CN1697883A

CN1697883A - 靶核苷酸序列的检测方法、该方法实施中使用的检测靶结构以及其制造方法、和靶核苷酸序列检测用分析试剂盒

Info

Publication number: CN1697883A
Application number: CNA2004800003752A
Authority: CN
Inventors: 堀内秀纪; 桥本幸二
Original assignee: Toshiba Corp
Current assignee: Toshiba Corp
Priority date: 2003-03-26
Filing date: 2004-03-19
Publication date: 2005-11-16
Anticipated expiration: 2024-03-19
Also published as: CN101074452A; KR100680673B1; CN100368558C; US20060099615A1; JP3923917B2; JP2004290055A; CN101074451A; WO2004085680A1; TW200506067A; EP1634962A1; EP1634962A4; KR20050024340A

Abstract

本发明提供对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法。提供由靶核酸(1)制造检测靶结构的方法。靶核酸(1)在其一部分含有靶核苷酸序列2(图1A)。按照本发明的方法，可以制造靶核酸(1)的靶核苷酸序列2以外的部分可形成双链，使用引物进行核酸的延伸的检测靶结构4(图1B)。还给出了通过本发明制造的检测用靶结构、使用该靶结构的靶核苷酸序列检测方法、检测靶结构制造用试剂盒、以及靶核苷酸序列检测用分析试剂盒。

Description

靶核苷酸序列的检测方法、该方法实施中使用的检测靶结构以及其制造方法、和靶核苷酸序列检测用分析试剂盒

技术领域

本发明涉及到对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法、通过该方法制造的检测靶结构、使用该结构的靶核苷酸序列检测方法、检测靶结构制造用试剂盒、以及靶核苷酸序列检测用分析试剂盒。

背景技术

为了检测含有特定核酸序列的核酸链，一般都采用以下那样的手段。那样的方法，例如使用与检测对象的核酸链互补的1对引物进行扩增后，通过电泳检测其存在的检测方法、使用与检测对象互补的靶核苷酸序列的核酸链作为核酸探针固定化的基体，进行杂交的方法。另外，一般来说，在这些检测中使用的引物或核酸探针是具有15个碱基左右以上连续的特异序列的寡核苷酸。然而，那样的寡核苷酸即使利用已有的引物或核酸探针设计软件等可以进行设计，但在反应体系中在靶核苷酸序列中存在高级结构，或存在部分类似的序列的情况多。这样的场合下，会引起错误退火、自杂交等。象这样的以往方法，要高精度、高效率地检测目的靶核苷酸序列是不容易的。另外，为了设定最适检测条件，必须要花费许多时间和费用。

例如，作为高灵敏度而且高效率地检测核酸序列的方法，到目前为止提出了“杂交法”(参照特开平6-70799号公报)和“利用部分双链DNA的DNA检测方法”(参照特开平11-332566号公报)等。这些方法是在使含有与要检测的靶核酸一部分区域互补的序列的核酸探针和该靶核酸进行杂交时，在该杂交反应前和杂交反应时，添加与上述核酸探针的结合部位以外的靶核酸的序列互补的核酸链，退火后在一部分形成双链的方法。这些方法目的在于通过在任一个靶核酸的序列上，将核酸探针识别的区域做为一条链，而将剩下的区域做成双链，防止非特异的杂交。

然而，在上述方法中，实际使用时还存在很多要解决的问题点。那样的一些问题就象下面所示的那样。

(1)由于必须要以单链状态制备“靶核酸”和“保护链”两种分子，所以工序数变多；

(2)靶核苷酸序列的设计被限定。为了避免非特异性杂交，在杂交反应液中希望除了核酸探针之外只存在游离的单链核酸分子。然而，在对靶核酸和保护链进行退火时，由于在液体中依靠分子运动使得长的核酸之间结合，受到分子内高级结构等影响，不能进行理想的杂交，所以杂交的效率显著低下的情形很多。为了防止这种现象，靶核苷酸序列的设计就受到限定了；

(3)靶核酸作出需要花费很多时间。这是由于例如从使保护链和靶核酸之间形成正确碱基对的目的考虑，就必须花费长时间进行退火反应的工序；

(4)特别是“利用部分双链DNA的DNA检测方法”(参照特开平11-332566号公报)，需要使用非对称PCR作出靶链和保护链。因此，即使解决了上述(2)的问题可以做到定性分析，也不能适应社会需要的高定量分析。

发明内容

本发明的目的在于提供对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法、通过该方法制造的检测靶结构、使用该结构的靶核苷酸序列检测方法、检测靶结构制造用试剂盒、以及靶核苷酸序列检测用分析试剂盒。

本发明为了解决上述课题，发现了以下手段。

如果按照本发明的第1个方面，作为对靶核苷酸序列检测有用的检测靶结构的制造方法，提供包括在可获得的适当延伸反应的条件下使与位于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的引物、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，通过该反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

如果按照本发明的第2个方面，作为对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法，提供包括在可获得的适当延伸反应的条件下使与位于靶核酸的5’端附近的靶核苷酸序列3’端以外的3’侧的序列互补，而且在3’末端含有不可延伸的修饰的终止核酸，与靶核酸的3’端附近的序列互补的引物、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，通过该反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列区域的靶核酸和与该靶核酸互补的保护链的检测靶结构的方法。

如果按照本发明的第3个方面，作为对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法，提供包括在可获得的适当延伸反应的条件下使与位于第1靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的第1引物，与位于第1靶核酸互补的第2靶核苷酸序列的5’端附近的第2靶核苷酸序列的3’端以外的3’侧的序列互补、而且在3’末端含有不可延伸的修饰的终止核酸，与第2靶核酸的3’端附近的序列互补的第2引物，具有核苷酸延伸活性的酶和第1以及第2靶核酸反应，通过该反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

如果按照本发明的第4个方面，作为对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法，提供包括在可获得的适当延伸反应的条件下使与位于靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的第1引物，与位于上述靶核酸的5’端附近的第2靶核苷酸序列3’端以外的3’侧的序列互补，而且在3’末端含有不可延伸的修饰的终止核酸，具有核苷酸延伸活性的酶和前述靶核酸反应，通过该反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

如果按照本发明的第5个方面，作为对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法：提供包括在可获得的适当延伸反应的条件下使含有3’端附近的第1靶核苷酸序列、存在于第1靶核苷酸序列以外的5’侧的第2靶核苷酸序列、存在于第2靶核苷酸序列以外的5’侧的第3靶核苷酸序列、5’端附近的第4靶核苷酸序列的靶核酸中的、第1、第2以及第3靶核苷酸序列的各个5’端以外的5’侧的各个序列互补的第1、第2以及第3引物，与存在于第2、第3以及第4靶核苷酸序列的3’端以外的3’侧的各个序列具有互补性、而且在3’末端含有不可延伸的修饰的第1、第2以及第3的终止核酸，具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，通过该反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分、在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

如果按照本发明的第6个方面，作为对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法：提供(1)包括在可获得的适当扩增反应的条件下使至少含有由与处于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列互补的核酸分解酶非抗性核酸构成的序列、以及由与上述靶核酸的5’端以外的5’侧序列互补的核酸分解酶非抗性核酸构成的序列的第1引物；与上述靶核酸的5’端附近的序列具有同源性，在5’端含有核酸分解酶抗性核酸的第2引物；具有核苷酸延伸活性的酶；由该靶核酸和其互补链构成的双链核酸核酸反应，

(2)利用能够分解上述分解酶非抗性核酸的核酸分解酶对通过上述(1)反应得到的扩增产物进行消化，通过上述反应，获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

如果按照本发明的第7个方面，作为对检测靶核苷酸序列有用的检测靶结构的制造方法：提供(1)包括在可获得的适当扩增反应的条件下，使至少含有由与位于第1靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列互补、而且核酸分解酶非抗性核酸构成的序列，以及与位于第1靶核苷酸序列5’端以外的5’侧序列互补的核酸分解酶抗性核酸构成的序列的第1引物，

至少含有与处于第2靶核酸的3’端附近的第2靶核苷酸序列互补的核酸分解酶非抗性核酸构成的序列、以及由与第2靶核苷酸序列5’端以外的5’侧序列互补的核酸分解酶抗性核酸构成的序列的第2引物，

具有核苷酸延伸活性的酶和由该第1靶核酸和第2靶核酸构成的双链核酸反应，

(2)利用核酸分解酶对通过上述(1)反应得到的扩增产物进行消化，

通过上述反应获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

按照本发明的第8个方面，作为检测靶核苷酸序列的方法，提供具备如下工序的方法：

(1)通过使用前述第1至7任一方面的方法，根据样品中的靶核酸制造检测靶结构，

(2)在可获得的适当杂交条件下，使与上述靶核苷酸序列互补的核酸探针与上述(1)制造的检测靶结构反应，

(3)通过对利用上述(2)中反应产生的杂交进行检测，检测上述靶核苷酸序列的存在。

如果按照本发明的第9个方面，提供通过第1至7任一方面的方法制造的检测靶结构。

如果按照本发明的第10个方面，提供靶核苷酸序列检测用分析试剂盒，该试剂盒为了实施上述第8个方面所述的检测方法，具备引物、具有核苷酸延伸活性的酶、终止核酸、核酸扩增用酶、核酸分解酶以及由第9方面的检测靶结构中选择出来的至少一种构成要素。

附图的简单说明

图1是表示本发明概要的图。

图2是表示本发明一个方式的第1例的图。

图3是表示本发明一个方式的第2例的图。

图4是表示本发明一个方式的第3例的图。

图5是表示本发明一个方式的第4例的图。

图6是表示本发明一个方式的第5例的图。

图7是表示本发明一个方式的第6例的图。

图8是表示本发明一个方式的第7例的图。

图9是表示本发明一个方式的第8例的图。

图10是表示本发明一个方式的第9例的图。

图11是表示本发明一个方式的第10例的图。

图12是表示本发明一个方式的第11例的图。

图13是表示在实施例1中，使用基于本发明的方法制造的检测靶结构对靶核苷酸序列进行检测的结果的图。

图14是表示在实施例2中，使用基于本发明的方法制造的检测靶结构对靶核苷酸序列进行检测的结果的图。

图15是表示在实施例5中使用的本发明的一个例子的图。

图16是表示在实施例6中使用的本发明的一个例子的图。

图17是表示在实施例7中，使用基于本发明的方法制造的检测靶结构对靶核苷酸序列进行检测的结果的图。

具体实施方式

1.发明的简要说明

如果按照本发明的方式，可以提供由图1所示那样的靶核酸1制造检测靶结构的方法。靶核酸1在其一部分含有靶核苷酸序列2(图1A)。具体来说，如果按照本发明的方法，使用引物进行核酸的延伸，制造检测靶结构4(图1B)，使得靶核酸(1)的靶核苷酸序列2以外的部分形成双链。即基于本发明的检测靶结构的制造方法基本来说是具备使用以含有靶核苷酸序列2的靶核酸作为模板，进行延伸反应或扩增反应的方法。通过基于这样的本发明方式的检测靶结构的制造方法制造的检测靶结构4也是本发明的另一种方式。另外，利用基于本发明的检测靶结构，可进行靶核苷酸序列的检测。这样的检测方法例如就象图1C所示那样，可以利用与检测靶结构4的靶核苷酸序列2互补的核酸探针5，使探针与靶核苷酸序列2反应，通过检测生成的杂交，可以检测例如样品中靶核苷酸序列存在，或含有靶核苷酸序列的靶核酸的存在。这样的靶核苷酸序列的检测方法也属于本发明范围内。

2.用语说明

这里使用的“样品”只要是含有核酸的样品，可以根据需要通过根据需要提取、扩增以及纯化等众所周知的任何手段从含有包括人在内的真核生物探取的组织以及细胞、原核生物、病毒、类病毒等检体制备，也可以是人工合成的核酸分子。

这里使用的“靶核苷酸序列”用语指的是要检测的一个连续的序列。“靶核酸”指含有靶核苷酸序列的核酸，在一个靶核酸中也可以含有1个以上的靶核苷酸序列。这里使用的“核酸”用语是概括表示DNA、RNA、S-寡核苷酸、甲基磷酸酯寡核苷酸、PNA(即，肽核酸)和LNA(即，锁定核酸)等核酸以及核酸类似物、同时含有上述几个核酸的核酸和核酸类似物、以及他们的混合物等，是概括地表示一般可以用碱基序列表示其一部分结构的物质的用语。而在本发明中使用的核酸既可以是天然存在的，也可以是人工合成的，或他们的混合物。这里使用的“核苷酸”指的是与构成上述那样核酸的一个碱基对应的单位。另外，“寡核苷酸”指上述那样人工合成的核酸片段，“寡DNA”指其中的DNA片段。

本发明中的“检测靶结构”指的是在利用靶核苷酸序列和与其对应的核酸探针的杂交进行的靶核苷酸序列的检测方法中，为了实际上使核酸探针结合，是指以样品中含有的原靶核酸为基础制造的制造物。特别是通过基于本发明方式的检测靶结构的制造方法得到的检测靶结构含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列区域的靶核酸和与该靶核酸互补的保护链的检测靶结构。即所谓由本发明方法所提供的检测靶结构是具有含有单链核酸部分和双链核酸部分的特定结构的核酸。另外，该检测靶结构也可以称之为“检测用靶结构核酸”和“靶结构核酸”。

本发明中的“进行延伸”和“进行延伸反应”同义，指的是在对模板核酸合适的条件下，使用引物和核酸合成酶，使核酸延伸之后形成模板核酸的互补链。另外，本发明中的“进行扩增”和“进行扩增反应”是同义，指的是具备在对模板核酸合适的条件下，使用引物和核酸合成酶，使核酸延伸之后形成模板核酸的互补链，生成双链；和通过对得到的双链进行变性或链的置换反应等给出单链；和用得到的单链为模板，在适当条件下使用引物和核酸合成酶，再度进行核酸延伸形成模板核酸的互补链后生成双链的反应。换言之，所谓“扩增”指的是在前后的延伸反应之间向单链变换时，重复进行2次以上的延伸反应。

这里使用的“可获得的适当延伸条件”指的是存在要延伸的核酸和引物、具有核苷酸延伸活性的酶、延伸时可整合的核酸合成底物以及延伸反应必需的辅酶等，而且适当控制温度以及pH等诸条件，目的核酸可延伸的条件。另外，这里使用的“可获得的适当扩增条件”指的是存在要延伸的核酸和引物、具有核苷酸延伸活性的酶、延伸时可整合的核酸合成底物以及延伸反应必需的辅酶等，而且适当控制温度以及pH等诸条件的条件下延伸反应至少重复进行2次以上，目的核酸可扩增的条件。

本发明中的“保护链”是在基于本发明方式的检测靶结构的制造方法中，是以靶核酸作为模板形成的核酸，是与靶核苷酸序列不同的部分靶核酸的序列互补的序列。由于该保护链的存在，可以防止由于核酸探针或其他核酸或其靶核酸本身结合靶核苷酸序列以外的部位引起没有预料的双链或立体结构的形成。

这里使用的“对杂化体进行检测”和“对结合进行检测”是同义，表示在可获得的适当杂交条件下，就多个核酸进行反应时，如果在这多个核酸中存在至少1组互补链，对得到的杂交体或结合进行检测。这样的杂化体或结合通过对在该互补链中的预先附加的至少某一个标记物进行检测，也可以完成检测，利用对存在于杂化体中的结合有选择结合的插入剂也可以进行检测。另外，即使是在可获得的适当杂交条件下就多个核酸进行反应时，如果在该多个核酸中不存在互补链，就不能得到杂化体。这里使用的“可获得的适当杂交条件”指的是在某一个反应体系中如果存在相互具有互补性的核酸链，通过进行反应可得到杂交的条件，例如，只要是严格的条件就可以。

3.检测靶结构的制造方法

(I)通过调节引物的结合位置，制造所期望的检测靶结构的方法

以下的第1例至第3例是以在3’端附近含有的靶核苷酸序列的靶核酸为基础制造检测靶结构的方法。这些例子是对引物与靶核酸的结合位置进行调节的方法。

(1)第1例

利用图2对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第1例进行说明。靶核酸21在3’端附近含有靶核苷酸序列22(图2A)。使引物23与靶核酸21中的靶核苷酸序列22的位置以外的5’侧(即，靶核苷酸序列5’端以外的5’侧)的序列结合，在可获得适当延伸反应的条件下对核酸进行延伸(图2B)。通过延伸反应形成与靶核酸21互补的保护链24，得到具有双链核酸部分和含有靶核苷酸序列的单链核酸部分的检测靶结构25(图2B)。

通过基于这样的本发明方式的反应得到的检测靶结构25就象图2C表示的那样，可以在使用核酸探针26的靶核苷酸序列的检测中利用。通过核酸探针26与靶核苷酸序列22的结合可以进行靶核苷酸序列22或靶核酸21的检测。

这里使用的引物可以是任一种核酸，其长度为了获得对实施者选择的引物特异的杂交要有充分的长度。例如，获得这样特异杂交的长度的例子为5个碱基长度以上就可以，优选是9个碱基以上。

这里可使用的延伸反应只要是引物23在以靶核酸21为模板合成核酸之后可以形成含有保护链24的双链的条件下进行就可以。这样的条件只要是有具有核苷酸延伸活性的酶、延伸时整合的核酸合成底物、以及延伸反应所必需的辅酶等存在，而且温度以及pH等诸条件被适当控制的条件就可以。在本发明中可以使用的酶，例如只要是具有由5’向3’方向将核酸链延伸的活性的酶就可以。在本说明书中有时将「将核酸链延伸的活性”略称为「核苷酸延伸活性”。例如，只要是核酸合成酶就可以，无论是DNA聚合酶和RNA聚合酶等聚合酶，还是逆转录酶都可以。而适当的温度的控制可以通过加热器等其本身众所周知的手段，对实施者以靶核酸21和引物23的序列、酶种类等为基础选择的温度控制。而，pH的控制可以利用pH控制等众所周知的手段通过盐的种类、盐的组合和浓度等控制。而延伸时整合的核酸合成底物可以是一般使用的众所周知的核酸合成底物类。详细的条件实施者可以根据使用的酶、序列以及核酸的种类等进行选择。

本发明中使用的靶核苷酸序列22只要是实施者想要检测的序列就可以，长度可以为5碱基～300碱基、优选是9碱基～50碱基。

另外，在本说明书中使用的所谓“3’端附近”表示从位于靶核酸最3’端的碱基到大约第A位的碱基，下面叙述中使用的所谓「5’端附近”表示从位于5’端的碱基到大约第A位的碱基。例如，当靶核苷酸序列存在于3’端附近时，既可以含有位于最3’端的碱基，也可以不含有该碱基。这里的“A”是作为问题的靶核苷酸序列的碱基数的二分之一的长度。即：

A＝(靶核苷酸序列的碱基数)/2

优选基于以上那样本发明方式的方法可以象以下那样进行。即，将具有与存在于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列的5’侧邻接或存在于靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的9碱基以上的序列互补的序列的核酸构成的引物、核酸合成酶添加到含有该靶核酸的样品中，以靶核酸作为模板进行延伸反应。通过该反应制造含有单链核酸部分和双链核酸部分的检测靶结构。

在制造检测靶结构时，该样品必需含有靶核酸，但也未必只含有靶核酸，也可以还含有其他核酸。为了进行基于本发明方式的反应，样品中的靶核酸的量为样品中含有的核酸整体量的约3％以上，更优选10％以上，最优选是在20％以上。另外根据需要，在实施本发明的方法之前，也可以通过其本身公知的任一扩增手段对靶核酸进行扩增。扩增手段的例子可以是PCR扩增、以及Nucleic acid strandamplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacementamplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic acids(ICANN)和Rolling circleamplification(RCA)法、Loop mediated amplification(LAMP)法等。

在上述那样的本发明的方式中，通过靶核酸中的引物结合部位可以决定作为结果得到的检测靶结构的单链核酸部分和双链核酸部分的边界。在该检测靶结构中，虽然在靶核苷酸序列的两侧可以存在直至大约100碱基的单链的核苷酸，但优选是只有靶核苷酸序列为单链。

通过基于上述那样本发明方式的方法，可以通过很少工序自由进行靶核苷酸序列的设计，而且可以在短时间内简便地制造检测靶结构。因此，经济性以及操作性都提高了。

(2)第2例

利用图3对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第2例进行说明。在上述的第1例中，靶核酸是单链，但在第2例中，给出了使用双链靶核酸的例子。

参照图3。首先准备双链靶核酸31。靶核酸31包括第1靶核酸31a和在3’端附近含有靶核苷酸序列32的第2靶核酸31b(图3A)。

在获得的适当延伸条件下，向靶核酸31中添加第1引物33a和第2引物33b，进行延伸反应(图3B和C)。结果得到第1延伸产物双链36(图3B)和第2延伸产物检测靶结构35(图3C)。得到的检测靶结构35包含含有靶核苷酸序列32的单链核酸部分以及不含有靶核苷酸序列的第2靶核酸31b和保护链34b的双链核酸部分。

而在第2例中所谓可获得的适当延伸条件还具备引物33a和b对靶核酸31进行适当结合。例如，在进行延伸之前，也可以通过众所周知的变性手段、例如热、碱和添加盐等手段使双链的靶核酸31解离为单链。

基于以上本发明方式的第2例除了靶核酸是双链以外，其他可以与第1例同样实施。而第2例中使用的反应条件以及靶核酸、引物和检测靶结构的各个条件也可以根据第1例进行变更。

在使用核酸探针37的靶核苷酸序列的检测中可以利用通过上述延伸反应得到的检测靶结构35(图3D)。例如，与第1例所述的方法同样，通过核酸探针36对靶核苷酸序列32的结合可以进行靶核苷酸序列的检测。

通过上述那样的基于本发明方式的方法，可以通过很少工序、自由设计靶核苷酸序列、而且在短时间内简便地制造检测靶结构。因此，经济性以及操作性都提高了。

(3)第3例

利用图4对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第3例进行说明。在第2例中，由双链靶核酸31得到了一个检测靶结构35，而在第3例中可以由双链靶核酸41得到2个检测靶结构45a和45b。除此之外，可以通过与第2例同样的步骤实施第3例。

参照图4。双链靶核酸41包括在3’端附近含有第1靶核苷酸序列42a的第1靶核酸41a和在3’端附近含有第2靶核苷酸序列42b的第2靶核酸41b(图4A)。

在可获得的适当延伸条件下，向靶核酸41添加第1引物43a和第2引物43b，进行延伸反应(图4B)。结果得到作为第1延伸产物的第1检测靶结构45a和作为第2延伸产物的第2检测靶结构45b(图4B)。各个检测靶结构45a和b包含含有靶核苷酸序列42a或b的单链核酸部分以及含有靶核酸41a或b的一部分和与他们互补的保护链44a或b的双链核酸部分。

基于以上那样本发明方式的第3例除了由双链靶核酸得到2个检测靶结构以外，其他可以与第2例同样实施。因此，在第3例中可获得的适当延伸反应的条件、其他的在第3例可使用的反应条件以及有关靶核酸、引物和检测靶结构的条件也可以是与上述的第2例中所述的条件同样的条件，另外也可以与第2例同样进行种种变更。

通过该延伸反应得到的检测靶结构45a和/或检测靶结构45b可以在使用核酸探针46a和/或核酸探针46b的靶核苷酸序列的检测中利用(图4C)。例如可以与第1例所述的那样方法同样通过对核酸探针46a和/或b与靶核苷酸序列42a和/或b的结合进行检测，对靶核苷酸序列进行检测。

通过上述那样的基于本发明方式的方法，可以通过很少工序、自由设计靶核苷酸序列、而且在短时间内简便地制造检测靶结构。因此，经济性以及操作性都提高了。另外根据第3例可以同时对2处的靶核苷酸序列进行检测。

(II)使用终止核酸的方法

以下第4例至第6例是以5’端附近含有的靶核苷酸序列为基础制造检测靶结构的方法。

(4)第4例

利用图5对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第4例进行说明。靶核酸51在5’端附近含有靶核苷酸序列52(图5A)。首先在靶核酸51的3’端附近选择用于引物53结合的序列。另外在靶核酸51中靶核苷酸序列52位置的3’侧选择用于结合终止核酸55的序列。终止核酸55的3’末端进行了不能延伸的修饰，使得在3’侧不能再进行延伸。

终止核酸55在与靶核酸51的靶核苷酸序列52以外的3’侧的部位结合存在的状态下，使用与靶核酸51的3’端附近的序列结合的引物53，在可获得适当延伸反应的条件下，由5’向3’方向使核酸延伸。结果形成保护链54(图5B)。象上述那样，终止核酸55的3’末端实施了使得不能接受进一步延伸反应的修饰。因此，从终止核酸55开始不能再向前进行延伸反应。因此靶核酸51含有的靶核苷酸序列52维持着原来的单链。

这里使用的引物53可以是任一种核酸，其长度为了获得对实施者选择的引物特异杂交要有充分的长度。例如，获得这样特异杂交的长度的例子可以象上述第1例所述的那样。

这里可使用的终止核酸可以是任一种类的核酸，为了特异结合于所希望的位置的序列，只要有充分长度就可以。例如获得这样特异杂交的长度的例子可以在5碱基长度以上，优选是9碱基长度以上。终止核酸的3’末端的修饰只要是在3’侧不能进一步进行延伸反应的那样修饰，可以实施任一种修饰。对此没有限定，例如，可以使用3’末端的磷酸化和双脱氧核苷酸等手段。另外也可以根据使用的具有核苷酸延伸活性的酶的种类，选择那些修饰的种类。在图5中，作为这样修饰的一个例子，给出了终止核酸55的3’末端被磷酸化的例子。图中这样的修饰用圆圈标记中“P”表示。

这里可使用的延伸反应可以在引物53以靶核酸51为模板开始核酸的延伸，形成含有保护链52的双链的条件下进行。这样的条件只要是存在具有核苷酸延伸活性的酶、延伸时可整合的核酸合成底物以及延伸反应必需的辅酶等，而且适当控制温度以及pH等诸条件就可以。本发明中使用的酶可以象上述第1例所述的那样的酶。另外适当的温度控制以及pH的控制也可以象上述第1例所述那样。

本发明中使用的靶核苷酸序列52只要是实施者要检测的序列就可以，长度可以为5碱基～300碱基、优选是9碱基～50碱基。而靶核苷酸序列52存在于靶核酸51的5’端附近，无论是包含5’末端的碱基，还是不包含5’末端的碱基都可以。

基于以上那样本发明方式的方法最好是象以下那样进行。即，将具有与存在于靶核酸的5’端附近的靶核苷酸序列的3’侧邻接或存在于靶核苷酸序列3’端以外的3’侧的9碱基以上的序列互补的序列，而且该3’末端被修饰成羟基(-OH)以外官能团的核酸终止核酸、与靶核酸3’端附近配列互补核酸的引物、核酸合成酶添加到含有该靶核酸的样品中，以靶核酸作为模板进行延伸反应。通过该反应可以制造具备单链核酸部分和双链核酸部分的检测靶结构。

而在上述的方法中，对该引物的延伸反应合成与在靶核苷酸序列的检测方法中使用的靶核苷酸序列互补的核酸探针序列同样极性的保护链。

可以在使用核酸探针56的靶核苷酸序列的检测中利用通过基于上述那样本发明方式的反应得到的检测靶结构57(图5C)。核酸探针56与靶核苷酸序列52的结合可以通过上述第1例所述的手段进行。

在上述那样的本发明方式中，给出了用靶核酸作为模板，使用引物和终止核酸对核酸进行延伸的方法。即，检测靶结构中含有的单链核酸部分和双链核酸部分的边界可以由通过选择终止核酸的结合部位控制延伸反应的停止位置来决定。通过这样操作得到的检测靶结构靶核酸上的靶核苷酸序列的区域是单链，而其他区域变成双链。

通过基于上述那样本发明方式的方法，可以通过很少工序、自由设计靶核苷酸序列、而且在短时间内简便地制造检测靶结构。因此，经济性以及操作性都提高了。

(5)第5例

利用图6对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第5例进行说明。在上述的第4例中，靶核酸51是单链，但在第5例中，使用双链靶核酸。

参照图6。准备双链靶核酸61。靶核酸61包括在5’端附近含有靶核苷酸序列62的第1靶核酸61a和第2靶核酸61b(图6A)。

首先，在靶核酸61a的3’端附近设定用于引物63结合的序列。另外在靶核酸61a的靶核苷酸序列62的3’端以外的3’侧设定用于终止核酸65结合的序列。终止核酸65的3’末端被修饰，使得3’侧不能进一步向3’进行延伸反应。

终止核酸65处于与靶核酸61a的靶核苷酸序列62以外的3’侧的序列结合存在的状态，使用与靶核酸61a的3’端附近的序列结合的引物63a，与靶核酸61b的3’端附近的序列结合的引物63b，在可获得适当延伸反应的条件下，由5’向3’方向使核酸延伸(图6B)。通过延伸形成保护链64a和64b。

该延伸反应后，得到以第1靶核酸61a为基础的第1延伸产物检测靶结构67，第2靶核酸61b为基础的第2延伸产物双链68。

第5例中的所谓可获得的核酸适当延伸条件还具备对于靶核酸61a和b，引物63a和b可进行适当结合。例如，在进行延伸之前，也可以通过众所周知的变性手段、例如热、碱和添加盐等手段使双链的靶核酸61解离为单链。

基于以上本发明方式的第5例除了靶核酸是双链以外，其他可以与第4例同样实施。而第5例中使用的反应条件、以及有关靶核酸、终止核酸、引物和检测靶结构的条件也可以根据第4例进行变更。

在使用核酸探针69的靶核苷酸序列的检测中可以利用通过上述延伸反应得到的检测靶结构67(图6C)。通过对与靶核苷酸序列62互补的核酸探针69与靶核苷酸序列62的结合进行检测，可以进行靶核苷酸序列的检测。该结合的检测可以通过与上述第1例同样的方法进行。

(6)第6例

利用图7对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第6例进行说明。在上述的第5例中，由双链靶核酸61可以得到一个检测靶结构67，而在以下所述的第6例中由双链靶核酸71含有的各个核酸71a和71b可以分别得到检测靶结构76a和76b。除此之外，可以与第5例所述方法同样实施第6例。

参照图7。双链靶核酸71包括在5’端附近含有第1靶核苷酸序列72a的第1靶核酸71a和在5’端附近含有第2靶核苷酸序列72b的第2靶核酸71b。

首先，在靶核酸71a的3’端附近设定用于引物73a结合的序列。另外在靶核酸71a的靶核苷酸序列72a以外的3’侧设定用于终止核酸75a结合的序列。终止核酸75a的3’末端被修饰，3’侧不能进一步进行延伸反应。同样，在靶核酸71b的3’端附近设定用于引物73b结合的序列。另外在靶核酸71b的靶核苷酸序列72b的3’端以外的3’侧设定用于终止核酸75b结合的序列。终止核酸75b的3’末端被修饰，不能向3’侧进一步进行延伸反应。在图7中，终止核酸75a和b的3’末端用圆圈标记表示被修饰，不能向3’侧进一步进行延伸反应。

终止核酸75a和75b处于与靶核酸71a和71b的靶核苷酸序列72a和72b的3’端以外的3’侧的序列结合存在的状态，使用与靶核酸71a和71b的3’端附近的序列结合的引物73a和73b，在可获得适当延伸反应的条件下，由5’向3’方向使核酸延伸。结果形成保护链74a和b，得到第1延伸产物检测靶结构76a，和第2延伸产物检测靶结构76b。靶核苷酸序列72a和b的部分两者都维持单链状态。各个检测靶结构76a和b分别包含含有靶核苷酸序列72a和b的单链核酸部分以及含有靶核酸71a和b的一部分和与这部分互补的保护链74a和b的双链核酸部分。

基于以上本发明方式的第6例除了由作为靶核酸的双链，得到2个检测靶结构之外，其他可以与第5例的方法同样实施。而第6例中可获得的适当延伸条件、有关其他可使用的反应条件、靶核酸、终止核酸、引物和检测靶结构的条件可以是与第5例的条件同样的条件，也可以与第5例同样进行各种各样的变更。

在使用核酸探针77a和核酸探针77b的靶核苷酸序列的检测中可以利用通过上述延伸反应得到的检测靶结构76a和检测靶结构76b。例如，与上述任一个例子同样，通过对核酸探针77a和b与靶核苷酸序列72a与b的结合进行检测，可以进行靶核苷酸序列的检测。

通过上述那样的基于本发明方式的方法，可以通过很少工序、自由设计靶核苷酸序列、而且在短时间内简便地制造检测靶结构。因此，经济性以及操作性都提高了。另外，根据第6例，可以对2处的靶核苷酸序列同时进行检测。

(III)通过对引物的结合位置进行调节和使用终止核酸，形成核酸探针结合部位的方法

通过将上述(I)和(II)所述方法组合，可以更自由地设计各种靶核苷酸序列。以下第7例至第9例给出了这样的例子。

(7)第7例

利用图8对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第7例进行说明。在上述的第6例中，第1靶核酸和第2靶核酸无论哪一个在其5’端附近都有靶核苷酸序列。而与第6例对照，在以下所述的第7例中，在第1靶核酸中3’端附近存在靶核苷酸序列，在第2靶核酸5’端附近存在靶核苷酸序列。

参照图8。作为双链的靶核酸81包括第1靶核酸81a和第2靶核酸81b。在第1靶核酸81a的3’端附近存在第1靶核苷酸序列82a。在第2靶核酸81b的5’端附近存在第2靶核苷酸序列82b。第1靶核酸82a和第2靶核苷酸序列82b相互可以互补，也可以不互补。

由第1靶核酸制造第1检测靶结构86a可以通过与上述第1例所述方法同样的方法进行。即，使用具有与第1靶核酸中的靶核苷酸序列82a的5’端以外的5’侧序列互补的序列的引物83a，在可获得的适当延伸条件下进行延伸反应，合成保护链84a，可以制作检测靶结构86a。另外可以象第1例所述那样进行各种各样的变更。

由第2靶核酸制造第2检测靶结构86b可以通过与上述第5例所述方法同样的方法进行。即，使用具有与第2靶核酸的3’端附近的一部分序列互补的引物83b，在终止核酸85存在条件下，于可获得的适当延伸条件下进行延伸反应，合成保护链84b，可以制作检测靶结构86b。其中终止核酸85含有与靶核酸81b的靶核苷酸序列82b以外的3’侧的序列互补的序列。由这样的第2靶核酸进行检测靶结构的制作可以象上述第5例所述那样进行种种变更。在图8中用圆圈标记表示用于抑制向3’侧方向进行延伸反应的终止核酸85的3’末端处的修饰。

对上述第1靶核酸的延伸和对第2靶核酸的延伸也可以同时进行，或依次进行。例如，同时进行时，与使用上述的双链作为靶核酸的其他例子同样，可以在第1靶核酸和第2靶核酸两者在可获得适当延伸反应的条件下都可以进行延伸反应。

而第1靶核苷酸序列和第2靶核苷酸序列可以是同样长度，具有100％的互补性，也可以是一方比另一方长，也可以是同等长度，但两末端多少错开一点。

通过上述那样的基于本发明方式的方法，由于可以通过很少工序、自由设计靶核苷酸序列、而且在短时间内简便地制造检测靶结构，所以经济性以及操作性都提高了。另外，根据第7例，可以就两条互补链对1处的靶核苷酸序列同时或依次进行检测。因此，可以确实进行末端靶核苷酸序列的检测，使判定精度提高。例如，对检测单核苷酸多型性(Single nucleotide polymorphism、以下记为SNP)时特别有利。

另外，使用该检测靶结构的靶核苷酸序列检测与上述的其他例子同样，可以通过使用对第1靶核苷酸序列82a互补的核酸探针87a和对第2靶核苷酸序列82b互补的核酸探针87b，对他们与靶核酸的结合进行检测来进行。

(8)第8例

利用图9对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第8例进行说明。参照图9。单链靶核酸91在3’端附近含有第1靶核苷酸序列92，在5’端含有第2靶核苷酸序列93(图9A)。由这样的靶核酸91制造检测靶结构97(图9B)。在有与靶核酸91中的第1靶核苷酸序列92的5’端以外的5’侧的一部分序列互补的引物94和与靶核酸91中的第2靶核苷酸序列93以外的3’侧的一部分序列互补的引物95存在下，于可获得的适当伸反应的条件下进行延伸反应，合成保护链96，可以制作检测靶结构97。在图9中用圆圈标记表示终止核酸95的3’末端处的修饰，用于抑制向3’侧方向延伸反应。

检测可以使用与第1靶核苷酸序列92互补的第1核酸探针98和与第1靶核苷酸序列93互补的第2核酸探针99，通过与上述其他例子同样的方法对核酸探针与各个靶核苷酸序列的结合进行检测。

在上述第8例中，作为靶核酸可以使用单链，但对于双链靶核酸也同样可应用第8例的方法。另外，第8例根据上述的第1例、第2例、第4例和第5例的方法，象那些方法的变更同样也可以进行所希望的变更。

通过上述那样的基于本发明方式的方法，由于可以通过很少工序、自由设计靶核苷酸序列、而且在短时间内简便地制造检测靶结构，所以经济性以及操作性都提高了。

(9)第9例

利用图10，对制造有关含有3个以上的靶核苷酸序列的检测靶结构的方法的例子进行说明。参照图10。单链靶核酸101含有3’侧，即3’端附近的第1靶核苷酸序列102a、第2靶核苷酸序列102b、第3靶核苷酸序列102c、紧靠5’侧、即5’端附近的第4靶核苷酸序列102d(图10A)。由这样的靶核酸101制造检测靶结构。首先准备与靶核酸101中的第1靶核苷酸序列102a以外的5’侧序列互补的第1引物103a、与第2靶核苷酸序列102b 5’端以外的5’侧序列互补的第2引物103b以及与第3靶核苷酸序列102c 5’端以外的5’侧序列互补的第3引物103c。另外准备3个终止核酸。第1终止核酸105a含有与靶核酸101中的第2靶核苷酸序列3’端以外的3’侧序列互补的序列。第2终止核酸105b含有与第3靶核苷酸序列3’端以外的3’侧序列互补的序列。第3终止核酸105c含有与第3靶核苷酸序列3’端以外的3’侧的序列互补的序列。

在有第1引物103a、第2引物103b、第3引物103c，以及第1终止核酸105a、第2终止核酸105b、第3终止核酸105c存在下，于可获得适当延伸反应的条件下进行延伸反应，合成第1保护链106a、第2保护链106b以及第3保护链106c，制作检测靶结构107(图10B)。

这样制作的检测靶结构107一次可以检测4处靶核苷酸序列的存在。这样的检测象上述任一个例子那样，通过对核酸探针108a、108b、108c、108d与第1靶核苷酸序列102a、第2靶核苷酸序列102b、第3靶核苷酸序列102c以及第4靶核苷酸序列102d检测的结合进行检测来进行。

在上述第9例中，给出了在一个靶核酸上存在4个靶核苷酸序列的例子，对于靶核苷酸序列数3个以上的情形也应用第9例的方法。另外，靶核苷酸序列可以不必与靶核酸的5’和/或3’端连接存在，可以存在于留出几个残基的任一端，也可以只存在于靶核酸的中央附近。另外，在图10中用圆圈标记表示用于抑制向3’侧方向延伸反应的终止核酸105a、b和c的各个3’末端处的修饰。

在上述第9例中，作为靶核酸可以使用单链，但对于双链靶核酸也同样可应用第9例的方法。此时，由双链可以得到一个检测靶结构，也可以得到2个检测靶结构。另外，第9例根据上述的第1例、第2例、第4例和第5例的方法可以与那些例中的变更同样进行所希望的变更。

(IV)通过酶形成核酸探针结合部分的方法

以下的第10例和11例是一旦对靶核酸的全长进行复制做成双链后，只将所希望的靶核苷酸序列部分做成单链的方法的例子。具体来说，预先将核酸扩增中使用的引物的至少一部分序列修饰成核酸分解酶抗性，使用该引物对样品进行延伸或扩增，将延伸或扩增后得到的双链核酸用核酸外切酶一直消化到修饰部分。通过该反应可以作出含有单链核酸部分和双链核酸部分的检测靶结构。

(10)第10例

利用图11，对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第10例进行说明。作为检测靶结构基础的靶核酸111是由第1靶核酸111a和第2靶核酸111b构成的双链靶核酸111。在第1靶核酸111a的3’端附近存在靶核苷酸序列112。使用这样的靶核酸111和第1引物113a和第2引物113b，进行保护链114a和b延伸。

这里第1引物113a是与第1靶核酸113a的3’端附近的序列互补的引物，含有与靶核苷酸序列112互补的序列和与该靶核苷酸序列开始的5’侧的靶核酸上的序列互补的序列。另外，与第1引物113a含有的靶核苷酸序列互补的序列部分由核酸分解酶非抗性的核苷酸构成。至少含有与该靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的一部分、优选是与靶核苷酸序列邻接的序列的一部分序列是核酸分解酶抗性核酸。另外，第2引物113b是与第2靶核酸111b的3’端附近的序列互补的引物。第2引物113b由于至少5’端是核酸分解酶抗性，所以不会被核酸分解酶消化。

在上述那样的靶核酸111和第1引物113a和第2引物113b存在下，于可获得适当延伸反应的条件下，进行核酸延伸(图11A)。然后对得到的双链进行变性，分成为单链。再以得到的单链作为模板，与上述同样使用第1引物113a和第2引物113b，于可获得适当延伸反应的条件下，进行核酸延伸(图11B)。然后在可获得的适当分解酶活性的条件下使可以从5’末端分解核酸的核酸分解酶反应(图11C)。存在于该反应体系的核酸中，在露出的5’末端不含有核酸分解酶抗性核苷酸的核酸被该核酸分解酶分解。通过分解得到具备保护链114a’和保护链114b的检测靶结构116(图11C)。

使核酸探针115与上述那样得到的检测靶结构116杂交，与上述其他例子同样可以通过检测该结合对靶核苷酸序列进行检测(图11D)。

这里使用的核酸分解酶只要是从5’末端分解核酸的外切酶等核酸酶就可以，最好使用例如T7 Gene6核酸外切酶等。

象上述那样可在本发明中使用的靶核苷酸序列只要是实施者要检测的序列就可以，长度可以为5碱基～300碱基、优选是9碱基～50碱基。另外，靶核苷酸序列112存在于靶核酸的3’端附近，也可以与上述其他例子同样也可以配置在含有3’末端的位置，或不含有3’末端，离开该末端的位置。

这里使用的第1引物象上述那样，特定位置对核酸分解酶抗性，与靶核苷酸序列对应的部分是核酸分解酶非抗性的核酸。第1引物只要是获得那样的条件可以是任一种核酸。其长度为了获得对实施者选择的第1引物特异杂交，要有充分的长度，而且也可以是比上述那样的靶核苷酸序列碱基长度更长的碱基长度。例如，在本例中使用的第1引物的长度的例子可以是6碱基长度以上，优选是10碱基长度以上。另外，就象上述那样，在本例中使用的第1引物与存在于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列5’端以外的5’侧邻接或存在于更远5’侧的核苷酸互补的部分是核酸分解酶抗性。核酸分解酶抗性核苷酸数可以是1至300碱基，优选1至50碱基，更优选1至30碱基。与第1引物结合的靶核苷酸序列互补的部分由核酸分解酶非抗性的核苷酸构成。另外，第1引物也可以在比该核酸分解酶抗性核苷酸3’端进一步的3’侧含有核酸分解酶非抗性核苷酸。

这里使用的第2引物至少在该5’末端含有对核酸分解酶是抗性的核苷酸，其他部分可以含有核酸分解酶非抗性的核苷酸。第2引物的全长可以是5至100碱基，优选6至50碱基比较好，更优选10至35碱基。另外，第2引物的核酸分解酶非抗性核酸可以是从约4碱基至约99碱基，优选从约5碱基至49碱基，更优选9至34碱基。

在本例中为了将所希望的核苷酸做成核酸分解酶抗性，可以使用这方面众所周知的任一种核酸分解酶抗性化手段对核苷酸进行修饰。例如，那样的手段可以是对磷酸二酯键部分进行硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰等，但并不限定于这样作法。

而所谓可获得适当延伸反应的条件下，例如可以是在具有核苷酸延伸活性的酶、延伸时可整合的核酸合成底物以及延伸反应必需的辅酶等存在下，而且对温度以及pH等诸条件进行适当控制的条件。本发明中使用的酶可以是上述第1例中使用的酶。另外适当的温度控制和pH控制等条件也可以使用上述第1例所述的条件。

另外在上述的例子中，在图11的(A)后可以再进行一次延伸，也可以再反复进行该操作。即，在基于本例那样的本发明方式的方法中，也可以具备包括进行2次以上延伸的扩增反应。这样的扩增可以通过这方面众所周知的任一个扩增手段进行。扩增手段的例子可以是PCR扩增、以及Nucleic acid strand amplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chainreaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification ofNucleic acids(ICANN)和Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediated amplification(LAMP)法等。在本例中通过进行扩增反应，可以同时制造更多的检测靶结构。

使用样品中含有的靶核酸，利用上述第10例制造基于本发明的检测靶结构时，这里的样品可以含有靶核酸，但不一定只含有靶核酸，也可以同时含有其他核酸。然而，最好是为了进行基于本发明方式的反应，样品中的靶核酸的量约为样品中含有的核酸整体的约3％以上，更优选10％以上，进一步优选20％以上。另外，根据需要，在实施基于本发明的方法之前可以通过这方面众所周知的任一个扩增手段对靶核酸进行扩增。扩增手段的例子可以是PCR扩增、以及Nucleicacid strand amplification(NASBA)、Transcription mediatedamplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Stranddisplacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimericprimer-initiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)和Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediatedamplification(LAMP)法等。

(11)第11例

利用图12，对基于本发明方式的检测靶结构的制造方法的第11例进行说明。作为检测靶结构基础的靶核酸121是由第1靶核酸121a和第2靶核酸121b构成的双链靶核酸121(图12A)。第11例是在第1和第2靶核酸两者的3’端附近存在靶核苷酸序列122a和b时的例子。因此是上述第10例的变形例子。

使用具有与第靶核酸121a 3’端附近的第1靶核苷酸序列122a互补的序列的第1引物123a和具有与第2靶核苷酸序列112b互补的序列的第2引物123b，进行延伸反应(图12A)。然后对得到的双链进行变性，对得到的单链使用同样的第1引物123a和第2引物123b，和具有核苷酸延伸活性的酶，再次进行延伸(图12B)。然后通过核酸分解酶从5’末端对核酸分解酶非抗性核酸进行分解。通过该反应得到具备由以单链核酸部分存在的靶核苷酸序列122a和b以及互补链124a’和b’构成的双链核酸部分的点对称的检测靶结构126(图12C)。

其中，引物123a和b在各个5’端一侧含有核酸分解酶非抗性核苷酸，该核酸分解酶非抗性核苷酸可以存在于与靶核苷酸序列122a和b对应的部分。另外在与各个靶核酸中的靶核苷酸序列5’端以外的5’侧区域互补的序列中存在核酸分解酶抗性核苷酸部分。

在本第11例中，该延伸反应后，通过核酸分解酶将存在于各个保护链124a和b的5’端的核酸分解酶非抗性核苷酸分解。因此，在本第11例中使用的第1引物123a和第2引物123b两者基本结构都可以与第10例中所述的第1引物同样。即，在作为与靶核苷酸序列互补的序列的部分中含有对核酸分解酶非抗性的核苷酸，存在于该非抗性核苷酸3’端以外的3’侧的序列的一部分，优选是与靶核苷酸序列互补的序列邻接部分的序列是核酸分解酶抗性核苷酸。除了这样的第1引物123a和第2引物123b的构成以外、本第11例可以通过与上述第10例同样的方法进行，也可以与第10例的变更同样进行所希望的变更。

对于这样得到的检测靶结构126可以使核酸探针125a和b同时、或依次杂交，利用与上述的其他例子同样的方法，可以通过检测该结合对靶核苷酸序列进行检测(图12D)。

对于通过以上说明的检测靶结构的制造方法的各种方式(I)～(IV)得到的效果可以给出如下更具体的例子。

在杂交操作中使用以·NAT基因、MDR基因、CYP2D6基因等为首的各种人代谢酶基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(I)、(II)、(III)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传的多态性进行检测。

在杂交操作中使用以·Cytb基因、D-Loop区域等为首的各种人线粒体基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(I)、(II)、(III)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传的多态性进行检测。

在杂交操作中使用以·Aspergillus属、Candida属、Trichomonas属、Cryptosporidium属为首的各种真核生物的r-RNA基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(I)、(II)、(III)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传多态性进行检测。

在杂交操作中使用以·Aspergillus属、Candida属、Trichomonas属、Cryptosporidium属为首的各种真核生物的r-RNA基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(V)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传多态性进行检测。

在杂交操作中使用以·Helicobacter属、Bacillus属、Clostridium属为首的各种真核生物的r-RNA基因序列以及病原性相关基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(I)、(II)、(III)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传多态性进行检测。

在杂交操作中使用以·Helicobacter属、Bacillus属、Clostridium属为首的各种真核生物的r-RNA基因序列以及病原性相关基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(IV)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传多态性进行检测。

在杂交操作中使用以·MHV、HPV、HCV、HBV、HIV、HEV为首的各种病毒基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(I)、(II)、(III)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传多态性进行检测。

在杂交操作中使用以·MHV、HPV、HCV、HBV、HIV、HEV为首的各种病毒基因序列作为对象，依据检测靶结构的制造方法(IV)做成的样品时，可以有效而且经济地对该基因序列中含有的遗传多态性进行检测。

4.检测靶结构

依据上述那样的本发明方法制造的检测靶结构也包括在本发明中。另外基于这样的本发明的检测靶结构在靶核苷酸序列或含有该序列的靶核酸的检测中使用很理想。另外依据本发明制造的检测靶结构可以以在溶液中游离的状态使用，也可以以被固定在颗粒和基板等基体上的状态使用。即，游离型的检测靶结构和固定于基体的检测靶结构任一个都可作为本发明提供。

一般来说，靶核苷酸序列的检测通过使互补的核酸探针与目的靶核苷酸序列结合，对其结合进行检测来进行。在多数场合下，靶核苷酸序列不是单独存在于样品中，而更多的是与含有多个不同序列的核酸共存、或存在于在其一部分含有靶核苷酸序列的靶核酸中，或许多具有同等序列的靶核苷酸序列和靶核酸集合存在。因此，靶核苷酸序列或含有该序列的靶核酸由于本身互补性产生二级结构，或与其他序列产生交叉杂交的可能性很大。如果产生那样的没有预料的结合，结果会使靶核苷酸序列的检测的精度变低。然而，利用本发明的检测靶结构可以抑制由于自身互补性或与其他序列的互补性造成的没有预料的杂交的发生。

5.靶核苷酸序列检测方法

使用上述那样基于本发明制造的检测靶结构，对靶核苷酸序列或靶核酸进行检测的方法也包括在本发明中。

即，准备作为该检测对象的样品。然后根据要求对含有目的序列的核酸进行扩增。然后利用上述的基于本发明方式的方法制造检测靶结构。然后在适当的杂交条件下使与检测对象靶核酸互补的核酸探针和制造的该检测靶结构反应。结果，当该样品中存在靶核酸时，在该核酸探针和靶核苷酸序列之间发生杂交。因此，对通过该杂交引起的结合进行检测，就可以检测样品中的靶核苷酸序列或靶核酸的存在。

本发明中使用的核酸的扩增手段只要是这方面众所周知的扩增手段就可以，例如，PCR扩增、以及Nucleic acid strandamplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacementamplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic acids(ICANN)和Rolling circleamplification(RCA)法、Loop mediated amplification(LAMP)法等。在本发明中，可获得的适当杂交条件只要是本领域技术人员，都可以根据靶核苷酸序列中含有的碱基种类、核酸探针固定基体所具备的核酸探针的种类、样品核酸的种类以及他们的状态等诸条件进行适当选择。

另外在使用基于本发明的检测靶结构的靶核苷酸序列的检测方法中使用的检测手段可以是使用核酸探针实施的众所周知的一般的检测手段。例如，这样的检测手段可以是对核酸探针预先进行荧光标记、化学发光物质和色素等可检测的标记物质，检测这些标记物的检测方法、利用对该结合部分可特异结合的嵌入剂进行检测的检测方法、以及使用通过电化学手段识别该结合部分的物质的电化学检测方法等。

6.分析试剂盒

(1)检测靶结构制造用试剂盒

依据本发明的方式，用于制造上述那样的基于本发明方式的检测靶结构的检测靶结构制造用试剂盒也包括在本发明中。

基于本发明方式的检测靶结构制造用试剂盒至少具备上述那样的各种引物、核酸合成酶、核酸合成底物、为了得到终止核酸的必需试剂、核酸分解酶、用于核酸的核酸分解酶抗性化所必需的试剂、核酸探针、用于对核酸探针进行标记的标记物质以及其他试剂、以及至少一个所希望的基体，也可以具备他们中的几个的组合。

(2)靶核苷酸序列检测用分析试剂盒

本发明还提供使用上述那样的基于本发明方式的检测靶结构对靶核苷酸序列进行检测的靶核苷酸序列检测用分析试剂盒。基于本发明的方式的靶核苷酸序列检测用分析试剂盒具备依据本发明方式的检测靶结构、核酸引物、用于检测结合的可检测的标记物质以及用于进行检测的各种试剂中的至少一个，也可以具备他们中几个的组合。另外，在上述的检测靶结构制造用试剂盒具备的上述那样的各种引物、核酸合成酶、核酸合成底物、为了得到终止核酸的必需试剂、核酸分解酶、用于核酸的核酸分解酶抗性化所必需的试剂、核酸探针、用于对核酸探针进行标记的标记物质和试剂、颗粒和基板等基体、以及核酸探针固定化基体等也可以至少具备一个，或他们中几个组合的形式。

实施例1

将使用上述终止核酸的图5所示那样的第4例子作为本发明的实施例1，再将得到的结果与用以往方法得到的结果进行比较。用与含有MBL基因编码区域的SNP的区域相对应的单链DNA作为靶核酸，通过本发明和以往方法两个方法作出检测靶结构。以下，使用用于检测同区域上SNP的核酸探针固定化基体进行MBL基因的SNP检测。具体方法如下所述。

将带有与在MBL基因中含有与要检测的SNP区域同样序列(即，序列编号1)的单链DNA作为靶核酸，将其浓度调整到终浓度为10¹²拷贝/mL程度。

另外保护链的延伸在终止核酸存在下使用引物进行。即，用终浓度0.4μM的3’磷酸化寡DNA(序列编号2)作终止核酸，用终浓度0.2μM的寡DNA(序列编号3)作引物。将这些终止核酸和引物与终浓度0.04U/μL的耐热性DNA合成酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)一起添加到上述靶核酸中。终止核酸和引物的序列如下。

序列编号2：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

序列编号3：

CATGGTCCTCACCTTGGTGT。

然后在最适酶反应溶液组成中，于66℃下进行10分钟反应。反应后，添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mM EDTA溶液，添加到预先准备的该核酸探针固定化芯片后，于35℃下进行1小时杂交。这里使用的核酸探针固定化芯片作为核酸探针含有通过在3’末端导入巯基，被固定在基板上具备的金电极上的序列编号4和序列编号5所示的核酸。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

作为比较对照的以往方法如下进行。将作为靶核酸的单链DNA与另外合成的单链保护链(即，序列编号6的核酸链)混合，在2×SSC缓冲液中，于95℃热变性5分钟后，通过30分钟将95℃缓慢地冷却至30℃，进行退火。将上述退火后得到的利用以往方法的检测靶结构添加到作为探针含有序列编号4和序列编号5的核酸固定于基板的金电极上，与上述同样的核酸探针固定化芯片上。然后于35℃下进行1小时杂交。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

另外，作为另一个以往方法，用不含有保护链的单链靶核酸(序列编号1)作为检测靶结构，对靶核苷酸序列进行检测。添加到作为核酸探针含有序列编号4和序列编号5的与上述同样的核酸探针固定化芯片，象上述那样进行杂交。杂交后用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

图13给出了以上结果。以上的杂交结果表明，只是从使用作为终止核酸的序列编号2的3’磷酸化寡DNA和作为引物的序列编号3寡DNA，向他们中添加耐热性DNA合成酶作出的检测靶结构，使用该检测靶结构进行的本发明方法涉及到的实验区可以检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针的特异杂交发生的电流信号(图13)。

另外，使用具有不同序列的靶核酸进行同样的比较实验，无论哪一种情况，只从使用本发明涉及到的方法作出的检测靶结构进行检测的情形可以检测到稳定而且特异的信号。另外，不带有保护链，而是将靶核酸直接以单链DNA作为检测靶结构进行检测时，或将靶核酸和另外合成的互补链混合后通过热变性和退火作出检测靶结构进行检测等，使用以往方法不能得到与图13所示结果几乎同样的好结果。

另外，依据图7所示本发明的第6例作出检测靶结构，进行靶核苷酸序列的检测。即，作为靶核酸使用双链核酸，以互不相同的部位作为靶核苷酸序列，由双链靶核酸中含有的各个链分别做成检测靶结构，同样进行靶核苷酸序列的检测。其结果只在通过本发明的方法作出的检测靶结构的场合可以确认特异的杂交。

以上结果表明利用本发明的方法的检测与以往方法比较，可以特异地、有效而且高灵敏度地检测靶核酸。因此，作出靶DNA时的经济性和操作性提高。

实施例2

作为实施例2，通过图2所示的本发明第1例涉及到的方法，即调节引物的结合位置，实施制造所希望的检测靶结构的方法，使用通过该方法得到的检测靶结构进行靶核苷酸序列的检测。将通过该实施例得到的结果与通过以往方法得到的结果进行比较。

将含有MxA基因的溶液作为样品，将与含有MxA基因启动子的SNP区域对应的单链DNA(序列编号7)作为靶核酸。另外，将含有该SNP的序列作为靶核苷酸序列。就上述样品使用本发明的方法和以往方法两个方法分别作出检测靶结构，进行靶核苷酸序列的检测。靶核苷酸序列的检测手段通过检测对将具有与靶核苷酸序列互补的序列的核酸探针固定在基体上得到的核酸探针固定化基体有无杂交来进行。通过这样检测，可以检测MxA基因启动子的SNP的基因型。

将带有与MxA基因中含有要检测的SNP区域同样的序列的靶单链DNA作为靶核酸，将其浓度调整到终浓度为10¹²拷贝/mL程度。作为引物准备寡DNA(序列编号8)。将终浓度0.4μM的该引物和终浓度0.04U/μL的PCR用Pyrobest DNA聚合酶(Takara)一起添加到上述靶核酸中。引物的序列如下。

序列编号8：

GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。

延伸反应在最适酶反应溶液组成中，于66℃下进行10分钟反应。反应后，添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到预先准备的该核酸探针固定化芯片后，于35℃下进行1小时杂交。这里使用的核酸探针固定化芯片，作为核酸探针分别含有通过在5’末端导入巯基，固定于金电极的序列编号9和序列编号10所示的核酸探针。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

作为比较对照的以往方法如下进行。将作为靶核酸的单链DNA与另外合成的单链保护链(即，序列编号11的核酸链)混合，在2×SSC缓冲液中，于95℃热变性5分钟后，用30分钟将95℃缓慢地冷却至30℃，进行退火。上述退火后得到的利用以往方法的检测靶结构添加到将作为探针含有序列编号9和序列编号10的核酸固定于基板的金电极上的与上述同样的核酸探针固定化芯片上。然后于35℃下进行1小时杂交。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

另外，作为另一个以往方法，用不含有保护链的单链靶核酸(序列编号7)作为检测靶结构，对靶核苷酸序列进行检测。添加到作为核酸探针分别含有序列编号9和序列编号10的与上述同样的核酸探针固定化芯片上，与上述同样进行杂交，测定电流应答。

结果只从使用本发明的方法作出的检测靶结构进行检测的实验区可以检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针特异杂交进行的电流信号(图14)。另外，使用具有多种不同序列的靶核酸也同样进行比较实验，无论哪一种情况，只从依据本发明的方法作出的样品检测到稳定而且特异的信号。另外，没有保护链，而是将靶核酸直接以单链DNA作为检测靶结构进行检测时，或将靶核酸和另外合成的互补链混合后通过热变性和退火作成检测靶结构进行检测时，使用以往方法场合下，不能得到在与图14所示结果几乎同样的好结果。

另外，依据图4所示本发明的第3例作出检测靶结构，进行靶核苷酸序列的检测。即，作为靶核酸使用双链核酸，以互不相同的部位作为靶核苷酸序列，由双链靶核酸中含有的各个链分别做成检测靶结构，另外再依据图8所示的本发明的第7例作出检测靶结构，进行靶核苷酸序列的检测。即，作为靶核酸使用双链核酸，以相互互补的部位作为各个靶核苷酸序列，由双链靶核酸中含有的各个链分别做成检测靶结构。依据以上那样的本发明的方法由双链靶核酸作出2种检测靶结构，使用该结构实施检测靶核苷酸序列的方法，结果无论对于什么样的场合，都可以确认对靶核苷酸序列的特异杂交。另外将这些结果与以往的方法进行比较，本发明的方法与任一个以往的方法相比，可以高灵敏度地检测靶核苷酸序列。

以上结果表明，利用本发明的方法的检测与以往方法比较，可以特异地、有效而且高灵敏度地检测靶核酸。因此，作出靶DNA时的经济性和操作性提高。

实施例3

对使用上述终止核酸的本发明涉及到的检测靶结构作出方法中的各种条件进行研究。将与含有MBL基因编码区域的SNP的区域对应的单链DNA作为靶核酸，改变添加的作为引物使用的寡DNA的种类作出靶核酸结构。使用用于检测同区域上SNP的核酸探针固定化基体进行MBL基因的SNP检测。

作为靶核酸准备带有含有与MBL基因中要检测的SNP的区域同样序列(序列编号1)的靶单链DNA。对其合成和扩增，将其浓度调整到终浓度为10¹²拷贝/mL程度。终止核酸准备用以下那样的序列编号2、序列编号12、序列编号13和序列编号14所示的3’磷酸化寡DNA。向靶核酸中添加终浓度0.4μM的任一种终止核酸，即3’磷酸化寡DNA(序列编号2、序列编号12、序列编号13或序列编号14)、作为引物终浓度0.2μM的寡DNA(序列编号3)、和终浓度0.04U/μL的耐热性DNA合成酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)。使用的终止核酸和引物的序列如下。

序列编号2：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

序列编号12：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA

序列编号13：

CACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA

序列编号14：

CCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

序列编号3：

CATGGTCCTCACCTTGGTGT。

然后在最适酶反应溶液组成中，于66℃下进行10分钟反应，进行核酸延伸。反应后，添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mM EDTA溶液，与预先在3’末端导入巯基固定在金电极的具有序列编号4和序列编号5所示的序列的核酸探针在35℃下进行1小时杂交。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

结果虽然由任一个实验区可以得到特异的信号，但就作为终止核酸的3’磷酸化寡DNA使用序列编号2或序列编号12，添加了这样序列、作为引物的寡DNA序列编号3和耐热性DNA合成酶的实验区来说，与作为终止核酸的3’磷酸化寡DNA使用序列编号13或序列编号14时相比，可以更高灵敏度地检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针进行特异杂交的电流信号。即，以上结果表明利用本发明的方法作出靶DNA时，更优选设计成使得作为终止核酸的3’磷酸化寡DNA的3’末端和核酸探针的5’末端邻接。

实施例4

就通过调节本发明涉及到的引物的结合位置，制造所希望的检测靶结构的方法，对该检测靶结构制造条件进一步研究。将与含有MxA基因启动子的SNP的区域对应的单链DNA作为靶核酸。准备多个使用的引物序列，使用这些序列作出检测靶结构。将得到的检测靶结构添加到用于检测同一区域上的SNP的核酸探针固定化基体后，使其反应，进行MxA基因的SNP检测。

将带有含有与MxA基因中要检测的SNP的区域同样的序列的单链DNA(序列编号7)作为靶核酸。对这样的靶核酸进行合成、扩增和调整。作为引物准备含有3种序列(序列编号8、序列编号15或序列编号16)中的任一序列的核酸。将终浓度0.4μM的引物和终浓度0.04U/μL的PCR用Pyrobest DNA polymerase(Takara)添加到该靶核酸中。添加的引物的序列如下。

序列编号8：

GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC

序列编号15：

CCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC

序列编号16

CGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。

将上述靶核酸、引物和酶的混合物在最适酶反应溶液组成中，于66℃下进行10分钟反应。反应后，添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到预先准备的该核酸探针固定化芯片后，于35℃下进行1小时杂交。这里使用的核酸探针固定化芯片作为核酸探针分别含有在5’末端导入巯基固定于基板上具备的金电极上的序列编号9和序列编号5所示的核酸探针。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

结果由任一个实验区可以检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针进行特异杂交的电流信号。更有趣的是看到了通过使用的引物的序列不同得到的信号强度的差异。信号强度与引物序列的关系依次是序列编号8＞序列编号15＞序列编号16的顺序。即，由以上结果可知利用本发明的方法作出靶DNA时，更优选设计成使得添加的引物的5’末端和核酸探针的3’末端邻接。

实施例5

使用上述图6所示的第5例的方法作出检测靶结构，进行靶核苷酸序列的检测。在本实施例中，对将双链核酸作为靶核酸时的条件进行研究。即，将与含有MBL基因编码区域的SNP的区域对应的PCR产物作为靶核酸，在几种不同的条件下作出本发明的检测靶结构。使用得到的检测靶结构和用于检测同区域上的SNP的核酸探针固定化基体的核酸探针固定化芯片进行MBL基因的SNP检测。

以预先判明SNP型的人基因组DNA作为模板，以分别含有序列编号17和序列编号3的寡DNA作为引物进行PCR法。通过该PCR扩增MBL基因中要检测的含有SNP的区域。向该扩增产物添加终浓度0.4μM的终止核酸3’磷酸化寡DNA(序列编号2)和终浓度0.04U/μL的耐热性DNA合成酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)、以及作为第1引物的终浓度为0.2μM的寡DNA(序列编号17)和/或作为第2引物的终浓度为0.2μM的寡DNA(序列编号3)。使用的寡DNA的序列如下。

序列编号17：

GTCCCATTTGTTCTCACTGC

序列编号3：

CATGGTCCTCACCTTGGTGT

序列编号2：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC。

然后在最适酶反应溶液组成中，于95℃下进行5分钟，66℃下进行10分钟反应。反应后，添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mMEDTA溶液，然后添加到预先准备的该核酸探针固定化芯片后，于35℃下进行1小时杂交。这里使用的核酸探针固定化芯片作为各个核酸探针含有通过在3’末端导入巯基，固定在基板具备的金电极上的序列编号4和序列编号5所示序列的核酸。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

结果只从向PCR产物添加作为引物的序列编号17的寡DNA和序列编号3的寡DNA、作为终止核酸的序列编号2的3’磷酸化寡DNA和耐热性DNA合成酶的实验区检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针进行特异杂交的电流信号。另外再准备多种靶核酸，对这些靶核酸进行同样的实验。结果任一场合下都能够稳定而且特异地检测信号只是用与上述同样的方法作出检测靶结构的场合。与此相反，对于用其他方法作出检测靶结构的场合，几乎所有的场合都得不到好的结果。另外象上述那样将扩增产物作为靶核酸使用时，即使是上述那样的PCR法以外的任一种扩增手段得到的扩增产物也可以作为靶核酸使用。例如，对于ICAN产物也用与上述同样的方法作出检测靶结构(参照图15)，使用得到的检测靶结构也可同样确认良好的靶核苷酸序列的特异检测。以上结果表明，作为靶核酸使用双链核酸作出本发明涉及到的检测靶结构时，在与核酸探针反应时，希望作为与靶核酸互补核酸游离的单链核酸不存在于杂交溶液中。因此，希望添加引物在要杂交时靶核酸的双链的两条链仍为双链。

实施例6

在本实施例中使用上述图3所示第2例的方法作出检测靶结构，进行靶核苷酸序列的检测。在本实施例中，对将双链核酸作为靶核酸时的条件进行研究。即，将与含有MxA基因启动子区域的SNP的区域对应的PCR产物作为靶核酸，在几种不同的条件下作出本发明的检测靶结构。使用得到的检测靶结构和在用于检测同区域上的SNP的基体上固定核酸探针的核酸探针固定化芯片进行MxA基因的SNP检测。

以预先判明SNP型的人基因组DNA作为模板，以分别含有序列编号18和序列编号19的寡DNA作为引物进行PCR法。通过该PCR扩增MxA基因中要检测的含有SNP的区域。向该扩增产物添加终浓度为0.4μM的作为第1引物的寡DNA(序列编号18)和/或作为第2引物的寡DNA(序列编号8)以及终浓度0.04U/μL的PCR用酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)。添加的寡DNA的序列如下。

序列编号18：

GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC

序列编号19：

CGCTAGTCTCCGCCACGAAC

序列编号8：

GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。

然后在最适酶反应溶液组成中，于95℃下进行5分钟，66℃下进行10分钟反应。反应后，添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mMEDTA溶液，然后添加到预先准备的该核酸探针固定化芯片后，于35℃下进行1小时杂交。这里使用的核酸探针固定化芯片作为各个探针含有通过在5’末端导入巯基，固定于基板具备的金电极上的序列编号9和序列编号10所示的序列的核酸。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

结果只从向PCR产物添加作为引物的序列编号19的寡DNA和序列编号8的寡DNA以及耐热性DNA合成酶的实验区检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针进行特异杂交的信号。另外再准备多种靶核酸，对这些靶核酸进行同样的实验。结果任一场合下都能够稳定而且特异地检测信号只是在用与上述同样的方法作出检测靶结构的场合。与此相反，对于用其他方法作出检测靶结构的场合，几乎所有的场合都得不到好的结果。另外象上述那样将扩增产物作为靶核酸使用时，即使是上述那样的PCR法以外的任一种扩增手段得到的扩增产物也可以作为靶核酸使用。例如，对于ICAN产物也用与上述同样的方法作出检测靶结构(参照图16)，使用得到的检测靶结构也可同样确认良好的靶核苷酸序列的特异检测。由以上结果表明作为靶核酸使用双链核酸作出本发明的检测靶结构时，在与核酸探针反应时，希望作为与靶核酸互补游离的单链核酸不存在于杂交溶液中。因此，希望在添加引物要杂交时靶核酸的双链的两条链仍为双链。

实施例7

在本实施例中，就象上述图11所示的第10例和图12所示的第11例那样，通过使用酶形成单链核酸部分的方法，可以制造检测靶结构。通过该检测靶结构检测靶核苷酸序列的结果与利用通过以往方法做成的检测靶结构检测靶核苷酸序列的结果进行比较。作为靶核酸使用水稻基因组，利用固定了核酸探针的基体进行含有靶核苷酸序列的水稻基因组PCR扩增片段是否存在的判定。

首先，从精米中提取、制备水稻基因组。对该水稻基因组DNA使用以下4个引物通过PCR对利用这些引物所夹的区域进行扩增。使用的引物序列如下。

序列编号20：tacCTGGTTGATGTATACAGATCTGGTT

序列编号21：ATCCCTCGATCCCTCtagCATTAT

序列编号22：TACCTGGTTGATGTAtacAGATCTGGTT

序列编号23：atcCCTCGATCCCTCTAGCATTAT

其中，在序列编号20、序列编号21、序列编号22和序列编号23这些序列中，小写字母表示的碱基存在于其3’侧的磷酸二酯键部分实施了硫代磷酸酯修饰。

向该扩增产物中添加T7 Gene6核酸外切酶和附带的缓冲液，在最适条件下进行完全消化。反应后，向酶反应液添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到预先准备的该核酸探针固定化芯片后，于35℃下进行1小时杂交。这里使用的核酸探针固定化芯片作为各个核酸探针是含有通过在5’末端导入巯基，固定于基板具备的金电极上的序列编号24和序列编号25以及序列编号26所示的序列的核酸。

核酸探针：

序列编号24：TACCTGGTTGATGTA

序列编号25：ATCCCTCGATCCCTC

序列编号26：ACAACGCCTCCGATG (对照用)

另外在进行该杂交反应时，作为对照实验就对PCR产物没有进行T7 Gene6核酸外切酶处理的产物、用没有进行硫代磷酸酯修饰的引物进行PCR扩增的产物、进行了T7 Gene6核酸外切酶处理的产物根据以往方法「利用部分双链DNA的DNA检测方法”(特开平11-332566)的方法作出的靶结构也同样进行杂交。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

结果表明，在对PCR产物没有进行T7 Gene6核酸外切酶处理的情况、以及用没有进行硫代磷酸酯修饰的引物进行PCR扩增、进行了T7 Gene6核酸外切酶处理的情况、用引物序列编号20和序列编号23的组合进行PCR后用T7 Gene6核酸外切酶处理的情况中没有获得表示发生杂交的结果。而根据「利用部分双链DNA的DNA检测方法”(特开平11-332566)作出的靶中，得到的某种程度的信号的背景的信号变大，为S/N＝1.2程度。与此相反，用引物序列编号20和序列编号21的组合进行PCR时通过核酸探针序列编号24，以及用引物序列编号22和序列编号23的组合进行时通过核酸探针序列编号25给出的特异信号都是S/N＞＞2(图17)。在用引物序列编号21和序列编号22的组合进行PCR时，可以确认与序列编号24和序列编号25两方的核酸探针的特异杂交以S/N＞＞2进行。而另外，对于多个PCR片段同时存在的多重PCR产物也进行实验。结果观察到通过本发明的方法作出检测靶结构的场合与以往方法相比有很高的特异性。以上结果表明在利用本发明的方法作出检测靶结构的场合与以往相比，经济性和操作性都提高、而且可以特异、有效和/或高灵敏度地检测靶核酸。

实施例8

对于多重PCR的扩增产物应用基于本发明的检测靶结构的制造方法，以下对在通过杂交进行检测中使用利用该方法得到的产物的例子进行说明。

以预先判明SNP型的人基因组DNA作为模板，为了对MxA基因启动子区域和MBL基因编码区域中含有SNP的区域进行扩增，使用序列编号17、序列编号3、序列编号18和序列编号19进行多重PCR。向反应后PCR产物添加终浓度0.4μM的引物(序列编号8)和终浓度0.4μM的终止核酸3’磷酸化寡DNA(序列编号2)、以及各个终浓度为0.2μM的2种引物(分别含有序列编号17或序列编号19)以及终浓度0.04U/μL的PCR用酶Pyrobest DNA聚合酶(Takara)。于95℃进行5分钟、66℃下进行10分钟反应。

其中使用的各个寡DNA的序列如下。

序列编号17：GTCCCATTTGTTCTCACTGC

序列编号3：CATGGTCCTCACCTTGGTGT

序列编号18：GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC

序列编号19：CGCTAGTCTCCGCCACGAAC

序列编号2：GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

序列编号8：GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC

反应后，向酶反应液中添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mM EDTA溶液，然后添加到预先准备的该核酸探针固定化芯片后，于35℃下进行1小时杂交。这里使用的核酸探针固定化芯片，作为固定化核酸探针具备通过预先在3’末端导入巯基，固定于基板具备的金电极上的序列编号4和序列编号5的核酸，以及预先在5’末端导入巯基，固定于基板具备的金电极上的序列编号9和序列编号10的核酸。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。结果检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针特异杂交发生的电流信号。

以上结果表明，如果利用本发明的方法形成检测靶结构，并用于靶核苷酸序列的检测中，即使多种DNA片段混合液作为样品时，也可以高特异性地进行靶核苷酸序列的检测。

实施例9

在本实施例中，就象上述图9所示的第8例那样，做成可以对存在于单链核酸的靶核酸上的2处靶核苷酸序列进行同时检测的检测靶结构，通过利用该结构的杂交进行靶核苷酸序列的检测。

将具有与作为MBL基因的序列，在两端含有SNP区域的DNA区域同一的序列(序列编号27)的靶单链DNA作为靶核酸。对该靶核酸进行合成、扩增，将其浓度调整到终浓度为10¹²拷贝/mL程度，然后添加终浓度0.4μM的引物序列编号28、作为终止核酸的0.4μM 3’磷酸化寡DNA序列编号2，以及终浓度0.04U/μL的PCR用酶PyrobestDNA聚合酶(Takara)，于66℃下反应10分钟。这里使用的寡DNA的序列如下。

序列编号2：GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

序列编号28：CCCATCTTTGCCTGGGAAGCCGTTGATGCC

反应后，向酶反应液中添加1/9量的20×SSC缓冲液、1/9量的10mM EDTA溶液。然后将该溶液添加到预先在3’末端导入巯基，固定在金电极上含有序列编号4和序列编号5的核酸探针，以及预先在5’末端导入巯基，固定在金电极上含有序列编号29以及序列编号30的核酸探针，于35℃下杂交1小时。杂交后，用0.2×SSC清洗15分钟，最后测定ヘキスト33258的电流应答。

结果检测到表示与检测对应的SNP的核酸探针特异杂交发生的电流信号。另外通过同样的设计，也利用图10所示的第9例的那样的本发明的方法，作出在单链的靶核酸上存在3处以上的靶核苷酸序列时的检测靶结构(图10)。使用做成的检测靶结构，对该4处靶核酸进行检测时确认获得了特异杂交。

以上结果表明利用本发明的方法，可以对存在于单链的靶核酸上的多处靶核苷酸序列同时进行检测。

另外上述实施例1至实施例9中的检测靶结构的检测表示可以通过利用金电极上的电流应答的电化学检测方法进行的例子。然而，实施例1至实施例9中的任一个例子也可以通过众所周知的方法在制造的检测靶结构上附带荧光标记物质，使他们与固定了对应的核酸探针的基体进行反应后，通过测定荧光强度也同样可以进行检测。

就象上述详细叙述的那样，如果使用本发明的方法，在获得靶核酸设计时的自由度的同时可以使靶核酸检测中的特异性、有效性和灵敏度提高，而且低费用和/或在短时间内可以作出靶核酸结果。

序列表

<110>KABUSHIKI KAISHA TOSHIBA

<120>Method of preparing of target，method of detecting for target sequence，target，kit for making of target，and assay kit for detecting oftarget sequence

<130>04S0167P

<150>JP 2003-085670

<151>2003-3-26

<160>30

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>316

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

gtcccatttg ttctcactgc cacggaaagc atgtttatag tcttccagca gcaacgccag 60

gtgtctaggc acagatgaac ccctccttag gatccccact gctcatcata gtgcctacct 120

ttgttaaagt actagtcacg cagtgtcaca aggaatgttt acttttccaa atccccagct 180

agaggccagg gatgggtcat ctatttctat atagcctgca cccagattgt aggacagagg 240

gcatgctcgg taaatatgtg ttcattaact gagattaacc ttccctgagt tttctcacac 300

caaggtgagg accatg 316

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’en

d.

<400>2

gcctagacac ctggcgttgc tgctggaaga ctataaac 38

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

catggtcctc accttggtgt 20

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 3’end.

<400>4

atgctttccg tggca 15

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 3’end.

<400>5

atgctttcgg tggca 15

<210>6

<211>284

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>6

catggtcctc accttggtgt gagaaaactc agggaaggtt aatctcagtt aatgaacaca 60

tatttaccga gcatgccctc tgtcctacaa tctgggtgca ggctatatag aaatagatga 120

cccatccctg gcctctagct ggggatttgg aaaagtaaac attccttgtg acactgcgtg 180

actagtactt taacaaaggt aggcactatg atgagcagtg gggatcctaa ggaggggttc 240

atctgtgcct agacacctgg cgttgctgct ggaagactat aaac 284

<210>7

<211>238

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

cgctagtctc cgccacgaac gccgctctcc caatgccctt ctccgcgctc ctagcgcggt 60

tactgggcgc tgcccccaga agcgacactc accggtccct gcgcagtgct ggagtgcggc 120

ctccgctctc gcttcgcctc tttcaccccg cgcccagccc cgccccgcgc cgcgaagaaa 180

tgaaactcac agaccctgtg ctgagggcgg ctccgggcgc agaaacgaaa cctagctc 238

<210>8

<211>35

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>8

gccgccctca gcacagggtc tgtgagtttc atttc 35

<210>9

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 5’end.

<400>9

gtttctgcgc ccgga 15

<210>10

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 5’end.

<400>10

gtttctgctc ccgga 15

<210>11

<211>211

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

gccgccctca gcacagggtc tgtgagtttc atttcttcgc ggcgcggggc ggggctgggc 60

gcggggtgaa agaggcgaag cgagagcgga ggccgcactc cagcactgcg cagggaccgg 120

tgagtgtcgc ttctgggggc agcgcccagt aaccgcgcta ggagcgcgga gaagggcatt 180

gggagagcgg cgttcgtggc ggagactagc g 211

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’end.

<400>12

gcctagacac ctggcgttgc tgctggaaga ctataaa 37

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’end.

<400>13

cacctggcgt tgctgctgga agactataaa 30

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A hydroxyl group is substituted for phosphoryl group at the 3’end.

<400>14

cctggcgttg ctgctggaag actataaac 29

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>15

ccgccctcag cacagggtct gtgagtttca tttc 34

<210>16

<211>33

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>16

cgccctcagc acagggtctg tgagtttcat ttc 33

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>17

gtcccatttg ttctcactgc 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>18

gagctaggtt tcgtttctgc 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>19

cgctagtctc cgccacgaac 20

<210>20

<211>28

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>Phosphorothioation is given to phosphodiester bonds on the 3’side of 1st，2nd and 3rd nucleotides.

<400>20

tacctggttg atgtatacag atctggtt 28

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>Phosphorothioation is given to phosphodiester bonds on the 3’side of 16th，17th and 18th nucleotides.

<400>21

atccctcgat ccctctagca ttat 24

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>22

tacctggttg atgtatacag atctggtt 28

<210>23

<211>24

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>23

atccctcgat ccctctagca ttat 24

<210>24

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiolis introduced into the 5’end.

<400>24

tacctggttg atgta 15

<210>25

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 5’end.

<400>25

atccctcgat ccctc 15

<210>26

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 5’end.

<400>26

acaacgcctc cgatg 15

<210>27

<211>464

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>27

tgccacggaa agcatgttta tagtcttcca gcagcaacgc caggtgtcta ggcacagatg 60

aacccctcct taggatcccc actgctcatc atagtgccta cctttgttaa agtactagtc 120

acgcagtgtc acaaggaatg tttacttttc caaatcccca gctagaggcc agggatgggt 180

catctatttc tatatagcct gcacccagat tgtaggacag agggcatgct cggtaaatat 240

gtgttcatta actgagatta accttccctg agttttctca caccaaggtg aggaccatgt 300

ccctgtttcc atcactccct ctccttctcc tgagtatggt ggcagcgtct tactcagaaa 360

ctgtgacctg tgaggatgcc caaaagacct gccctgcagt gattgcctgt agctctccag 420

gcatcaacgg cttcccaggc aaagatgggc gtgatggcac caag 464

<210>28

<211>30

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>28

cccatctttg cctgggaagc cgttgatgcc 30

<210>29

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 5’end.

<400>29

cttggtgcca tcacg 15

<210>30

<211>15

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<223>A thiol is introduced into the 5’end.

<400>30

cttggtgaca tcacg 15

Claims

1.一种为了检测靶核苷酸序列的有用的检测靶结构的制造方法：

是包括在可获得适当延伸反应的条件下，使与位于靶核酸3’端附近的靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的引物、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，

通过该反应，获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有上述靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去上述靶核苷酸序列的区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

2.一种为了检测靶核苷酸序列的有用的检测靶结构的制造方法：

是包括在可获得适当延伸反应的条件下，使与位于靶核酸的5’端附近的靶核苷酸序列3’端以外的3’侧的序列互补、而且在3’末端含有不可延伸的修饰的终止核酸，与靶核酸的3’端附近的序列互补的引物，具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，

通过该反应，获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列的区域的靶核酸和与其互补的保护链的检测靶结构的方法。

3.一种为了检测靶核苷酸序列的有用的检测靶结构的制造方法：

是包括在可获得适当延伸反应的条件下，使与位于第1靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的第1引物，与位于第1靶核酸互补的第2靶核苷酸序列的5’端附近的第2靶核苷酸序列的3’端以外的3’侧的序列互补、而且在3’末端含有不可延伸的修饰的终止核酸，与第2靶核酸的3’端附近的序列互补的第2引物，具有核苷酸延伸活性的酶和第1以及第2靶核酸反应，

4.一种为了检测靶核苷酸序列的有用的检测靶结构的制造方法：

是包括在可获得适当延伸反应的条件下，使与位于靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的第1引物，与位于上述靶核酸的5’端附近的第2靶核苷酸序列3’端以外的3’侧的序列互补、而且在3’末端含有不可延伸的修饰的终止核酸、具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，

5.一种为了检测靶核苷酸序列的有用的检测靶结构的制造方法：

是包括在可获得适当延伸反应的条件下，使含有3’端附近的第1靶核苷酸序列、存在于第1靶核苷酸序列以外的5’侧的第2靶核苷酸序列、存在于第2靶核苷酸序列以外的5’侧的第3靶核苷酸序列、5’端附近的第4靶核苷酸序列的靶核酸中的第1、第2以及第3靶核苷酸序列的各个5’端以外的5’侧的各个序列互补的第1、第2以及第3引物，与存在于第2、第3以及第4靶核苷酸序列的3’端以外的3’侧的各个序列具有互补性、而且在3’末端含有不可延伸的修饰的第1、第2以及第3的终止核酸，具有核苷酸延伸活性的酶和上述靶核酸反应，

通过该反应，获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列的区域的靶核酸和与该靶核酸互补的保护链的检测靶结构的方法。

6.一种为了检测靶核苷酸序列的有用的检测靶结构的制造方法：具备

(1)包括在可获得的适当扩增反应的条件下，使至少含有由与位于靶核酸的3’端附近的靶核苷酸序列互补的核酸分解酶非抗性核酸构成的序列、以及由与位于上述靶核酸的5’端以外的5’侧序列互补的核酸分解酶抗性核酸构成的序列的第1引物；与上述靶核酸的5’端附近的序列具有同源性，在5’端含有核酸分解酶抗性核酸的第2引物；具有核苷酸延伸活性的酶；由该靶核酸和其互补链构成的双链核酸核酸反应，

(2)利用能够分解上述分解酶非抗性核酸的核酸分解酶对通过上述(1)的反应得到的扩增产物进行消化，

通过上述反应，获得含有单链核酸部分和双链核酸部分，在上述单链核酸部分中含有靶核苷酸序列，在上述双链核酸部分中至少含有除去靶核苷酸序列的区域的靶核酸和与该核酸互补的保护链的检测靶结构的方法。

7.一种为了检测靶核苷酸序列的有用的检测靶结构的制造方法：

包括(1)在可获得的适当扩增反应的条件下，使至少含有由与位于第1靶核酸的3’端附近的第1靶核苷酸序列互补、而且核酸分解酶抗性核酸构成的序列、以及与位于第1靶核苷酸序列5’端以外的5’侧序列互补的核酸分解酶抗性核酸构成的序列的第1引物、

至少含有与位于第2靶核酸的3’端附近的第2靶核苷酸序列互补的核酸分解酶非抗性核酸构成的序列、以及由与第2靶核苷酸序列5’端以外的5’侧的序列互补的核酸分解酶抗性核酸构成的序列的第2引物、

(2)利用核酸分解酶对通过上述(1)的反应得到的扩增产物进行消化，

8.一种检测靶核苷酸序列的方法，是具备如下工序的方法：

(1)通过使用权利要求1至7中任一项所述的方法，根据样品中的靶核酸制造检测靶结构，

(2)在可获得适当杂交的条件下，使与上述靶核苷酸序列互补的核酸探针与上述(1)制造的检测靶结构反应，

9.一种通过权利要求1至7中任一项所述的方法制造的检测靶结构。

10.一种靶核苷酸序列检测用分析试剂盒，该试剂盒为实施权利要求8所述的检测方法，具备从引物、具有核苷酸延伸活性的酶、终止核酸、核酸扩增用酶、核酸分解酶以及由权利要求9所述的检测靶结构中选择出来的至少一种构成要素。