CN101984071A - 一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，所述液相芯片包括针对每种突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对、分别包被有特异的anti-tag序列的微球，和用于分别扩增具有M244V、L248V、D276G、G250E、Y253F/H、E255K/V、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、和/或F486S突变位点的Bcr-Abl基因目标序列的引物。所制备的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应。本发明设计的ASPE引物具有非常好的特异性，能准确区分各种类型的突变位点。所述检测方法步骤简单，16种突变位点可以一步检测完成，操作方便，并且避免了多次操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片。
背景技术
Bcr-Abl融合基因是人体细胞第9号染色体上的Abl原癌基因与第22号染色体上的Bcr基因相互易位形成的融合基因。此基因产生一种新的mRNA，编码的蛋白为P210，P210可引起蛋白激酶持续性激活，使白细胞过分增殖而出现慢性粒细胞白血病(CML)。酪氨酸激酶在CML的发生中起了关键作用，抑制其活性成分成为CML治疗的一个新途径。治疗CML的一线药物伊马替尼就是一种特异的Abl酪氨酸激酶抑制剂，它能选择性地结合于Bcr-Abl受体，阻止磷酸基团从三磷酸腺苷向蛋白质底物的转移，使之不能催化底物酪氨酸残基的磷酸化而激活下游效应分子的信号转导，从而抑制细胞增殖而诱导细胞凋亡。
研究表明，Bcr-Abl基因突变可使CML患者对伊马替尼产生继发性耐药，其中，耐药性最强的突变位点主要有T315I突变和P-环簇突变中的Y253F/H、E255K/V、G250E、F486S，具有这些突变类型患者的生存期较其他突变类型显著降低；而其他位点M244V、L248V、D276G、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R等耐药程度不高，可以通过提高剂量来抵抗耐药。
目前对Bcr-Abl的检测产品一般是基于PCR技术的荧光定量PCR法、FRET法和DNA测序法等，存在样品易污染、假阳性率高、灵敏度低等缺点，同时由于检测通量的局限性，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，该液相芯片用于检测Bcr-Abl基因的M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255K/V、D276G、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R和F486S的野生型和突变型。
一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，主要包括有：
(A)针对Bcr-Abl基因每种突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自：SEQ ID NO.32及SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36及SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38及SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44及SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46及SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52及SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54及SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58及SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、和SEQ ID NO.61及SEQ ID NO.62中的一对或多对；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.31中的序列；
(B).分别包被有特异的anti-tag序列、每种微球具有不同颜色编码的微球；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.63～SEQ ID NO.93中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C).用于扩增具有M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255K/V、D276G、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、和F486S中的一个或多个突变位点的Bcr-Abl基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为：针对M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K和D276G突变位点的SEQ ID NO.94及SEQ ID NO.95、针对T315I、F317L、E355G、F359V、V379I和H396P/R突变位点的SEQ ID NO.96及SEQ ID NO.97、和针对F486S突变位点的SEQ ID NO.98及SEQ ID NO.99中的一对或多对。
优选地，所述ASPE引物对为：针对M244V突变位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.32组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.33组成的序列；针对L248V突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.34组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.35组成的序列；针对G250E突变位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.36组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.37组成的序列；针对Y253F/H突变位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.38组成的序列、由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.40组成的序列；针对E255K/V突变位点的由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.41组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.42组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.43组成的序列；针对D276G突变位点的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.44组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.45组成的序列；针对T315I突变位点的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.46组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.47组成的序列；针对F317L突变位点的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.48组成的序列、由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.49组成的序列、由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.50组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.51组成的序列；针对E355G突变位点的由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.52组成的序列及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.53组成的序列；针对F359V突变位点的由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.54组成的序列及由SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.56组成的序列及由SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.57组成的序列；针对H396P/R突变位点的由SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.58组成的序列、由SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.59组成的序列及由SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.60组成的序列；和/或针对F486S突变位点的由SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.61组成的序列及由SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.62组成的序列中的一对或多对。
优选地，所述液相芯片主要包括有：
(A)ASPE引物对为：针对M244V突变位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.32组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.33组成的序列；针对L248V突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.34组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.35组成的序列；针对G250E突变位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.36组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.37组成的序列；针对Y253F/H突变位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.38组成的序列、由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.40组成的序列；针对E255K/V突变位点的由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.41组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.42组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.43组成的序列；针对D276G突变位点的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.44组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.45组成的序列；针对T315I突变位点的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.46组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.47组成的序列；针对F317L突变位点的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.48组成的序列、由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.49组成的序列、由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.50组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.51组成的序列；针对E355G突变位点的由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.52组成的序列及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.53组成的序列；针对F359V突变位点的由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.54组成的序列及由SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.56组成的序列及由SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.57组成的序列；针对H396P/R突变位点的由SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.58组成的序列、由SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.59组成的序列及由SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.60组成的序列；以及针对F486S突变位点的由SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.61组成的序列及由SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.62组成的序列；
(B).分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.63～SEQ ID NO.93中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C).扩增引物为：针对M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K和D276G突变位点的SEQ ID NO.94及SEQ ID NO.95、针对T315I、F317L、E355G、F359V、V379I和H396P/R突变位点的SEQ ID NO.96及SEQ ID NO.97、和针对F486S突变位点的SEQ ID NO.98及SEQ ID NO.99。
优选地，所述间隔臂序列为5-10个T。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明所提供的液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片具有很好的信号-噪声比，并且所涉及的探针以及anti-TAG序列之间基本上不存在交叉反应，TAG标签序列、anti-TAG标签序列的选取以及TAG标签序列与具体ASPE引物的结合，均能够避免交叉反应，实现多个突变位点的并行检测；
(2)本发明设计的ASPE特异引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型号的基因型；
(3)本发明的检测方法步骤简单，16种突变检测可通过一步多重PCR即可完成含有16个突变位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测的准确率，同时能够定性、定量分析的特征；
(4)本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备的微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性，检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对Bcr-Abl基因的16种常见突变位点M244V、L248V、D276G、G250E、Y253F/H、E255K/V、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、F486S，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/LTris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的31种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的31种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被于微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/mL的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50μL 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10μL合成的anti-tag分子(100nmol/mL)。配制10ng/mL的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5μL的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5μL的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100μL的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对Bcr-Abl基因的16种常见突变位点M244V、L248V、D276G、G250E、Y253F/H、E255K/V、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、F486S，分别利用Primer5.0设计扩增引物对(见表3)，分别扩增出三条含有突变位点的目标序列。
表3扩增出具有突变位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2实施例1所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250mL)：
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250mL的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50mL |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20mL |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4mL |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计三对引物，多重PCR一步扩增出分别针对Bcr-Abl基因的16种常见突变位点M244V、L248V、D276G、G250E、Y253F/H、E255K/V；T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R；F486S，共3条目标序列，产物大小分别为389bp、397bp、299bp，引物序列(SEQ ID NO.94-99)见表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ.94-99的引物贮存液100μL于1.5mL微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25μL
dNTP(各2.5mmol/L) 4μL
Taq酶(5U/μL) 0.2μL
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6μL
模板DNA(10ng/μL) 2μL
ddH2O 12.8μL
共 50μL
PCR扩增程序为：95℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃40s，30个循环；72℃10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5μL PCR反应后的产物，加入1μL 10×SAP缓冲液、1μLSAP酶和0.5μL Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测Bcr-Abl基因的突变位点相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10μL于1.5mL微量离心管中，加入10mmol/LTris Buffer补至200μL，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。
ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2μL
MgCl2(50mmol/L) 0.5μL
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25μL
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100μmol/L) 1μL
Tsp酶(5U/μL) 0.25μL
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1μL
酶切处理的PCR扩增产物 5μL
ddH2O 10μL
共 20μL
反应程序为：96℃2min；94℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的最优微球(微球浓度均为2.5×105个/mL)。每种微球分别带有不同颜色编码，同时每种微球表面分别连接有一段24bp的特异性的寡核苷酸序列(anti-tag)，这些anti-tag序列能分别与对应的ASPE引物5’端的tag序列特异结合；
2.分别取1μL每种编号的微球于1.5mL的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100μL的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25μL上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25μL的ddH2O；
6.取5-25μL的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50μL；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75μL的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75μL的1×Tm杂交缓冲液中，加入15μL浓度为10μg/mL的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以突变型检测荧光值(MFI)100为cut-off值，当检测的MFI值大于cut-off值时，判定该样本为存在相应的突变，否则判定该样本为野生型，检测结果如表4、表5和表6所示。
使用本方法检测大量样本的Bcr-Abl基因突变，以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的Bcr-Abl基因突变检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片能够准确地检测出Bcr-Abl基因的突变类型，且结果稳定可靠。
表6样本Bcr-Abl基因突变类型分析结果
| 样本序号 | 液相芯片检测结果 | 测序结果 |
| 1 | 野生型 | 野生型 |
| 2 | F486S突变 | F486S突变 |
| 3 | E255V、F317L突变 | E255V、F317L突变 |
| 4 | 野生型 | 野生型 |
| 5 | 野生型 | 野生型 |
| 6 | Y253H、V379I突变 | Y253H、V379I突变 |
| 7 | 野生型 | 野生型 |
| 8 | 野生型 | 野生型 |
| 9 | M244V突变 | M244V突变 |
| 10 | 野生型 | 野生型 |
| 11 | 野生型 | 野生型 |
| 12 | T315I突变 | T315I突变 |
| 13 | 野生型 | 野生型 |
| 14 | 野生型 | 野生型 |
| 15 | H396P突变 | H396P突变 |
| 16 | 野生型 | 野生型 |
| 17 | L248V突变 | L248V突变 |
| 18 | F359V突变 | F359V突变 |
| 19 | 野生型 | 野生型 |
| 20 | 野生型 | 野生型 |
实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对Bcr-Abl基因突变位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以Bcr-Abl基因M244V位点突变检测液相芯片为例，分别针对M244的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.31，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.63-SEQ ID NO.93。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳，参见本实施例试验组1。其它不同tag序列与特异性引物序列的搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (5)
1.一种Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，主要包括有：
(A)针对Bcr-Abl基因每种突变位点分别设计的野生型和突变型ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列选自：SEQ ID NO.32及SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34及SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36及SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38及SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41及SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44及SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46及SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48及SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52及SEQ ID NO.53、SEQ ID NO.54及SEQ ID NO.55、SEQ ID NO.56及SEQ ID NO.57、SEQ ID NO.58及SEQ ID NO.59和SEQ ID NO.60、和SEQ ID NO.61及SEQ ID NO.62中的一对或多对；所述tag序列选自SEQ IDNO.1～SEQ IDNO.31中的序列；
(B).分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.63～SEQ ID NO.93中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C).用于扩增具有M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255K/V、D276G、T315I、F317L、E355G、F359V、V379I、H396P/R、和F486S中的一个或多个突变位点的Bcr-Abl基因目标序列的扩增引物。
2.根据权利要求1所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述扩增引物为：针对M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K和D276G突变位点的SEQ ID NO.94及SEQ ID NO.95、针对T315I、F317L、E355G、F359V、V379I和H396P/R突变位点的SEQ ID NO.96及SEQ ID NO.97、和针对F486S突变位点的SEQ ID NO.98及SEQ ID NO.99中的一对或多对。
3.根据权利要求1或2所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，所述ASPE引物对为：针对M244V突变位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.32组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.33组成的序列；针对L248V突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.34组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.35组成的序列；针对G250E突变位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.36组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.37组成的序列；针对Y253F/H突变位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.38组成的序列、由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.40组成的序列；针对E255K/V突变位点的由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.41组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.42组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.43组成的序列；针对D276G突变位点的由SEQ ID NO.13和SEQID NO.44组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.45组成的序列；针对T315I突变位点的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.46组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.47组成的序列；针对F317L突变位点的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.48组成的序列、由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.49组成的序列、由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.50组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.51组成的序列；针对E355G突变位点的由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.52组成的序列及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.53组成的序列；针对F359V突变位点的由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.54组成的序列及由SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.56组成的序列及由SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.57组成的序列；针对H396P/R突变位点的由SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.58组成的序列、由SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.59组成的序列及由SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.60组成的序列；和/或针对F486S突变位点的由SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.61组成的序列及由SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.62组成的序列中的一对或多对。
4.根据权利要求3所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征在于，主要包括有：
(A)ASPE引物对为：针对M244V突变位点的由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.32组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.33组成的序列；针对L248V突变位点的由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.34组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.35组成的序列；针对G250E突变位点的由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.36组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.37组成的序列；针对Y253F/H突变位点的由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.38组成的序列、由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.39组成的序列及由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.40组成的序列；针对E255K/V突变位点的由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.41组成的序列、由SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.42组成的序列及由SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.43组成的序列；针对D276G突变位点的由SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.44组成的序列及由SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.45组成的序列；针对T315I突变位点的由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.46组成的序列及由SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.47组成的序列；针对F317L突变位点的由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.48组成的序列、由SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.49组成的序列、由SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.50组成的序列及由SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.51组成的序列；针对E355G突变位点的由SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.52组成的序列及由SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.53组成的序列；针对F359V突变位点的由SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.54组成的序列及由SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.55组成的序列；针对V379I突变位点的由SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.56组成的序列及由SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.57组成的序列；针对H396P/R突变位点的由SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.58组成的序列、由SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.59组成的序列及由SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.60组成的序列；以及针对F486S突变位点的由SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.61组成的序列及由SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.62组成的序列；
(B).分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.63～SEQ ID NO.93中的序列，所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对，且所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；
(C).扩增引物为：针对M244V、L248V、G250E、Y253F/H、E255V/K和D276G突变位点的SEQ ID NO.94及SEQ ID NO.95、针对T315I、F317L、E355G、F359V、V379I和H396P/R突变位点的SEQ ID NO.96及SEQ ID NO.97、和针对F486S突变位点的SEQ ID NO.98及SEQ ID NO.99。
5.根据权利要求1所述的Bcr-Abl基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为5-10个T。
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