CN1737165A

CN1737165A - 一种减少假阳性结果的方法

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Publication number: CN1737165A
Application number: CNA2005100926909A
Authority: CN
Inventors: F·博格曼; A·埃谢里希; D·海因德尔; J·克雷布斯; H·范德埃尔兹
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2004-08-19
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2006-02-22
Also published as: JP2006055166A; CA2512599A1

Abstract

本发明提供了用于消除来自某些分子的液体污染的方法和化合物。特别地，本发明指向保持试剂不含双链核酸分子的方法和化合物。更特别地，本发明指向确保没有扩增污染的扩增核酸的方法和化合物。

Description

一种减少假阳性结果的方法

发明领域

本发明提供了用于去除来自某些分子的液体污染的方法和化合物。特别是，本发明指向保持试剂不含所述分子的方法和化合物。更特别地，本发明指向确保样品中目标分子的核酸扩增反应避免假阳性结果的方法和化合物。

现有技术背景

以核酸分析为基础用于诊断或研究的微生物检测仍然日趋重要。这是由于一方面，核酸经常以非常小的浓度存在，另一方面，经常发现核酸存在于很多其他的固体和溶解的物质中，例如在细胞裂解后，这些难以分离和测定核酸，特别是在允许对特异的被分析物进行检测的生物特异性分析中。因此在大多数情况下，这些微生物检测包括对待检测的特征性DNA分子进行至少一个扩增步骤。需要两条寡核苷酸引物选择性结合的众所周知的检测是在US 4,683,195中描述的聚合酶链式反应(PCR)。这种方法在脱氧核苷三磷酸的存在下在几个循环中通过热稳定性聚合酶将特异性核酸区域选择性地扩增至可检测的水平。其他可能的扩增反应是连接酶链式反应(LCR；Wu，D.Y.和Wallace，R.B.，Genomics 4(1989)560-569以及Barany，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany，PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；Gap-LCR(PCT专利公开号WO 90/01069)；修复链式反应(欧洲专利公开号439 182 A2)、3SR(Kwoh，D.Y.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.C.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；PCT专利公开号WO 92/0880A)，和NASBA(美国专利号5,130,238)。更进一步的，还有链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)和Qβ-扩增(相关综述参见例如Whelen，A.C.和Persing.D.H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.D.和Myers，T.W.，Current Opinion in Biotechnology 4(1993)41-47)。

由于这些技术导致核酸分子急骤扩增，因此即使来自为所述扩增反应所必需的试剂的非所需核酸分子对样品的最轻微污染，也可能导致大量的假扩增产物，类似于例如假阳性诊断。当待测样品中存在细菌以及所使用的一些试剂被这种细菌污染，或被来自这种细菌的核酸污染时，就可能在微生物检测中发生突出的这种现象的实例。在这种情况下，在检测中来自样品的目标核酸分子与来自污染试剂的非所需分子是一样的。

因此，对于无污染的核酸扩增反应环境的要求是至关重要的。

在科学文献和专利申请中，描述了对来自核酸的溶液进行净化的一些方法。这些方法包括化学处理，例如使用次氯酸钠(Prince，A.M.和Andrus，L，Biotechniques 12(1992)358-360)、表面活性剂、或氧化剂(WO2002/060539)。另外的一些策略使用消化酶进行处理(Fox，J.C.等人，J.Virol.Meth.33(1991)375-3823)或UV照射(Fox，J.C.等人，J.Virol.Meth.33(1991)375-3823)。上述的相关策略可从一些综述中找到(Abravaya，K.等人，Nucleic Acid Ampl.Technol.第9章(1997)125-133；Corless，C.E.等人，J.Clin.25 Microbiol. 38(2000)1747-1752；Klaschik，S.等人，Mol.Biotechnol.22(2002)231-242)。

一般用于从复杂的生物液体中分离或隔离例如DNA等的另一种方法是使用DNA结合材料。DNA结合材料的最重要实例是玻璃表面，这是由于其在存在离液剂时能够可逆地结合DNA(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)。但是，这个方法并不区分单链和双链DNA。US 04/121336描述了使核酸与大量的固体基质结合单元相结合的方法。

更为普遍地，可使用阳离子表面来结合带电荷的DNA分子，由此例如EP 0 281390描述了一种用于核酸分离的聚阳离子支持物，WO01/94573描述了带电薄膜或WO 00/69872描述了pH依赖型离子交换基质。WO 02/48164中公开了位于固体支持物上的用于可逆地结合DNA的带有可转换电荷的聚合体。与阳离子表面相类似，聚阳离子实体也具有某些DNA结合亲和力。Stewart，等人，J.Phys.Org.Chem.5(1992)461-466中报道了一种随着阳离子电荷的增加而提高结合溶液中DNA的亲和性的多胺。Doré等人JACS 126(2004)4240-4244)描述了阳离子复合物在双链和单链核酸之间的选择性。

而且本领域众所周知，双链(ds)DNA结合分子可区分单链和双链DNA。这里应特别提及小沟结合剂(MBGs)、抗-ds DNA抗体和嵌入剂。

MGB类似于吡咯脒抗生素偏端霉素或纺锤菌素，通过氢键结合到小沟上，而并不通过嵌入作用相互影响(Fish，E.L.等人，Biochemistry 27(1988)6026-6032).Boger，D.L.等人，J.Am.Chem.Soc.123(2001)5878-5891研究了偏端霉素、纺锤菌素、和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)与固定在微量滴定板上的双链DNA的结合。US2002/0095073描述了使用MGB作为探针，通过酰胺或硫醇键固定在固相支持物上，使其与DNA结合，以确定一种或多种医学症状的诱因。Li，M.等人Bioorg.Med.Chem.Letters 12(2003)4351-4354描述了一种通过共价酰胺键结合到表面氨基上的DAPI衍生物。

已知抗-ds DNA抗体能够区分单链和双链DNA，因此将其用作例如固定于固相支持物上的DNA杂交探针，由此通过色度检测来验证抗体的存在(Mantero，G.等人，Clin.Chem.37(1991)422-429)。WO2002/074993描述了一种使用活化的硫醇单层将抗DNA抗体固定在包金的玻璃片上的方法。专利EP 0 792 376涉及核酸扩增反应领域，而且公开了通过生物素/链霉亲和素键将抗杂交抗体固定到表面上的方法。

在现有技术中，也使用固定化的抗体来可逆地结合细胞或细胞的聚集体，例如细菌。为了分离食品病原体，已经有基于被抗体官能化的珠的商业产品(DYNAL Biotech或MATRIX Microscience Ltd)。WO 91/19003公开了一种使用表面上的抗体来检测污染的方法。

PROFOS GmbH公开了使用与载体偶联的噬菌体尾蛋白质来结合细胞(WO 01/09370、WO 02/06117)或内毒素(WO 04/01418)。Koepsel和Russell(Koepsel，R.R.And Russell，A.J.，Biomacromolecules 4(2003)850-855)公开了用来捕获细菌的原生质膜上的抗体。对于非特异的细胞，WO 03/33698描述了使用带电荷的聚合物的方法。

过去已经集中研究过结合于双链DNA堆叠的碱基对之间的一些有机小分子的嵌入特性(Brana，M.E.等人，Curr.Pharm.Design 7(2001)1745-1780)。WO 2002/82078描述了由嵌入剂和信号分子产生的复合物，以便检测固相支持物上双链DNA的存在。在US2002/0006617中描述了附加在支持物上的嵌入剂用于分离单链和双链DNA的用途。US 2001/0026921描述了一种带有通过氨基功能团连接到表面的嵌入剂和带有荧光团的第二个嵌入剂的核酸杂交检测组合物。

US 2003/0130499公开了例如使用可掺入固相的放线菌素D或溴化乙锭作为嵌入剂来结合核酸。

发明概述：

用于将来自溶液生物分子(例如核酸)结合到固相支持物的表面的很多方法是本领域技术人员已知的，但是这些备选方法中没有一个可适用于特殊应用的净化方法。

因此，本发明指向用于检测样品中生物分子的方法和化合物，其净化试剂为所述检测所必需的，和/或保持所述试剂不含生物分子，由此在特定实验背景下使净化过程恒定发挥作用。尤为特别地，本发明指向通过在实际的核酸扩增之前永久存在的核酸结合化合物来确保核酸扩增的效率而不扩增非目标核酸分子和/或潜在地存在于所述试剂中的目标核酸分子的改进方法和化合物。

本发明的一个方面是用于检测样品中生物分子的方法，其避免检测到潜在地存在于为检测样品中的生物分子所必需的试剂中的生物分子，包括步骤：

a)提供潜在地包括所述生物分子的样品，

b)提供偶联于固相表面的结合部分，

c)提供为检测生物分子所必需的试剂，

d)向所述样品中加入所述试剂，

e)检测所述样品中的生物分子，以及

其中，在步骤c)或在步骤d)或在步骤c)和d)中，所述的试剂在环境下与所述的结合部分物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的所述生物分子结合到偶联于所述固相表面的所述结合部分上。

本发明也涉及扩增目标核酸分子的方法，包括步骤：

a)提供潜在地包括目标核酸分子的样品，

b)提供偶联于固相表面的核酸结合部分，

c)提供为扩增所述的目标核酸分子所必需的试剂，

d)向所述样品中加入所述试剂，

e)扩增所述样品中的所述目标核酸分子，并且

其中，在步骤c)或在步骤d)或在步骤c)和d)中，所述的试剂在环境下与所述的核酸结合部分物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的所述生物分子结合到偶联于所述固相表面的所述核酸结合部分上。

在本发明的备选实施方案中，步骤a)至c)可以以这些步骤的任何其他可能的顺序来进行。

贯穿本发明的“结合部分”是能够可逆地结合生物分子或生物区室的分子复合物。如果其能够结合核酸，那么它们就被称为核酸结合部分。如果其对双链核酸的亲和性高于单链核酸，则被称为双链核酸结合部分。短语双链核酸结合部分或′ds-DNA结合剂′在本发明中具有等同的意义。本发明的上下文中，短语核酸(NA)概括了脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)以及类似于肽核酸(PNA)或锁定的核酸(LNA)的核酸类似物。

生物区室是指细胞或细胞的集合体。由于细胞在细胞膜中具有特定的蛋白质和聚合体，结合部分对这些分子结构具有亲和性，而便于可逆地结合细胞或细胞集合体。而且，带阴性电荷的细胞膜与阳性结合部分的静电相互作用能够用于可逆地结合生物区室。

在本发明中自始至终，结合部分都是偶联到固相表面上的。这种固相的表面可以是任意形状的，因此包括例如盖玻片的平坦表面、例如检测试管的曲面、容器或移液管吸头、小颗粒例如磁珠的表面，或多孔材料例如玻璃毛的表面。在本发明中自始至终，容器是指单一的反应容器，例如Eppendorf帽或离心管。作为固相材料，所有的材料都可能在本发明的范围之内，只要这种固相材料的表面包括针对所述结合部分的偶联基团，或只要这个固相材料的表面可以被所述结合部分的偶联基团功能化。在一些情况中，在偶联结合部分之前，有必要给所述表面提供功能性包被。这种功能性包被是例如聚合物涂层。

在在本发明的上下文中，结合部分与固相表面的偶联包括共价键(例如硅烷偶联)、酰胺键或环氧化物偶联、例如His标签和鳌合物之间的配位结合、例如生物素/链霉亲和素键的生物亲和结合。

“样品中的生物分子”是指潜在地存在于待检测的所述样品中的目标分子，因此，其也被称为“样品中的目标分子”。而且，特定的非目标分子也可能存在于所述样品中而可能干扰目标分子的检测。不能通过本发明避免这些最初存在于样品中的非目标分子。如果目标分子和非目标分子是核酸分子，则相应地将其称作目标核酸分子和非目标核酸分子。非目标核酸分子是与目标核酸分子具有不同序列的分子。

此外，为了检测所述目标分子必需的试剂是可能含有非目标分子或目标分子，或同时含有这两种分子的溶液，如果将这些分子引入所述样品成为污染，可能在例如诊断检测中干扰样品中目标分子的检测。在本发明的范围内，潜在地存在于试剂中的非目标分子还包括含有目标和/或非目标核酸分子的细胞。本发明自始至终通过短语“潜在地存在于试剂中的生物分子”来概括这些潜在地存在于试剂中的非目标分子和/或目标分子。

关于核酸，潜在地存在于试剂中的目标分子包括核酸分子本身以及相应的扩增子和细胞中的核酸。本发明自始至终使用短语“潜在地存在于试剂中的核酸分子”来概括所有潜在地存在于试剂中的可能的核酸分子污染，也就是只有目标核酸分子、只有非目标核酸分子、或同时有目标和非目标核酸分子。

试剂包括为检测样品中目标分子所必需的所有物质，即例如缓冲液、酶、抗体、引物、探针、标记、核苷酸和/或脱氧核苷酸。

可能初始就存在例如非目标分子和/或目标分子的所述试剂的污染，或可在一个或多个检测步骤中引入这些分子，例如通过加入已污染的试剂，或仅仅通过使试剂与周围环境接触。试剂的污染可能引起非目标分子和目标分子进入所述样品而导致假阳性结果。

在本发明中，所述试剂的可能污染包括细胞或细胞集合体，因此在本发明的范围内细胞或细胞集合体也理解为非目标分子。作为突出的实例，在此提及PCR试剂的细菌污染物，因为这些试剂的细菌污染会向溶液中添加双链(ds)DNA。如果试剂中的细菌污染与将通过检测样品中特异性目标分子而验证的相同，那么这可能在基于目标核酸PCR扩增的诊断性检测中产生假阳性结果。在这种情况下，非来源于检测下的样品的目标核酸分子会使得PCR结果增大。

当在特定条件下结合部分与试剂物理性地接触时，发生从试剂中去除非目标分子和/或目标分子的污染，由此非目标分子和/或目标分子可逆地结合到结合部分上。

贯穿本发明，短语物理接触应被理解为，所述的结合部分与所述试剂在缓冲液、压力、温度、放射或机械应力的特定条件下相接触。本领域的技术人员已知，有机分子之间的结合一般都是可逆的，并且依赖于周围缓冲溶液的条件。因此，要提供特定的条件来确保非目标分子和/或目标分子与结合部分结合的条件。本发明自始至终，物理接触包括将载玻片或颗粒浸入到试剂中，用试剂填充例如试管，或使试剂流过例如移液管吸头。

在本发明的范围中，所有的检测模式都可能用于目标分子的检测，只要其能够检测有机分子。

在DNA的情况下，本领域的技术人员已知适用的检测方法在标准的教科书中有描述，如Sambrook等人：Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2nd Addition，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)或Ausubel等人：Current Protocolsin Molecular Biology(1987)J.Wiley and Sons，NY)。

在蛋白质的情况下，适用的检测方法在如下教科书中有描述，Tijssen：Practice and theory of enzyme immunoassays(1985，Elsevier，Amsterdam，Netherlands)and Aslam & Dent：Bioconjugation(2000，Macmillian Reference，伦敦，英国)。

对于目标核酸分子的扩增，本领域技术人员已知的所有检测技术，例如PCR、LCR或复制酶扩增都可包括在本发明的范围内。

本发明的另一个方面与固相材料有关，其中双链核酸结合部分偶联到所述固相材料的表面。固相材料和以特定数量偶联到其表面的结合部分的复合物可以是根据本发明的固相材料和结合部分的任意组合。

本发明的另一个方面是所述固相材料用于扩增样品中的目标核酸，避免潜在地存在于为扩增所述样品中所述目标核酸分子所必需的试剂中的核酸分子扩增的用途。目标核酸分子的扩增包括扩大样品中核酸分子数目的任何可能性。实例是提供核酸拷贝数相对于循环数指数级增长的PCR和LCR，或是提供核酸拷贝数相对于反应时间线性增长的复制酶扩增。

本发明还涉及包括根据本发明为进行目标核酸扩增所必需的试剂和所述固相材料的试剂盒。

附图简述：

图1：生物素化的ds-NA结合剂(MGB)

图2：ds-NA结合剂的特性(MGB，肽和嵌入剂)

图3：使用偶联于Dynabeads的ds-NA结合剂通过PCR扩增来测定来自细菌DNA的净化效率。

图4：连接到Dynabeads的ds-NA结合剂对hg DNA的净化效率，通过PCR扩增测定。

图5：使用3个偶联于Dynabeads的ds-NA结合剂通过PCR扩增测定来自质粒DNA的净化效率。

图6：利用UV吸收率以时间依赖性方式评估双-PEG-偏端霉素/SA-磁珠复合物对于双链和单链寡核苷酸的选择性。

图7：利用PCR扩增以时间依赖性方式评估3种ds-NA结合剂对于双链和单链寡核苷酸的选择性。

图8：利用双-PEG-偏端霉素/SA-磁珠复合物净化来自细菌DNA的溶液，并通过PCR扩增定量。

图9：利用双-PEG-偏端霉素/SA-包被的试管净化来自细菌DNA的溶液，并通过PCR扩增定量。

图10：利用几种细菌结合物/SA-磁珠复合物通过PCR扩增测定的两个细菌浓度下的净化效率。

发明详述：

a)提供潜在包括所述生物分子的样品，

b)提供偶联于固相表面的结合部分，

c)提供为检测生物分子所必需的试剂，

d)向所述样品中加入所述试剂，

e)检测样品中的生物分子，并且

本发明的另一个方面是用于检测样品中生物分子的方法，其避免检测到潜在地存在于为检测样品中的生物分子所必需的试剂中的生物分子，包括步骤：

a)提供偶联于固相表面的结合部分，

b)提供为检测生物分子所必需的试剂，

c)向潜在地包括所述目标分子的样品中加入所述的试剂，

d)检测所述样品中的生物分子，并且

其中，在步骤b)或在步骤c)或在步骤b)和c)中，所述的试剂与环境下与所述的结合部分物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的所述生物分子结合到偶联于所述固相表面的所述结合部分上。

在本发明中自始至终，试剂是指为检测所述目标分子所必需的所有试剂，包括例如缓冲溶液、酶、抗体、引物、探针、标记、核苷酸和/或寡核苷酸的物质。由于这些试剂都要被加入样品中，所以确保所使用的试剂没有被非目标分子以及目标分子污染是十分重要的，以便于在检测样品中的目标分子时避免假阳性结果。

上述用于检测样品中目标分子的检测方法避免了检测到潜在地存在于所述试剂中的生物分子，减少了由于污染所引起的假阳性结果的风险。

潜在地存在于所述试剂中的生物分子选自目标分子、非目标分子、以及同时存在的目标分子和非目标分子。非目标分子和/或目标分子与所述结合部分的结合优选是可逆的，因此，在特定条件下发生结合，并且能够通过改变所述的条件而释放出来。优选能够通过改变缓冲液浓度、温度或机械压力方面的条件而变换非目标分子和/或目标分子的结合和释放。最优选地，在室温和适度的盐浓度下发生非目标分子和/或目标分子的结合。

有机分子之间结合的条件和相互作用的类型是本领域的技术人员已知的。对于蛋白质来说，相互作用在教科书Tijssen：Practice andtheory of enzyme immunoassays(1985，Elsevier，阿姆斯特丹，荷兰)以及Aslam和Dent：Bioconjugation(2000，Macmillian Reference，伦敦，英国)中有描述。DNA与其他有机分子的相互作用在标准的教科书中都有描述，例如Sambrook等人：Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2nd Addition，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)或Ausubel等人：Current Protocolsin Molecular Biology(1987，J.Wiley和Sons，NY)。

ds DNA与类似于小沟结合剂或嵌入剂的ds-NA结合剂的结合可以在含盐溶液如氯化钠、氯化钾、氯化镁或Tris缓冲液中进行，而在较低盐浓度下的结合亲和性更高，优选使用10-100mM的盐浓度。而且，优选在室温和非变性的pH，优选pH6-8下进行结合步骤(Zimmer，G.等人，Prog.Biophys.Molec.Biol.47(1986)37-112；Pauluhn，J.等人Ber.Bunsenges.Phys.Chem.82(1978)1265-1278)。

对于ds DNA与结合ds-DNA的抗体的结合，可以使用TBS缓冲液，优选为室温下pH7.4的25mM Tris和150mM氯化钠(DiPietro，S.M.等人，Biochemistry 42(2003)6218-6227)。蛋白质-DNA结合的亲和性随着盐浓度的增加而降低(Record，M.T.等人，J.Mol.BioL 107(1976)145-158)。

此外，可在“现有技术背景”的章节和本发明的实施例中引用的文献和专利中找到适于双链DNA与不同的ds-DNA结合剂相结合的条件。

在本发明所述的优选方法中，使潜在地存在于所述试剂中的所述生物分子与偶联于所述固相表面的所述结合部分相结合的所述条件包括于室温下，10-200mM的盐浓度，最优选10-50mM，非变性pH，最优选pH6-8，5-90分钟的孵育时间，最优选60分钟。

在本发明所述的另一个优选方法中，在添加步骤之前将检测样品中的所述生物分子所必需的所述试剂混合，由此所述试剂与所述结合部分在环境下物理接触，并由此潜在地存在于所述试剂中的所述生物分子与偶联于所述固相表面的所述结合部分相结合。

由于在通常情况下，为了进行目标分子的检测，需要特定比率的两种或多种试剂在添加至样品前混合所述试剂是更为有利的，这样试剂与所述结合部分，优选在所有时间都进行物理接触。在本发明的另一个实施方案中，以适当的量依次将试剂加入到样品中，这样每个试剂都与所述的结合部分，优选在所有的时间都进行物理接触。

在本发明的优选方法中，所述的固相表面是容器或移液管吸头的内表面。

在本发明的该实施方案中，在加入样品前，在其表面偶联有结合部分的容器中提供、保存和/或混合要检测所述目标分子所必需的试剂。若将试剂从一个容器转移到另外一个容器中，或如果将试剂最终加入样品中，在本发明的一个实施方案中使用其表面偶联有结合部分的移液管吸头。根据本发明的用结合部分功能化的固相优选是塑料装置，类似于例如试管或移液管吸头，或玻璃装置，例如反应容器。

在本发明的另一个优选方法中，所述固相表面是指珠子的表面或多孔材料的表面。

在本发明的这个实施方案中，将其表面偶联有结合部分的珠子加入含有某种试剂的容器中。提供用于特定孵育时间的适当条件，非目标分子和/或目标分子结合到结合部分上，并且上清液包括优选不含非目标分子和目标分子的试剂。最优选地，这些珠子是磁珠，例如商业化的磁性Dynabeads(Dynal Biotech S.A.，奥斯陆，挪威)。

在本发明的另一个实施方案中，使用多孔材料表面偶联有结合部分的所述多孔材料来去除试剂内的非目标分子和/或目标分子。优选地，将多孔材料成型为过滤器，而所述的过滤器能够与例如注射器组合，用于在从一个容器向另一个容器或向样品转移试剂期间，去除试剂中的非目标分子和/或目标分子。本发明所述的可能偶联结合部分的多孔固相优选是多孔无机材料，例如玻璃毛或可控孔度的玻璃。备选的是多孔塑料，比如聚乙烯(PE)或聚丙烯(PP)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚丙烯腈(PAT)、或聚偏二氟乙烯(PVDF)或聚苯乙烯。在本发明的另一个备选实施方案中，使用多孔有机材料，例如多孔聚合物或共聚物材料。

在本方法的优选实施方案中，本发明所述的结合部分通过共价键或生物亲和键，优选生物素/链霉亲和素键与所述固相表面偶联。

所述结合部分与所述固相表面的偶联包括共价键，例如硅烷偶联到羟基表面，或氨基偶联到环氧化物，硫醇连接到金属例如金上，例如组氨酸标签和鳌合剂之间的配位结合，例如生物素/链霉亲和素的生物亲和连接或生物素/抗生物素蛋白键。在本发明的另一个实施方案中，所述固相表面被包括针对结合部分的偶联位点的聚合物层所覆盖。

在本发明的优选实施方案中，所述结合部分的结合亲和性使得试剂中的生物分子含量的减少系数至少为10²，优选至少为10³。

试剂中的生物分子含量包括试剂中的目标分子的含量和/或非目标分子的含量，其依赖于存在于所述试剂中的核酸分子的类型。

本发明中自始至终所使用的短语“结合亲和性”用于定量测定结合非目标分子和/或目标分子的能力。某个结合部分减少非目标分子和/或目标分子量的能力可能取决于环境条件，即例如缓冲液的组成或温度。在本发明的范畴内，调整结合部分和环境条件的组合，以实现试剂内非目标分子含量和/或目标分子含量的减少系数为至少10²，优选系数为至少10³。

在另一个优选的实施方案中，本发明所述的方法进一步包括下列步骤：

f)将与所述结合部分缔合的生物分子洗脱下来，以及

g)检测所述洗脱的生物分子。

由于本发明所述的非目标分子和/或目标分子与结合部分的结合是可逆的，就有可能在净化后检测结合的分子，以研究所用试剂内的污染，或在制备步骤期间引入的污染。如果改变缓冲液的浓度、温度、pH、变性试剂或机械压力方面的结合条件，就会发生所述的洗脱。优选在适度的温度和盐浓度以及碱性pH下从所述结合部分上释放非目标分子和/或目标分子。对于结合部分与非目标分子和/或目标分子之间的静电相互作用，可以通过提高盐浓度和相应屏蔽作用的增强而获得释放。一般来说可通过提高温度而实现非目标分子和/或目标分子与结合部分的偶联。

在本发明所述的另一个优选方法中，所述目标分子和所述非目标分子是核酸分子，最优选地，试剂中的所述目标分子和所述非目标分子是双链核酸分子。

在本发明的优选实施方案中，结合部分是能够连接双链核酸分子的部分。

如果结合部分结合了双链核酸分子，将其称为双链核酸结合部分。在整个本发明中短语双链核酸结合部分或′ds-NA结合剂′是等同的。

在本发明的更优选的实施方案中，结合部分是聚阳离子实体、小沟结合剂、嵌入剂或抗双链核酸的抗体。

聚阳离子实体是带有多个电荷的大分子。就聚合体或肽来说，这个聚阳离子实体包括一定数量的单体，每个单体具有正电荷或负电荷，或是中性的。因此，这样的聚阳离子实体的特点在于其所带的净电荷，即为所有单体电荷的总和。实例是肽或聚胺酰衍生物。小沟结合剂(MGBs)，例如偏端霉素或甲基-咪唑-聚酰胺衍生物，是结合到双链核酸的小沟上的分子。嵌入剂，例如放线菌素D或溴化乙锭，是结合在双链核酸的堆叠的碱基对之间的分子。已知抗-dsDNA的抗体只选择性地结合双链DNA，而不结合单链DNA。这些种类的ds-DNA结合剂是本领域技术人员公知的，附加的信息包括在“现有技术背景”的章节中。

在本发明所述的另一个实施方案中，所述样品中目标分子的检测是基于核酸扩增反应。

合适的DNA检测方法是本领域的技术人员已知的，并且在标准的教科书中有描述，如Sambrook等人：Molecular Cloning，ALaboratory Manual(2nd Addition，Cold Spring Harbour LaboratoryPress，Cold Spring Harbour，NY)或Ausubel等人：CurrentProtocols in Molecular Biology(1987)J.Wiley和Sons，NY)。检测方法可包括但不限于，特殊染料例如溴化乙锭的结合或嵌入，其嵌入双链DNA中并在此后改变其荧光。也可任意地在限制性消化后通过电泳方法而分离纯化DNA然后显示。也可使用基于探针的分析，其中使寡核苷酸与特异性序列杂交并且随后检测杂交物。也可在本领域技术人员已知的进一步的步骤之后进行DNA测序。另一个方法是将不同的DNA序列应用于硅芯片上，使这些硅芯片与特异的探针结合，并且当互补的序列结合时产生信号。

对目标核酸分子的扩增包括扩增样品中核酸分子的拷贝数的任何可能。实例是使核酸拷贝数对于循环数呈几何增长的PCR或LCR扩增，或是使核酸拷贝数对于反应时间呈线性增长的复制酶扩增。另外可能的扩增反应已经在′现有技术背景′一章中进行了描述。

在所述核酸扩增前的所有准备步骤中，例如缓冲液的准备、储液的稀释、酶、核苷酸、引物和探针的提供、成分的混合和/或将试剂移液至用于扩增的反应容器中，都包括了污染样品的一定风险。因此，在连接到固相表面的结合部分的帮助下，在所述的核酸扩增前应尽可能多地完成这些准备步骤。

用于DNA的特别优选的检测方法是所谓的“同源性“分析。”同源性“分析系统包括报告分子或在目的序列扩增时能产生信号的标签。“同源性”分析系统的实例是TaqMan系统，其已经在US5,210,015、US 5,804,375和US 5,487,972中有详细阐述。简单地说，该方法是基于双标记探针和Taq DNA聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。探针与通过PCR过程而扩增的目标序列互补，并且在每个聚合酶循环步骤中，探针位于两个PCR引物之间。该探针上结合有两个荧光标记。一个是报告染料，例如6-羧基荧光素(FAM)，其发射光谱由于在空间上接近第二个荧光染料6-羟基-四甲基-若丹明(TAMRA)通过发生能量转移而淬灭。在每个扩增循环过程中，在延长初始DNA链的过程中，Taq DNA聚合酶代替和降解退火的探针，后者是由于该聚合酶固有的5′-3′核酸外切酶活性。该机制也使得报告染料从TAMRA的淬灭活性中释放出来。因而该荧光活性随着探针断裂的增加而增强，这与生成PCR产物的量成比例。因此，可以通过检测释放的荧光标记的强度来测定扩增的目标序列。

利用所谓的“分子信标”(US 6,103,476)使荧光染料分子之间能量转移的相似原理应用于“同源性分析”。这些发夹形状的核酸分子具有内部淬灭的荧光团，当其结合目标核酸时，荧光团的荧光就会恢复(US 6,103,476)。将其设计成分子的环部分是与PCR过程中的目标序列内的区域互补的探针序列。通过使探针序列末端上的互补臂序列退火形成茎。荧光部分连接到臂的末端，淬灭部分连接到另一个臂的末端。茎使得这两个部分互相紧密接近，导致由于能量转移使荧光团的荧光淬灭。由于淬灭剂部分是非荧光生色团，并且放出其从作为热源的荧光团获得的能量，探针不能发出荧光。当探针遇到目标分子，它形成比茎杂合体更长更稳定的杂合体，并且其硬度和长度排除了茎杂交体的同时存在。因此，分子信标经历了自发的构象重组，迫使茎分开，并导致荧光团和淬灭剂相互间移开，恢复可检测到的荧光。

通过在LightCycler仪器中使用的模式(参见例如US 6,174,670)来提供用于“同源性”分析体系的更多实例，其中一些有时候被称为“相吻探针”。此外，该原理是基于两个相互作用的染料，其特征在于通过荧光共振能量转移供体染料激发受体染料。例示的方法使用了两个修饰的寡核苷酸作为杂交探针，其与PCR过程中目标序列的邻近的内部序列杂交。5′-定位的修饰的寡核苷酸在其3’末端有一个供体染料作为标签。3′定位的修饰的寡核苷酸在其5′末端有一个受体染料。在扩增循环过程中，在两个修饰的寡核苷酸与目标序列按从头至尾的方向退火后，使供体和受体染料紧密接近。通过单色光脉冲的方式特异性地激发供体染料时，检测到受体染料荧光，从而提供了对PCR产物形成的量的测定。

另一个分析方式是所谓的“阵列”模式。“阵列”是装置上的可设定地址的定位排列(例如US 5,143,854、US 6,022,963、US6,156,501、WO 90/15070、WO 92/10092)。位置数能够从几个到至少几十万个。更重要的是，每个位置代表一个完全独立的反应位点。每个位置都携带一种核酸，例如“低聚的化合物”，其可作为第二核酸，特别是目标核酸的结合伴侣。其制造方法在EP-A-0 476 014，Hoheisel，J.D.，TIBTECH 15(1997)465-469、WO 89/10977、WO89/11548、US 5,202,231、US 5,002,867、WO 93/17126中有描述。进一步的研发已经提供了在非常小的区域内制备非常大的寡核苷酸探针阵列的方法(US 5,143,854、WO 90/15070、WO 92/10092)。微型制备的大量寡核苷酸探针的阵列，称为“DNA芯片”，为广泛的多样性应用提供了重要的保证(例如US 6,156,501和US 6,022,963)。该方法的基本步骤是分离来自对照和处理样品的核酸并且在扩增过程中用不同的荧光染料进行标记。更详细的是，根据US 5,545,522、US 5,716,785、US 5,891,636和US 6,291,170中描述的方法进行，其中用包括细菌T7启动子的引物合成双链cDNA，在存在核糖核苷三磷酸时转录标记的RNA，由此使标记连接到某些核苷三磷酸上。然后任选地使这些标记的核酸片段化、混合、并与阵列的低聚化合物杂交。

之后使用光学设备来测定每个染料对于每个单个点的相对强度。两个探针之间荧光水平的比率显示了样品之间基因表达的比率。通过这些方法，研究者能够同时评估一整套基因，而不是一次只查找一个基因的效果。之后可通过传统的方法，例如northern印迹或定量实时PCR追踪特异性基因的高差异性表达。可组合来自多个实验的数据用于指定其他未知功能基因的功能性信息。在不同状态下显示出相似表达图谱的基因很可能参与了共同的生理或代谢途径。已经开发了成簇分析程序，其容许检测反映功能信息的共表达的基因群。根据本发明的另一个实施方案，所述结合部分是能够结合生物区室的部分。

在本发明的另一个实施方案中，试剂内的污染是生物区室，而结合部分能够与这些生物区室相结合。生物区室是细胞或细胞的集合体。在本发明的范围内，潜在地存在于试剂中并含有目标和/或非目标核酸分子的细胞或细胞的集合体是非目标分子。由于细胞在细胞膜内具有特定的蛋白质或聚合物，本发明该实施方案的结合部分对这些细胞结构具有特定的亲和性，以便于可逆的结合细胞或细胞集合体。本发明该实施例的可能结合部分包括，膜化合物的抗体、或细胞结合蛋白质，优选纤连蛋白，或这些结合蛋白的功能性部分。

另一个实施方案中，用于结合细胞或细胞集合体的结合部分是可以与膜结构，优选染料分子或两性分子组装在一起的结合部分。另外，小沟结合物(MGB)可用作结合细胞或细胞集合体的结合部分。染料的实例包括功能化的结晶紫、亚甲基兰和番红O，使染料以与固相表面偶联。能够结合细胞膜的两性分子的实例包括，例如十二烷基磺酸钠(SDS)、胆固醇或十二(烷)酰基细胞溶素，也被功能化以便与固相表面偶联。合适的MGBs是例如偏端霉素或甲基-咪唑-聚酰胺衍生物。

在另一个实施方案中，用于结合细胞或细胞集合体的结合部分是多聚阳离子实体。这些多聚阳离子实体，优选聚阳离子肽或聚合物通过与细胞膜的多个负电荷的静电相互作用而结合细胞。也使这些聚阳离子实体功能化以与固相表面偶联。

在本发明的另一个优选的实施方案中，所述的结合部分是能够结合双链核酸分子和生物区室的部分。本发明的这个实施方案的一个可能的变种是特异于细胞或细胞集合体的结合部分与特异于潜在地存在于所述试剂中的双链核酸分子的结合部分的组合。因此，可以使用两种或多种不同的部分或使用一种能够结合双链核酸分子和生物区室两者的结合部分来实施本发明的这个实施方案。根据本发明的该实施方案的方法能够结合基于细胞或细胞集合体和基于在单个准备步骤中潜在地存在于所述试剂中的双链核酸分子的污染物。

本发明的另一个方面涉及扩增样品中目标核酸分子的方法，包括步骤：

a)提供潜在地包括目标核酸分子的样品，

b)提供偶联于固相表面的核酸结合部分，

c)提供为扩增所述目标核酸分子所必需的试剂，

d)将所述试剂加入所述的样品中，

e)扩增所述样品中的所述目标核酸分子，并且

其中，在步骤c)或在步骤d)或在步骤c)和d)中，所述试剂与所述核酸结合部分在环境下物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的所述核酸分子结合到偶联于所述固相表面的所述核酸结合部分上。

本发明的另一个方面涉及扩增目标核酸分子的方法，其避免扩增潜在地存在于为扩增样品中所述目标核酸分子所必需的所述试剂中的核酸分子，包括步骤：

a)提供潜在地包括目标核酸分子的样品，

b)提供偶联于固相表面的核酸结合部分，

c)提供为扩增所述目标核酸分子所必需的试剂，

d)向所述样品加入所述的试剂，

e)扩增所述样品中的所述目标核酸分子，并且

其中，在步骤c)或在步骤d)或在步骤c)和d)中，所述的试剂与所述核酸结合部分在环境下物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的所述核酸分子结合到偶联于所述固相表面的所述核酸结合部分上。

本发明的另一个方面涉及扩增样品中的目标核酸分子的方法，包括步骤：

a)提供偶联于固相表面的核酸结合部分，

b)提供为扩增所述目标核酸分子所必需的试剂，

c)向潜在地包括目标核酸分子的样品中加入所述试剂，

d)扩增所述样品中的所述目标核酸分子，以及

其中，在步骤b)或在步骤c)或在步骤b)和c)中，所述试剂与所述的核酸结合部分在环境下物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的所述核酸分子结合到偶联于所述固相表面的所述核酸结合部分上。

本发明的另一个方面涉及扩增样品中的目标核酸分子的方法，其避免扩增潜在地存在于为扩增样品中所述目标核酸分子所必需的所述试剂中的核酸分子，包括步骤：

a)提供偶联于固相表面的核酸结合部分，

b)提供为扩增所述目标核酸分子所必需的试剂，

c)向潜在包括目标核酸分子的样品中加入所述试剂，

d)扩增所述样品中的所述目标核酸分子，以及

其中，在步骤b)或在步骤c)或在步骤b)和c)中，所述试剂与所述核酸结合部分在环境下物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的所述核酸分子结合到偶联于所述固相表面的所述核酸结合部分上。

为了扩增核酸分子，有几种试剂是必需的，包括缓冲溶液、酶、引物、探针、标签和/或核苷酸。由于要将这些试剂加入样品中，因此确保所使用的这些试剂没有被非目标核酸分子以及核酸目标分子所污染是很重要的，这样可以避免检测样品内的目标分子时出现假阳性结果。

潜在地存在于所述试剂中的核酸分子选自：只含目标核酸分子、只含非目标核酸分子、以及同时含有目标和非目标核酸分子。上面提到的用于扩增样品中的目标核酸分子，并避免扩增潜在地存在于所述试剂中的非目标核酸分子和/或目标核酸分子的扩增方法，降低了由于污染而带来的假阳性结果的风险。

优选地，在上述包括室温和适度盐浓度的条件下发生非目标核酸分子和/或目标核酸分子的结合。

在根据本发明的扩增目标核酸分子的另一个优选方法中，在加入步骤d)之前混合要扩增所述目标核酸分子所必需的所述试剂，由此所述试剂与所述核酸结合部分在环境下物理接触，由此潜在地存在于所述试剂中的核酸分子结合到偶联于所述固相表面的所述核酸结合部分上。

上述关于目标分子的检测，要扩增目标核酸分子需要一种以上的试剂，因此在加入样品前，混合所述的试剂是有利的，由此试剂与所述的结合部分，优选在所有的时间都进行物理接触。可以在扩增期间，例如在实时PCR中，或在扩增后对所扩增的目标核酸分子进行检测。

在根据本发明扩增核酸分子的优选方法中，所述固相材料的表面是容器或移液管吸头的内表面。

在根据本发明的扩增核酸分子的另一个优选方法中，所述固相材料的表面是珠子的表面或多孔材料的表面。

上述关于目标分子的检测，优选在加入样品前，在其表面偶联有结合部分的容器中提供、保存和/或混合要扩增所述目标核酸分子所必需的试剂。在本发明的一个优选实施方案中，如果将试剂从一个容器转移到另一个容器，或是将试剂最终加入样品中，则使用其表面偶联有结合部分的移液管吸头。将所述珠子的表面偶联有结合部分的珠子加入到，例如含有某些试剂的容器中，以结合非目标核酸分子和/或目标核酸分子，并且获得优选没有污染的上清液。也使用多孔材料的表面偶联有结合部分的所述多孔材料来除去试剂内的污染。优选地，使多孔材料成型为滤器，而所述的滤器可与注射器组合，用于在将试剂从一个容器转移到另一个容器或最终加入样品中时，从试剂中除去非目标核酸分子和/或目标核酸分子。

在根据本发明的扩增目标核酸分子的优选方法中，试剂中的所述非目标核酸分子和所述的目标核酸分子是双链核酸分子，优选双链DNA分子。

在根据本发明扩增核酸分子的另一个优选方法中，所述核酸结合部分是双链核酸结合部分。

上述关于目标分子的检测中已经描述了可能的双链核酸结合部分。为了能够使双链核酸分子结合ds-NA结合剂，需要将温度控制在杂交的解链温度以下。

在根据本发明扩增目标核酸分子的更优选方法中，所述双链核酸结合部分对单链核酸分子的亲和性低于其对双链核酸分子的亲和性。

如前所述，本发明中自始至终，结合亲和性是对结合部分结合非目标分子和/或目标分子的能力的定量测量。注意，结合亲和性可能依赖于环境条件，即例如缓冲液的组成或温度。对于将区别双链核酸和单链核酸的ds-NA结合剂来说，针对这两个分子类型的结合亲和性必须是不同的。因此，在本发明的范畴中，将ds-NA结合剂和环境条件调整至能够实现这种亲和性的差异。

以定量的方式测定ds-DNA结合剂的这种亲和性差异的方法是，提供分别包括相同量的单链和双链DNA分子的两个样品。将两个样品与相同数量的ds-DNA结合剂在相同的反应条件下孵育一定时间后，定量样品中剩下的单链和双链DNA分子。样品中剩余量的比例是ds-DNA结合剂对单链和双链DNA的亲和性差异。

更普遍的，ds-DNA结合剂的亲和性差异必须足够大才可能以有效的方式结合存在于含有大量短的、单链引物分子的试剂中的少量长的双链核酸分子。如果ds-DNA结合剂的亲和性差异不够大，那么短的单链引物分子将占据所有的结合部分，而长的双链核酸分子将留在试剂中(见实施例8)。

在根据本发明扩增目标核酸分子的另一个优选方法中，所述双链核酸结合部分的结合亲和性使得试剂内双链核酸含量的降低系数至少为10²，更优选系数为至少10³。

双链核酸的含量包括试剂中双链目标核酸分子的含量和/或双链非目标分子核酸的含量，取决于所述试剂中存在的核酸分子的类型。

根据扩增目标核酸分子方法的另一个实施方案，所述的双链核酸结合部分是多聚阳离子实体、小沟结合剂、嵌入剂或抗双链核酸的抗体。

根据扩增目标核酸分子方法的优选实施方案，所述的聚阳离子实体是结合核酸的聚酰胺衍生物。

根据扩增目标核酸方法的更优选实施方案，所述的结合核酸的聚酰胺衍生物带有正的净电荷，优选每个单体带有至少0.1个正的净电荷，更优选每个单体带有至少0.2个正的净电荷。

如上所定义的，聚阳离子实体是带有多个电荷的大分子。对于聚合物或肽来说，这个聚阳离子实体包括特定数量的单体，每个单体带有正电荷、负电荷、或是中性的。因此，这样的聚阳离子实体的特征就由其净电荷体现，净电荷是所有单体电荷的总和。为了比较带有不同数量的单体单位的聚阳离子实体，在单体单位的这种数量上使净电荷标准化，提供“每个单体的正净电荷”的数量。这些聚阳离子实体提供对双链和单链核酸之间的特定选择性，也就是聚阳离子实体对双链核酸比对单链核酸有更高的亲和性。无需理论化，这个效应也许来自于双链和单链核酸分子中电荷的差异。在本发明的优选实施方案中，当长的双链核酸(例如细菌DNA)存在于含有短的单链核酸(例如引物)的试剂中时，基于试剂中双链和单链核酸之间电荷差异的选择性就更加显著了。

根据扩增目标核酸分子方法的优选实施方案，所述的小沟结合剂是偏端霉素、纺锤菌素、甲基-咪唑-聚酰胺衍生物或4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)衍生物。

根据扩增目标核酸分子方法的另一个优选实施方案，所述嵌入剂为吖啶衍生物，优选吖啶黄素衍生物或菲啶鎓化合物，优选溴化乙锭衍生物。

上述的小沟结合剂和嵌入剂以及其它分子也可用于本发明，例如在Demeunynck等人(编辑)：DNA and RNA binders(Vol.1 & 2，2003，Wiley-VCH，Weinheim)的教科书中所描述的。

在根据本发明的扩增目标核酸分子的另一个优选方法中，所述的双链核酸结合部分通过共价键或通过生物亲和键，优选生物素/链霉亲和素键，与所述固相材料的表面偶联。

在根据本发明扩增目标核酸分子的另一个优选方法中，生物素化的双链核酸结合部分连接到链霉亲和素包被的固相表面。

由于一些已经用链霉亲和素功能化的固相材料可商业购买，因此使用这种生物亲和键的标准体系是有利的。例如链霉亲和素包被的DynabeadsM-280(Dynal Biotech S.A.，产品号112.06，Oslo，挪威)或链霉亲和素包被的PCR管(Roche目录号1741772，RocheDiagnostics GmbH，曼海姆)。此外，用生物素基团修饰的不同的有机分子已经广泛用于本领域(见教科书Kessler(编辑)：Nonradioactivelabeling and detection ofbiomolecules，1992，Springer Verlag，海德尔堡)。

在根据本发明扩增目标核酸分子的另一个优选方法中，该方法进一步包括步骤：

f)将与所述核酸结合部分缔合的核酸分子洗脱下来，以及

g)检测所述洗脱的核酸分子。

根据本发明的这个优选方法，提供了净化后对结合非目标核酸分子和/或目标核酸分子进行检测的时机，用以了解所用试剂的污染或在检测过程期间引入的污染。可通过本领域技术人员已知的技术，例如PCR扩增或某些阵列技术来检测洗脱的核酸分子。

在根据本发明扩增目标核酸分子的更优选方法中，步骤f)中的洗脱包括温度处理、离子强度的变化、pH的改进或变性试剂。

可以通过温度处理、离子强度的变化、pH改进和/或变性试剂来进行所述的对结合非目标核酸分子和/或目标核酸分子的洗脱作用。对于以ds-NA结合剂作为结合部分以及后续的双链DNA作为结合分子来说，洗脱作用相当于对DNA杂合物的变性，其中使温度提高到解链温度以上或碱性pH条件是优选的。

在根据本发明的扩增目标核酸分子的另一个优选方法中，所述目标核酸的扩增是PCR扩增。

在根据本发明扩增目标核酸分子的又一个优选方法中，所述的试剂包括寡核苷酸、核苷酸、酶和缓冲溶液。

在根据本发明扩增目标核酸分子的更优选方法中，所述的寡核苷酸包括引物和探针，且所述的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)。

在根据本发明扩增目标核酸分子的另一个优选实施方案中，所述目标核酸分子的扩增是用于样品的微生物感染检测中的核酸扩增。

样品微生物感染检测的实例是脓毒病检测，用于检测格兰氏阳性细菌，例如金黄色葡萄球菌或肺炎链球菌，和格兰氏阴性菌，例如大肠杆菌或产气肠杆菌。这种检测都是本领域技术人员已知的，并包括几个步骤：从获得潜在地含有细菌细胞的生物样品开始，裂解细胞，以及最后分离遗传物质用于扩增。

本发明的另一个方面涉及固相材料，其中双链核酸结合部分偶联于所述固相材料的表面。

由固相材料和偶联于其表面的一定数量的ds-NA结合剂构成的复合物可以是本发明所述的固相材料和结合部分的任意组合。这个固相的表面可以是任意形状的，因此包括例如盖玻片的平坦表面、例如试管、容器或移液管吸头的弯曲表面、例如磁珠的小颗粒表面、或例如玻璃毛的多孔材料表面。本发明中自始至终，容器是指单一的反应容器，例如Eppendorf帽或离心管。作为固相材料，所有的材料都可能在本发明的范畴内，只要这个固相材料的表面包括用于所述结合部分的结合基团，或只要这种固相材料的表面被用于所述结合部分的结合基团功能化。在一些情况下，有必要在结合部分偶联前提供具有功能性包被的表面。这种功能性包被是例如聚合物涂层。

本发明的另一个方面涉及固相材料，其中双链核酸结合部分偶联于所述固相材料的表面，而所述的固相材料是容器、珠子、或移液管吸头。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述的固相材料是珠子或多孔材料。

在根据本发明的固相材料的优选实施方案中，所述双链核酸结合部分对单链核酸分子的亲和性低于其对双链核酸分子的亲和性。

在根据本发明的固相材料的另一个优选实施方案中，所述双链核酸结合部分的结合亲和性使试剂内双链核酸含量的降低系数为至少10²，优选系数为至少10³。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述的双链核酸结合部分是聚阳离子实体、小沟结合剂、嵌入剂或抗双链核酸的抗体。

根据本发明所述的固相材料的更优选实施方案，所述的聚阳离子实体是结合核酸的聚酰胺衍生物。

根据本发明所述的固相材料的更优选实施方案，所述核酸结合聚酰胺衍生物带有正的净电荷，优选每个单体带有至少0.1个正的净电荷，更优选每个单体带有至少0.2个正的净电荷。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述小沟结合剂是偏端霉素、纺锤菌素、甲基-咪唑-聚酰胺衍生物或4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)衍生物。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述的嵌入剂是吖啶衍生物，优选吖啶黄素衍生物或菲啶化合物，优选溴化乙锭衍生物。

在根据本发明的固相材料的另一个优选实施方案中，所述的双链核酸结合部分通过共价键或通过生物亲和键，优选生物素/链霉亲和素键与固相材料的表面相偶联。

在根据本发明的固相材料的更优选实施方案中，生物素化的双链核酸结合部分连接到链霉亲和素包被的固相表面上。

本发明的另一个方面是固相材料，其中聚阳离子实体或嵌入剂作为双链核酸结合部分而结合到所述固相材料的表面上。

在根据本发明的固相材料的优选实施方案中，生物素化的聚阳离子实体或生物素化的嵌入剂作为双链核酸结合部分结合到链霉亲和素包被的固相表面上。

本发明的另外一个方面是固相材料，其中结合部分与所述固相材料的表面偶联，所述的固相材料能够结合生产区室并且其中所述的固相材料是容器或移液管吸头。

如前面所述，生物区室是细胞或细胞的集合体，本发明的这个实施方案的结合部分对这些分子结构具有某种亲和性从而可逆地结合细胞或细胞的集合体。

在根据本发明的用于与生物区室结合的固相材料的优选实施方案中，所述的结合部分是小沟结合物，抗体、染料、两亲性实体或聚阳离子实体。

用于本发明的这个实施方案的可能的结合部分包括膜化合物的抗体或细胞结合蛋白质，优选纤连蛋白或这些结合蛋白的功能性部件。还可能是与膜结合装配在一起的结合部分，优选染料分子或两亲性分子。另外，小沟结合物(MGB)也可用作结合细胞或细胞集合体的结合部分。染料的实例包括经过官能化的结晶紫、亚甲基兰和番红O，以便与固体表面偶联。能够结合细胞膜的两亲性分子的实例包括例如十二碳烷基硫酸钠(SDS)胆甾醇或月桂酰基-细胞溶素，也已经官能化以便与固体表面偶联。合适的MGBs是例如偏端霉素或甲基-咪唑-聚酰胺衍生物。而且，聚阳离子实体可以被用作结合细胞或细胞集合体的结合部分。这些聚阳离子实体，优选聚阳离子肽或聚合物通过与细胞膜的多个负电荷的静电相互作用而结合细胞。这些聚阳离子实体也被官能化以便与固体表面偶联。

在根据本发明的用来结合生物区室的固相材料的另一个优选的实施方案中，生物素酰化的结合部分与链霉亲和素包被的固相表面相结合。

本发明的又一个方面是固相材料，其中染料、两亲性实体、聚阳离子实体或小沟结合物作为用于结合生物区室的结合部分被偶联到所述固相材料的表面。优选所述的结合部分是生物素化的并且所述的生物素化的结合部分结合到链霉亲和素包被的固相材料的表面。

本发明的另一个方面涉及固相材料，其中结合部分结合到能够结合双链核酸分子和生物区室的所述固相材料的表面。

在本发明的这个实施方案中，所述的结合部分是能够结合双链核酸分子和生物区室的部分。本发明的这个实施方案的一个可能的变种是对细胞或细胞集合体特异的结合部分与对双链核酸分子特异的结合部分的组合。因此，本发明的这个实施方案可以使用两种或多种不同的结合部分或使用一种能够结合双链核酸的分子和生物区室两者的结合部分来实施。根据本发明的这个实施方案的固相材料能够在单个的制备步骤中结合基于细胞或细胞集合体和潜在地存在于所述试剂中的双链核酸分子的污染。

在用来结合双链核酸分子和生物区室的固相材料的一个优选实施方案中，所述的固相材料是珠子、多孔材料、容器或移液管吸头。

在用来结合双链核酸分子和生物区室的固相材料的另一个优选的实施方案中，两种或多种结合部分被偶联到所述固相材料的表面。

在用来结合双链核酸分子和生物区室的固相材料的一个更加优选的实施方案中，所述的两种或多种结合部分选自小沟结合物、嵌入剂、抗体、染料、两亲性实体或聚阳离子实体。

在用来结合双链核酸分子和生物区室的固相材料的另外一个优选的实施方案中，生物素化的结合部分结合到链霉亲和素包被的固相的表面。

本发明的另一个方面涉及根据本发明的固相材料用于扩增样品中的目标核酸的用途，其中避免了扩增潜在地存在于为扩增所述样品中所述目标核酸分子所必需的试剂中的核酸分子。

因此根据本发明的固相材料用于扩增样品中目标核酸的用途，其避免扩增潜在地存在于所述试剂中的非目标和/或目标核酸，从而降低了由于污染造成的假阳性结果的风险。

在本发明所述的优选用途中，所述目标核酸的扩增是PCR扩增。

在本发明所述的另一个优选用途中，所述的目标核酸扩增是检测样品的微生物感染的一部分。

本发明的另一个方面涉及试剂盒，其包括为进行目标核酸扩增所必需的试剂，以及本发明所述的固相材料。

在本发明所述的优选试剂盒中，所述的试剂包括寡核苷酸、核苷酸、酶和缓冲溶液。

在本发明所述的更优选试剂盒中，所述的寡核苷酸包括引物和探针，并且所述的酶包括DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)。

在本发明所述的另一个优选试剂盒中，所述的固相材料包括移液管吸头和容器。

实施例1：

小沟结合剂(MGB)、肽和嵌入剂的合成

材料

从Novabiochem(Merck Biosciences AG，Lufelfingen，瑞士)购买rink酰胺树脂和Fmoc-Glu(生物素基-PEG)-OH。从Fluka购买4-(Fmoc-氨基)-1-甲基吡咯-2-羧酸(Fmoc-Amp-OH)和4-(Fmoc-氨基)-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(Fmoc-Im-OH)，并从Bachem(Bubendorf，瑞士)购买Fmoc-Orn-OH和Fmoc-Nva-OH。所有其他的氨基酸购买自Applied Biosystems(Foster City，美国)。HBTU和HOBt来自Iris Biotech(Marktredwitz，德国)。从Merck AG(Darmstadt，德国)获得肽合成溶剂(DMF，NMP)，类似的其他全部溶剂均为商业上提供的最高生化级别。

常规合成方法

利用FastMoc化学反应，手工或在Applied Biosystems Inc.433肽合成仪上合成所有的化合物。除非另有注释，使用以HOBt/HBTU和DIPEA活化1h的Fmoc氨基酸(1mmol)进行一般的偶联反应。使用在DMF中的20％哌啶处理树脂2×5min而有效地去除Fmoc。如下保护三功能的氨基酸侧链：Arg(Pmc)、Asn(Trt)、Asp(OtBu)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)、Tyr(tBu)。

1.小沟结合剂：

MGB1

Bi-PEG-偏端霉素

H-Glu(生物素基-PEG)-Nva-Om-Nva-Amp-Amp-Amp-Arg-NH₂

在将第一个精氨酸常规锚定在浓度为0.25mmol的rink酰胺树脂上后(0.43mmol/g)，随后去除其Fmoc基团，继续用NMP、异丙醇和NMP洗涤树脂。将DIPEA(DMF中为2M)加入Fmoc-Amp-OH(2mmol)和HOBt/HBTU(1∶1；2mmol)的溶液中。活化2分钟后，将混合物加入树脂中。将悬浮液振荡3小时，用DMF和异丙醇彻底洗涤树脂。该过程重复3次直到所有的3个Amp残基都掺入序列。如上所述切除Fmoc基团，使用双连接在正常连接条件下，通过Nva、Orn、Nva和Glu(生物素基-PEG)延长肽链。在切去N端Fmoc基团并且用DMF洗涤树脂后，用2.8ml(每100mg树脂)含有TFA、三乙基硅烷和乙二硫醇(0.8/0.5/1.5)的混合物切割树脂。将树脂过滤，用300ml冷的二异丙醚从洗提液中沉淀出肽。用乙醚洗涤沉淀，真空干燥，溶于乙酸/水(1/5)，用于在vydac polygosil上进行制备性的HPLC纯化。

LC-ESI-MS：m/z＝1410.12[M+H]⁺，C₆₄H₁₀₄N₂₀O₁₄S的计算值为M_r＝1409.59Da。

MGB2

双-PEG-偏端霉素(无Arg)

H-Glu(生物素基-PEG)-Nva-Om-Nva-Amp-Amp-Amp-NH₂

除了Fmoc-Arg(Pmc)不是作为第一个氨基酸连接到树脂上外，根据所描述的用于MGB1的方法合成这种物质。

LC-ESI-MS：m/z＝1253.74[M+H]⁺；C₅₈H₉₂N₁₆O₁₃S的计算值为M_r＝1253.51Da。

MGB3

双-PEG-咪唑-衍生物

H-Glu(生物素基-PEG)-Nva-Om-Nva-Im-Im-Im-Arg-NH₂

除了Fmoc-Amp-OH由4-(Fmoc-氨基)-1-甲基-1H-咪唑-2-羧酸(Fmoc-Im-OH)所代替外，根据所描述的用于双-PEG-偏端霉素的方法合成这种物质。

使用1.2ml含有TFA、水、苯甲硫醚、乙二硫醇(1/0.05/0.05/0.1)的混合物(每100mg的树脂)来从树脂上实现切割。如上所述进行检查和纯化。

LC-ESI-MS：m/z＝1412.86[M+H]⁺；C₆₁H₁₀₁N₂₃O₁₄S的计算值为M_r＝1411.9Da。

MGB4

双-PEG-咪唑-衍生物(短的)

H-Glu(生物素基-PEG)-Im-Im-Im-Arg-NH₂

除了Fmoc-Glu(生物素基-PEG)-OH直接与Im连接外，根据所描述的用于MGB3的方法合成这种物质。

LC-ESI-MS：m/z＝1100.5[M+H]⁺；C₄₆H₇₃N₁₉O₁₁S的计算值为M_r＝1100.20Da。

2.肽：

根据所描述的一般步骤进行合成。如用于咪唑偏端霉素化合物所描述的方法实现从树脂进行切割，并用制备性的HPLC纯化该物质。

肽1

H-Glu(生物素基-PEG)-QGRVEVLYRGSWGTVA-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝1168.06[M+2H]²⁺；C₁₀₄H₁₆₈N₃₀O₂₉S的计算值为M_r＝2334.1Da。

肽2

H-Glu(生物素基-PEG)-IGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝1116.58[M+3H]³⁺；C₁₅₄H₂₆₉N₄₃O₃₇S的计算值为M_r＝3346.7Da。

肽3

双-ZU-KKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRA-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝696.6[M+7H]⁷⁺；M_r＝4869.2Da.

肽4

双-XUZU-KKNKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTS-NH₂

M_r＝5639.8Da

肽5

双-XUZU-PWPLYGNEGLGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDPRRRSR-NH₂

M_r＝4728.8Da

肽6

双-XUUUU-QPGPPSEKAWQPGWT-NH₂

M_r＝2303.6Da

肽7

BXUZU-GGGGDDLGANDELISFKDEGEQEEK(Amid)

M_r＝3219.44g/mol

肽8

H-Glu(生物素基-PEG)-(Arg-Gly)₅-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝411.39[M+4H]⁴⁺；C₆₅H₁₂₁N₃₁O₁₇S的计算值为M_r＝1640.9Da。

肽9

H-Glu(生物素基-PEG)-(Arg-Gly)₁₅-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝755.8[M+5H]⁵⁺；C₁₄₅H₂₇₁N₈₁O₃₇S的计算值为M_r＝3773.3Da。

肽10

H-Glu(生物素基-PEG)-(Lys-Gly)₅-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝501.51[M+3H]³⁺；C₆₅H₁₂₁N₂₁O₁₇S的计算值为M_r＝1501.4Da。

肽11

H-Glu(生物素基-PEG)-(Lys-Gly)₁₅-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝839.43[M+4H]⁴⁺；C₁₄₅H₂₇₁N₅₁O₃₇S的计算值为M_r＝3354.6Da。

肽12

H-Glu(生物素基-PEG)-(Arg)₂₀-NH₂

LC-ESI-MS：m/z＝617.61[M+6H]⁶⁺；C₁₄₅H₂₈₆N₈₆O₂₇S的计算值为M_r＝3699.5Da。

缩写

氨基酸和肽的命名法是根据IUPAC-IBU委员会对生化命名法(Europ.J.Biochem.138(1984)9-37)的提议。

ABI 应用生物系统

Amp 氨甲基吡咯-2-羧酸

Boc 叔丁基羰基

Da 道尔顿

DIPEA 二异丙基乙胺

DMF 二甲基甲酰胺

ESI-MS 电喷雾电离质谱

Fmoc 9-芴甲基羰基

HBTU 2-(1-氢-1-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

HOBt 1-羟基苯并三唑

HPLC 高效液相色谱

Im 氨甲基-1H-咪唑-2-羧酸

MS 质谱

NMP N-甲基吡咯

OtBu O-叔丁基

PEG 聚乙二醇

Pmc 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基

TFA 三氟乙酸

Trt 三苯基甲基

3.嵌入剂：

吖啶黄素-生物素共轭物：2，7-双(氨基)-9-(生物素基氨基乙胺基)吖啶：

Toronto Reasearch Chemicals，North York，加拿大；目录号：A191100；M_r＝493.64Da(C₂₅H₃₁N₇O₂S)

实施例2：

将几个生物素化的ds DNA-结合剂(实施例1)固定到包被有链霉亲和素的DynabeadsM-280(Dynal Biotech S.A.，产品号.112.06，奥斯陆，挪威；生物素的结合容量为：650pmol/mg；这些实施例自始至终都使用SA-磁珠)上，按照如下步骤进行操作：

将200μl(2mg)悬浮的DynabeadsM-280转移到PP试管中。将该试管置于磁铁上1-2分钟。去除上清液后，用500μl的洗涤和结合缓冲液洗涤珠子2次(5mM Tris-HCl pH7.5；0.5mM EDTA；1.0M NaCl)。之后，加入200μl洗涤和结合缓冲液以及2μl(2000pmol)生物素化的ds DNA-结合剂(c＝1000pmol/μl)，置于Eppendorf恒温混匀仪上于室温下孵育60分钟。提供磁铁从反应后的珠子中去除上清液，之后用500μl洗涤和结合缓冲液洗涤珠子5次。将反应后的珠子贮存在洗涤和结合缓冲液中备用(终浓度：1mg反应后的珠子/100μl洗涤和结合缓冲液)。

实施例3：

将小沟结合剂MGB1、MGB3和肽3(实例1)固定到链霉亲和素包被的DynabeadsM-280(Dynal产品号.112.06，奥斯陆，挪威；生物素的结合容量：650pmol/mg；这些实施例自始至终都使用SA-磁珠)上，按照如下步骤进行操作：

将200μl(2mg)悬浮的DynabeadsM-280转移到PP试管中。将此试管置于磁铁上1-2分钟。在去除上清液之后，用200μl的洗涤和结合缓冲液(5mM Tris-HCl pH7.5；0.5mM EDTA；1.0M NaCl)洗涤珠子2次。之后，加入200μl洗涤和结合缓冲液以及20μl(20μmol)生物素化的ds DNA结合剂，置于Eppendorf恒温混匀仪上于室温下孵育60分钟。提供磁铁从反应后的珠子中去除上清液，之后用200μl洗涤和结合缓冲液洗涤珠子3-4次。将反应后的珠子贮存在洗涤和结合缓冲液中备用(终浓度：1mg反应后的珠子/100μl洗涤和结合缓冲液)。

实施例4：

将小沟结合剂MGB1、MGB3和肽3(图1和图2)固定到链霉亲和素包被的PCR管上(Roche目录号1741772，Roche DiagnosticsGmbH，曼海姆；生物素结合容量：61.5pmol/200μl管)，按照如下步骤进行操作：

用缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.1；LC脓毒病试剂盒，鉴定号为04493613，Roche Diagnostics GmbH，德国)洗涤试管2次，之后加入195μl缓冲液和5μl生物素化的ds-NA结合剂(在10mM Tris，pH8.0中；c＝1000pmol/μl)。于37℃(水浴)孵育20分钟后，小心地用吸管除去上清液，并用缓冲液洗涤试管3-4次。

实施例5：

在本实验中使用若干小沟结合剂/SA-磁珠复合物除去来自细菌DNA(表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))的污染。

对于每个实验，将50μl(0.5mg)的MGB/SA-磁珠复合物(见实施例2)转移到灭菌和硅烷化的试管中，用250μl的缓冲液(10mMTris-HCl pH8.0)洗涤大约4次，完全去除上清液。之后，向每个试管加入40μl表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的DNA溶液(DNA标准来自LC脓毒病试验，Roche鉴定号为：04493613)。在室温下孵育期间混合试管60分钟。通过PCR在Light Cycler 1.2上分析上清液。通过在50mM Tris-HCl缓冲液pH8.1中的细菌DNA(表皮葡萄球菌储液；c＝10⁵cp/10μl)的1∶10稀释液系列获得标准曲线。

利用Light Cycler葡萄球菌试剂盒M^级(Roche目录号3 376419，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)在Light Cycler Version 1.2上进行定量反应，按照如下循环条件：95℃变性10分钟，之后进行45个循环，包括50℃下15秒进行荧光测量获得曲线，72℃下10秒以及95℃下10秒。循环后快速冷却到40℃，再以0.1℃/min的斜率使温度升高到95℃，通过连续荧光测定进行解链分析。

图3中总结了该实验的结果。实验中1.7×10⁴cp得到了净化。总之，除了肽6和肽7外，所有结合剂的净化效率都在10³-10⁴之间。

实施例6：

使用Light Cycler对照试剂盒DNA(Roche目录号2158833，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)，Light Cyler DNA Master杂交探针(Roche目录号2 015 102，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)和LightCycler 1.2仪器(Roche目录号2 011 468；软件版本LC 3.5)来评估几个ds DNA结合剂分子的净化效率。

在每个净化实验中，用0.5mg的ds DNA结合剂/SA-磁珠复合物(制备同实施例2)净化含有60μl hg DNA的溶液(用于对照反应的模板来自Light Cycler对照试剂盒DNA(β-球蛋白基因的110bp片段))。将来自试剂盒的hg DNA在10mM pH8.0的Tris中制得1∶10系列的稀释溶液来获得标准曲线。

在Eppendorf恒温混匀仪上于室温孵育60分钟后，按照试剂盒的操作手册对上清液进行PCR分析。

在Light Cycler仪器上进行定量反应，按照试剂盒说明书的程序进行检测，并采用下述循环条件：95℃下变性30秒，之后进行45个循环，包括55℃下10秒进行荧光测量获得曲线，72℃下5秒以及95℃下0秒，最后以20℃/s的斜率冷却到40℃。使用来自试剂盒的hg DNA的系列稀释液评估标准曲线。

图4中总结了本实验的结果。实验中1.2×10⁴cp得到了净化。总之，除了肽6和肽7外，所有结合剂的净化效率都在10²-10⁴之间。

实施例7：

使用细小病毒B19定量试剂盒(Roche目录号3 246 809，RocheDiagnostics GmbH，德国)和LightCycler 1.2仪器(Roche目录号2011468，Roche Diagnostics GmbH，德国；软件版本LC 3.5)来测定3个ds-NA(MGB1、MGB3和肽3)结合剂的净化效率。

对于每个净化实验，将来自实施例3的10μl(0.1mg)ds-NA结合剂/SA磁珠复合物转移到PP试管中，用10mM pH8.0的Tris洗涤2次。去除上清液后，加入20μl含质粒DNA的溶液(细小病毒DNA标准，来自细小病毒B19定量试剂盒Roche目录号3 246 809，RocheDiagnostics GmbH，德国)。置于混匀仪上(Thermomixer Comfort，目录号5350000.013，Eppendorf，德国)于室温下孵育60min，按照试剂盒操作指导通过PCR分析上清液。

在Light Cycler仪器上进行定量，并按照试剂盒操作手册上的步骤进行分析，无需加入内对照，使用下列循环条件：95℃下变性10分钟，之后进行45个循环，包括60℃下15秒进行荧光测量获得曲线，72℃下10s以及95℃下10s。最后以20℃/s的斜率冷却到40℃。使用来自试剂盒的DNA标准评估标准曲线。

图5中概述了这些净化实验的扩增曲线。总之获得了下述的净化效率：

4×10²(对于MGB1)，2.6×10²(对于MGB3)和1.6×10³(对于肽3)。

表：

实施例7的结果

	上清液[cp/5μl]	整个溶液[cp/20μl]	％
	上清液[cp/5μl]	整个溶液[cp/20μl]	％	被污染溶液的初始浓度	52920	2.1×10⁵	100
使用如下材料净化后的DNA溶液；	上清液[cp/5μl]	整个溶液(cp/20μl]	％剩余	被污染溶液的初始浓度	52920	2.1×10⁵	100
使用如下材料净化后的DNA溶液；	上清液[cp/5μl]	整个溶液(cp/20μl]	％剩余	1.MGB1	128	5.1×10²	0.242
2.MGB3	199	7.9×10²	0.376	1.MGB1	128	5.1×10²	0.242
2.MGB3	199	7.9×10²	0.376	3.肽3	32	1.2×10²	0.060

实施例8：

为了评估3个不同的ds-NA结合剂(MGB1，MGB3和肽3)对于双链和单链寡核苷酸的时间依赖性方式的选择性而进行本实验。

用ds-NA结合剂/SA-磁珠复合物(来自实施例3)以时间依赖性的方式净化两个单链寡核苷酸溶液(5′-CCC ATC CCC AAA AAC ACAAAC CAC A PO4-3′；c＝14,189OD/ml[49,9μM]溶于10mM Tris ph8.0中)，一个加入质粒DNA，另一个不加(细小病毒DNA标准，来自Light Cycler细小病毒B19定量试剂盒，Roche目录号3 246 809，Roche Diagnostics GmbH，曼海姆)。1、6和48小时后使用UV-吸光度(UVIKON 931分光光度计，Kontron，德国)来测定上清液中的寡核苷酸浓度，而且对于含有质粒DNA的溶液，通过上述实施例中描述的PCR评估其净化效率。为了进行对照，仅在缓冲液中(TBE缓冲液：10mM Tris-HCl pH8.0)净化含有质粒DNA的溶液并同样用PCR定量。

将细小病毒B19质粒标准DNA(c＝5×10⁵cp/μl)加入单链寡核苷酸溶液(比率：1∶4(^v/_v))。对于图6和图7的每个实验，将100μl(1mg)置于洗涤和结合缓冲液中的的双-PEG-偏端霉素/SA-磁珠转移到硅烷化并灭菌的PP试管中，用10mM pH8.0的Tris洗涤两次，并完全去除上清液。之后，将200μl的寡核苷酸溶液都加入到含有珠子的两个不同试管中，并在1、6、和48小时后测定寡核苷酸溶液的吸光率(λ＝260nm)以确定上清液的浓度。另外，在Light Cycler 1.2上，使用所有的3个ds-NA结合剂(图7)按照前述实验中描述的方法通过PCR对含有和不含有单链寡核苷酸的质粒DNA溶液进行分析。

图6和图7中总结了实验结果。从吸光率实验(图6)中，可以看出在ss寡核苷酸存在时，双-PEG-偏端霉素/SA磁珠复合物的ds DNA结合选择性。甚至在存在大量的单链寡核苷酸时，从样品中有效地去除了ds DNA分子。LightCycler定量(图7)证实了，在ss寡核苷酸存在时如果使用生物素化的肽3作为ds-NA结合剂，ds DNA的时间依赖的选择性结合是最好的。

实施例9：

在本实验中，使用双-PEG-偏端霉素/SA磁珠复合物去除来自细菌DNA的污染(肺炎链球菌DNA，来自LC脓毒病试剂盒，Id.nr.04493613，Roche Diagnostics GmbH，德国)，之后从珠子上洗脱结合的DNA。

对于每个实验，将10μl(0.1mg)的双-PEG-偏端霉素/SA磁珠复合物(来自实施例3)转移到灭菌并硅烷化的试管中，用缓冲液(50mMTris-HCl pH8.1)洗涤2次，再重悬于20μl相同的缓冲液中。通过在50mM Tris-HCl缓冲液pH8.1中制得1∶10的细菌DNA(肺炎链球菌储液：c＝10⁶cp/μl)系列稀释液而获得标准曲线。

之后向每个试管中加入20μl肺炎链球菌DNA溶液。在室温下混合孵育期间，使试管混合60分钟。在Light Cycler 1.2上通过PCR法分析上清液。使用Light Cycler脓毒病试剂盒(Id.nr.04493613，Roche Diagnostics GmbH，德国)在Light Cycler Version 1.2(目录号2011468，Roche Diagnostics GmbH，德国；软件版本LC 3.5)上进行定量反应，按照下列循环条件进行：95℃变性10分钟，之后进行45个循环，包括：60℃下25秒的荧光测量获得曲线，72℃下40秒以及95℃下20秒。循环之后快速冷却到40℃再以0.1℃/min的斜率使温度升高到95℃，通过连续荧光测定进行解链分析。

去除上清液后，用PCR水(来自脓毒病试剂盒)洗涤每个试管(含有双-PEG-偏端霉素/SA-磁珠复合物)两次。之后加入40μl的10mMNaOH，并将试管在混匀仪(Thermomixer Comfort，目录号5350000.013，Eppendorf，德国)上在室温下孵育60分钟。通过PCR分析从珠子上洗脱的含有DNA的上清液。

图8中总结了本实验的扩增曲线，证明了去除细菌DNA污染的功效。净化后，上清液含有17cp/μl，而从珠子洗脱的结合分子的上清液含有340cp/μl。

表：

实施例9的结果

	上清液[cp/10μl]
	上清液[cp/10μl]	DNA溶液的初始浓度	372
净化后(3次检测的平均值)	17	DNA溶液的初始浓度	372
净化后(3次检测的平均值)	17	NaOH(10mM)处理后(3次检测的平均值)	340

实施例10：

在本实验中，在双-PEG-偏端霉素/SA-包被的试管中进行细菌DNA(肺炎链球菌DNA，来自LC脓毒病试剂盒，Id.nr.04493613，Roche Diagnostics GmbH，德国)的净化，随后从试管中洗脱结合的DNA。

制备缓冲液(TBE缓冲液：50mM Tris-HCl pH8.1)中的肺炎链球菌DNA(肺炎链球菌储液：c＝10⁶cp/μl)的溶液(比率1∶1(c/v))。通过细菌DNA在50mM Tris-HCl pH8.1缓冲液中以1∶10的稀释系列获得标准曲线。

向每个试管(双-PEG-偏端霉素/SA-包被的试管复合物，来自实施例4)加入40μl制得的溶液，在混匀仪(Thermomixer Comfort，目录号5350000.013，Eppendorf，德国)上在室温下孵育60分钟。使用Light Cycler脓毒病试剂盒在Light Cycler 1.2(目录号2011468.Roche Diagnostics GmbH，德国；软件版本LC 3.5)上通过PCR分析上清液，按照下列循环条件进行定量反应：95℃变性10分钟，之后进行45个循环，包括：60℃下25秒的荧光测量获得曲线，72℃下40秒和95℃下20秒。循环之后快速冷却到40℃再以0.1℃/min的斜率使温度升高到95℃，通过连续荧光测定进行解链分析。

去除上清液后，用PCR水(来自脓毒病试剂盒)洗涤每个试管两次。之后加入40μl的10mM NaOH并使试管在混合器上于室温孵育60分钟。随后通过PCR分析从试管上洗脱下的含有DNA的上清液。

图9中总结了本实验的扩增曲线，证明了试管对于细菌DNA的净化功效。净化后，上清液中完全不含有可检测到的分子，而从试管洗脱的结合分子的上清液含有38cp/μl。

表：

实施例10的结果

	上清液[cp/10μl]
	上清液[cp/10μl]	DNA溶液的初始浓度	510
净化后(3次检测的平均值)	0	DNA溶液的初始浓度	510
净化后(3次检测的平均值)	0	NaOH(10mM)处理后(3次检测的平均值)	38

实施例11：

在本实验中，使用几种细菌结合剂/SA-磁珠复合物来去除来自细菌(表皮葡萄球菌)的污染。

对于每个试验，将50μl(0.5mg)细菌结合剂/SA-磁珠复合物(参见实施例2，关于生物素化的结合剂在链霉亲和素包被的Dynabeads^上的固定化)。

转移到一个无菌的硅化的试管中，用250μl缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0)洗涤大约4次，完全除去上清液。之后，向每个试管中加入40μl表皮葡萄球菌细菌稀释液。在室温下温育期间，将试管混合60分钟。通过PCR在Light Cycler 1.2(Roche DiagnosticsGmbH，Germany；Software Version LC 3.5)上分析上清液。通过细菌储备液(表皮葡萄球菌储备溶液；C＝9×10³DNA当量份数/10μl)在10mM Tris-HCl缓冲液pH8.0中的1∶10稀释系列得到标准曲线。

使用Light Cycler葡萄球菌试剂盒M级(Roche目录号3 376 419，Roche Diagnostics GmbH，Germany)，以下列条件在Light CyclerVersion 1.2上进行定量反应：在95℃变性10分钟，然后进行45个扩增循环，每个循环具有下列概略特征：50℃15秒，进行荧光测定、72℃10秒和95℃10秒。在扩增反应后，立即通过快速冷却到40℃，然后以0.1℃/分钟的斜率速度升温到95℃，利用连续的荧光测定来进行熔融分析。

将该试验的结果概括在图10中。在试验中，除去了大约3.4×10³和4.5×10⁴个拷贝数的细菌。结论是，可以除尽完整的细菌，净化效率最高达到10³的量级，其中小沟结合剂和带正电荷的肽的工作效率最好，而带负电荷的肽则根本不起作用。

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序列表

<110>Hoffmann La Roche AG

<120>一种减少假阳性结果的方法

<130>22697FF

<150>EP 04019636

<151>2004-08-19

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于实施例的人工序列

<220>

<221>3’-磷酸

<222>(25)..(25)

<400>1

cccatcccca aaaacacaaa ccaca 25

Claims

1.一种用于检测样品中生物分子的方法，其避免检测到潜在地存在于为检测样品中的生物分子所必需的试剂中的生物分子，包括步骤：

a)提供潜在地包括所述生物分子的样品，

b)提供偶联于固相表面的结合部分，

c)提供为检测生物分子所必需的试剂，

d)向所述样品中加入所述试剂，

e)检测样品中的生物分子，

2.根据权利要求1的方法，其中所述的固相表面是容器或移液管吸头的内表面。

3.根据权利要求1的方法，其中所述固相表面是珠子的表面或多孔材料的表面。

4.根据权利要求1至3的方法，其中所述结合部分的结合亲和力实现了试剂中生物分子含量的减少，其减少系数至少为102，优选系数至少为103。

5.根据权利要求1至4的方法，其中所述的结合部分是能够结合双链核酸分子的部分。

6.根据权利要求1至4的方法，其中所述的结合部分是能够结合生物区室的部分。

7.根据权利要求1至4的方法，其中所述的结合部分是能够结合双链核酸分子和生物区室的部分。

8.一种扩增目标核酸分子的方法，包括步骤：

a)提供潜在地包括目标核酸分子的样品，

b)提供偶联于固相表面的核酸结合部分，

c)提供为扩增所述目标核酸分子所必需的试剂，

d)向所述样品中加入所述试剂，

e)扩增所述样品中的所述目标核酸分子，

9.根据权利要求8的方法，其中所述固相的所述表面是容器或移液管吸头的内表面。

10.根据权利要求8的方法，其中所述固相的所述表面是珠子的表面或多孔材料的表面。

11.根据权利要求8至10的方法，其中所述的核酸结合部分是结合双链核酸的部分。

12.根据权利要求11的方法，其中所述结合双链核酸的部分是聚阳离子实体、小沟结合剂、嵌入剂或抗双链核酸的抗体。

13.根据权利要求11至12的方法，其中生物素化的结合双链核酸的部分结合到链霉亲和素包被的固相表面上。

14.根据权利要求8至13的方法，其中所述目标核酸分子的扩增是用于样品中微生物感染检测的核酸扩增。

15.一种固相材料，其中结合双链核酸的部分与所述固相的表面偶联，而所述的固相材料是容器、珠子或移液管吸头。

16.根据权利要求15的固相材料，其中所述的结合双链核酸的部分是聚阳离子实体、小沟结合剂、嵌入剂或抗双链核酸抗体。

17.一种固相材料，其中聚阳离子实体或嵌入剂作为结合双链核酸的部分偶联到所述固相材料的表面。

18.一种固相材料，其中结合部分偶联到能够结合生物区室的所述固相材料的表面，并且所述的固相材料是容器或移液管的吸头。

19.根据权利要求18所述的固相材料，其中所述的结合部分是小沟结合物、抗体、染料、两亲性实体或聚阳离子实体。

20.一种固相材料，其中染料、两亲性实体、聚阳离子实体或小沟结合物被偶联到所述固相材料的表面作为生物区室的结合部分。

21.一种固相材料，其中结合部分被偶联到能够结合双链核酸分子和生物区室的所述固相材料的表面。

22.根据权利要求21的固相材料，其中所述的固相材料是珠子、多孔材料、容器或移液管吸头。

23.根据权利要求21至22的固相材料，其中两种或多种结合部分被偶联到所述固相材料的表面。

24.根据权利要求23的固相材料，其中所述的两种或多种结合部分选自小沟结合物、嵌入体、抗体、染料、两亲性实体或聚阳离子实体。

25.根据权利要求15至24的固相材料用于扩增样品中的目标核酸的用途，其中避免了扩增在为扩增所述样品中的所述目标核酸分子所必需的试剂中潜在地存在的核酸分子。

26.根据权利要求25的用途，其中所述目标核酸分子的扩增是样品微生物感染检测中的一部分。

27.包括为进行目标核酸分子扩增所必需的试剂和权利要求15至24所述的固相材料的试剂盒。