20中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；

(C)用于扩增出具有GSTM1和/或GSTT1的突变区域的目标序列的扩增引物；所述扩增引物为：针对GSTM1基因突变区域的SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22、和/或针对GSTT1基因突变区域的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。

4.根据权利要求3所述的GSTP1基因突变检测液相芯片，其特征是，其组成为：

A)ASPE引物：针对GSTP1基因A313G突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列，及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列、和针对GSTP1基因C341T突变位点的由SEQ IF NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列，及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序列；针对GSTM1基因缺失突变的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7组成的序列或由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8组成的序列；和针对GSTT1基因缺失突变的由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.9组成的序列或由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列；

(C)分别用于扩增具有GSTP1基因突变位点、GSTM1和GSTT1突变区域的目标序列的扩增引物；所述扩增引物为：所述扩增引物为：SEQ IF NO.21及SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23及SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、和SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28。

5.根据权利要求1-4任一项所述的GSTP1基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。