CN102559852B - 一种agt和ace基因多态性检测特异性引物和液相芯片 - Google Patents
一种agt和ace基因多态性检测特异性引物和液相芯片 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种AGT和ACE基因多态性检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片主要包括有：由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物分别为：针对AGT基因的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11及SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和/或针对ACE基因的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；由anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。所制备的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并能够避免交叉反应，实现多个多态性位点的并行检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种AGT和ACE基因多态性检测特异性引物和液相芯片。
背景技术
肾素-血管紧张素-醛固酮(renin-angiotensin system，RAS)是一个激素系统，该系统对血压、血流和内环境调节起着重要的作用，其中，血管紧张素原和血管紧张素转换酶是RAS系统的关键组成部分。
血管紧张素原(Angiotensinogen，AGT)是一种主要由肝脏持续合成并释放入血液循环的α-2球蛋白，AGT的主要功能是作为肾素的底物在调节血压上发挥重要作用。血管紧张素转换酶(Angiotensin-Converting Enzyme，ACE)又称二肽羧基肽酶，ACE的主要作用是将血管紧张素I转化为具有强烈缩血管作用的血管紧张素II。在血循环，AGT被肾素水解生成无活性的血管紧张素I(Ang I，10肽)，后者在肺等器官内皮细胞ACE作用下，从Ang I C端切除两个氨基酸生成具有血管收缩活性的8肽，即血管紧张素II(Ang II)。血管紧张素II除具有刺激血管收缩引起血压升高的作用外，还具有促进醛固酮分泌，引起Na+贮留活性。此外ACE还能够催化有促血管舒张作用的缓激肽水解，ACE活性水平的增高刺激了血管平滑肌细胞的增生和细胞外基质的形成，是ACE基因多态性的重要病理生理基础。
人血管紧张素原(AGT)的基因全长13kb，含5个外显子和4个内含子，位于染色体1q42～43区，AGT的cDNA由1455个核苷酸组成，编码含有485个氨基酸的蛋白质。研究表明，AGT基因中存在某些突变，该突变可引起血浆AGT水平轻度增加，导致Ang I和AngII增加，最终引起血压升高。
本发明目标检测的AGT基因突变位点，如表所示：
| 序号 | AGT位点突变的内容 | 简写 |
| 1 | SEQ ID NO.33的第185位核苷酸，发生T→C突变 | T185C |
| 2 | SEQ ID NO.34的第75位核苷酸，发生A→G突变 | A75G |
| 3 | SEQ ID NO.35的第99位核苷酸，发生C→T突变 | C99T |
血管紧张素转换酶编码基因(ACE)位于17号染色体q23位点，长度为21kb，由26个外显子和25个内含子组成。其中第16内含子存在一段287bp的DNA序列插入(insertion，I)或缺失(deletion，D)，构成ACE基因的I/D多态性(rs1799752)，因此ACE基因可分为3中基因型：缺失纯合子(DD)型、缺失与插入杂合子(ID)型和插入纯合子(II)型。研究表明，ACE基因I/D多态性与血清及组织中ACE浓度密切相关，ACE的D等位基因数目增多与ACE浓度呈正比。目前研究表明，血管紧张素转换酶基因I/D多态性与心脑血管疾病易感性、严重性及预后显著相关。
目前，对AGT和ACE基因多态性进行检测、分析的方法很多，如：直接测序法、荧光定量PCR、PCR-RFLP分析法、连接酶检测反应法、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交法等等，其中最常用的方法有荧光定量PCR和PCR-RFLP分析法。荧光定量PCR具有操作简便、结果快捷、量化等优点，但是，该技术存在样品易污染，易发生交叉反应，假阳性率高的缺点；而PCR-RFLP法是基于基因突变造成的限制性内切酶识别位点的改变，如位点丢失或产生新位点，通过PCR扩增某一特定片段，再用限制性内切酶酶切扩增产物，电泳观察片段的大小，这种方法用于检测酶切位点改变的基因突变，可直接判断基因型，但该法不能用于没有产生新酶切位点的基因突变检测。再次，以上这些方法都存在着检测通量的局限性，每次只能检测一种突变类型，不能满足实际应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，该液相芯片可用于检测AGT基因常见突变位点T185C、A75G和C99T的野生型和突变型，以及ACE基因常见基因型插入/缺失(insertion/deletion，I/D)的野生型和突变型。
一种AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，包括有：
(A).针对每种突变分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为：针对AGT基因的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和/或针对ACE基因的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQID NO.1～8；
(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C).用于扩增出需要检测的、具有相应突变的目标序列的引物。
优选地，所述扩增引物为：针对AGT基因T185C突变位点的SEQ ID NO.25及SEQ IDNO.26、
针对AGT基因A75G突变位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对AGT基因C99T突变位点的SEQ ID NO.29及SEQ ID NO.30、和/或针对ACE基因I/D突变的SEQ ID NO.31及SEQ IDNO.32。
优选地，所述ASPE引物为：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序列、和/或由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16组成的序列。
优选地，所述间隔臂为5-10个T。
本发明的另一目的是提供一种AGT和ACE基因多态性检测的特异性引物。
具体技术方案如下：
一种AGT和ACE基因多态性检测的特异性引物，包括有：针对AGT基因的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和/或针对ACE基因的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％，检测所需要的时间远远低于常用的测序技术，特别符合实际应用需要。由于在非常大量的特异性引物中，经过大量试验，反应验证，才能得到最优组合的液相芯片体系，所制备的液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，tag标签序列、anti-tag标签序列的选取以及tag标签序列与具体ASPE引物的结合，能够避免交叉反应，实现多个多态性位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE引物特异性引物能够灵敏特异地识别目标检测的突变位点，准确区分各种型别的基因型；在同一个反应体系中，不同的特异性引物之间、特异性引物与非目标检测的PCR扩增产物之间基本上不存在交叉反应，检测特异性好，交叉反应率低于3％；除了能够单独检测AGT或ACE基因突变情况，也能够同时并行检测AGT基因和ACE基因多个突变位点的多态性情况，检测效果一致。
3.本发明的检测方法步骤简单，可通过一步多重PCR即可完成四条含有多态性位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征。
4.本发明不仅克服了传统固相芯片敏感性不高，检测结果的可重复性差的缺陷，同时对现有的液相芯片技术进行改进，使得所制备微球能适用于不同的检测项目，具有很强的拓展性。检测的荧光信号值大大提高，从而使得检测的灵敏度进一步得到提高，信噪比增强，检测结果更加准确可靠。
具体实施方式
实施例1 AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对AGT基因常见突变位点T185C、A75G和C99T的野生型和突变型，ACE基因常见基因型插入/缺失(insertion/deletion，I/D)，分别设计特异性引物序列。ASPE引物由“Tag序列+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1 AGT和ACE基因的ASPE引物序列(Tag序列+特异性引物序列)
每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异的引物片段(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物片段，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物片段可能形成的二级结构，选择的8种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2 微球编号与微球上相应的anti-tag序列
选择的八种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序列，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH2O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T，微球包被的过程如下：
分别取5×106个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/LTris(pH8.0)]，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出含有突变位点的目标序列的引物
针对AGT基因常见突变位点T185C、A75G和C99T的野生型和突变型，以及ACE基因常见基因型插入/缺失(insertion/deletion，I/D)，设计扩增引物对(见表3)，针对AGT的3个突变位点分别设计3对扩增引物，扩增出三条含有突变位点的目标序列；针对ACE基因的插入/缺失突变，设计1对扩增引物，当目标序列为插入型纯合子时，PCR产物长度为476bp，当目标检测序列为缺失型纯合子时，PCR产物长度为188bp，当检测序列为插入型/缺失型杂合子时，PCR产物同时存在476bp和188bp两种。
表3 扩增出具有多态性位点的目标序列的引物
所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2 运用AGT和ACE基因多态性检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：
2×Tm杂交缓冲液
| 试剂 | 来源 | 终浓度 | 每250ml的用量 |
| 1MTris-HCl，pH8.0 | SigmaT3038 | 0.2M | 50ml |
| 5M NaCl | Sigma S5150 | 0.4M | 20ml |
| Triton X-100 | Sigma T8787 | 0.16％ | 0.4ml |
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照《分子克隆》关于DNA提取的相关方法，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
设计四对引物，多重PCR一步扩增出分别含有AGT基因的三种常见基因型T185C、A75G和C99T共三条的目标序列，产物大小分别为382bp、347bp和275bp，针对ACE基因的插入/缺失突变，当目标序列为插入型纯合子时，PCR产物长度为476bp，当目标检测序列为缺失型纯合子时，PCR产物长度为188bp，当检测序列为插入型/缺失型杂合子时，PCR产物同时存在476bp和188bp两种。引物序列(SEQ ID NO.25-32)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ ID NO.25-32的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
2×缓冲液(含Mg2+) 25ul
dNTP(各2.5mmol/L) 4ul
Taq酶(5U/ul) 0.2ul
多重PCR引物工作液(各8.3pmol/mL) 6ul
模板DNA(10ng/ul) 2ul
ddH2O 12.8ul
共 50ul
PCR扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 40s，30个循环；72℃ 10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入1ul 10×SAP缓冲液、1ul SAP酶和0.5ul Exo-I酶；
2.37℃孵育15min，80℃孵育15min，灭活多余的酶。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别取待检测基因相应的野生型和突变型ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/L Tris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液 2ul
MgCl2(50mmol/L) 0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L) 0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L) 1ul
Tsp酶(5U/ul) 0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L) 1ul
酶切处理的PCR扩增产物 5ul
ddH2O 10ul
共 20ul
反应程序为：96℃ 2min；94℃ 30s，54℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，每组选择相应的8种微球(微球浓度均为2.5×105个/ml)；
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH2O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH2O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃ 60s，37℃ 15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11.将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。检测结果如表4、表5和表6所示。对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NETMFI÷(突变型NETMFI+野生型NETMFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测20份样本的AGT和ACE基因多态性位点，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的AGT和ACE基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片能够准确地检测出AGT和ACE基因类型，且结果稳定可靠。
表4 样本检测结果(MFI)
表5 样本AGT和ACE基因突变比值(％)
表6 样本AGT和ACE基因突变类型分析结果
实施例3 不同的ASPE引物的液相芯片对AGT和ACE基因多态性位点的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以AGT基因T185C位点突变和ACE基因的插入/缺失突变检测液相芯片为例，分别针对T185C的野生型和突变型、插入型/缺失型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选自SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.24。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7 液相芯片制备的设计
二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8 样本检测结果与基因多态性分析
表9 样本检测结果与基因多态性分析
其它针对不同的突变位点的液相芯片，ASPE引物运用不同的Tag序列，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。而ASPE引物选用实施例1中tag序列与特异性引物序列搭配时，效果更佳(信噪比更好)，参见本实施例试验组1和实验组5。其它不同tag序列与特异性引物序列搭配，与实施例2和本实施例的结果相同，具体数据省略。
以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
Claims (4)
1.一种AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
（A）.针对每种突变分别设计的野生型和突变型的ASPE引物：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为：针对AGT基因的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13及SEQ ID NO.14、和/或针对ACE基因的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；所述tag序列选自SEQ ID NO.1～8；
（B）.有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；
（C）.用于扩增出需要检测的、具有相应突变的目标序列的引物；
所述扩增引物为：针对AGT基因T185C突变位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对AGT基因A75G突变位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对AGT基因C99T突变位点的SEQ IDNO.29及SEQ ID NO.30、和/或针对ACE基因的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32。
2.根据权利要求1所述的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述ASPE引物为：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序列、和/或由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16组成的序列。
3.根据权利要求1所述的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，主要包括有：
（A）.所述ASPE引物：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.9组成的序列及由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.10组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.12组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14组成的序列、和由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.16组成的序列；
（B）.有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.17～SEQ ID NO.24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与（A）中所选的tag序列互补配对；
（C）.扩增引物：针对AGT基因T185C突变位点的SEQ ID NO.25及SEQ ID NO.26、针对AGT基因A75G突变位点的SEQ ID NO.27及SEQ ID NO.28、针对AGT基因C99T突变位点的SEQ IDNO.29及SEQ ID NO.30、和针对ACE基因I/D突变的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32。
4.根据权利要求1－3任一项所述的AGT和ACE基因多态性检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂为5－10个T。
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| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Applicant after: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. Address before: Five 510663 Guangdong city of Guangzhou province Guangzhou Science City Moon Road No. 80, Guangzhou technology innovation base B, C Applicant before: GUANGZHOU SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: GUANGZHOU YISHAN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. TO: SUREXAM BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140507 |