CN1912139A - 细胞色素p450基因遗传变异的检测芯片及其应用 - Google Patents

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盛海辉
肖华胜
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Abstract

本发明公开了一种细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片，该芯片包括：固定在固相载体上的与待测细胞色素P450基因核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针。本发明还公开了所述芯片用于检测细胞色素P450基因遗传变异的方法。本发明的检测芯片能有效检测分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遗传变异，对40％以上的临床常用药物的治疗效应做出预测，以实现个性化医疗。

Description

细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片及其应用
技术领域
本发明涉及药物基因检测芯片，尤其涉及一种与人体药物代谢相关的细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片及其应用。
背景技术
长期以来，临床医生往往根据药物的临床试验，对同一种疾病按照相同的剂量服用同样的药物，或根据临床经验对剂量做出稍微的调整。在临床的疾病治疗中，经常出现相同的药物治疗同一病症的不同病人时，产生大相径庭的疗效，甚至有些病人发生严重的副作用或无反应，除造成巨大的浪费之外，有时则直接耽搁了疾病的及时治疗，延误病情。每年因药物不良反应以及药源性疾病造成的死亡率和相应卫生资源花费极其惊人，美国每年在这方面的费用达到1360亿美元。这种对药物的个体差异成为困扰临床用药和制药厂研制新药的难题。不同个体对于药物治疗反应的殊异可由多种因素造成，并产生不同的相应后果。其中20-95％药物处置和效应差异由遗传因素所致，涉及药物靶体基因、药物代谢酶基因、药物转运相关基因、DNA修复酶基因以及一些辅基合成酶基因等[Kalow W，Tang BK，Endrenyi I.Hypothesis：comparisonsof inter-and intra-individual variations can substitute for twin studies indrug research.Pharmacogenetics，1998，8：283-9.]。这些基因中的遗传变异是形成药物疗效产生个体差异的基础，主要是一些单个碱基的改变即单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)的遗传变异。其他影响因素尚有年龄、性别、疾病以及环境因素。
药物在体内的代谢过程由各种酶来参与完成。催化I相药物代谢的酶主要是细胞色素P450酶系(CYP)，具有显著意义遗传多态性的酶包括CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A5等；催化II相药物代谢的酶主要有硫嘌呤甲基转移酶(TPMT)、N-乙酰基转移酶(NAT)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等。这些与人体内药物代谢相关的酶，至少可分为30多个家族[Evans WE，Relling MV.Pharmacogenomics：translating functional genomics into rational therapeutics.Science，1999，286：487-91；Ingelman-Sundberg M，Oscarson M，McLellan RA.Polymorphic humancytochrome P450 enzymes：an opportunity for individualized drug treatment.Trends Pharmacol Sci，1999，20：342-9.]。其中CYP酶系为人体内代谢药物的主要酶系统，约有50％药物主要是经CYP酶系代谢的，CYP基因多态性以及对药物代谢的影响，也是药物遗传学研究的最早对象之一。
在I相药物代谢中，约有40-45％的药物是由CYP3A4所催化[Ingelman-Sundberg，M.Pharmacogenetics of cytochrome P450 and its applications in drug therapy：the past，present and future.Trends Pharmacol Sci.2004，25：193-200.]，这些药物包括乙酰氨基酚、卡马西平、洛伐他汀、硝苯地平等。虽然在CYP3A4基因至今已发现了不少的遗传变异，但更为重要的是功能性变异至今尚未在高加索和中国人中发现，并且CYP3A4和CYP3A5底物特异性有重叠。CYP3A4和CYP3A5同属CYP3A家族，CYP3A底物清除方面的个体差异主要是由于CYP3A5的多态性表达所造成。CYP3A5代谢的药物种类很多，但在人群中丧失表达有功能的CYP3A5的频率较高，主要表现为多态性表达。现已清楚，CYP3A5基因表达水平的丧失是由于第3个内含子中的一个SNP(A→G)所致，该SNP使得CYP3A5基因产生了异常剪切，引起翻译提前终止，产生无功能的CYP3A5截短蛋白[Kuehl P，Zhang J，Lin Y，Lamba J，Assem M，Schuetz J，Watkins PB，Daly A，Wrighton SA，Hall SD，Maurel P，Relling M，BrimerC，Yasuda K，Venkataramanan R，Strom S，Thummel K，Boguski MS，Schuetz E.Sequence diversity in CYP3A promoters and characterization of the geneticbasis for polymorphic CYP3A5 expression.Nat Genet，2001，27：383-91.]。并且异常剪切产物稳定性较差，易于被快速降解，这也可以解释AA纯合者为何CYP3A5表达水平低下。带有该SNP的G等位基因的CYP3A5为CYP3A5*3。CYP3A5*3的频率在高加索人、亚洲人和非洲人中的频率分别是88％，75％和35％。
CYP2D6代谢药物的种类仅次于CYP3A4，与大约25％已知药物的代谢有关，包括异喹胍、丙咪嗪、氯氮平、β-肾上腺素受体阻滞药等[Ingelman-Sundberg.Geneticpolymorphisms of cytochrome P450 2D6(CYP2D6)：clinical consequences，evolutionary aspects and functional diversity.Pharmacogenomics J.2004，5：6-13]。如果病人CYP2D6基因发生突变就会对降压药异喹胍产生明显的副作用，大约3％~10％的高加索人缺乏该酶基因的活性，在东方人中约占1％～2％[Bertilsson L，Dahl ML，Dalen P，Al-Shurbaji A.Molecular genetics of CYP2D6：clinicalrelevance with focus on psychotropic drugs.Br J Clin Pharmacol.2002，53：111-22.]。这种CYP2D6酶活性缺乏者称为慢代谢型(poor metabolizer，PM)，由于药物不能被代谢，容易产生副作用，或药物前体不能被有效地转为活性成分，导致治疗失败。正常人的两条22号染色体上的CYP2D6基因都正常，其代谢类型为快代谢型(extensive metablizer，EM)。而中间代谢型(intermediate metablizer，IM)者并不缺乏CYP2D6，只是由于基因突变导致CYP2D6活性较正常人为低。在中国人群中，最为常见的基因型是CYP2D6*10(由于第一个外显子中第100位核苷酸C→T的改变所致)，频率为51-70％[Ji L，Pan S，Marti-Jaun J，Hanseler E，Rentsch K，HersbergerM.Single-step assays to analyze CYP2D6 gene polymorphisms in Asians：allelefrequencies and a novel *14B allele in mainland Chinese.Clin Chem.2002，48：983-8.]。超快代谢型(ultrarapid metablizer，UM)者往往是由于携带有多个拷贝的有功能的CYP2D6基因所致，因此UM患者服用经CYP2D6代谢的标准剂量的药物，将不能达到有效治疗效果。UM分布频率可从瑞典人群中的2％到埃塞俄比亚人群中的30％，但在亚洲人群中频率较低。根据个体CYP2D6代谢型不同，需要对常规用药剂量做调整，以获得可以接受的药物疗效及安全性，这在精神类药物中研究的较为明确[Kirchheiner J，Nickchen K，Bauer M，Wong ML，Licinio J，Roots I，BrockmollerJ.Pharmacogenetics of antidepressants and antipsychotics：the contributionof allelic variations to the phenotype of drug response.Mol Psychiatry，2004，9：442-473.]。迄今发现的CYP2D6的变异已超过80多种，涉及单个碱基改变、短片段插入/缺失、基因部分缺失，甚至整个基因的缺失和重复，是CYP450超基因家族中多态性最高的。
CYP2C9是一种重要的药物代谢酶，参与临床上大约10％的常用药物的代谢，以及多种内源性物质的体内转化[Xie HG，Prasad HC，Kim RB，Stein CM.CYP2C9 allelicvariants：ethnic distribution and functional significance.Adv Drug Deliv Rev.2002，54：1257-70；Lee CR，Goldstein JA，Pieper JA.Cytochrome P450 2C9polymorphisms：a comprehensive review of the in-vitro and human data.Pharmacogenetics.2002，12：251-63.]。常见的药物有华法林、苯妥英、甲苯磺丁脲、苯妥因、丙咪嗪、氟伐他丁及一些非甾体类抗炎药(如双氯灭酸、布洛芬)等。CYP2C9有一些功能性SNP，能导致酶活性的显著改变。在高加索人群中，CYP2C9*2和CYP2C9*3是CYP2C9的两种常见等位基因，分别位于外显子3和外显子7，造成第144位精氨酸→半胱氨酸和第359位异亮氨基酸→亮氨基酸的改变。CYP2C9*2和CYP2C9*3的酶活性低于CYP2C9*1(野生型)，因此CYP2C9*2和CYP2C9*3纯合子、CYP2C9*2/CYP2C9*3杂合子者是慢代谢型，占总人数的4％，对华法林等抗凝药物非常敏感，相对于拥有CYP2C9*1的人来说，他们只需要很小的剂量即可。在东方黄种人中，发生率最高、最为常见的基因型式CYP2C9*3，频率约为3％，而其他遗传变异在黄种人中十分罕见或不存在。
CYP2C19与CYP2C9同属CYP2C家族，是重要的P450酶，具有明显的遗传多态，能催化许多临床药物，包括奥美拉唑、安定、环己巴比妥、普萘洛尔等。目前至少已确定6种有缺陷的等位基因。如果个体带有CYP2C19的多态性基因，在代谢奥美拉唑时，失活的酶会导致血药浓度过高，增加药物反应。CYP2C19基因缺陷的人，对甲妥英、环己烯巴比妥等药物高度敏感。有12％-23％的亚洲人无CYP2C19或活性很低，故这些人群为慢代谢型，而白种人和黑人仅3％-5％无CYP2C19或活性很低，故这些人群为快代谢型。在日本人的慢代谢型个体中，70％为CYP2C19*2，其次为CYP2C19*2。CYP2C19*3是亚洲人的特征性基因型[Nagata K，Yamazoe Y.Genetic polymorphism ofhuman cytochrome p450 involved in drug metabolism.Drug Metab Pharmacokinet.2002；17(3)：167-89.]。在日本人中，约有1/5为慢代谢型，质子泵抑剂奥美拉唑(活赛克)和普奈活尔(心得安)在体内难以代谢。慢代谢型和快代谢型个体的血药浓度可相差7倍之多，这也不难理解为何在日本人群中这两种药物的不良反应较多。
CYP基因的多态性是造成个体对药物治疗反应的差异的主要原因之一，因此若能将药物遗传学的研究结果应用于疾病治疗，通过检测患者的CYP基因的遗传变异，使临床医生获得病人的遗传信息，以判断哪些药物治疗有效，有针对性地使用药物和剂量，有效地提高药物的疗效和降低药物的毒副作用，从而有望大幅降低医疗费用。而对于医药企业，根据药物遗传学和药物基因组学的信息，以及药物靶点和药物代谢的途径，选择合适的临床试验的人群，以提高药物对疾病治疗的疗效，降低药物的无效率和毒副作用，缩短药物的研究与开发的周期，提高药物的临床批准率；根据本国人的遗传结构，进行药物衍生物或同类药物开发。
由于CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19和CYP3A5等CYP基因在各群体中的等位基因型分布已研究的较为清楚，并且发现一种新的功能性遗传变异的概率是非常小的，因此完全可以利用现有的药物遗传学研究结果，对CYP基因的功能性或标记性遗传变异进行检测即可。其他一些单个碱基变异和短片段的插入/缺失，基本都可用一些常规的单核苷酸多态性分型方法检测，主要方法包括限制性酶切片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、等位基因特异性聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、等位基因特异性错配引物法、侵入切割、单碱基延伸SNaPshot和基因芯片。CYP2D6基因的缺失和重复除了RFLP外，还可用特殊的PCR方法和定量检测[Johansson I，Lundqvist E，Dahl ML，Ingelman-SundbergM.PCR-based genotyping for duplicated and deleted CYP2D6 genes.Pharmacogenetics.1996，6：351-5.Schaeffeler E，Schwab M，Eichelbaum M，Zanger UM.CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determinationby TaqMan real-time PCR.Hum Mutat.2003，22：476-85.]，
(1)限制性酶切片段长度多态性(RFLP)检测技术
这是于80年代后期首先建立的对CYP基因的多态性进行检测的DNA分析技术[Newton CR，Graham A，Heptinstall LE，Powell SJ，Summers C，Kalsheker N，SmithJC，Markham AF.Analysis of any point mutation in DNA：The amplificationrefractory mutation system(ARMS).Nucleic Acids Res.1989，17：2503-2516；Orita M，SuzukiY，Hayashi K.Rapid and sensitive detection of point mutationsand DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction.Genomics.1989，5：874-879.]。个体间细胞色素P450酶系活性差异是由其编码基因的碱基序列不同、基因缺失或重复所导致。这种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识别位置及酶切位点数目的不同，从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。用特异性探针对整个基因组DNA酶切片段进行杂交，即可分析限制性长度片段多态性(RFLP)。一定的内切酶组合所得到的RFLP可以和传统方法测定的代谢类型相关。80年代末发展起来的PCR技术已被用于RFLP分析，即用等位特异限制酶裂解PCR扩增的片段，然后再进行分析，从而大大提高了灵敏度。其缺点是获得完整的CYP基因的遗传变异的分型至少需要几天的时间，若需要分析的基因越多，遗传位点也越多，则可能需要一周以上的时间。并且直接利用基因组DNA进行RFLP，探针的放射性标记使得该技术只能在少数实验室中进行。
(2)等位基因特异性聚合酶链反应(ASPCR)
等位基因特异性聚合酶链反应是根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的(allele-specific)、或组特异性(group-specific)的引物，此即为序列特异性引物(SSP)。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的[Ji L，Pan S，Marti-Jaun J，Hanseler E，Rentsch K，Hersberger M.Single-step assaysto analyze CYP2D6 gene polymorphisms in Asians：allele frequencies and a novel*14B allele in mainland Chinese.Clin Chem.2002，48：983-8；Hiratsuka M，Agatsuma Y，Omori F，Narahara K，Inoue T，Kishikawa Y，Mizugaki M.Highthroughput detection of drug-metabolizing enzyme polymorphisms byallele-specific fluorogenic 5’nuclease chain reaction assay.Biol Pharm Bull.2000，23：1131-5.]。该方法的缺点是每个反应只能对一个位点进行检测，通量水平低下，并且易于产生假阳性结果。
(3)等位基因特异性错配引物法
等位基因特异性错配引物法[Ishiguro A，Kubota T，Soya Y，Sasaki H，YagyuO，Takarada Y，Iga T.High-throughput detection of multiple geneticpolymorphisms influencing drug metabolism with mismatch primers inallele-specific polymerase chain reaction.Anal Biochem.2005，337：256-61.]是通过在等位基因特异性引物的3’端第2位碱基对上引入错配碱基来区分野生型和突变型的序列。除此以外，还在3’端第3位碱基对上引入错配碱基以提高ASPCR在分型突变类型为点突变的突变基因型时的特异性。该方法不仅能分型点突变，而且亦能分型CYP2D6基因的结构性改变，包括缺失和重复。但其缺陷亦是不能多重水平分型，通量水平较为低下。
(4)侵入切割
侵入切割是依据FEN酶的酶切特性来设计一条侵入探针(与多态位点3’端序列互补，错配的3’末端碱基与SNP重叠)和两条SNP等位基因特异性探针(含有与多态位点及其5’端序列互补的序列)，将多态性位点置于侵入探针和等位基因特异性探针之间的重叠处[Olivier M.The Invader assay for SNP genotyping.Mutat Res.2005，573(1-2)：103-10；Nevilie M，Selzer R，Aizenstein B，Maguire M，HoganK，Walton R，Welsh K，Neri B，de Arruda M.Characterization of cytochrome P4502D6 alleles using the Invader system.Biotechniques Suppl.2002，34-8，40-3.]。正确的重叠结构仅在侵入探针和完全匹配的等位基因特异性探针间形成，而非单碱基错配的探针。这样等位基因特异性探针的5’端就如同在侵入探针的侵入下而呈翼状探出，进而被FEN酶切下。等位基因特异性探针被切割后，导致5’端的荧光基团和内部的淬灭基团分离，从而产生荧光信号。所设计的侵入探针在检测温度中与靶核苷酸序列保持结合状态，而等位基因特异性探针的退火温度与反应温度非常接近，使得等位基因探针处于退火和分离的动态变化之中。一旦退火的等位基因特异性探针被FEN酶切割后，残留的探针片段脱落离开后，新的未切割的等位基因特异性探针又可结合到同一位点上。这种设计在90分钟内，每个靶核苷酸分子的切割率大约在3000个探针分子[Lyami chev V，Mast AL，Hall JG，Prudent JR，Kaiser MW，Takova T，Kwiatkowski RW，Sander TJ，de Arruda M，Arco DA，Neri BP，Brow MA.Polymorphismidentification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavageof oligonucleotide probes.Nat Biotechnol.1999；17：292-296.]，足够不经靶序列扩增即可检测。此方法的优点在于等温反应，无需PCR扩增即可分型。然而由于CYP基因家族成员之间序列的高度同源性，需要预先扩增目的基因方能用于侵入切割检测，并且无法做到多重水平，显然对于多个SNP位点的分型，通量水平也较为有限。
(5)单碱基延伸SNaPshot
SNaPshot的原理是预先扩增含靶SNP位点的核苷酸序列后，反应体系中未使用的PCR引物和游离的dNTPs同时分别被E.coli exonuclease I(ExoI)和ShrimpAlkaline Phosphatase(SAP)降解。然后加入另一条5’末端碱基紧邻SNP位点的位点特异性引物和荧光标记的ddNTPs而非dNTPs。考虑到ddNTPs的结构，只有一个碱基才可以添加到引物上，而且与SNP位点配对。SNaPshot技术类似于测序试剂盒，只是在反应体系中只加入荧光标记的ddNTP，不加入dNTP，因此，测序反应只延伸一个碱基，反应结束之后，即可利用毛细管电泳和片段分析软件分析这单个碱基。通过在每个SNP的位点特异性引物中引入长度填充片段，根据每个SNP位点特异引物长度的布通来区分SNP，达到多重水平的目的[Sistonen J，Fuselli S，Levo A，SajantilaA.CYP2D6 genotyping by a multiplex primer extension reaction.Clin Chem.2005，51：1291-5.]。其缺点是需要预先扩增CYP2D6基因，并且多重水平仍很有限，所能分型的CYP2D6基因非常有限。
(6)基因芯片
2004年9月，Roche与Affymetrix合作开发的基因分析芯片AmpliChip CYP450正式获得了欧盟的核准，成为全球第一片针对人体药物代谢基因CYP450的药物基因检测芯片产品[Kling J.Roche’s microarray tests US FDA’s diagnostic policy.Nat Biotechnol.2003，21(9)：959-60.]。AmpliChip CYP450芯片拥有15,000点的核酸探针，可以用来检测患者体内负责药物代谢的CYP2D6和CYP2C19的基因型。这二个基因与目前大约25％的处方药代谢有关，若能在临床诊断之前给予检测，将有助于医疗人员开立正确的处方用药。此次Roche的AmpliChip CYP450基因检测芯片能获得欧盟核准，除了象征药物基因组学已由研究跨入基因检测之外，亦对基因芯片的产品开发开拓了新的应用商机。AmpliChip CYP450的主要缺陷是仅含CYP2D6和CYP2C19，所能分析的CYP450基因型仍属有限。另一个P450基因芯片是CodeLink P450生物芯片，该芯片由通用电气医疗集团(GE Healthcare)开发推出的，采用了等位基因特异性引物延伸(allele-specific Primer extension，ASPE)技术。尽管CodeLinkP450生物芯片能检测9个CYP450基因的110种多态性，但是需要12个多重反应进行DNA制备，因此它的DNA制备方法多重水平低下，而显得十分繁琐，限制了它的实际应用。
快速、准确的基因多态性检测对药物的开发研究、药物的毒理实验、改善药物的临床实验、监测药物的有效性和安全性都具有重要的作用。检测单个CYP基因的遗传变异，由于所能分型的基因型有限，临床检测诊断的实用性较低。只有集合CYP超基因家族中多个重要基因的遗传变异，尽可能分型所有功能相关基因型，方能对个体的代谢表型做出准确预测，达到临床检测诊断的目的。并且由于CYP基因的高度多态性，所涉及的遗传变异在几十至几百不等，显然传统的检测方法由于通量水平低，难以应用于个性化医疗中。为此，寻求一种高通量的基因筛检方法尤为重要。与传统检测方法相比，基因芯片技术具有高通量，平行性和微量化等特点，可以同时对很多疾病相关基因或药物效应相关基因进行检测，避免了繁琐而费时的常规基因分型，且这些特点使得医务人员在短时间内便可以掌握患者大量的遗传信息，有助于医生及时找到正确的用药方案，指导患者合理用药。作为第一张药物基因临床检测芯片，AmpliChipCYP450仅含CYP2D6和CYP2C19，所能分型的基因仍很有限。在I相药物代谢中，约有40％的药物是由CYP2C9、CYP2C19或CYP2D6代谢的。另一方面，尽管CYP3A4代谢的药物种类最多，但由于缺乏功能性变异，以及与CYP3A5存在着广泛的底物重叠，CYP3A5的多态性表达基本代表了CYP3A个体间的代谢差异。因此，CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5这四个基因所代谢的药物种类，基本涵盖了CYP基因超家族所代谢的药物种类。检测分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遗传变异，将至少能对40％以上的临床常用药物的治疗效应做出预测，以达到个性化医疗的目的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片，它能有效检测分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遗传变异，对40％以上的临床常用药物的治疗效应做出预测。
本发明要解决的技术问题之二是提供一种应用上述芯片检测细胞色素P450基因遗传变异的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
在本发明的一个方面，提供了一种细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片，它包括：固定在固相载体上的与待测细胞色素P450基因核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针。
本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果就可以。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
所述待测细胞色素P450基因包括CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9和CYP3A5基因。
所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度是没有限制的，只要能完成特异性杂交的功能，与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。如果所述探针中可能还有一定程度的错配碱基，则所述探针可以加大长度来抵消错配碱基的不利影响，以提高杂交效率。
本发明检测芯片的探针为DNA，包括：(1)与待测CYP2D6基因杂交的(a)SEQ IDNO：1～SEQ ID NO：76所示序列，(b)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：76所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：76所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(2)与待测CYP2C19基因杂交的(a)SEQ ID NO：77～SEQ ID NO：94所示序列，(b)SEQID NO：77～SEQ ID NO：94所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：77～SEQ IDNO：94所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(3)与待测CYP2C9基因杂交的(a)SEQ ID NO：95～SEQ ID NO：112所示序列，(b)SEQ ID NO：95～SEQ ID NO：112所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：95～SEQ ID NO：112所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(4)与待测CYP3A5基因杂交的(a)SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：163所示序列，(b)SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：163所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：163所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
优选的，本发明检测芯片的探针选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：163所示序列。
所述探针序列可包含1～10个错配碱基，较佳地，可包含1～5个错配碱基，更佳地，可包含1～2个错配碱基。
本发明检测芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。
本发明检测芯片可使用任何适当的阴性对照探针，所述阴性对照探针最好能与阳性对照探针有1～5个碱基对的错配。
本发明检测芯片可使用任何合适的阳性对照探针，所述阳性对照探针最好能与目的核苷酸序列、以目的核苷酸序列为模板扩增产生的核苷酸序列或人工合成的核苷酸序列的一部分互补。
本发明检测芯片可使用任何适当的杂交对照探针，所述杂交对照探针最好与人工合成的跟目的基因无关的核苷酸序列互补，也可与一段人工合成的经标记的序列互补或与一段人工合成的经标记的序列有1～10碱基对的错配。
本发明检测芯片可使用任何适当的固定化对照探针，它是芯片表面化学修饰、点样和固定化过程的内部对照，它不与任何核酸序列杂交。固定化对照探针可一端进行化学修饰，另一端带有可检测的标记。
本发明检测芯片所用到的芯片可包含任何一条、部分或全部阳性对照探针、阴性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。这些对照探针可用任何排布方式固定于芯片上，如：可被排布在芯片的四角、中心等进行有规律的排布或随机排布。
所述探针可用多种方法固定于载体上，如点样法(USA Patent No.5288514，USAPatent No.5556752)、光介导法(USA Patent No.5143854，5384261和5561071)、磁珠法(USA Patent No.5541061)等。所述探针可以通过化学或物理的方法，固定于载体上，如通过离子键、共价化合或其它已知的力吸附在载体上，如可用紫外交联仪将所述探针固定于载体上。
所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slidescoated with an agarose film.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。
所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2-轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。
所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH2修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH2修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。
所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记选自：荧光素标记、酶标记、放射性元素标记、发光标记、化学标记和荧光共振能量转移标记。
在本发明的另一方面，提供了一种应用上述芯片检测细胞色素P450基因遗传变异的方法，包括如下步骤：
(1)从合适样品中抽提待测细胞色素P450基因的核酸；
(2)待测细胞色素P450基因目的核苷酸序列的制备；
(3)标记步骤(2)的目的核苷酸序列；
(4)选取权利要求1所述的芯片，在适于与所选芯片进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；
(5)检测杂交反应的结果。
本发明的方法中所述合适样品包括：来自于人类和动物的血液、唾液、毛发及其它任何含有核酸的组织、以及来自植物和环境产物(如泥土或水)的样品。
样本的核酸能用任何合适的方法从样品中被抽提出来。例如，样本核酸能用磁珠从样品中抽提出来，很多生物公司能提供核酸抽提的试剂盒，如Qiagen，Invitron等。
由于技术的进步，现在已可以不经核酸抽提，直接用靶样本中的含核酸的细胞进行扩增。靶样本的含核酸的细胞能用任何合适的方法从样品中被抽提出来。例如，靶样本中含核酸的细胞能用磁珠从样品中分离出来。
所述目的核苷酸序列的制备可包括扩增的步骤，用分离的靶样本中含核酸的细胞直接扩增，也可用抽提的靶核酸直接扩增。如用磁珠从全血中分离白细胞，直接用分离的白细胞或用全血抽提的核酸作模板，扩增目的核酸序列。扩增得到的单链或双链的DNA或RNA可含有荧光或生物素标记，标记的DNA或RNA可不经纯化直接用于杂交。与本发明中所述芯片杂交的优选靶核苷酸分子是单链核酸分子，双链核酸分子经过变性等处理后也于本发明所述芯片杂交。
目的核苷酸序列可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，连接酶链反应(ligase chainreaction，LCR)，滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，链置换扩增(stranddisplacement amplification，SDA)和转录介导的扩增(transcription medicatedamplification，TMA)等。TMA方法最好使用T7启动子。
单链DNA可使用不对称PCR获得。不对称PCR中两条引物可以是任何适当的比例，比如从1∶3到1∶200。不对称PCR中两条引物可以有相同的或者不同的Tm值，例如两引物的Tm值的差异可以是1℃到20℃。不对称PCR也可以使用三条引物，两条有相同或相近的Tm，另一条相差范围1℃到20℃。引物可以是直链或带有发卡结构。可使用单一或组合的退火温度。例如：不同的退火温度可以相差1℃到20℃。有较低的Tm值的引物可以用于双链的扩增，另一条有较高的Tm值的引物可以在有一定双链后扩增单链DNA。通过这种PCR过程产生的单链目的核苷酸可以不经过纯化直接用于杂交。
单链RNA也可以通过TMA方法得到。含有一个T7启动子的引物使用RNA聚合酶用于扩增。用单链DNA或RNA杂交，避免了用双链所带来的PCR产物的纯化和变性以及杂交信号弱或丢失的问题。
只要用于杂交的目的核苷酸序列的长度足够以产生特异性杂交，所述目的核苷酸序列长度在上下游方向上并无限制。合适的目的核苷酸序列长度从30到200碱基对长度。杂交用的靶核苷酸序列过长或过短，会影响杂交效率，并使得杂交在探针上的靶核苷酸序列易于被洗脱下来，导致荧光信号过弱或丢失。较长的DNA片段，可用DNase I进行片段化处理，或者在反应体系中加入适当比例的脱氧尿嘧啶，然后PCR产物用尿嘧啶DNA糖苷酶处理，片段化DNA片段。至于RNA，处理方法较为简单，直接用高盐和高温处理即可。
在本发明的一个实施例中，目的核苷酸序列的制备采用PCR扩增方法，该方法所用引物含有(a)SEQ ID NO：164～SEQ ID NO：193所示序列的核苷酸链，(b)SEQ IDNO：164～SEQ ID NO：193所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：164～SEQ IDNO：193所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
优选的，本发明的引物序列为SEQ ID NO：164～SEQ ID NO：193所示序列的核苷酸链。
所述探针和目的核苷酸序列之间的杂交可同源，也可非同源。
所述探针或目的核苷酸序列都适合用于标记。探针在合成引入标记，目的核苷酸序列可以在扩增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。
合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。
本发明方法的杂交可以在任何杂交液中进行，如含有SSPE和表面活性剂的杂交液。杂交液可以含有任何浓度的SSPE，例如1～10×SSPE。也可以使用任何适当的表面活性剂，如Triton-100，SDS，SLS(十二烷基肌氨酸钠)，CTAB(六烷基三甲基溴化铵)等。杂交液中也可有任何浓度的表面活性剂，如0.01～1％(w/w)。所述的杂交可在任何适当的温度下进行，如25℃～65℃，所述杂交时间为5分钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。
所述杂交结果在检测前的洗涤可使用任何适当的洗涤液，该洗涤液可含有0～3％(w/w)的表面活性剂，洗涤可持续适当的时间，如1～30分钟。可以用室温的洗涤液进行洗涤，或预热后洗涤，如42℃。可用不同的洗涤液先后进行洗涤。
所述探针和目的核苷酸序列之间的杂交可以采用任何已知的方法进行检测。根据标记的不同，可以选用合适的检测方法，例如荧光标记的探针或目的核苷酸序列可以用激光扫描仪或荧光仪检测，放射性元素标记的探针或目的核苷酸序列可以用放射自显影检测。
总体杂交特异性可以用任何适当的标准来确定，例如可按中国专利CN1566366A描述的方法来确定。
芯片的阳性信号可以用任何适当的标准来确定，例如可按中国专利CN1566366A描述的方法来确定，或以杂交信号大于平均背景噪音与3倍标准差之和的方法来确定。
本发明也可用于目的基因的拷贝数检测。结合于芯片探针上的目的核苷酸序列的数量能够被检测，并且与目的基因的拷贝数相关。根据含有已知拷贝数的对照基因的核苷酸序列的数量可以对目的基因的拷贝数进行定量。荧光能用光电倍增管CCD或激光扫描探测。
本发明的细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片及其应用，与传统检测方法相比，对基因筛检具有高通量，平行性和微量化等优点，它能有效分型CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A5的遗传变异，使医务人员在短时间内便可掌握患者大量的遗传信息，及时找到正确的用药方案，指导患者合理用药。
附图说明
图1是本发明的单对引物PCR扩增后的电泳检测结果图；
图2是本发明的多重PCR扩增后的电泳检测结果图；
图3是本发明PCR产物片段化后的电泳检测结果图；
图4是本发明检测芯片的杂交结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1  基因芯片的制备
1.探针溶解
每条探针用TE溶液稀释，终浓度为10mM。将浓度为10mM的探针与浓度为200mM的PBS溶液于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。
2.点样
将预先设计并合成好的探针通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：65-75％(以FullMoon片基为准)，温度为25℃的条件下点样，点样的格式为1×3，每个矩阵为8×18，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。
实施例2  待测样品的处理和标记
1.人基因组DNA抽提及目的基因的扩增
采用FlexiGene DNA Kit(250)(QIAGEN，Cat.No.51206)试剂盒抽提人外周血中基因组DNA，具体步骤如下：
(1)将ACD(枸橼酸8g/L，枸橼酸钠22g/L，葡萄糖24.5g/L)抗凝的外周全血混匀取1ml入15ml离心管，加入2.5ml缓冲液FG1，充分颠倒混匀；
(2)2000g离心5分钟，弃去上清。静置2分钟；
(3)加入500ul缓冲液FG2/QIAGEN蛋白酶混合试剂，立即混匀，直至原有的沉淀完全消失；
(4)65℃水浴10分钟，40次/分匀速振荡；
(5)加入500ul 100％异丙醇充分混匀，直至出现可见的DNA絮状沉淀；
(6)3000g离心5分钟，弃去上清，倒置2分钟；
(7)加入500ul 70％乙醇，振荡；
(8)3000g离心5分钟，弃去上清，倒置约1小时，直至管内不再有水珠；
(9)加入200ul缓冲液FG3溶解DNA，轻轻振荡，溶解过夜；
(10)将抽提溶解好的DNA移入高压灭菌过的1.5ml离心管中，取1ul进行电泳(1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，EB，80MV，1.5小时电泳)，在FR-200紫外与可见分析装置上拍摄照片，并对照marker(Lambda DNA/EcoRI+HindIII)进行定量。用于CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9和CYP3A5基因扩增的引物为SEQ ID NO：164～SEQ IDNO：191所示序列的核苷酸链。PCR扩增用30μl反应体系进行，反应体系是0.3mMdNTP、10mM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgCl2、20％ Q solution(Qiagen)、上游和下游引物的浓度0.16μM、基因组DNA 10ng，Taq酶0.6U(Takara)。应用Touch-downPCR反应程序[Don RH，Cox PT，Wainwright BJ，Baker K，Mattick JS.’Touchdown’PCR to circumvent spurious priming during gene amplification.Nucleic AcidsRes.1991，19：4008]：94℃变性5min；94℃变性40s，64℃退火1min，每个循环降低0.5℃，72℃延伸50s，共10个循环；然后94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后用1.5％琼脂糖凝胶检测扩增结果，PCR产物的检测结果如图1所示，图1中的PCR产物名称和长度从左到右依次为：CYP2D6P1是1184bp、CYP2C9P1是365bp、CYPA5P3是567bp、CYP3A5P2是639bp、CYP3A5P1是690bp、CYP2C19P2是400bp、CYP2D6P3是671bp、CYP3A5P4是393bp、CYP3A5P5是510bp、CYP3A5P7是668bp、CYP2D6P4是517bp、CYP2D6P2是1497bp、CYP3A5P6是473bp、CYP2C19P1是1732bp以及CYP2C9P2是914bp，与理论数值一致。
当进行多重PCR反应时，将SEQ ID NO：164～SEQ ID NO：191所示序列的引物放入一个反应体系中进行扩增，体系为50μl。多重PCR的反应体系为：每种dNTP 0.3μmol/L，Tricine-KOH(PH8.7)40mmol/L，KCl 16mmol/L，MgCl2 3.5mmol/L，BSA3.75μg/ml，每条引物2μmol/L，DNA 80ng和2.2×Titanium Taq DNA聚合酶(ClontechLaboratories Inc.，USA)。多重PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，66℃退火2.5min，68℃延伸4min，共40个循环；最后68℃延长10min。PCR扩增后，取3μl PCR反应产物做琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图2。这些PCR产物经处理后可用于下面的杂交步骤。
2.PCR产物纯化和片段化
每个样品的所有PCR产物混合，用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Cat.No.28106)纯化，具体步骤如下：
(1)加入5倍PCR产物体积的缓冲液PB，混匀，无需去除石蜡油或煤油；
(2)将QIAquick离心柱放置于试剂盒提供的2ml收集管子中；
(3)将样本加入QIAquick离心柱中，离心30-60s，以结合DNA；
(4)倒掉2ml收集管子中的离心液体，将QIAquick离心柱放到原收集管子中；
(5)将0.75ml缓冲液PE加入到QIAquick离心柱中进行洗涤，离心30-60s；
(6)倒掉2ml收集管子中的离心液体，将QIAquick离心柱放到原收集管子中，离心1min；
(7)将QIAquick离心柱放置于高压灭菌的1.5ml的离心管子中；
(8)在QIAquick膜中央加入50μl缓冲液EB(10mM Tris-Cl，pH 8.5)或H2O以洗脱DNA，离心1min，为了提高DNA的浓度，可在QIAquick膜中央只加入30μl洗脱缓冲液，静置1min，然后离心。
纯化的PCR经测定浓度后，用DNase I进行片段化。片段化的反应体系包括：
Figure A20061002900500201
反应条件为37℃温浴5min，然后95℃ 15min。片段化后的产物跑1.5％琼脂糖凝胶，电泳检测结果如图3所示。
3.荧光素标记
利用脱氧核苷酸转移酶在3’末端进行荧光素标记，标记的反应体系包括：
Figure A20061002900500202
反应条件为37℃温浴120min，然后95℃加热15min。
实施例3  杂交、洗涤和结果检测
荧光标记的PCR产物95℃变性10min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应体系包括：
Figure A20061002900500203
反应条件为48℃温浴120min，然后相继用1×洗涤缓冲液I(5×SSC，0.1％SDS)、1×洗涤缓冲液II(2×SSC，0.1％SDS)和1×洗涤缓冲液III(1×SSC)在42℃各洗涤10min，最后用ddH2O洗涤0.5min。
洗涤后的芯片，经甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图4所示，再用GenePix Pro处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析就可以得到目的基因的基因型，图4所示的分型结果是CYP2D6*10，CYP2C19*1，CYP2C9*1和CYP3A5*3。
                              序列表
<110>上海生物芯片有限公司
<120>细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片及其应用
<130>NP-10646
<160>188
<170>PatentIn version 3.3
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<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>33
aaccactccc gtgggtgat                                             19
<210>34
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<210>36
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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ctagctcagg acgggactga ag                                         22
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
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<211>25
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<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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aactgagcac tggatgacct g                                          21
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
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agcccagacc cccccgagac ct                                         22
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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tgagaacctg agcatagtgg t                                          21
<210>61
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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atgatcctac atccggatgt g                                          21
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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tgatcctacg tccggatgt                                             19
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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ggatgtgcag catgagccca tct                                        23
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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gccgagggag aaagggtaca g                                          21
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<213>人工序列
<400>69
gccgagggag taagggtaca g                                          21
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
ttgattattt ccagggaacc cataa                                      25
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>84
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
tgattatttc cctggaaccc ataac                                      25
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
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<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
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caaaatggag aaggaaaaat gttaacaaa                                  29
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<210>93
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>94
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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cattgaggac tgtgttcaag a                                          21
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
cattgaggac agtgttcaag a                                          21
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<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>98
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>99
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<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>100
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
gaaaatggag aaggtaaaat gta                                        23
<210>102
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
gaaaatggag aggtaaaatg ta                                         22
<210>103
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
gaaaatggag ggtaaaatgt aa                                         22
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>104
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<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>105
gcagaaactg gagcccc                                               17
<210>106
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>106
gcagaaacag gagcccc                                               17
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>107
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<210>108
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>108
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<210>109
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>109
atacattgaa cttctcccc                                             19
<210>110
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>110
ccagagatac attgaccttc t                                          21
<210>111
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>111
ccagagatac cttgaccttc t                                          21
<210>112
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>112
ccagagatac tttgaccttc t                                          21
<210>113
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>113
cttttgtctt tcagtatctc ttccctg                                    27
<210>114
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>114
cttttgtctt tcaatatctc ttccctg                                    27
<210>115
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>115
cttttgtctt tcattatctc ttccctg                                    27
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<212>DNA
<213>人工序列
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tatgggaccc gtacacatg                                             19
<210>117
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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tatgggacct gtacacatg                                             19
<210>118
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>118
tatgggacca gtacacatg                                             19
<210>119
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>119
acccgtacac atggacttt                                             19
<210>120
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>120
acccgtacat atggacttt                                             19
<210>121
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>121
acccgtacaa atggacttt                                             19
<210>122
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>122
gtacacatgg actttttaag a                                          21
<210>123
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>123
gtacacatgg gactttttaa g                                          21
<210>124
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>124
gtacacatgg cactttttaa g                                          21
<210>125
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>125
cttttgtctt tcagtatctc ttccctg                                    27
<210>126
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>126
cttttgtctt tcaatatctc ttccctg                                    27
<210>127
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>127
cttttgtctt tcattatctc ttccctg                                    27
<210>128
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>128
ctcaaggagg tatgaaaata a                                          21
<210>129
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>129
ctcaaggagg catgaaaata a                                          21
<210>130
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>130
ctcaaggagg aatgaaaata a                                          21
<210>131
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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acatcacaaa attcattaca aaa                                        23
<210>132
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>132
acatcacaaa actcattaca aaa                                        23
<210>133
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>133
acatcacaaa aatcattaca aaa                                        23
<210>134
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>134
ctcaacaatc cacaagaccc ctttgtg                                    27
<210>135
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>135
tcaacaatcc acgagacccc tttgtg                                     26
<210>136
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>136
ctcaacaatc cactagaccc ctttgtg                                    27
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>137
ggagagcact aagaagttcc taaaa                                      25
<210>138
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>138
ggagagcact aaaaagttcc taaaa                                      25
<210>139
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>139
ggagagcact aataagttcc taaaa                                      25
<210>140
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>140
gtcttcaaga agccataggg a                                          21
<210>141
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>141
gtcttcaaga ggccataggg a                                          21
<210>142
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>142
gtcttcaaga tgccataggg a                                          21
<210>143
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>143
ggagattgat gcagttttgc                                            20
<210>144
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>144
ggagattgat acagttttgc                                            20
<210>145
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>145
ggagattgat tcagttttgc                                            20
<210>146
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>146
tagtactgca tggactcag                                             19
<210>147
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>147
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Claims (15)

1.一种细胞色素P450基因遗传变异的检测芯片，其特征在于，它包括：固定在固相载体上的与待测细胞色素P450基因核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针。
2.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述待测细胞色素P450基因包括CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9和CYP3A5基因。
3.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。
4.如权利要求3所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA，包括：
(1)与待测CYP2D6基因杂交的(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：76所示序列，(b)SEQID NO：1～SEQ ID NO：76所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1～SEQ IDNO：76所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(2)与待测CYP2C19基因杂交的(a)SEQ ID NO：77～SEQ ID NO：94所示序列，(b)SEQID NO：77～SEQ ID NO：94所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：77～SEQID NO：94所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(3)与待测CYP2C9基因杂交的(a)SEQ ID NO：95～SEQ ID NO：112所示序列，(b)SEQ ID NO：95～SEQ ID NO：112所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：95～SEQ ID NO：112所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列；
(4)与待测CYP3A5基因杂交的(a)SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：163所示序列，(b)SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：163所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：113～SEQ ID NO：163所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
5.如权利要求4所述的检测芯片，其特征在于，所述探针选自：SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：163所示序列。
6.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，它还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。
7.如权利要求1或3或6所述的检测芯片，其特征在于，所述探针可设有连接臂，且所述探针可被修饰。
8.如权利要求1或3或6所述的检测芯片，其特征在于，所述探针可被标记，该标记选自：荧光素标记、酶标记、放射性元素标记、发光标记、化学标记和荧光共振能量转移标记。
9.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。
10.一种应用权利要求1所述芯片检测细胞色素P450基因遗传变异的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从合适样品中抽提待测细胞色素P450基因的核酸；
(2)待测细胞色素P450基因目的核苷酸序列的制备；
(3)标记步骤(2)的目的核苷酸序列；
(4)选取权利要求1所述的芯片，在适于与所选芯片进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；
(5)检测杂交反应的结果。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述目的核苷酸序列为单链或双链的DNA或RNA，优选单链DNA或RNA。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述目的核苷酸序列的制备包括PCR扩增反应，该反应所用引物含有(a)SEQ ID NO：164～SEQ ID NO：193所示序列的核苷酸链，(b)SEQ ID NO：164～SEQ ID NO：193所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：164～SEQ ID NO：193所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述引物序列为SEQ ID NO：164～SEQ ID NO：193所示序列的核苷酸链。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述目的核苷酸序列的标记采用荧光素、生物素、放射性元素、酶或其它化学发光元素。
15.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的杂交温度为25℃～65℃，杂交时间为5分钟～18小时。
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