CN1616676A - 稳定的杂交体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在利用固相上杂交的核酸检测方法中用于进行更高灵敏度、而且高特异的微量检测的杂交体。作为固定于固相的探针核酸和样品核酸形成的杂交体,提供通过使上述样品核酸的靶链比上述探针核酸的探针序列长,具有该靶链的5′末端的部分至少延长到上述靶序列的5′侧,而该靶链的3′末端相当于上述靶序列的3′侧端部,或处于在上述靶序列的3′侧端部的3′方向延长至少1个碱基的部分的前端,当将具有上述靶链的5′末端的部分的碱基数表示为L1、将上述靶链3′末端的上述靶序列伸出的部分的碱基数表示为L2时,L1/L2の值满足0~1.5关系的杂交体。
Description
技术领域
本发明涉及到探针和样品核酸的稳定的杂交体的形成。另外本发明还涉及杂交体的形成中利用的探针、探针载体PCR用引物、以及它们的设计方法。
背景技术
就象人类基因组计划所代表的那样,各种生物的基因正在被阐明,生命活动的机制、疾病、体质等与基因的关系正在陆续被研究。而且通过了解基因有无和其存在量(表达量),可以了解例如疾病等的更详细的特征或类型、或有效的治疗方法的选择等。
研究检体具有的特定基因的有无和其存在量的方法,以前就想出了很多方法,其中,作为应用范围广,不管检测对象如何都适用的方法,广泛应用选择作为检测对象的基因或核酸的特征部分序列,通过研究其部分序列的有无和量来确定其有无或存在量的方法。具体来说,通过准备相当于被选择出来的部分序列的互补链的核酸序列(探针),用某些手段检测检体和探针的杂交,研究检体中核酸序列的有无的方法。
利用杂交的特定核酸的检测方法不管是固相、还是液相都可以用。例如在液相中进行时,准备双链形成时使分光特性变化的标记物质结合的探针溶液,将该溶液添加到检体中,通过测定其分光特性的变化研究检体中特定核酸的有无的方法就是其中一例。
在固相上进行杂交时,代表性的方法是预先使探针固定或吸附于固相上,向该固相上添加通过某些可检测的标记物质标记的检体,通过测定来自固相上的标记物质的信号,进行检测的方法。其中,探针固定在玻璃或金属等平面基板上的微阵列、或固定于微小粒子表面的(磁)珠等是代表性的固相杂交方式。固相上杂交被优选的理由是B/F分离容易,预期可以从物理上将检测区域微小化,高灵敏度化,通过用物理方法将多种探针隔离,可同时进行多项目的检测,由于是固相,所以其处理和应用都容易。
例如,在美国Affymetrix公司,使标记的核酸作用于平面基板上合成的寡DNA,通过荧光检测对其杂交进行测定,检测检体中具有的特定核酸的有无和量(参照美国专利第6410229号说明书)。另外,富士胶片公司使用预先导入了氨基的基板制作DNA阵列,利用该阵列检测标记的22mer单链DNA(参照特开2001-128683号公报)。
发明内容
利用固相上杂交的检测方法也象以往技术中所述的那样,虽然与其他检测方法相比,存在着高灵敏度的长处,但对于极微量的核酸检测的需要要求进行比上述灵敏度高的更高灵敏度、而且高特异的检测,不用说检测方法还需要改良。
为了提高检测性能,尝试着从各种各样的角度进行改善。作为改善方法,例如将捕获靶的探针的Tm值增高,使探针与靶的结合力提高的方法。另外也采用使对靶的标记率提高的发出强信号的标记物质结合,或标记物质本身被多个标记物质多次放大(增感剂)等方法。
然而提高探针结合力的方法有时会引起非特异的吸附或结合,使特异性大幅度降低,其效果是有限的。而改善标记方法的方法有时S/N比和定量性显著降低,其效果仍然是有限的。
除了探针的改良和标记方法以外,作为改善杂交效率的方法,还有使探针和靶形成的杂交体稳定的方法。为了使杂交体稳定,需要使杂交反应的环境、即盐浓度和变性剂浓度最优化,但有时仍然出现特异性、S/N比降低等。
因此,强烈期盼在核酸检测中更有效的稳定的杂交体的形成方法、为此目的的探针设计方法、检体制备方法等的开发。
为了解决上述课题反复进行了专心研究,结果发现通过将固相上的探针以及探针进行杂交的样品核酸设定在满足特定条件的序列上的位置关系,探针和样品核酸可以形成稳定的杂交体。
本发明的杂交体,是样品核酸的靶链具有的靶序列和与该靶序列互补的该探针核酸的探针序列结合的杂交体,其特征是:
上述靶链比上述探针核酸的探针序列长,当将上述靶链的5′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L1、将上述靶链3′末端侧的上述标记的序列以外的部分的碱基数表示为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系。
本发明涉及的探针是被设计成与具有靶序列的靶链形成上述杂交体的构成的探针。
本发明涉及的探针组是具有2个以上上述探针的探针组,还有,本发明的探针载体是载体上总探针数的50%以上为上述探针组的探针载体。
本发明涉及的探针设计方法是将探针设计成相对于具有靶序列的靶链形成上述杂交体的构成的探针设计方法。
本发明涉及的PCR用引物是制备成相对于上述探针可形成上述杂交体的构成的样品核酸的PCR用引物。
本发明涉及的样品核酸的检测方法是特征如下的检测方法,即在通过使固定于固相的探针核酸与比该探针核酸还长的样品核酸反应,对得到的杂交体进行检测的样品核酸检测方法中,将上述探针核酸的序列设计成可形成满足以下构成(1)和(2)的杂交体:
(1)是上述核酸的靶链具有的靶序列和与该靶序列互补的该探针核酸的探针序列结合的杂交体,
(2)上述靶链比上述探针核酸的探针序列长,当将上述靶链的5′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L1、将3′末端侧的上述标记的序列以外的部分的碱基数表示为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系。
本发明涉及的靶链是具有靶序列,和可作为与该靶序列互补的探针核酸的探针序列结合的杂交体的构成的样品核酸的靶链,
上述靶链比上述探针核酸的探针序列长,当将上述靶链的5′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L1、将3′末端侧的上述标记的序列以外的部分的碱基数表示为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系。
当该方法涉及的样品核酸是以检体核酸为模板的PCR扩增产物的情形时,最好是将该PCR用引物和上述探针设计成有可能形成满足上述构成(1)和(2)的杂交体。
本发明涉及的样品核酸检测用的试剂盒是特征如下的试剂盒:在具有用于从检体核酸使具有靶链(具有靶序列)的样品核酸扩增的PCR用引物、和用于确认在以该检体核酸为模板,使用该PCR用引物扩增的扩增产物中有无上述靶序列的固定于固相探针核酸的样品核酸的检测用试剂盒中,上述引物和上述探针核酸的序列被设计成可形成满足以下构成(1)和(2)的杂交体的序列。
(1)是上述探针核酸和样品核酸通过该样品核酸的靶链具有靶序列和与该靶序列互补的该探针核酸具有的探针序列形成的杂交部分结合的杂交体,
(2)上述样品核酸具有的靶链5′末端处于在上述靶序列5′侧端部的5′方向上至少延长1个碱基的部分的前头,而且、该靶链的3′末端处于上述靶序列的3′侧端部,或处于从上述靶序列的3′侧端部的3′方向至少延长1个碱基的部分,
当将上述靶链5′末端的部分的碱基数表示为L1、将上述靶链3′末端的上述靶序列3′末端部分延长部分的碱基数表示为L2(但是,将上述靶链3′末端相当于上述靶序列3′侧端部的情形定为L2=0)时,L1/L2的值满足0~1.5的关系。
本发明的杂交体只要是固定于固相的探针核酸和样品核酸的杂交体,无论使用什么样的组合都可以实施。其中,就象DNA微阵列所代表的那样,使作为探针的寡核苷酸和cDNA等的DNA固定于平面基板上,使他们与通过可检测的标志标记的样品核酸杂交的杂交体就是本发明比较优选的一个例子。
固定于固相上的探针可以通过各种各样的方式进行固定,作为代表的固定方法有共价结合、离子结合、吸附等,本发明的杂交体无论用哪一种固定方法都可实施。
这些方法中,通过共价结合的固定方法比较难于受到伴随杂交而发生的各种各样的条件变化(例如,加热或高盐浓度)的影响,在形成稳定的杂交体上是优选的结合方式。作为共价结合的具体的结合方法,可以无限制地适用通过可导入到固相上的官能团和可导入核酸探针侧的官能团的组合的各种结合方式,但在探针中使用合成寡核苷酸时,由于巯基和氨基、或其衍生物作为修饰官能团比较容易导入,所以经常使用。其中,向寡核苷酸的5′末端或3′末端导入上述官能团的方法在合成上容易,通过在寡核苷酸末端修饰的官能团固定于固相的探针适合用于本发明的杂交体。而即使在5′末端、3′末端以外,将来自寡核苷酸序列中间部位的核酸的官能团或人工合成的核苷酸衍生物整合到样品核酸中,也可以利用该官能团进行固定。
还有,DNA由于通过磷酸酯键形成其骨架,所以分子整体带有负电荷,也有可能使其吸附于例如固相上导入了带有正电荷的被覆剂或固相本体。
作为固定于固相的探针,可以使用具有各种各样的链长的探针。链长会带来特异性、结合力等各种特征,但具有15~30mer、31~50mer、51mer~80mer的各链长的寡核苷酸经常用作固定于固相表面的探针,是适合用作构成本发明杂交体的探针的碱基长度。
一般来说,作为探针经常使用寡核苷酸等核酸,也可以使用可期待进行强杂交的肽核酸(PNA)作为探针,通过形成本发明的具有L1和L2关系的杂交体,可以形成更稳定的杂交体。
L1和L2的关系只要是L1/L2的值满足0~1.5的关系,就可以形成本发明的稳定的杂交体。其中,L1/L2的值处于0~1范围时可以形成更稳定的杂交体。
样品核酸可用于以作为检查对象的检体本身、或以用各种方法从检体提取的核酸片段与探针的反应中,具有作为与探针进行杂交的部分的靶序列。该靶序列只要是可以特定假设有检体的序列的序列就可以,由于样品核酸的种类不同,可以是检体中直接具有的作为检测对象的序列的一部分本身,也可以是其互补序列。样品核酸是含具有与探针进行杂交的靶序列(与探针具有的探针序列互补的序列)的靶链的核酸,例如、无论双链DNA、单链DNA、RNA哪一种核酸在适当的条件下只要是可与固相探针杂交都适用于本发明。例如、单链DNA时,其自身就成了靶链。
另外,样品核酸的制备方法可以没有特别限制地运用,作为常用的制备方法,有PCR扩增法、RNA的逆转录,为了形成本发明的杂交体使用通过这些制备方法得到的PCR产物、逆转录产物合适。
就象DNA微阵列等所代表的那样,将固相上杂交用于特定碱基序列的检测时,多数情况下都是使任一个标记物质结合于样品核酸,整合了标记物质的样品核酸都适合用于本发明的杂交体的形成。
作为标记物质,一般常用处理容易,而且可高灵敏度检测的荧光物质,而利用放射线同位素标记在灵敏度方面优越,也适合运用。利用荧光物质时,荧光物质的种类很多,可以使用任一种荧光色素,但广泛应用的是Cy3和Cy5等荧光色素,都适合应用于本发明的杂交体。
虽然样品核酸的链长可以没有特别限制形成杂交体,但其中样品核酸的链长在500bp以上时可以形成稳定的杂交体。而当链长处于500bp以上2500bp以下时,可形成更稳定的杂交体。
在本发明中,对为了与样品核酸形成上述杂交体设计的探针提出了提案。即、对在样品核酸中可形成本发明的杂交体的位置上设定探针捕捉区域,形成固相探针和样品核酸具有本发明给出的位置关系的杂交体那样的探针提出了提案。
另外,对由2个以上不同种类探针构成的探针组也提出了提案。而当提供上述探针时,需要设计探针的序列等,也提出了为此目的的探针设计方法的提案。
为了有效利用用于靶核酸(序列)检测的探针,为了使B/F分离容易进行,有时预先在固体载体上固定探针,为此,对在固体载体上固定至少一个以上本发明的探针的探针载体也提出了提案。如在固体载体上固定至少一个以上探针的探针载体DNA微阵列,DNA微阵列作为本发明的探针固定化载体是很合适的一个例子。
另外,作为样品核酸象上述那样经常使用PCR产物,当制备PCR产物时,对满足上述L1和L2条件设计的PCR用的引物也提出了提案。
通过本发明在固相上探针和样品核酸形成杂交体中,可以得到更稳定的杂交体,另外可以获得其形成的条件。另外,一并提供满足本发明条件的探针、引物、和他们的设计方法、以及这些杂交体形成的相应的探针载体。通过本发明在固相上利用杂交的核酸检测方法中,可以进行有效而且高灵敏度的检测。
附图的简单说明
图1是表示固定于固相的A链探针和作为样品核酸的B链的杂交体的图。在样品核酸中由杂交体形成部分开始的5′侧的碱基链长用B5表示,而3′侧的碱基链长用B3表示。
图2是表示pUC118 EcoRI/BAP中3个引物的位置的图,箭头表示在各个引物中5′至3′的方向。
图3是表示在pUC118 EcoRI/BAP中3个引物、和3个探针的图。
图4是表示在pUC118 EcoRI/BAP中,由正向引物F1至F8、反向引物R1至R7、共计15种引物的位置关系的图,箭头表示在各个引物中5′至3′的方向。
图5是表示在pUC118 EcoRI/BAP中各引物、和3个探针的位置关系的图。
图6是在25mer的探针中辉度值对L1/L2作图得到的曲线图。
图7是在40mer的探针中辉度值对L1/L2作图得到的曲线图。
图8是在60mer的探针中辉度值对L1/L2作图得到的曲线图。
图9是表示固定了3′末端的探针和靶链的杂交体、以及L1、L2的位置关系的图。
图10是在3′末端固定的25mer的探针中辉度值对L1/L2作图得到的曲线图。
具体实施方式
就本发明的杂交体进行更详细说明。
通过本发明提供的杂交体是探针和在序列的一部分具有互补序列的样品核酸形成的杂交体,位于样品核酸的捕捉对象区域的5′侧的碱基数作为L1,位于3′侧的碱基数作为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系的杂交体。图1表示5′末端固定于固相的单链探针(A链)与具有互补序列的单链核酸(B链)的杂交体的模式图。在该图中,将B链的探针结合区域的5′侧的碱基链长作为B5(L1),3′侧的碱基链长作为B3(L2)时,具有B5≤B3的关系的杂交体是表示本发明的一个例子的杂交体。
只要L1/L2的值为0~1.5,就可以形成本发明的稳定杂交体,为了形成更稳定的杂交体,优选L1/L2的值处于0~1范围。
探针只要是被固定在任一固相上或固相表面,对其固定形式没有限制,可以形成本发明的杂交体。其中,玻璃基板上固定了核酸的DNA微阵列是其代表例,各种各样的DNA微阵列可以运用于本发明的杂交体。作为可用于固相的材料,除了玻璃以外,也可以运用树脂、金属、金属薄膜、纤维等,另外对其形式,没有限制,可以使用微粒子、光纤维顶端、多孔材料、纤维等。
作为结合方式,存在着吸附、化学结合等各种各样的方式,任一种结合方式都可以形成杂交体。例如、在用于解决课题的手段中记载的离子结合中,对于被覆着氨基的玻璃基板或树脂表面,仅提供给通常的核酸,就可以使其进行离子结合。
另外,使用对处于5′末端、3′末端、或序列中部的巯基、氨基等官能团进行修饰的修饰寡核苷酸,利用导入的官能团的反应也可以进行固定化。例如利用氨基时,可以预先使与处于固相表面的氨基有效反应的琥珀酰亚胺基结合、通过将位于5′末端或3′末端等的氨基进行修饰的寡核苷酸供给给固相表面,可以很容易形成共价键,适合用作构成本发明杂交体的探针。
而在使用巯基时,例如,通过使马来酰亚胺基结合于固相,与使用氨基时同样,容易形成共价结合,适合用作本发明的杂交体。
作为探针的种类,除了DNA等之外,也可以使用PNA等。作为探针也可以使用cDNA等,为了形成精度更高的杂交体,在探针中多使用通过化学手法合成的寡核苷酸,作为该探针的碱基链长,根据探针各自的特性经常利用15~30mer、31~50mer、51~80mer的探针。
形成本发明的杂交体的样品核酸只要是比固相上的探针链长长,可以没有特别限制地用于本发明的杂交体。
本发明的杂交体适用于DNA微阵列、(磁)株等上的核酸序列的检测。此时,样品核酸经常使用通过PCR扩增的PCR产物、转录物、逆转录产物等,这些核酸适用于本发明的杂交体。即、样品核酸无论双链、还是单链都可以,另外无论是DNA、还是RNA也都可以形成本发明的杂交体。
另外,利用分光学手法对杂交体的形成进行检测时,有时需要用任一标记物质、例如荧光物质对样品核酸进行标记,具有这样标记物质的样品核酸也可以形成本发明的杂交体。其中,以Cy3、Cy5为代表的Cy Dye(Amersham Pharmacia生产)经常用作核酸标记用的荧光物质,具有这些荧光物质的样品核酸可以没有任何问题适用于本发明的杂交体。
另外,作为具有与荧光物质同一水平的检测灵敏度的标记材料也经常使用32P等放射性同位素等,此时,本发明的杂交体也可以充分形成。
本发明的杂交体不管样品核酸的链长多长,都可以形成,其中500bp以上时可形成稳定的杂交体,具有500bp以上,2500bp以下的链长的样品核酸可以形成更稳定的杂交体。
样品核酸例如为双链DNA时,与探针形成杂交体部分以外的部分有时样品核酸本身也可与其互补链形成双链,即使是那样的场合也可能形成本发明的杂交体。即,固相上探针和样品核酸形成杂交体中,只要是存在具有上述的L1和L2关系的部分,形成本发明所示的稳定性高的杂交体也是可能的。
即使是当探针和样品核酸的双链形成部分的链长比探针长度还短时,即,探针以包含错配的方式与样品核酸形成杂交体的情形,稳定的杂交体的形成也是可能的(样品核酸)。此时,将核酸的5′末端至双链形成部分的末端部分的链长作为L1,而将3′末端至同一双链形成部分的末端部分的链长作为L2,只要是满足上述L1和L2的关系,都可以形成本发明的杂交体。
识别特定碱基序列,用于通过与固相上探针形成杂交体,检测对象物有无的探针往往是考虑到可以特异而且高灵敏度检测样品核酸后设计的。这些设计方法中的很多方法,由于只用于设计碱基序列,虽然在液相系杂交中可进行有效设计,但对于在固相上的杂交,未必进行最适合的探针设计。本发明的杂交体形成条件提供与固相上的杂交体稳定性相关的指标。在此,本发明中也提出了在固相上探针的设计中满足先前例举的条件的探针设计方法。
另外,也提出了通过该探针设计方法设计的探针。还提出了这些探针2个以上汇集的探针组。
作为多个不同种类探针被固定于固体载体上的探针载体的一个例子,如DNA微阵列,作为构成这样的探针载体的探针,利用本发明的探针时,载体上的总探针数中的50%以上优选是由本发明的探针构成,而70%以上构成比率更优选。在本发明中也提出了固定了那样多个探针(探针组)探针载体的提案。
满足条件的探针数的比例只要是在50%以上就可以,75%以上优选。
样品核酸为PCR产物等时,样品核酸序列中相对的探针区域可以通过设计的用于实施PCR扩增的引物的设计改变。样品核酸的碱基序列中可选作为探针区域的部分希望按照满足上述条件那样进行设计,但从特异性等观点考虑,有时未必在这样的条件下设定探针。此时,对探针区域进行设定时,只要进行探针区域满足权利要求1的条件的那样的样品核酸的引物设定就可以。在本发明中也提出了用于针对设定的探针区域形成满足上述条件的那样杂交体的样品核酸扩增用引物的提案。
【实施例】
以下通过实施例对本发明进行更具体的说明。但是,以下所述实施例是本发明涉及到的最好的实施方式的一个例子,本发明的技术范围并不限定于这些实施例。
I.pUC118 EcoRI/BAP的PCR
(1)引物的设计
作为具有检查对象的序列的检体的标本,选择市售的Takara公司生产的载体pUC118 EcoRI/BAP(全长3162bp),由其碱基序列中设计具有下面序列的3种引物。而有关pUC118 EcoRI/BAP的全碱基序列情报是由Takara公司提供的,另外由公开的数据库等也可以获得。
在进行引物设计时,要充分照顾到pUC118 EcoRI/BAP中的所期望的部分碱基序列要能够通过PCR扩增特异而且有效地被扩增、配列、GC%、融解温度(Tm值)之后进行设计。
设计的引物正向侧(F)2种、反向侧(R)1种,共计3种。通过以pUC118 EcoRI/BAP作为模板,使用F1和R1、或F2和R1的组合进行PCR扩增,应当可以扩增到分别为1324bp(PCR产物1)、940bp(PCR产物2)的PCR产物。表1给出了设计的引物的碱基序列和Tm值。
【表1】
名称 | 碱基序列 | Tm(℃) |
F1 | 5′TGATTTGGGTGATGGTTCACGTAG 3′(SEQ ID NO:1) | 60.9 |
F2 | 5′GAGCTGCATGTGTCAGAGGTTT 3′(SEQ ID NO:2) | 61.0 |
R1 | 5′ATCAGCAATAAACCAGCCAGCC 3′(SEQ ID NO:3) | 61.5 |
另外,图2给出了3种引物在pUC118 EcoRI/BAP全长中的位置。而在该图中,箭头表示的方向是各引物链的5′末端至3′末端的方向。
(2)引物的合成
合成实施例1的(1)中设计的3种引物。各引物的合成根据通用的方法利用DNA合成仪合成具有各个碱基序列的DNA链。纯化通过cartridge纯化进行,得到3种引物。得到的引物用TE缓冲液稀释到10μM浓度。
(3)PCR扩增反应
使用实施例1的(2)中合成的3种引物、作为模板DNA的Takara公司生产载体pUC118 EcoRI/BAP、和QIAGEN公司生产PCR试剂盒HotStarTaq Master Mix进行PCR扩增反应。在Master Mix中具有dATP、dCTP、dTTP、dGTP 4种脱氧核苷酸,为了通过荧光标记对PCR产物进行标记,加入Amersham Pharmacia公司生产的Cy3dUTP,通过Cy3对PCR产物进行标记。
作为正向引物和反向引物的组合,用(1)中所述2组组合进行PCR扩增。PCR的反应条件按照下面的程序,制备下面表2所示组成的反应液(1)和(2)。
【表2】
反应液组成
成分 | 组成 |
Master Mix(QIAGEN公司) | 25μl |
Template DNA(pUC118稀释物,Takara公司) | 1μl(10ng) |
正向引物F1(反应液1)or正向引物F2(反应液2) | 25μl(25pmol/tube) |
反向引物(R1) | 25μl(25pmol/tube) |
Cy3 dUTP(1mM,Amersham Pharmacia公司制造) | 2μl(25pmol/tube) |
H2O | 17μl |
合计 | 50μl |
关于制备的反应液,使用市售的热循环仪按照下面表3的温度循环程序进行PCR扩增反应。即、95℃/保持15分后、每一个循环为92℃(变性)/45秒、55℃(退火)/45秒和72℃(延伸)/45秒,进行25循环,最后,72℃/保持10分。
【表3】
PCR扩增反应的温度条件
步骤 | 温度 | 保持时间 | 重复次数 | |
1 | 95℃ | 15min. | ||
2 | 92℃ | (变性) | 45s | 25循环 |
3 | 55℃ | (退火) | 45s | |
4 | 72℃ | (延伸) | 1min. | |
4 | 72℃ | 10min. |
扩增反应结束后、PCR扩增产物用纯化用柱(Qiagen QIAquickPCR Purification Kit)进行纯化。纯化后,将PCR扩增产物溶液的液量调整到50μl。取得到的纯化后PCR扩增产物溶液的一部分,按照通常的方法进行电泳,确认在2种PCR产物(1)和(2)中分别出现具有所期望的碱基长度的带。
II.DNA微阵列的制作
(1)探针的设计和合成
对于上述PCR产物1设计了3种探针。探针设计与引物的设计同样,进行设计时要充分考虑到各探针要可以特异识别在PCR产物(1)中选择的部分碱基序列(靶序列),另外GC%、杂交体的融解温度(Tm值)要相同。
表4示出了设计的探针的碱基序列和Tm值。
【表4】
名称 | 碱基序列 | Tm(℃) |
P1 | 5′ATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGC 3′SEQ ID NO:4 | 75.7 |
P2 | 5′GTGGGTTACATCGAACTGGATCTCA 3′SEQ ID NO:5 | 75.8 |
P3 | 5′GATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGC 3′SEQ ID NO:6 | 75.7 |
在该探针设计中,与探针杂交、与探针形成杂交体的是由R1引物延伸的DNA链。
而P2和P3作为探针也可以与PCR产物2形成杂交体。
表5示出了在PCR产物1以及2和各探针的杂交体中,将存在于杂交体部的5′侧的靶链的链长作为L1,将存在于3′侧的链长作为L2,对于各PCR产物的各探针的L1、L2和L1/L2的值。
【表5】
PCR产物 | 探针 | L1 | L2 | L1/L2 |
1F1-R1 | P1 | 1053 | 246 | 4.28 |
P2 | 545 | 754 | 0.72 | |
P3 | 35 | 1264 | 0.03 | |
2F2-R2 | P2 | 545 | 370 | 1.47 |
P3 | 35 | 880 | 0.04 |
图3示出了在pUC118 EcoRI/BAP全长中的3种探针、3种引物的位置。
(2)玻璃基板的清洗
将合成石英的玻璃基板(大小(W×L×T):25mm×75mm×1mm、饭山特殊玻璃公司生产)放入耐热、耐碱性的槽中,浸入到调整到所定浓度的超音波清洗用的洗涤液中。于洗涤液中浸泡过夜后,进行20分钟的超音清洗。然后取出玻璃基板,轻轻地用纯水涮涮后,于超纯水中进行20分钟超音清洗。然后将玻璃基板在加热到80℃的1N氢氧化钠水溶液中浸泡10分钟。再次进行纯水清洗和超纯水清洗,准备DNA微阵列用的洗涤过的石英玻璃基板。
(3)表面处理
将硅烷耦合剂KBM-603(信越硅公司生产)溶解于纯水中使其浓度变为1%,于室温下搅拌2小时。然后将洗涤过的石英玻璃基板浸泡于该硅烷耦合剂水溶液中,于室温下放置20分钟。提出玻璃基板,用纯水轻轻清洗表面后,用氮气吹玻璃基板的两面,使其干燥。然后,将氮气流干燥的玻璃基板在加热到120℃的烘箱中焙烘1小时,使耦合剂处理完结。通过该耦合剂处理,来自硅烷耦合剂的氨基被导入到玻璃基板表面。
另一方面,准备将同仁化学研究所公司生产的N-马来酰亚胺己氧基琥珀酰亚胺(N-(6-Malemidocaproyloxy)Succinimido);以下、略称为EMCS)溶解于二甲亚砜和乙醇的1∶1混合溶剂中,使其最终浓度为0.3mg/ml的EMCS溶液。焙烘结束后、将耦合剂处理后的玻璃基板放冷,在室温下在制备的EMCS溶液中浸渍2小时。在浸渍处理期间,导入到耦合剂处理过的玻璃基板表面的氨基和EMCS的琥珀酰亚胺基反应,将来自EMCS的马来酰亚胺基导入到玻璃基板表面。将从EMCS溶液捞出的玻璃基板用上述的二甲亚砜和乙醇的混合溶剂洗涤,再用乙醇洗涤后,于氮气氛围下干燥。
(4)探针用DNA的合成
合成上述(1)中设计的3种探针。
为了使探针DNA与上述表面导入了马来酰亚胺基的玻璃基板共有结合,根据通用的方法对5′末端实施巯基化处理。然后,为了避免DNA合成时的副反应,脱去实施保护的保护基,再实施HPLC纯化和脱盐处理。
得到的探针DNA溶解于纯水中,分别使最终浓度(墨水溶解时)为10μM那样分注后,进行冷冻干燥,除去水分。
(5)由BJ打印机吐出的探针DNA、以及与基板表面结合
准备含有甘油7.5重量%、硫二甘醇7.5重量%、尿素7.5重量%、アセチレノ一ルEH(川研フアインケミカル公司生产)1.0重量%的水溶液。然后将分注的探针DNA溶解于上述混合溶剂中使之达到规定浓度(10μM)。将得到的探针DNA溶液充填到BJ打印机(商品名:BJF-850,佳能公司生产)的墨盒中,装到印字头上。
而上述BJ打印机可以改造成可向平板进行喷墨印刷的机器。而改造的泡(雾)喷射印刷机可以按照所定的膜作成方法,通过输入印字图形,在约120μM间距点印约5pl的DNA溶液液滴。
然后,使用这个改造的泡(雾)喷射印刷机,进行将探针DNA溶液点印到玻璃基板表面的操作。每1枚DNA微阵列,对于每个探针进行16点的吐出那样预先做成印字的图案,进行喷墨印字。用放大镜等确认DNA溶液确实点印到目的图案后,于常温下,在加湿盒内静置30分钟,使玻璃基板表面的马来酰亚胺基和探针DNA5′末端的巯基反应。
(6)洗涤
在加湿盒内进行30分钟反应后,用具有100mm的NaCl的10mm磷酸缓冲液(pH7.0)将残留在玻璃基板表面的未反应的探针DNA冲洗掉。得到在玻璃基板表面按照1枚16点,所定的单链探针DNA各个被固定了的DAN微阵列。
III.杂交反应
使用II中制作的DNA微阵列和作为样品核酸检体在I中制作的PCR扩增产物,在微阵列上进行杂交。
(1)DNA微阵列的封闭
将BSA(牛血清清蛋白Fraction V:Sigma公司生产)按照终浓度为1重量%那样溶解于100mM NaCl/10mM磷酸缓冲液,将II制作的DNA微阵列于室温下在上述溶液浸泡2小时,对玻璃基板面进行封闭。封闭结束后,用含有0.1重量%SDS(十二烷基硫酸钠)的2×SSC溶液(NaCl 300mM、Sodium Citrate(Trisodium CitrateDihydrate,C6H5NA3·2H2O)30mM、pH7.0)进行清洗后,用纯水轻洗。然后用旋转干燥装置除去DNA微阵列的水分。
(2)杂交溶液的制备
在各PCR产物按照相互等摩尔那样制备后,用PCR扩增产物溶液将最终浓度做成如下构成的对于各PCR产物的杂交溶液。
<杂交溶液>
6×SSPE/10%Form Amide/PCR扩增产物溶液
(6×SSPE:NaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、pH7.4)
(3)杂交
将除去水分后的DNA微阵列放置在杂交装置(Genomic SolutionsInc.Hybridization Station)中,使用上述组成的杂交溶液,按照下面步骤·条件进行杂交反应。
<杂交条件·步骤>
将上述杂交溶液加热到65℃并保持3分钟后,再于92℃保持2分钟、然后在55℃下保持4小时。完成上述操作后,用2×SSC和0.1%SDS于25℃下进行清洗。再用2×SSC于20℃下进行清洗,根据需要,可以按照通常的指南用纯水轻洗,最后用旋转干燥装置除去水分,使其干燥。
【表6】
操作 | 操作步骤和条件 |
反应 | 65℃3min→92℃2min→55℃4h |
洗涤 | 2×SSC/0.1%SDS在25℃ |
2×SSC在20℃ | |
轻洗 | H2O(手工轻洗) |
干燥 | 旋转干燥 |
(4)荧光测定
杂交反应结束后,对于旋转干燥过的DNA微阵列使用DNA微阵列用荧光检测装置(Axon公司生产、Genepix4000B),测定来自杂交体的荧光。下面表7示出了对应于各探针的PCR扩增产物1、2的荧光辉度的测定结果。
在计算辉度时,将在DNA微阵列上没有探针DNA点的部分处观测的荧光强度作为背景值,由从各个点的外表的荧光强度扣除背景值的值作为荧光强度的实测值。而测定进行了2次,给出了他的平均值。
【表7】
PCR产物 | 探针 | 荧光辉度 | L1/L2 |
1F1-R1 | P1 | 10 | 4.28 |
P2 | 4607 | 0.72 | |
P3 | 7369 | 0.03 | |
2F2-R2 | P2 | 725 | 1.47 |
P3 | 1504 | 0.04 |
由该结果可知,即使是对于同一样品核酸设计成具有几乎同一的Tm值的探针,荧光辉度值差异也很大,即稳定性有很大差别。荧光辉度值上升表明形成的杂交体更多,即,表明杂交体稳定。另外,位于杂交体形成部的5′侧、3′侧的部分的碱基链长比(L1/L2)不同,杂交体的稳定性也不同,特别是5′侧的碱基链长比3′侧的碱基链长短时可形成更稳定的杂交体。
【实施例2】
I.pUC118 EcoRI/BAP的PCR
(1)引物的设计
作为具有检查对象的序列的检体的标本,选择市售的Takara公司生产的载体pUC118 EcoRI/BAP(全长3162bp),由其碱基序列中设计具有下面序列的3种引物。而有关pUC118 EcoRI/BAP的全碱基序列情报是由Takara公司提供的,另外由公开的数据库等也可以获得。
在进行引物设计时,要充分照顾到pUC118 EcoRI/BAP中的所期望的部分碱基序列要能够通过PCR扩增特异而且有效地扩增,配列、GC%、融解温度(Tm值)后进行设计。
设计的引物正向侧(F)8种、反向侧(R)7种,共计15种。通过以pUC118 EcoRI/BAP作为模板,使用正向侧和反向侧的引物各一种的组合进行PCR扩增,应当可以扩增到104bp至2345bp的各种各样链长的PCR产物。表8示出了设计的引物的碱基序列和Tm值。
【表8】
名称 序列(5′→3′)
FP1 CTTAATCGCCTTGCAGCACATC
SEQ ID NO:7
FP2 TGATTTGGGTGATGGTTCACGTAG
SEQ ID NO:8
FP3 GAGCTGCATGTGTCAGAGGTTT
SEQ ID NO:9
FP4 TTCTTAGACGTCAGGTGGCACT
SEQ ID NO:10
FP5 CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCA
SEQ ID NO:11
FP6 GCATCTTACGGATGGCATGACA
SEQ ID NO:12
FP7 TGAAGCCATACCAAACGACGAG
SEQ ID NO:13
FP8 TTACTCTAGCTTCCCGGCAACA
SEQ ID NO:14
RP1 TTCGGTGATGACGGTGAAAACC
SEQ ID NO:15
RP2 ACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCA
SEQ ID NO:16
RP3 ATCAGCAATAAACCAGCCAGCC
SEQ ID NO:17
RP4 TACGGGAGGGCTTACCATCTG
SEQ ID NO:18
RP5 CATCCATAGTTGCCTGACTCCC
SEQ ID NO:19
RP6 ACGCTCAGTGGAACGAAAACTC
SEQ ID NO:20
RP7 GCGCCTTATCCGGTAACTATCG
SEQ ID NO:21
另外,图4示出了15种引物在pUC118 EcoRI/BAP全长中的位置。而在该图中,箭头表示的方向是各引物链的5′末端至3′末端的方向。
(2)引物的合成
合成实施例2的(1)中设计的15种引物。各引物的合成根据通用的方法利用DNA合成仪合成具有各个碱基序列的DNA链。纯化通过cartridge纯化进行,得到15种引物。得到的引物用TE缓冲液稀释到10μM浓度。
(3)PCR扩增反应
使用实施例2的(2)中合成的15种引物、作为模板基因DNA的Takara公司生产载体pUC118 EcoRI/BAP、和Invitrogen公司生产PCR试剂盒AccuPrime Taq DNA Polymerase System进行PCR扩增反应。在AccuPrime的试剂盒含有的专用的缓冲液中具有dATP、dCTP、dTTP、dGTP的4种脱氧核苷酸,为了通过荧光标记对PCR产物进行标记而加的Amersham Pharmacia公司生产的Cy3dUTP,进行PCR扩增反应。
就象表9所示那样,将正向引物和反向引物组合成24种组合,每一种组合都进行PCR扩增反应。
【表9】
No. 正向引物 反向引物 PCR产物的长度
1 FP1 RP1 811
2 FP1 RP2 1336
3 FP1 RP4 1786
4 FP1 RP6 2019
5 FP1 RP7 2345
6 FP2 RP4 1398
7 FP2 RP7 1957
8 FP3 RP4 1014
9 FP3 RP6 1247
10 FP3 RP7 1573
11 FP4 RP4 909
12 FP5 RP3 640
13 FP5 RP4 714
14 FP6 RP3 367
15 FP6 RP4 441
16 FP6 RP7 1000
17 FP7 RP3 190
18 FP7 RP4 264
19 FP7 RP5 305
20 FP7 RP6 497
21 FP8 RP3 104
22 FP8 RP4 178
23 FP8 RP5 219
24 FP8 RP6 411
反应条件按照下面的程序进行下面表10所示组成的反应液的制备。
【表10】
成分 | 组成 |
AccuPrime Taq DNA Polymerase | 0.5μl |
模板DNA(Takara公司pUC118稀释物)(100pg/μl) | 0.5μl(50pg) |
正向引物(10μM) | 1.25μl |
反向引物(10μM) | 1.25μ |
Cy3 dUTP(1mM、Amersham Pharmacia公司生产) | 0.5μl |
10×AccuPrime PCR Buffer I | 2.5μl |
H2O | 18.5μl |
合计 | 25μl |
关于制备的反应液使用市售的热循环仪,按照下面表11的温度循环程序进行PCR扩增反应。即、94℃/保持2分钟后,按照一个循环为92℃(变性)/30秒、55℃(退火)/45秒、和72℃(延伸)/60秒进行30循环、最后,72℃/保持10分钟。
【表11】
步骤 | 温度 | 保持时间 | 重复次数 | |
1 | 94℃ | 2分 | ||
2 | 92℃ | 变性 | 30秒 | 30循环 |
3 | 55℃ | 退火 | 45秒 | |
4 | 72℃ | 延伸 | 1分 | |
4 | 72℃ | 10分 |
扩增反应结束后、PCR扩增产物用纯化用柱(Qiagen QIAquickPCR Purification Kit)进行纯化。纯化后,将PCR扩增产物溶液的液量调整到50μl。取得到的纯化过的PCR扩增产物溶液的一部分,按照通用的方法进行电泳,确认在24种PCR产物中分别出现了具有所期望的碱基长度的带和各PCR产物的生成量。
II.DNA微阵列的制作
(1)探针的设计
为了检测上述24种PCR产物,针对pUC118 EcoRI上的3个区域设计探针。图5示出了pUC118 EcoRI上的探针区域。对于3个区域中的各区域设计链长不同的3个探针。链长为25mer、40mer、60mer的3种。探针设计与引物的设计同样,各探针选择可以特异识别检体中选择的部分碱基序列(靶序列)的那样序列,另外对于各探针都要充分照顾到GC%、融解温度(Tm值)一致后进行设计。
表12示出了共计9种设计的探针的名称、碱基序列、和Tm值。
【表12】
名称 序列(5′→3′) Tm值
A25 ATG GTG CAC TCT CAG TAC AAT CTG G 75.7
SEQ ID NO:22
B25 GTG GGT TAC ATC GAA CTC GAT CTC A 75.8
SEQ ID NO:23
C25 GAT AAA GTT GCA GGA CCA CTT CTG C 75.7
SEQ ID NO:24
A40 ATG GTG CAC TCT CAG TAC AAT CTG CTC TGA TGC CGC ATA G 80.7
SEQ ID NO:25
B40 AGT TGG GTG CAC GAG TGG GTT ACA TCG AAC TGG ATC TCA A 80.9
SEQ ID NO:26
C40 TAG ACT GGA TGG AGG CGG ATA AAG TTG CAG GAC CAC TTC T 80.8
SEQ ID NO:27
A60 TTT TAT GGT GCA CTC TCA GTA CAA TCT GCT CTG ATG CCG CAT 83.3
AGT TAA GCC AGC CCC GAC
SEQ ID NO:28
B60 GTG GGT TAC ATC GAA CTG GAT CTC AAC AGC GGT AAG ATC 83.3
CTTGAGAGTTTT CGC CCC GAA
SEQ ID NO:29
C60 CTT CCC GGC AAC AAT TAA TAG ACT GGA TGG AGG CGG ATA 83.3
AAG TTG CAG GAC CAC TTC TGC
SEQ ID NO:30
上述探针在pUC118 EcoRI序列上,由于是处于与正向引物相同的序列上的序列,与该探针杂交形成双链的是作为互补链的反向引物侧的序列(反向引物延伸链)。
在各PCR产物(靶链)与各探针的杂交体中,将存在于杂交体部的5′侧的靶链的链长作为L1,将存在于3′侧的链长作为L2,表中示出了对于各PCR产物的各探针的L1、L2以及L1/L2的值。表13给出了25mer的探针A25、B25、C25,表14给出了40mer的探针,表15示出了60mer的探针。
【表13】
No. 正向引物 反向引物 探针 PCR产物的长度 L1(bp) L2(bp) L1/L2
1 FP1 RP1 A25 811 152 634 0.24
2 FP1 RP2 A25 1336 677 634 1.07
3 FP1 RP2 B25 1336 169 1142 0.15
4 FP1 RP4 A25 1786 1127 634 1.78
5 FP1 RP4 B25 1786 619 1142 0.54
6 FP1 RP4 C25 1786 109 1652 0.07
7 FP1 RP6 A25 2019 1360 634 2.15
8 FP1 RP6 B25 2019 852 1142 0.75
9 FP1 RP6 C25 2019 342 1652 0.21
10 FP1 RP7 A25 2345 1686 634 2.66
11 FP1 RP7 B25 2345 1178 1142 1.03
12 FP1 RP7 C25 2345 668 1652 0.40
13 FP2 RP4 A25 1398 1127 246 4.58
14 FP2 RP4 B25 1398 619 754 0.82
15 FP2 RP4 C25 1398 109 1264 0.09
16 FP2 RP7 A25 1957 1686 246 6.85
17 FP2 RP7 B25 1957 1178 754 1.56
18 FP2 RP7 C25 1957 668 1264 0.53
19 FP3 RP4 B25 1014 619 370 1.67
20 FP3 RP4 C25 1014 109 880 0.12
21 FP3 RP6 B25 1247 852 370 2.30
22 FP3 RP6 C25 1247 342 880 0.39
23 FP3 RP7 B25 1573 1178 370 3.18
24 FP3 RP7 C25 1573 668 880 0.76
25 FP4 RP4 B25 909 619 265 2.34
26 FP4 RP4 C25 909 109 775 0.14
27 FP5 RP3 B25 640 545 70 7.79
28 FP5 RP3 C25 640 35 580 0.06
29 FP5 RP4 B25 714 619 70 8.84
30 FP5 RP4 C25 714 109 580 0.199
31 FP6 RP3 C253 367 35 307 0.11
32 FP6 RP4 C25 441 109 307 0.36
33 FP6 RP7 C25 1000 668 307 2.18
34 FP7 RP3 C25 190 35 130 0.27
35 FP7 RP4 C25 264 109 130 0.84
36 FP7 RP5 C25 305 150 130 1.15
37 FP7 RP6 C25 497 342 130 2.63
38 FP8 RP3 C25 104 35 44 0.80
39 FP8 RP4 C25 178 109 44 2.48
40 FP8 RP5 C25 219 150 44 3.41
41 FP8 RP6 C25 411 342 44 7.77
【表14】
No. 正向引物 反向引物 探针 PCR产物的长度 L1(bp) L2(bp) L1/L2
1 FP1 RP1 A40 811 137 634 0.22
2 FP1 RP2 A40 1336 662 634 1.04
3 FP1 RP2 B40 1336 168 1128 0.15
4 FP1 RP4 A40 1786 1112 634 1.75
5 FP1 RP4 B40 1786 618 1128 0.55
6 FP1 RP4 C40 1786 111 1635 0.07
7 FP1 RP6 A40 2019 1345 634 2.12
8 FP1 RP6 B40 2019 851 1128 0.75
9 FP1 RP6 C40 2019 344 1635 0.21
10 FP1 RP7 A40 2345 1671 634 2.64
11 FP1 RP7 B40 2345 1177 1128 1.04
12 FP1 RP7 C40 2345 670 1635 0.41
13 FP2 RP4 A40 1398 1112 246 4.52
14 FP2 RP4 B40 1398 618 740 0.84
15 FP2 RP4 C40 1398 111 1247 0.09
16 FP2 RP7 A40 1957 1671 246 6.79
17 FP2 RP7 B40 1957 1177 740 1.59
18 FP2 RP7 C40 1957 670 1247 0.54
19 FP3 RP4 B40 1014 618 356 1.74
20 FP3 RP4 C40 1014 111 863 0.13
21 FP3 RP6 B40 1247 851 356 2.39
22 FP3 RP6 C40 1247 344 863 0.40
23 FP3 RP7 B40 1573 1177 356 3.31
24 FP3 RP7 C40 1573 670 863 0.78
25 FP4 RP4 B40 909 618 251 2.46
26 FP4 RP4 C40 909 111 758 0.15
27 FP5 RP3 B40 640 545 70 7.79
28 FP5 RP3 C40 640 37 563 0.07
29 FP5 RP4 B40 714 618 56 11.04
30 FP5 RP4 C40 714 111 563 0.20
31 FP6 RP3 C40 367 37 290 0.13
32 FP6 RP4 C40 441 111 290 0.38
33 FP6 RP7 C40 1000 670 290 2.31
34 FP7 RP3 C40 190 37 113 0.33
35 FP7 RP4 C40 264 111 113 0.98
36 FP7 RP5 C40 305 152 113 1.35
37 FP7 RP6 C40 497 344 113 3.04
38 FP8 RP3 C40 104 37 27 1.37
39 FP8 RP4 C40 178 111 27 4.11
40 FP8 RP5 C40 219 152 27 5.63
41 FP8 RP6 C40 411 344 27 12.74
【表15】
No. 正向引物 反向引物 探针 PCR产物的长度 L1(bp) L2(bp) L1/L2
1 FP1 RP1 A60 811 115 636 0.18
2 FP1 RP2 A60 1336 640 636 1.01
3 FP1 RP2 B60 1336 148 1128 0.13
4 FP1 RP4 A60 1786 1090 636 1.71
5 FP1 RP4 B60 1786 598 1128 0.53
6 FP1 RP4 C60 1786 91 1635 0.06
7 FP1 RP6 A60 2019 1323 636 2.08
8 FP1 RP6 B60 2019 831 1128 0.74
9 FP1 RP6 C60 2019 324 1635 0.20
10 FP1 RP7 A60 2345 1649 636 2.59
11 FP1 RP7 B60 2345 1157 1128 1.03
12 FP1 RP7 C60 2345 650 1635 0.40
13 FP2 RP4 A60 1398 1090 248 4.40
14 FP2 RP4 B60 1398 598 740 0.81
15 FP2 RP4 C60 1398 91 1247 0.07
16 FP2 RP7 A60 1957 1649 248 6.65
17 FP2 RP7 B60 1957 1157 740 1.56
18 FP2 RP7 C60 1957 650 1247 0.52
19 FP3 RP4 B60 1014 598 356 1.68
20 FP3 RP4 C60 1014 91 863 0.11
21 FP3 RP6 B60 1247 831 356 2.33
22 FP3 RP6 C60 1247 324 863 0.38
23 FP3 RP7 B60 1573 1157 356 3.25
24 FP3 RP7 C60 1573 650 863 0.75
25 FP4 RP4 B60 909 598 251 2.38
26 FP4 RP4 C60 909 91 758 0.12
27 FP5 RP3 B60 640 524 56 9.36
28 FP5 RP3 C60 640 17 563 0.03
29 FP5 RP4 B60 714 598 56 10.68
30 FP5 RP4 C60 714 91 563 0.16
31 FP6 RP3 C60 367 17 290 0.06
32 FP6 RP4 C60 441 91 290 0.31
33 FP6 RP7 C60 1000 650 290 2.24
34 FP7 RP3 C60 190 17 113 0.15
35 FP7 RP4 C60 264 91 113 0.81
36 FP7 RP5 C60 305 132 113 1.17
37 FP7 RP6 C60 497 324 113 2.87
38 FP8 RP3 C60 104 17 27 0.63
39 FP8 RP4 C60 178 91 27 3.37
40 FP8 RP5 C60 219 132 27 4.89
41 FP8 RP6 C60 411 324 27 12.00
(2)微阵列的制作
从上述探针的合成至微阵列制作都象实施例1那样进行。在本实施例中,对于9种探针的每一个都制作了微阵列。与实施例1同样,1枚微阵列上固定了16点。
III.杂交反应
使用II制作的DNA微阵列和作为样品核酸检体在I制作的24种PCR扩增产物,在微阵列上进行表13至表15记载的全部243种杂交。
(1)DNA微阵列的封闭
象实施例1那样用BSA进行封闭。
(2)杂交溶液的制备
在各PCR产物按照相互等摩尔那样制备后,用PCR扩增产物溶液制备最终浓度为如下构成的对于各PCR产物的杂交溶液。
<杂交溶液>
6×SSPE/10% Form Amide/0.05% SDS/PCR扩增产物溶液(6×SSPE:NaCl 900mM、NaH2PO4·H2O 60mM、EDTA 6mM、pH7.4)
(3)杂交
将除去水分后的DNA微阵列放置在杂交装置(Genomic SolutionsInc.Hybridization Station)中,使用上述组成的杂交溶液,按照下记步骤·条件进行杂交反应。
<杂交条件·步骤>
将上述杂交溶液加热到65℃并保持3分钟后,再于92℃保持2分钟,然后在55℃下保持4小时。完成上述操作后,用2×SSC和0.1%SDS于25℃下进行清洗。再用2×SSC于20℃下进行清洗,根据需要,可以按照通常的指南用纯水轻洗,最后用旋转干燥装置除去水分,使其干燥。
【表16】
操作 | 操作步骤·条件 |
添加 | 于65℃下添加杂交液 |
反应 | 92℃2分→55℃4小时 |
清洗 | 2×SSC/0.1%SDS 25℃下 |
2×SSC 20℃下 | |
(轻洗) | H2O(手动轻洗) |
干燥 | 旋转干燥 |
(4)荧光测定
杂交反应结束后的荧光测定与实施例1同样进行。在表17至表19给出了对应于每个探针长的各PCR产物的辉度值。辉度的计算也与实施例1同样进行。
【表17】
L1 L2
No. 正向引物 反向引物 探针 PCR产物的长度 L1/L2 荧光强度
(bp) (bp)
1 FP1 RP1 A25 811 152 634 0.24 3172.0
2 FP1 RP2 A25 1336 677 634 1.07 52.4
3 FP2 RP2 B25 1336 169 1142 0.15 3638.8
4 FP2 RP4 A25 1786 1127 634 1.78 2.2
5 FP1 RP7 B25 1786 619 1142 0.54 3077.4
6 FP1 RP4 C25 1786 109 1652 0.07 3519.9
7 FP1 RP6 A25 2019 1360 634 2.15 0.6
8 FP1 RP6 B25 2019 852 1142 0.75 3020.5
9 FP1 RP6 C25 2019 342 1652 0.21 3449.8
10 FP1 RP7 A25 2345 1686 634 2.66 1.6
11 FP1 RP7 B25 2345 1178 1142 1.03 722.5
12 FP1 RP7 C25 2345 668 1652 0.40 2252.7
13 FP2 RP4 A25 1398 1127 246 4.58 1.5
14 FP2 RP4 B25 1398 619 754 0.82 2202.0
15 FP2 RP4 C25 1398 109 1264 0.09 2762.2
16 FP2 RP7 A25 1957 1686 246 6.85 1.4
17 FP2 RP7 B25 1957 1178 754 1.56 24.1
18 FP2 RP7 C25 1957 668 1264 0.53 1951.8
19 FP3 RP4 B25 1014 619 370 1.67 22.4
20 FP3 RP4 C25 1014 109 880 0.12 2763.2
21 FP3 RP6 B25 1247 852 370 2.30 0.5
22 FP3 RP6 C25 1247 342 880 0.39 2203.1
23 FP3 RP7 B25 1573 1178 370 3.18 0.5
24 FP3 RP7 C25 1573 668 880 0.76 519.7
25 FP4 RP4 B25 909 619 265 2.34 1.8
26 FP4 RP4 C25 909 109 775 0.14 1893.2
27 FP5 RP3 B25 640 545 70 7.79 1.1
28 FP5 RP3 C25 640 35 580 0.06 2009.7
29 FP5 RP4 B25 714 619 70 8.84 1.6
30 FP5 RP4 C25 714 109 580 0.19 1388.6
31 FP6 RP3 C25 367 35 307 0.11 1338.6
32 FP6 RP4 C25 441 109 307 0.36 484.5
33 FP6 RP7 C25 1000 668 307 2.18 1.3
34 FP7 RP3 C25 190 35 130 0.27 590.1
35 FP7 RP4 C25 264 109 130 0.84 73.4
36 FP7 RP5 C25 305 150 130 1.15 168.3
37 FP7 RP6 C25 497 342 130 2.63 2.7
38 FP8 RP3 C25 104 35 44 0.80 797.2
39 FP8 RP4 C25 178 109 44 2.48 709.4
40 FP8 RP5 C25 219 150 44 3.41 643.4
41 FP8 RP6 C25 411 342 44 7.77 3.1
【表18】
PCR产物 L1 L2
No. 正向引物 反向引物 探针 L1/L2 荧光强度
的长度 (bp) (bp)
1 FP1 RP1 A40 811 137 634 0.22 6310.5
2 FP1 RP2 A40 1336 662 634 1.04 466.2
3 FP1 RP2 B40 1336 168 1128 0.15 7415.4
4 FP1 RP4 A40 1786 1112 634 1.75 10.0
5 FP1 RP4 B40 1786 618 1128 0.55 6451.3
6 FP1 RP4 C40 1786 111 1635 0.07 8547.4
7 FP1 RP6 A40 2019 1345 634 2.12 4.8
8 FP1 RP6 B40 2019 851 1128 0.75 5920.8
9 FP1 RP6 C40 2019 344 1635 0.21 8037.6
10 FP1 RP7 A40 2345 1671 634 2.64 3.0
11 FP1 RP7 B40 2345 1177 1128 1.04 1942.1
12 FP1 RP7 C40 2345 670 1635 0.41 6506.2
13 FP2 RP4 A40 1398 1112 246 4.52 3.2
14 FP2 RP4 B40 1398 618 740 0.84 5026.4
15 FP2 RP4 C40 1398 111 1247 0.09 7090.1
16 FP2 RP7 A40 1957 1671 246 6.79 3.7
17 FP2 RP7 B40 1957 1177 740 1.59 121.1
18 FP2 RP7 C40 1957 670 1247 0.54 5571.0
19 FP3 RP4 B40 1014 618 356 1.74 105.6
20 FP3 RP4 C40 1014 111 863 0.13 7291.5
21 FP3 RP6 B40 1247 851 356 2.39 4.0
22 FP3 RP6 C40 1247 344 863 0.40 6122.6
23 FP3 RP7 B40 1573 1177 356 3.31 0.5
24 FP3 RP7 C40 1573 670 863 0.78 1967.1
25 FP4 RP4 B40 909 618 251 2.46 19.9
26 FP4 RP4 C40 909 111 758 0.15 5674.5
27 FP5 RP3 B40 640 545 70 7.79 3.5
28 FP5 RP3 C40 640 37 563 0.07 4904.3
29 FP5 RP4 B40 714 618 56 11.04 4.0
30 FP5 RP4 C40 714 111 563 0.20 4248.7
31 FP6 RP3 C40 367 37 290 0.13 3611.1
32 FP6 RP4 C40 441 111 290 0.38 1810.2
33 FP6 RP7 C40 1000 670 290 2.31 7.4
34 FP7 RP3 C40 190 37 113 0.33 1390.3
35 FP7 RP4 C40 264 111 113 0.98 334.4
36 FP7 RP5 C40 305 152 113 1.35 579.7
37 FP7 RP6 C40 497 344 113 3.04 13.7
38 FP8 RP3 C40 104 37 27 1.37 1434.0
39 FP8 RP4 C40 178 111 27 4.11 1674.2
40 FP8 RP5 C40 219 152 27 5.63 1737.6
41 FP8 RP6 C40 411 344 27 12.74 14.6
【表19】
PCR产物 L1 L2
No. 正向引物 反向引物 探针 L1/L2 荧光强度
的长度 (bp) (bp)
1 FP1 RP1 A60 811 115 636 0.18 9191.0
2 FP1 RP2 A60 1336 640 636 1.01 1963.3
3 FP1 RP2 B60 1336 148 1128 0.13 10343.4
4 FP1 RP4 A60 1786 1090 636 1.71 42.7
5 FP1 RP4 B60 1786 598 1128 0.53 11856.1
6 FP1 RP4 C60 1786 91 1635 0.06 10930.5
7 FP1 RP6 A60 2019 1323 636 2.08 10.7
8 FP1 RP6 B60 2019 831 1128 0.74 11330.2
9 FP1 RP6 C60 2019 324 1635 0.20 11745.8
10 FP1 RP7 A60 2345 1649 636 2.59 5.3
11 FP1 RP7 B60 2345 1157 1128 1.03 5436.4
12 FP1 RP7 C60 2345 650 1635 0.40 10108.0
13 FP2 RP4 A60 1398 1090 248 4.40 10.9
14 FP2 RP4 B60 1398 598 740 0.81 9617.4
15 FP2 RP4 C60 1398 91 1247 0.07 9193.6
16 FP2 RP7 A60 1957 1649 248 6.65 7.6
17 FP2 RP7 B60 1957 1157 740 1.56 826.5
18 FP2 RP7 C60 1957 650 1247 0.52 8783.0
19 FP3 RP4 B60 1014 598 356 1.68 1061.5
20 FP3 RP4 C60 1014 91 863 0.11 9409.1
21 FP3 RP6 B60 1247 831 356 2.33 44.6
22 FP3 RP6 C60 1247 324 863 0.38 9139.9
23 FP3 RP7 B60 1573 1157 356 3.25 0.8
24 FP3 RP7 C60 1573 650 863 0.75 3470.7
25 FP4 RP4 B60 909 598 251 2.38 306.8
26 FP4 RP4 C60 909 91 758 0.12 7428.8
27 FP5 RP3 B60 640 524 56 9.36 9.1
28 FP5 RP3 C60 640 17 563 0.03 5929.9
29 FP5 RP4 B60 714 598 56 10.68 11.9
30 FP5 RP4 C60 714 91 563 0.16 6037.3
31 FP6 RP3 C60 367 17 290 0.06 5069.8
32 FP6 RP4 C60 441 91 290 0.31 2892.6
33 FP6 RP7 C60 1000 650 290 2.24 15.4
34 FP7 RP3 C60 190 17 113 0.15 2119.3
35 FP7 RP4 C60 264 91 113 0.81 649.6
36 FP7 RP5 C60 305 132 113 1.17 1108.0
37 FP7 RP6 C60 497 324 113 2.87 37.4
38 FP8 RP3 C60 104 17 27 0.63 1448.2
39 FP8 RP4 C60 178 91 27 3.37 2060.3
40 FP8 RP5 C60 219 132 27 4.89 2130.9
41 FP8 RP6 C60 411 324 27 12.00 59.8
IV.结果的解析
接下来以该结果为基础,做成辉度值相对于L1/L2值的曲线图。为了容易理解,纵轴、横轴都用对数表示。图6为25mer的曲线图,图7为40mer的曲线图,图8为60mer的曲线图。
由该结果可知,对于同一样品核酸设计的使得对应于探针长,具有几乎同一的Tm值的探针,即使对同一浓度的检体进行杂交时,荧光辉度值也有很大不同,即稳定性有很大不同。可知L1/L2值处于0至1.5的范围可以得到很大的辉度值的稳定的杂交体。特别是当L1/L2值为0到1时,可知可以得到特别稳定的杂交体。与此相反,可知当L1/L2的值在2以上时,除了一部分例外,只得到辉度极低的荧光辉度,杂交体的稳定性也极低。
【实施例3】
(1)探针的设计
就实施例2中设计的9种探针中的25mer 3种,制作3′末端进行了巯基修饰的下面的探针。巯基只在3′末端进行修饰,在5′末端不结合巯基。
表20示出了共计3种设计的探针的名称、碱基序列、以及Tm值。
【表20】
名称 序列(5′→3′) Tm值
AR25 ATGGTGCACTGTGAGTAGAATGTGC 75.7
SEQ ID NO:24
BR25 GTGGGTTAGATGGAACTGGATGTGA 75.8
SEQ ID NO:25
CR25 GATAAAGTTGCAGGAGCAGTTbTGG 75.7
SEQ ID NO:26
与实施例2同样,与该探针杂交形成双链的是作为互补链的反向引物侧的序列(反向引物延伸链)。
图9示出了这里合成的3种探针和实施例2中合成的各PCR产物(靶链)的杂交体的1个例子。将存在于杂交体部的5′侧的靶链的链长作为B5(L1),将存在于3′侧的链长作为B3(L2)。表21示出了针对实施例2合成的各PCR产物的各探针的L1、L2以及L1/L2的值。由于探针和各PCR产物产物(靶链)的位置关系没有变,所以L1、L2和L1/L2的值与实施例2相同。
【表21】
No. 正向引物 反向引物 探针 PCR产物的产度 L1(bp) L2(bp) L1/L2
1 FP1 RP1 AR25 811 152 634 0.24
2 FP1 RP2 AR25 1336 677 634 1.07
3 FP1 RP2 BR25 1336 169 1142 0.15
4 FP1 RP4 AR25 1786 1127 634 1.78
5 FP1 RP4 BR25 1786 619 1142 0.54
6 FP1 RP4 CR25 1786 109 1652 0.07
7 FP1 RP6 AR25 2019 1360 634 2.15
8 FP1 RP6 BR25 2019 852 1142 0.75
9 FP1 RP6 CR25 2019 342 1652 0.21
10 FP1 RP7 AR25 2345 1686 634 2.66
11 EP1 RP7 BR25 2345 1178 1142 1.03
12 FP1 RP7 CR25 2345 668 1652 0.40
13 FP2 RP4 AR25 1398 1127 264 4.58
14 FP2 RP4 BR25 1398 619 754 0.82
15 FP2 RP4 CR25 1398 109 1264 0.09
16 FP2 RP7 AR25 1957 1686 246 6.85
17 FP2 RP7 BR25 1957 1178 754 1.56
18 FP2 RP7 CR25 1957 668 1264 0.53
19 FP3 RP4 BR25 1014 619 370 1.67
20 FP3 RP4 CR25 1044 109 880 0.12
21 FP3 RP6 BR25 1247 852 370 2.30
22 FP3 RP6 CR25 1247 342 880 0.39
23 FP3 RP7 BR25 1573 1178 370 3.18
24 FP3 RP7 CR25 1573 668 880 0.76
25 FP4 RP4 BR25 909 619 265 2.34
26 FP4 RP4 CR25 909 109 775 0.14
27 FP5 RP3 BR25 640 545 70 7.79
28 FP5 RP3 CR25 640 35 580 0.06
29 FP5 RP4 BR25 714 619 70 8.84
30 FP5 RP4 CR25 714 109 580 0.19
31 FP6 RP3 CR25 367 35 307 0.11
32 FP6 RP4 CR25 441 109 307 0.36
33 FP6 RP7 CR25 1000 668 307 2.18
34 FP7 RP3 CR25 190 35 130 0.27
35 FP7 RP4 CR25 264 109 130 0.84
36 FP7 RP5 CR25 305 150 130 1.15
37 FP7 RP6 CR25 497 342 130 2.63
38 FP8 RP3 CR25 104 35 44 0.80
39 FP8 RP4 CR25 178 109 44 2.48
40 FP8 RP5 CR25 219 150 44 3.41
41 FP8 RP6 CR25 411 342 44 7.77
(2)微阵列的制作
使用3种探针的DNA微阵列制作与实施例2同样,对各个探针都制作每1微阵列有16点的DNA微阵列。
(3)杂交反应和荧光测定
杂交反应和反应结束后的荧光测定与实施例2同样进行。表22示出了由各微阵列得到的辉度值。
【表22】
PCR产物 L1 L2
No. 正向引物 反向引物 探针 L1/L2 荧光强度
的长度 (bp) (bp)
1 FP1 RP1 AR25 811 152 634 0.24 2569.3
2 FP1 RP2 AR25 1336 677 634 1.07 54.0
3 FP1 RP2 BR25 1336 169 1142 0.15 3056.6
4 FP1 RP4 AR25 1786 1127 634 1.78 1.8
5 FP1 RP4 BR25 1786 619 1142 0.54 2277.3
6 FP1 RP4 CR25 1786 109 1652 0.07 3379.1
7 FP1 RP6 AR25 2019 1360 634 2.15 0.5
8 FP1 RP6 BR25 2019 852 1142 0.75 2476.8
9 FP1 RP6 CR25 2019 342 1652 0.21 2207.9
10 FP1 RP7 AR25 2345 1686 634 2.66 1.4
11 FP1 RP7 BR25 2345 1178 1142 1.03 556.3
12 FP1 RP7 CR25 2345 668 1652 0.40 1667.0
13 FP2 RP4 AR25 1398 1127 246 4.58 1.3
14 FP2 RP4 BR25 1398 619 754 0.82 1431.3
15 FP2 RP4 CR25 1398 109 1264 0.09 2679.3
16 FP2 RP7 AR25 1957 1686 246 6.85 1.2
17 FP2 RP7 BR25 1957 1178 754 1.56 48.8
18 FP2 RP7 CR25 1957 668 1264 0.53 1678.5
19 FP3 RP4 BR25 1014 619 370 1.67 18.8
20 FP3 RP4 CR25 1014 109 880 0.12 2321.1
21 FP3 RP6 BR25 1247 852 370 2.30 0.0
22 FP3 RP6 CR25 1247 342 880 0.39 2137.0
23 FP3 RP7 BR25 1573 1178 370 3.18 0.4
24 FP3 RP7 CR25 1573 668 880 0.76 556.0
25 FP4 RP4 NR25 909 619 265 2.34 3.7
26 FP4 RP4 CR25 909 109 775 0.14 1666.0
27 FP5 RP3 BR25 640 545 70 7.79 0.8
28 FP5 RP3 CR25 640 35 580 0.06 1748.5
29 FP5 RP4 BR25 714 619 70 8.84 0.1
30 FP5 RP4 CR25 714 109 580 0.19 1222.0
31 FP6 RP3 CR25 367 35 307 0.11 1030.7
32 FP6 RP4 CR25 441 109 307 0.36 382.8
33 FP6 RP7 CR25 1000 668 307 2.18 1.1
34 FP7 RP3 CR25 190 35 130 0.27 454.4
35 FP7 RP4 CR25 264 109 130 0.84 67.6
36 FP7 RP5 CR25 305 150 130 1.15 140.6
37 FP7 RP6 CR25 497 342 130 2.63 2.9
38 FP8 RP3 CR25 104 35 44 0.80 693.5
39 FP8 RP4 CR25 178 109 44 2.48 524.9
40 FP8 RP5 CR25 219 150 44 3.41 540.4
41 FP8 RP6 CR25 411 342 44 7.77 4.8
(4)结果的解析
与实施例2同样,做成辉度值相对于L1/L2值的曲线图,如图10所示。在本实施例中,纵轴、横轴都用对数表示。由该曲线图可以得到L1/L2值在0至1.5之间的高辉度,可知形成稳定的杂交体。另外也可看出这一倾向特别是在0至1之间更显著。
这一结果表明在通过3(末端的巯基固定的探针中,也与5(末端固定的场合同样可以得到对应于L1和L2的值的稳定的杂交体,不管探针固定方法如何,都可以得到本发明的稳定的杂交体。
序列表
<110>佳能株式会社
<120>稳定的杂交体
<130>10003817CN01
<150>JP2003-324647
<151>2003-09-17
<160>30
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物F1
<400>1
tgatttgggt gatggttcac gtag 24
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物F2
<400>2
gagctgcatg tgtcagaggt tt 22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物R1
<400>3
atcagcaata aaccagccag cc 22
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物P1
<400>4
atggtgcact ctcagtacaa tctgc 25
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物P2
<400>5
gtgggttaca tcgaactgga tctca 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物P3
<400>6
gataaagttg caggaccact tctgc 25
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物FP1
<400>7
cttaatcgcc ttgcagcaca tc 22
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物FP2
<400>8
tgatttgggt gatggttcac gtag 24
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物FP3
<400>9
gagctgcatg tgtcagaggt tt 22
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物FP4
<400>10
ttcttagacg tcaggtggca ct 22
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物FP5
<400>11
ccttcctgtt tttgctcacc ca 22
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>Primer,PF6
<400>12
gcatcttacg gatggcatga ca 22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物FP7
<400>13
tgaagccata ccaaacgacg ag 22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物FP8
<400>14
ttactctagc ttcccggcaa ca 22
<210>15
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物RP1
<400>15
ttcggtgatg acggtgaaa cc 22
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物RP2
<400>16
actggtgagt actcaaccaa gtca 24
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物RP3
<400>17
atcagcaata aaccagccag cc 22
<210>18
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物RP4
<400>18
tacgggaggg cttaccatct g 21
<210>19
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物RP5
<400>19
catccatagt tgcctgactc cc 22
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物RP6
<400>20
acgctcagtg gaacgaaaac tc 22
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物RP7
<400>21
gcgccttatc cggtaactat cg 22
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针A25
<400>22
atggtgcact ctcagtacaa tctgg 25
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针B25
<400>23
gtgggttaca tcgaactcga tctca 25
<210>24
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针C25
<400>24
gataaagttg caggaccact tctgc 25
<210>25
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针A40
<400>25
atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag 40
<210>26
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针B40
<400>26
agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 40
<210>27
<211>40
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针C40
<400>27
tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 40
<210>28
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针A60
<400>28
ttttatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac 60
<210>29
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针B60
<400>29
gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 60
<210>30
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>探针C60
<400>30
cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 60
Claims (34)
1.一种杂交体,是样品核酸的靶链具有的靶序列和与该靶序列互补的该探针核酸的探针序列结合的杂交体,其特征是:
上述样品核酸的靶链比上述探针核酸的探针序列长,当将上述靶链5′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L1、将3′末端的上述靶序列以外部分的碱基数表示为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系。
2.权利要求1所述的杂交体,上述探针核酸被固定于固相。
3.权利要求2所述的杂交体,其中上述探针是DNA。
4.权利要求3所述的杂交体,其中固定于固相的探针DNA通过共价键被固定。
5.权利要求3所述的杂交体,其中固定于固相的探针DNA通过导入到5′侧末端的官能团被固定。
6.权利要求3所述的杂交体,其中固定于固相的探针DNA通过导入3′侧末端的官能团固定。
7.权利要求3所述的杂交体,其中固定于固相的探针DNA通过导入到序列中的官能团被固定。
8.权利要求5所述的杂交体,其特征是:导入的官能团是巯基。
9.权利要求6所述的杂交体,其特征是:导入的官能团是巯基。
10.权利要求1所述的杂交体,其中探针是PNA。
11.权利要求1所述的杂交体,其中探针的碱基链长为15~30mer。
12.权利要求1所述的杂交体,其中探针的碱基链长为31~50mer。
13.权利要求1所述的杂交体,其中探针的碱基链长为51~80mer。
14.权利要求1所述的杂交体,其中L1/L2处于0~1范围。
15.权利要求1所述的杂交体,其中样品核酸是双链DNA。
16.权利要求1所述的杂交体,其中样品核酸是单链DNA。
17.权利要求14所述的杂交体,其中样品核酸是PCR产物。
18.权利要求1所述的杂交体,其中样品核酸是RNA。
19.权利要求1所述的杂交体,其中样品核酸通过可直接或间接检测的标记物质标记。
20.权利要求19所述的杂交体,其中标记物质是荧光物质。
21.权利要求20所述的杂交体,其中荧光物质是Cy3或Cy5。
22.权利要求1所述的杂交体,样品核酸的链长在500bp以上。
23.权利要求22所述的杂交体,其中样品核酸的链长在500bp以上、2500bp以下。
24.一种设计的探针,是以相对于具有靶序列的靶链,可形成权利要求1所述的杂交体的构成而设计的。
25.权利要求24所述的探针,其中上述探针被固定于固体载体上。
26.一种由2个以上探针构成的探针组,其中构成的探针是权利要求24所述的探针。
27.一种探针载体,是固定用于检测靶核酸的探针的探针载体,其特征是权利要求26所述探针的构成比率是全部探针数的50%以上。
28.权利要求27所述探针载体,其特征是:构成比率在70%以上。
29.一种探针设计方法,是将探针设计成相对于具有靶序列的靶链可形成权利要求1所述的杂交体的构成。
30.一种PCR用引物,用于制备相对于权利要求1所述探针可以形成权利要求1所述的杂交体的构成的样品核酸。
31.一种样品核酸的检测方法,是在通过检测使固定于固相的探针核酸与比该探针核酸还长的样品核酸反应得到的杂交体的样品核酸的检测方法中,其特征是将上述探针核酸的序列设计成可形成满足以下构成(1)和(2)的杂交体:
(1)是样品核酸的靶链具有的靶序列和与该靶序列互补的探针核酸的探针序列结合的杂交体,(2)上述靶链比上述探针核酸的探针序列长,将该靶链的5′末端侧的上述上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L1、将3′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系。
32.权利要求31所述的检测方法,上述样品核酸是以检体核酸为模板的PCR扩增产物,将该PCR用引物以及上述探针设计成可形成满足上述构成(1)和(2)的杂交体。
33.一种样品核酸检测用试剂盒,具有用于从检体核酸扩增具有靶序列的靶链的样品核酸的PCR用引物和固定于固相用于确认在以该检体核酸为模板使用该引物进行扩增的扩增产物中有无上述靶序列的探针核酸,其特征是,
上述引物和上述探针核酸的序列被设计成可形成满足以下构成(1)和(2)的杂交体:
(1)是样品核酸的靶链具有的靶序列和与该靶序列互补的探针核酸的探针序列结合的杂交体,
(2)上述靶链比上述探针核酸的探针序列长,当将该靶链的5′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L1、将3′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系。
34.一种样品核酸的靶链,具有靶序列,可与该靶序列互补的探针核酸的探针序列结合的杂交体而构成,其特征是:
上述靶链比上述探针核酸的探针序列长,当将该靶链的5′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L1、将3′末端侧的上述靶序列以外的部分的碱基数表示为L2时,满足0≤L1/L2≤1.5的关系。
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