CN101067152A

CN101067152A - 心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片及其应用

Info

Publication number: CN101067152A
Application number: CNA200710037182XA
Authority: CN
Inventors: 盛海辉; 姜潇; 占伊扬; 肖华胜
Original assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd; Jiangsu Province Hospital
Current assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd; Jiangsu Province Hospital
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2007-02-06
Publication date: 2007-11-07

Abstract

本发明涉及基因多态性检测芯片，公开了一种心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测心脑血管疾病的药物遗传学相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。本发明还公开了应用所述芯片对心脑血管疾病进行药物遗传学检测的方法。本发明的检测芯片能使医务人员及时掌握高血压等心脑血管疾病患者的遗传信息，并指导其合理用药，实现个体化医疗。

Description

心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片及其应用

技术领域

本发明涉及基因多态性检测芯片，尤其涉及一种心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片及其应用。

背景技术

心脑血管疾病是威胁中老年人的头号疾病，以其发病率高、致残率高和死亡率高为最典型的三高疾病，给患者以及家庭、社会都带来了极大的危害。流行病学调查显示世界人口平均心脑血管疾病发病率为10-20％；全球每年死于心脑血管病的人数占死亡人数的52％，为死亡头号杀手。随着人们生活的提高，饮食结构、生态环境的改变，我国心脑血管疾病患者逐年上升，是全球心脑血管疾病发病率最高的国家。我国有心脑血管疾病患者3000多万，其中瘫痪在床者达1200万人，每年死亡达400万人以上，居各类死亡之首。有效预防、治疗心脑血管疾病刻不容缓。心脑血管疾病的防治，应该采取预防与治疗相结合的方法，从根本入手，选用效果显著、副作用小、标本兼治的药物，结合自身状况酌量服用，才能彻底根治心脑血管疾病。

目前对于高血压等心脑血管疾病的药物治疗仅是经验性对症治疗，而相同的药物，不同的种族和个体患者对药物的反应、药物副作用以及药物在体内的代谢，都存在明显的个体差异，因此个体化用药越来越受到重视。心脑血管药物遗传学通过对相关基因SNPs基因型的研究，临床试验可以评估个体对心脑血管药物治疗的反应差异，揭示不同个体对心脑血管药物反应的遗传基础，使临床医生可以根据病人的遗传背景来选择合适的药物和合理的剂量。

1.与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)有关的基因

高血压是心、脑血管病的重要病因和危险因素，影响心、脑、肾等重要器官的结构和功能，最终导致这些器官功能衰竭，是心脑血管病死亡的主要原因之一，而且高血压还引起血脂代谢异常、胰岛素抵抗、糖耐量异常等一系列病理综合征群，严重危害人类生活质量及生命安全。RAAS的异常变化在高血压的发生、发展和靶器官损害方面起着重要作用。经典的RAAS系统包括：肾小球入球动脉的球旁细胞分泌肾素，激活从肝脏产生的血管紧张素原，生成血管紧张素I，然后经肺循环的ACE生成血管紧张素II(AngII)。AngII是ARRS的主要效应物质，在血压的控制，心脏，血管重构，肾脏血流动力学的调控，心肌收缩力和心肌供血的调节及水盐代谢等方面发挥着重要的作用。因此，通过对RAAS的研究发现了一系列与心脑血管疾病相关的基因。

1.1血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme，ACE)

ACE基因第16内含子中存在一段287bp插入/缺失(I/D)多态性，形成了II、ID、DD三种基因型。不同种族间I/D等位基因频率不同。Li等人的研究发现ACE基因的多态性与ACEI治疗高血压的疗效有关，使用贝那普利治疗2月后，发现DD型基因患者收缩压和舒张压降压效果均比II型基因患者显著[Li X，Du Y，Du Y，et al.Correlationof angiotensin-converting enzyme gene polymorphism with effect ofantihypertensive therapy by angiotensin-converting enzyme inhibitor.Cardiovasc Pharmacol Ther，2003，8：25-30]。此外，Sciarrone等的研究发现，II基因型和DD基因型的高血压病人平均动脉压分别降低约10和3.8mmHg，认为II基因型患者对利尿剂的降压反应优于ID、DD基因型患者[Sciarrone MT，Stella P，Barlassina C，et al.ACE and α-adducin polymorphism as markers of individualresponse to diuretic therapy.Hypertension，2003，41：398-403]。

1.2血管紧张素原(Angiotensiongen，AGT)基因

AGT基因不仅作为高血压侯选基因已被广泛研究，同时也是高血压药物遗传学研究的主要对象之一。AGT基因多态性可影响药物治疗效应，如在应用利尿剂治疗高血压时，美籍非洲裔妇女携带-6位点G等位基因患者收缩压下降较明显[Frazier L，Turner ST，Schwartz GL，et al.Multilocus effects of therenin-angiotensin-aldosterone system genes on blood pressure response to athiazide diuretic.Pharmacogenomics，2004，4(1)：17-23]。Kurland等[KurlandL，Liljedahl U，Karlsson J，et al.Angiotensinogen gene polymorphismsrelationship to blood pressure response to antihypertensive treatment.Results from the Swedish Irbesartan Left Ventricular HypertrophyInvestigation vs Atenolol (SILVHIA)trial.Hypertension，2004，17：8-13.]对49名高血压患者用阿替洛尔单一治疗12周后，发现AGT基因-6A或235T等位基因与收缩压的下降有明确关系，这些等位基因携带者血压下降的更多。研究者推测这可能是由于-6A或235T等位基因增加了AGT基因的转录水平，使肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)活性增强，对阿替洛尔更加敏感。

1.3血管紧张素II1型受体(AT1R)基因

AT1R常见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)A1166C是高血压的独立危险因素，可能参与高血压发生及其靶器官的损害过程。研究发现A1166C多态性增加机体对Ang II的反应能力，且纯合子C等位基因可能是高血压患者心血管疾病危险性增加的一个可能原因。血管紧张素II受体阻滞剂(ARB)直接作用于血管紧张素II I型受体(AT1R)，阻断血管紧张素II的缩血管作用，并抑制其刺激醛固酮的产生。ARB最大的特点是与药物有关的不良反应很少，且不引起刺激性干咳，所以持续治疗的依从性较高，不仅是血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)不良反应的替换药，更具有自身疗效的价值，广泛应用于高血压、充血性心力衰竭、冠心病及高血压引起的脑血管意外等疾病的治疗，是临床上应用较广的心血管药之一。国内李海涛等[李海涛，王晓春。原发性高血压患者血管紧张素II 1型受体基因多态性及其对拮抗剂的药物作用反应，中国综合临床，2004，20：978-980]的研究亦表明ARB对AT1R基因A1166C多态性的各基因型患者均有良好降压作用，没有选择性。

1.4醛固酮合成酶(CYP11B2)基因

虽然CYP11B2基因多态性与高血压的关系的研究结果不一致，但大多学者认为SNPT-344C与血浆肾素的降低和醛固酮水平的增高有关，而这将影响高血压药物治疗效应。国内学者[吴寿岭，李云，刘克俭，等。血管紧张素转换酶和醛固酮合成酶基因多态性与氢氯噻嗪降压疗效的关系，中华心血管病杂志，2005，33(7)：595-598]报道，高血压患者服用氢氯噻嗪后，CYP11B2基因CC型患者收缩压、舒张压和平均动脉压下降值均高于TT、TD型患者，但这种差别在三种基因型间的差异无统计学意义。而把ACE基因型与CYP11B2基因型多态性联合分析发现，DD+CC基因型患者对氢氯噻嗪的降压反应可能优于其他基因型组合患者。该SNP也影响ACEI的疗效，TT和CT基因型的高血压患者的降压效果明优于CC基因型高血压患者[Yu HM，Lin SG，Liu GZ，et al.Associations between CYP11B2 gene polymorphisms and the response toangiotensin-converting enzyme inhibitors.Clin Pharmacol Ther.2006，79(6)：581-589]。

2.β-肾上腺素受体(Beta-adrenergic receptor，β-AR)基因

β-受体阻滞剂是抗高血压的首选药物之一，主要通过抑制心肌收缩力和减少肾素及其后产物的分泌来降低血压。此外还具有拮抗RAAS系统而用于慢性充血性心力衰竭的降低RAS基础张力用药，并具有负性频率作用而用于快速心律失常的治疗。但是不同的个体对β-受体阻滞剂的反应也存在很大的差异，其中遗传因素是这种差异的重要影响因素之一。遗传因素主要是β1-肾上腺素受体(β1-AR)基因和β2-肾上腺素受体(β2-AR)基因的遗传变异。

2.1 β1-AR基因

β1-肾上腺素受体基因最常见的多态位点是Gly389Arg，患者服用美托洛尔后，Arg/Arg型患者收缩压下降值高于Gly/Gly型患者[Liu J，Liu ZQ，Tan ZR，et al.Gly389Arg polymorphism of β1-adrener gic receptor is associated with thecardiovascular response to metoprolol.Clin Pharmacol Ther，2003，74：372-379]。同时Johnson等[Johnson JA，Zineh I，Puckett BJ，et al.Beta1-adrenergic receptor polymorphisms and antihypertensive response tometoprolol.Clin Pharmacol Ther，2003，74：44-52]在一项临床试验研究中，用美托洛尔对40名高血压患者治疗4周，并在治疗前后监测动态血压，结果显示Arg/Arg型患者白天的舒张压下降的比Gly/Gly型患者更明显。在中国人中的一项研究显示，49Ser389Arg/49Ser389Arg和49Ser389Arg/49Gly389Arg高血压患者美托洛尔治疗效果良好，收缩压下降幅度大于49Ser389Arg/49Gly389Arg高血压患者，并且49Ser389Gly/49Gly389Arg和49Ser389Gly/49Ser389Gly高血压患者对美托洛尔治疗无反应[Liu J，Liu ZQ，Yu BN，et al.Betal-Adrenergic receptor polymorphismsinfluence the response to metoprolol monotherapy in patients with essentialhypertension.Clin Pharmacol Ther.2006，80(1)：23-32.]。

2.2 β2-肾上腺素受体(β2-AR)基因

β2-AR基因2个常见SNP(Arg16Gly和Gln27Glu)可引起β2-AR与儿茶酚胺类的亲和力降低，导致舒血管反应降低。Tomaszewski等在欧洲人群中研究显示Arg16Gly和Gln27Glu多态性与高血压没有关联，但发现染色体5q31.1-5区域与高血压相关。Etzel等也认为β2-AR基因突变不是美国人群中高血压易感的主要因素。但是有研究者报告[Lee YW，Oh VM，Garcia E，et al.Haplotypes of the beta2-adrenergic receptorgene are associated with essential hypertension in a Singaporean Chinesepopulation.Hypertension，2004，22(11)：2111-2116.]，β2-AR突变是新加坡华人和英国人对高血压易感的一个遗传因素。β2-AR可能是中国人高血压的相关基因。Liljedahl等认为β2-AR、AGT和Appo B等基因的遗传变异可用来预测抗高血压治疗左心室质量(left ventricular mass)的改变[Liljedahl U，Kahan T，MalmqvistK，et al.Single nucleotide polymorphisms predict the change in leftventricular mass in response to antihypertensive treatment.J Hypertens.2004Dec；22(12)：2321-2328]。

3.G蛋白β3-亚单位(GNB3)基因

Gs蛋白α亚基的遗传变异与β-肾上腺素受体阻断剂疗效无关，但GNB3的C825T与atenolol的疗效反应存在相关性，CC基因型的女性高血压患者的降压效果明显优于CT和TT基因型[Filigheddu F，Reid JE，Troffa C，et al.Genetic polymorphisms ofthe beta-adrenergic system：associationwith essential hypertension andresponse to beta-blockade.Pharmacogenom J 2004；4：154-160]。另外，TT基因型亦与盐敏感高血压相关[Turner ST，Schwartz GL，Chapman AB，Boerwinkle E.C825T polymorphism of the G protein b3-subunit and antihypertensive responseto a thiazide diuretic.Hypertension 2001；37：739-743]，825T等位基因与氢氯噬嗦的降血压作用相关，与CC型纯合子相比，TT型纯合子病人平均收缩压和舒张压的降低更为显著[王喆，苏瑞斌。遗传多态性和抗高血压药物治疗间的药物基因相互作用，国外医学(药学分册)，2005，32：162-164]。

4.内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因

G894T是eNOS基因的常见SNP，导致第298位谷氨酸转换成天门冬氨酸，损害了eNOS的NO释放功能，与心肌梗死和高血压相关[Persu A，Vinck WJ，EI Khattabi O，et al.Influence of the endothelial nitric oxide synthase gene on conventional andambulatory blood pressure：sib-pair analysis and haplotype study.Hypertension，2005，23：759-765]。此外日本学者研究表明eNOS基因另一突变T-786C与冠状动脉痉挛有关，-786C使eNOS的mRNA水平下降，从而导致eNOS表达减少。临床实验结果显示CC型等位基因携带者比其他基因型的收缩压高，而且在高血压患者中CC型等位基因过度表达。华琦等[华琦，李东宝，皮林等。T786C多态性与缬沙坦降压疗效的关系，高血压杂志，2004，12：331-334]等发现T786C多态性与高血压有关，C等位基因携带者对缬沙坦的治疗反应较好。

5.α-内皮蛋白(alpha-adducin，ADD)基因

α-ADD基因的多态性会影响整个肾小管细胞的离子转运能力，从而引起肾功能的变化，其变异与高血压有统计学上的联系[Lanzani C，Citterio L，Jankaricova M，et al.Role of the adducin family genes in human essentialHypertension.Hypertension，2005，23(3)：543-549]。利尿剂药物遗传学研究发现，发现T等位基因与收缩压和平均动脉压的下降相关，TT基因型患者的降压疗效最显著[Sciarrone MT，Stella P，Barlassina C，et al.ACE and α-adducinpolymorphism as markers of individual response to diuretic therapy.Hypertension，2003，41：398-403；吴寿岭，李冬青，李宏芬等。α-内收蛋白基因多态性与氢氯噻嗪降压疗效的相关性研.中华心血管病杂志，2005，33(10)：880-884]。

6.胰岛素受体底物1(IRS1)基因

高血压病常伴有代谢异常如胰岛素抵抗(IR)，约50％高血压患者中存在糖耐量异常或非胰岛素依赖型糖尿病。IR和继发性高胰岛素血症可能会导致血压升高，参与高血压的发生、发展。胰岛素发挥其功能必须以胰岛素受体介导，胰岛素受体的结构和功能决定了细胞对胰岛素作用的反应，是胰岛素抵抗的重要原因之一。在中度以上的IR伴高血压病人中常可检测出胰岛素受体(Insulin Receptor，INSR)基因突变，提示INSR基因可能是高血压的候选基因之一。IRS1基因SNP G6244A与血浆AGT浓度升高有关，此多态可能参与高加索人群高血压的发生。

7.噻嗪化物敏感的Na⁺-Cl^-协同转运蛋白(thiazide-sensitive Na⁺，Cl^--cotransporter，TSC)基因

目前发现主要存在C1784T及G2736A等多态性。其中C1784T位于第1内含子，本身不影响TSC的功能，也未发现其上游启动子区有相关连锁功能基因存在。G2736A位于细胞内区域的C末端，其出现的Arg→Gln的替换导致阳离子蛋白向阴离子蛋白的转变而影响功能。Matsuo等[Matsuo A，Katsuya T，Ishikawa K，et al.G2736Apolymorphism of thiazide-sensitive Na-Cl cotransporter gene predisposes tohypertension in young women.Hypertension，2004，22：2123-2127]研究发现在日本妇女中TSC基因的G2736A多态性是高血压的一个遗传易感因子，可能是由于2736A等位基因携带者易导致体内雌激素水平升高，从而加剧此类女性钠水潴留而发生高血压及容量负荷增加诱发充血性心力衰竭。

目前对高血压等心脑血管疾病的药物治疗仅是经验性对症治疗，而相同的药物，不同的种族和个体患者对药物的反应、药物副作用以及药物在体内的代谢，都存在明显的个体差异，因此个体化用药越来越受到重视。但是，由于心脑血管疾病相关基因的高度多态性，每个基因所涉及的遗传变异在几十至几百不等，显然传统的检测方法因通量水平低，难以应用于个性化医疗中。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片，能有效检测心脑血管疾病相关基因的多态性，辅助医生及时找到治疗包括高血压的心脑血管疾病的正确用药方案。为此，本发明还要提供应用该芯片检测心脑血管疾病相关基因多态性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测的心脑血管疾病药物遗传学相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。

本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。

所述待测心脑血管疾病的药物遗传学相关基因包括ACE、AGT、AT1R、CYP11B2、ADRB1、ADRB2、GNB3、eNOS、ADD1、IRS1和TSC基因。

所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成与目的核苷酸序列特异性结合。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于6个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明检测芯片的探针为DNA，包括：(1)与待测ACE基因杂交的(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示序列，(b)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(2)与待测AGT基因杂交的(a)SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：15所示序列，(b)SEQ IDNO：4～SEQ ID NO：15所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：15所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(3)与待测AT1R基因杂交的(a)SEQ ID NO：16～SEQ ID NO：21所示序列，(b)SEQID NO：16～SEQ ID NO：21所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：16～SEQID NO：21所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(4)与待测CYP11B2基因杂交的(a)SEQ ID NO：22～SEQ ID NO：24所示序列，(b)SEQID NO：22～SEQ ID NO：24所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：22～SEQID NO：24所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(5)与待测ADRB1基因杂交的(a)SEQ ID NO：25～SEQ ID NO：30所示序列，(b)SEQID NO：25～SEQ ID NO：30所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：25～SEQID NO：30所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(6)与待测ADRB2基因杂交的(a)SEQ ID NO：31～SEQ ID NO：36所示序列，(b)SEQID NO：31～SEQ ID NO：36所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：31～SEQID NO：36所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(7)与待测GNB3基因杂交的(a)SEQ ID NO：37～SEQ ID NO：39所示序列，(b)SEQID NO：37～SEQ ID NO：39所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：37～SEQID NO：39所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(8)与待测eNOS基因杂交的(a)SEQ ID NO：40～SEQ ID NO：42所示序列，(b)SEQID NO：40～SEQ ID NO：42所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：40～SEQID NO：42所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(9)与待测ADD1基因杂交的(a)SEQ ID NO：43～SEQID NO：45所示序列，(b)SEQID NO：43～SEQ ID NO：45所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：43～SEQID NO：45所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(10)与待测IRS1基因杂交的(a)SEQ ID NO：46～SEQ ID NO：48所示序列，(b)SEQID NO：46～SEQ ID NO：48所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：46～SEQID NO：48所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(11)与待测TSC基因杂交的(a)SEQ ID NO：49～SEQ ID NO：54所示序列，(b)SEQID NO：49～SEQ ID NO：54所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：49～SEQID NO：54所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。

优选的，本发明检测芯片的探针选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：54所示序列。

所述探针序列可包含1～10个错配碱基，较佳地，可包含1～5个错配碱基，更佳地，可包含1～2个错配碱基。

本发明检测芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。

所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。

所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。

所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH₂修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH₂修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。

所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、酶标记和荧光共振能量转移标记。

在本发明的另一方面，提供了一种应用上述芯片对心脑血管疾病进行药物遗传学检测的方法，包括如下步骤：

(1)在固相载体表面点载与待测心脑血管疾病相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；

(2)抽提待测样品的核酸；

(3)制备待测心脑血管疾病药物遗传学相关基因的目的核苷酸序列；

(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列；

(5)在适于与步骤(1)所述的点载在固相载体上的探针进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；

(6)检测杂交反应的结果。

在本发明的另一方面，还提供了一种应用上述芯片对心脑血管疾病进行药物遗传学检测的方法，包括如下步骤：

(1)标记与待测心脑血管疾病药物遗传学相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；

(2)抽提待测样品的核酸；

(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列；

(5)在适于与步骤(4)所述的点载在固相载体上的目的核苷酸序列进行杂交的条件下，加入经标记的探针，并使其反应足够时间；

(6)检测杂交反应的结果。

所述目的核苷酸序列的制备可包括扩增的步骤，用分离的靶样本中含核酸的细胞直接扩增，也可用抽提的靶核酸直接扩增。如用磁珠从全血中分离白细胞，直接用分离的白细胞或用全血抽提的核酸作模板，扩增目的核酸序列。扩增得到的单链或双链的DNA或RNA可含有荧光或生物素标记，标记的DNA或RNA可不经纯化直接用于杂交。与本发明中所述芯片杂交的优选靶核苷酸分子是单链核酸分子，双链核酸分子经过变性等处理后也于本发明所述芯片杂交。

目的核苷酸序列可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，连接酶链反应(ligase chainreaction，LCR)，滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，链置换扩增(stranddisplacement amplification，SDA)和转录介导的扩增(transcription medicatedamplification，TMA)等。

在本发明的一个实施例中，目的核苷酸序列的制备采用PCR扩增方法，该方法所用引物含有SEQ ID NO：55～SEQ ID NO：80所示序列的核苷酸链或其互补链。

所述探针或目的核苷酸序列都适合用于标记。探针在合成引入标记，目的核苷酸序列可以在扩增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。

合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。

本发明方法的杂交可在任何适当的温度下进行，如25℃～65℃，所述杂交时间为2分钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。

本发明心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片及其应用，使医务人员及时掌握高血压等心脑血管疾病患者大量遗传信息，并指导其合理用药，实现个体化医疗，提高治疗的有效性和减少药物的毒副作用。对于医药企业，本发明的检测芯片可使其选择合适的临床试验人群，从而提高药物疗效，降低药物的无效率和毒副作用，缩短药物的研发周期。

附图说明

图1是本发明的实施例1中多重PCR扩增后的电泳检测结果图；

图2是本发明的实施例1中PCR产物片段化后的电泳检测结果图；

图3是本发明实施例1的心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片的杂交结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1 反向杂交

1.基因芯片的制备

(1)探针溶解

将SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：54所示序列探针的每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10mM。将浓度为10mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。

(2)点样

将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，(GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。

2.待测样品的处理和标记

(1)人基因组DNA抽提及目的基因的扩增

采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)试剂盒抽提人外周血中基因组DNA。取1ul进行电泳(1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小时电泳)，在FR-200紫外与可见分析装置上拍摄照片，并对照marker(LambdaDNA/EcoRI+HindIII)进行定量。

用ACE的引物(SEQ ID NO：55、56)、AGT的引物(SEQ ID NO：57、58)、AT1R的引物(SEQ ID NO：59、60)、CYP11B2的引物(SEQ ID NO：61、62)、ADRB1的引物(SEQID NO：63～66)、ADRB2的引物(SEQ ID NO：67、68)、GNB3的引物(SEQ ID NO：69、70)、eNOS的引物(SEQ ID NO：71、72)、ADD1的引物(SEQ ID NO：73、74)、IRS1的引物(SEQ ID NO：75、76)和TSC的引物(SEQ ID NO：77～80)进行目的核苷酸序列的扩增。PCR扩增用30μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP、10mM Tri s-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％ Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的浓度0.16μM、基因组DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。应用Touch-down PCR反应程序[Don RH，CoxPT，Wainwright BJ，Baker K，Mattick JS.’Touchdown’PCR to circumvent spuriouspriming during gene amplification.Nucleic Acids Res.1991，19：4008]：94℃变性5min；94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸50s，共10个循环；然后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果。

当进行多重PCR反应时，将SEQ ID NO：55～SEQ ID NO：80所示序列的引物放入一个反应体系中进行扩增，体系为50μl。多重PCR的反应体系为：每种dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl₂3.5mmol/L，BSA 3.75μg/ml，每条引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(Clontech，USA)。多重PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，66℃退火2min，68℃延伸4min，共40个循环；最后68℃延长10min。PCR扩增后，取3μl PCR反应产物做琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。这些PCR产物经处理后可用于下面的杂交步骤。

(2)PCR产物纯化和片段化

每个样品的所有PCR产物混合，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。纯化的PCR产物经测定浓度后，用DNase I进行片段化。片段化的反应体系包括：30μl纯化PCR产物(10μg)，4μl的10×DNase I缓冲液，0.12μl的DNase I，5.88μl的ddH₂O。反应条件为37℃温浴5min，然后95℃ 15min。片段化后的产物跑4％琼脂糖凝胶，保证绝大多数的片段处于30-200个碱基对，电泳检测结果如图2所示。

(3)荧光素标记

利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记，标记的40μl反应体系包括：25μl片段化PCR产物，8μl的5×脱氧核苷酸转移酶缓冲液，1μl的CY3-N6-ddCTP(1mM)，3μl的脱氧核苷酸转移酶(20U/μl)，3μl的ddH₂O。反应条件为37℃温浴120min，然后95℃加热15min。

3.杂交、洗涤和结果检测

荧光标记的PCR产物95℃变性10min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应20μl体系包括：荧光素标记的PCR产物15μl，20×SSPE 1.2μl，1％ Triton 0.2μl，10×Denhandts 0.9μl，甲酰胺0.5μl，ddH₂O 2.2μl。反应条件为48℃温浴120min，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％ SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％ SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤0.5min。

洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图3所示，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以得到心脑血管疾病的药物遗传学结果，从而指导临床医生为患者选择合适的药物和合理的剂量。

实施例2 正向杂交

1.心脑血管疾病的药物遗传学相关基因的扩增和芯片制备

用ACE的引物(SEQ ID NO：55、56)、AGT的引物(SEQ ID NO：57、58)、AT1R的引物(SEQ ID NO：59、60)、CYP11B2的引物(SEQ ID NO：61、62)、ADRB1的引物(SEQID NO：63～66)、ADRB2的引物(SEQ ID NO：67、68)、GNB3的引物(SEQ ID NO：69、70)、eNOS的引物(SEQID NO：71、72)、ADD1的引物(SEQ ID NO：73、74)、IRS1的引物(SEQ ID NO：75、76)和TSC的引物(SEQ ID NO：77～80)扩增基因。PCR扩增用100μl反应体系进行，反应体系是0.3mM dNTP，10mM Tris-HCl，50mM KCl，2mM MgCl₂，20％ Q solution(Qiagen)，0.01μM SHV-F，0.2μM SHV-R，100ng基因组DNA，3U Ex Taq酶(Takara)。循环参数：94℃变性5min；94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸1min，共40个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化。将纯化的PCR产物浓度调整至400ng/μl。

将浓度为400ng/μl的PCR产物与100％的DMSO于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心。将200ng/μl的PCR产物通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样完毕放置半小时后，将芯片放于饱和食盐水盒中，37℃水化过夜，次日取出，600mJ交联，交联完毕之芯片即可使用。

2.芯片杂交

杂交反应体系包括：2nM荧光标记的寡核苷酸探针(SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：54)，1.2μl 20×SSPE，0.2μl 1％ Triton，0.9μl 10×Denhandts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH₂O。反应条件为50℃温浴2小时，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％ SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％ SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH₂O洗涤10秒。洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。

序列表

<110>上海生物芯片有限公司

<120>心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片及其应用

<130>NP-07-11240

<160>80

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

tgctgggatt acaggcgt 18

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

ctgctgccta tacagtcact t 21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctgctgccac agtcactt 18

<210>4

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cctgcaccgg ctcact 16

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cctgcaccag ctcactc 17

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cctgcacctg ctcactc 17

<210>7

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cccggccggg ggaag 15

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gacccggcca ggggaaga 18

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

cccggcccgg ggaag 15

<210>10

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

gctgtccacg gtggtg 16

<210>11

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

gctgtccatg gtggtgg 17

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gctgtccaag gtggtgg 17

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<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

aaatagggca tcgtgaccc 19

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aaatagggcc tcgtgacc 18

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<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

aaatagggct tcgtgacc 18

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

taccaaatga gcattagcta ctttt 25

<210>17

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

accaaatgag ccttagctac ttt 23

<210>18

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

accaaatgag cgttagctac ttt 23

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<211>19

<212>DNA

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<400>19

gcctgcacca tgttttgag 19

<210>20

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

cctgcaccct gttttgag 18

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

gcctgcacct tgttttgag 19

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

atccaaggct ccctctcat 19

<210>23

<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

ccaaggcccc ctctca 16

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<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

atccaaggca ccctctcat 19

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<211>16

<212>DNA

<213>人工序列

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cagcgaaagc cccgag 16

<210>26

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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cagcgaaggc cccga 15

<210>27

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

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cagcgaacgc cccga 15

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<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>28

ccttccaggg actgctc 17

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

ccttccagag actgctct 18

<210>30

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

ccttccagcg actgctc 17

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

gcacccaatg gaagccat 18

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<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

gcacccaata gaagccatg 19

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<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>33

gcacccaatt gaagccatg 19

<210>34

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

tcacgcagga aagggac 17

<210>35

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

tcacgcagca aagggac 17

<210>36

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

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tcacgcagaa aagggac 17

<210>37

<211>17

<212>DNA

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atcacgtccg tggcctt 17

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<211>17

<212>DNA

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atcacgtctg tggcctt 17

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<211>17

<212>DNA

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<400>39

atcacgtcgg tggcctt 17

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<211>18

<212>DNA

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<211>16

<212>DNA

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ccagatgagc ccccag 16

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<212>DNA

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ccagatgaac ccccagaa 18

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<212>DNA

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ccgaggaagg gcagaat 17

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<212>DNA

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<211>18

<212>DNA

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ccgaggaaag gcagaatg 18

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<211>14

<212>DNA

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cctcccgggg ctgc 14

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acctcccagg gctgc 15

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<211>15

<212>DNA

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acctccccgg gctgc 15

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<212>DNA

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gcagagacgc cgtccc 16

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<212>DNA

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gcagagatgc cgtccc 16

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<211>16

<212>DNA

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tgcagagagg ccgtcc 16

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<211>16

<212>DNA

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gaaccctcgg gctgag 16

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<212>DNA

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agaaccctca ggctgagc 18

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<212>DNA

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gaaccctccg gctgag 16

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<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

<223>引物

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ctggagagcc actcccatcc tttct 25

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<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

<223>引物

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gacgtggcca tcacattcgt cagat 25

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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ggttggcctc aggctgtcac a 21

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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cccggcttac cttctgctgt 20

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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aaatgagcac gctttcctac c 21

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<211>25

<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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agtcggttca gtccacataa tgcat 25

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<211>21

<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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caggaggaga ccccatgtga c 21

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<211>22

<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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ctccaccctg ttcagcccaa at 22

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<220>

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<223>引物

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gagcccggta acctgtcgt 19

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<220>

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<223>引物

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acagcacgtc cactgaggtc 20

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<220>

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<223>引物

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ccgcctcttc gtcttcttca act 23

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<220>

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<223>引物

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gtgggcttcg agttcacctg cta 23

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<220>

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<223>引物

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ccctagcacc cgacaagctg a 21

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<220>

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<223>引物

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ggaagtccaa aactcgcacc a 21

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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ctgacccact tgccacccgt 20

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

<400>70

ccttacccac acgctcagac tt 22

<210>71

<211>21

<212>DNA

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<220>

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<223>引物

<400>71

catgaggctc agccccagaa c 21

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

<400>72

cagtcaatcc ctttggtgct cac 23

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

<400>73

ctagtgacgg tgattcgggc a 21

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<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>74

agagactgca gcaagggttt cac 23

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<212>DNA

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<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>75

aaaggtggac acagctgctc a 21

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

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gggacaactc atctgcatgg t 21

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<212>DNA

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<220>

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<223>引物

<400>77

gcgcagtggt gcaggtcagt 20

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<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>78

agtcagagct gagcctggat g 21

<210>79

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>79

gtccacatcc tccctgacat caa 23

<210>80

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>80

gaacctgcca ttggtcactg cta 23

Claims

1.一种心脑血管疾病的药物遗传学检测芯片，包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测心脑血管疾病的药物遗传学相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。

2.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述待测心脑血管疾病的药物遗传学相关基因包括ACE、AGT、AT1R、CYP11B2、ADRB1、ADRB2、GNB3、eNOS、ADD1、IRS1和TSC基因。

3.如权利要求1或2所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。

4.如权利要求3所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA，包括：

(1)与待测ACE基因杂交的(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示序列，(b)SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：3所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(9)与待测ADD1基因杂交的(a)SEQ ID NO：43～SEQ ID NO：45所示序列，(b)SEQID NO：43～SEQ ID NO：45所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：43～SEQID NO：45所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

5.如权利要求4所述的检测芯片，其特征在于，所述探针选自：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：54所示序列。

6.一种应用权利要求1所述芯片对心脑血管疾病进行药物遗传学检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)在固相载体表面点载权利要求1所述的探针；

(2)抽提待测样品的核酸；

(3)制备待测的心脑血管疾病药物遗传学相关基因的目的核苷酸序列；

(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列；

(6)检测杂交反应的结果。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述目的核苷酸序列的标记采用包括荧光素标记、生物素标记、电化学发光标记、放射性元素标记或酶标记。

8.一种应用权利要求1所述芯片对心脑血管疾病进行药物遗传学检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)标记权利要求1所述的探针；

(2)抽提待测样品的核酸；

(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列；

(6)检测杂交反应的结果。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的探针标记采用包括荧光素标记、生物素标记、荧光共振能量转移标记、电化学发光标记、放射性元素标记或酶标记。

10.如权利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的目的核苷酸序列的制备包括PCR扩增反应，该反应所用引物含有SEQ ID NO：55～SEQ ID NO：80所示序列的核苷酸链或其互补链。

11.如权利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的杂交温度为25℃～65℃，杂交时间为2分钟～18小时。

12.权利要求1所述的检测芯片在指导心脑血管疾病患者合理用药中的应用。