KR19990067080A - 특정 뉴클레오티드 서열의 검출방법 및 조성물 - Google Patents

특정 뉴클레오티드 서열의 검출방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

세포 또는 조직원으로부터 정제된 특이적 핵산서열의 검출 방법 및 조성물이 제공됨. 구체적으로 말해서, 본 발명은 도면에 도해된 바와 같은 방법, 및 표적 핵산서열을 포함하는 삼본쇄 또는 이본쇄 핵산 구조와 같은 보호된 핵산서열(PNAS)을 형성하는 보호분자를 사용하는 핵산서열 검출용 조성물을 포함한다. 본 발명의 방법을 이용하는 분석은 의-양성 시그널을 최소화하기 위하여 1,2 또는 3 수준의 특이성을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법 또는 조성물을 이용하는 분석은 고 수준의 감도를 가지고 단일 시험으로 다량의 정제된 DNA에 대하여 수행될 수 있으며, 따라서 DNA 증폭과정의 필요성이 제거된다.

Description

특정 뉴클레오티드 서열의 검출방법 및 조성물
관련 출원에 관한 전후-참조
본 출원은 "Diagnostic Procedures and Process for Detection of Specific DNA Sequences"라는 제목하에, 1995년 10월 27일자에 출원된 미국 임시 특허 출원 No. 60/005, 938에 대한 우선권을 주장한 본 임시 특허 출원은 본원에서 전부 참조 문헌으로 인용된다.
다수의 표적 및 시그널 증폭 방법이 문헌에 기술되어 있으나, 어떤 것도 높은 특이성, 단순성, 및 속도의 조합을 제공하는 것으로 여겨지지는 않는다. 문헌[참조: Landegren, U., et al., Science 242 : 229-237 (1988)] 및 문헌[참조: Lewis, R., Genetic Engineering News 10 : 1, 54-55 (1990)]에서는 이들 방법에 관한 일반적인 고찰을 하고 있다. 이들 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 동일 반응계내 PCR, 라이게이즈 증폭 반응 (LAR), 라이게이즈 하이브리드화, Qβ 박테리오파아지 복제효소, 전사-기초 증폭 시스템(TAS), 전사체 서열분석과 동시에 게놈의 증폭 (GAWTS), 핵산서열-기초 증폭 (NASBA) 및 동일 반응계내 하이브리드화를 포함한다. 하기에서는 이러한 다양한 기술 중 몇가지를 기술하고 있다.
중합효소 연쇄 반응 (PCR)
PCR은 Mullis의 미국 특허 No. 4, 683, 195 및 4, 683, 202에 기술된 핵산 증폭 방법이다. PCR은 DNA 중합효소 생성된 프라이머 연장 반응의 반복 사이클로 구성된다. 표적 DNA를 열로 변성시키고 증폭하고자 하는 DNA의 반대편 본쇄 상에 표적 서열을 일괄하는 두 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화한다. 이 올리고뉴클레오티드는 DNA 중합효소와 함께 사용될 경우 프라이머가 된다. 프라이머 연장에 의해 DNA를 복제하여 두 본쇄 모두 두번째 복제본을 만든다. 열 변성, 프라이머 하이브리드화 및 확장 사이클을 반복함으로써, 약 2 내지 4 시간동안 표적 DNA를 백만 배 이상 증폭시킬 수 있다. PCR은 증폭 결과를 측정하기 위한 검출 기술과 함께 사용되어야 하는 분자 생물학 기술이다. PCR의 이점은 대략 4 시간 동안 표적 DNA를 백만 배 내지 10 억배 정도 증폭시킴으로써 감도를 증가시킬 수 있다는데 있다. 단점은 불순물 혼입이 악 양성 결과, 또는 감소된 특이성을 야기시킬 수도 있다는 데 있다.
전사-기초 증폭 시스템 (TAS)
TAS는 DNA 또는 RNA를 증폭시키기 위해 RNA 전사를 이용하며 이에 관해서는 문헌[참조: Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86 : 1173 (1989)]에서 기술하고 있다. TAS는 두 증폭 기를 이용한다. 1 기에서는, 표적에 폴리뉴클레오티드를 하이브리드화시킴으로써 앞이 돌출되고, 일본쇄인 T7 전사 프로모터를 함유한 이본쇄 cDNA를 형성한다. 이본쇄를 열로 변성시키고 T7 영역을 함유한 반대편 본쇄에 프라이머를 하이브리드화시킨다. 이 프라이머를 사용할 경우, 역 전사효소를 첨가시켜 이본쇄 (활성) T7 중합효소 결합 부위를 가진 이본쇄 cDNA를 생성한다. T7 RNA 중합효소는 이본쇄를 전사시켜 다량의 일본쇄 RNA를 생성한다.
2 기에서는, 프라이머를 새로운 RNA와 하이브리드화시키고 또다시 이본쇄 cDNA로 전환시킨다. 이본쇄를 열로 변성시키고 앞서와 같이 사이클을 계속한다. 각각의 사이클 동안 생성된 표적의 두가지 복제본에 있어 PCR 보다 TAS의 장점은, 각각의 사이클과 동시에 각 표적 분자의 10 내지 100 복제본을 생성한다는데 있다. 이는 단지 4 내지 6 사이클 동안 106배의 증폭을 달성할 수 있음을 의미한다. 그러나, 이러한 횟수의 증폭 사이클은 완료에 대략 3 내지 4시간이 요구된다. TAS의 주요 단점은 효소의 첨가 및 열 변성을 수반한 다수의 단계를 요구한다는데 있다.
전사 증폭 (3SR)
문헌[참조: Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 1874 (1990)]에서 기술한 바와 같이, 3SR로 공지된 TAS의 변형에 있어서는, 열 변성 대신 RNA/DNA 이종이본쇄 중의 RNA의 효소 분해가 이용된다. RNAse H 및 다른 효소를 반응에 첨가하고 모든 단계는 동일한 온도에서 추가적인 시약의 첨가없이 일어난다. 이러한 공정에 이어, 42℃에서 1 시간 동안 106내지 109의 증폭을 달성한다.
연결 증폭 (LAR/LAS)
연결 증폭 반응 또는 연결 증폭 시스템은 DNA 라이게이즈 및 표적 본쇄 당 2개인 총 4개의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. "Wu, D. Y. and Wallace, R. B., Genomics 4 : 560 (1989)"에서는 이 기술에 관해 기술하고 있다. 올리고뉴클레오티드를 표적 DNA 상의 이웃한 서열과 하이브리드화시키고 라이게이즈로 연결한다. 반응을 열로 변성시키고 사이클을 반복한다. LAR은 라이게이즈가 표적 DNA를 하이브리드화시키지 못할 경우 조차도 올리고뉴클레오티드를 연결시킬 수 있게 된다. 이는 높은 백그라운드를 야기시킨다. 또한, LAR은 효과적인 반응이 아니고 따라서 각 사이클동안 대략 5 시간이 요구된다. 따라서, 완성을 위해 증폭은 며칠이 경과된다.
Qβ 복제효소
문헌[참조: Lizardi et al., Bio/Technology 6 : 1197 (1988)]에 기술된 바와 같이, 이 기술에서는, 표적 DNA를 증폭시키기 위해 일본쇄 RNA를 복제하는 박테리오파아지 Qβ를 위한 RNA 복제효소를 사용한다. 우선, 표적 DNA를 T7 프로모터 및 Qβ 5' 서열 영역을 포함하는 프라이머에 하이브리드화시킨다. 이 프라이머를 사용할 경우, 역 전사효소는 공정에서 5' 말단이 프라이머와 연결된 cDNA를 제조한다. 이들 두 단계는 TAS 프로토콜과 유사하다. 생성된 이종이본쇄를 열로 변성시킨다. 다음, Qβ 3' 서열 영역을 함유한 제 2 프라이머를 사용하여 cDNA 합성의 제 2 라운드를 개시한다. 이는 활성 T7 RNA 중합효소 결합 부위뿐만 아니라 Qβ 박테리오파아지의 5' 및 3'말단 모두를 함유한 이본쇄 DNA를 생성한다. 그 다음 T7 RNA 중합효소는 이본쇄 DNA를 전사하여 Qβ를 모방한 새로운 RNA를 생성한다. 임의의 하이브리드화되지 않은 탐침을 제거하기 위한 광범위한 세척 후, 표적으로부터 새로운 RNA를 용출시키고 Qβ 복제효소로 복제한다. 후자의 반응은 대략 20분 동안 107배의 증폭을 생성한다. 반응 동안 비특이적으로 보유된 미소한 양의 탐침 RNA에 기인하여 중요한 백그라운드를 형성할 수 있다.
키론 시그널 증폭
문헌[참조: Urdea et al., Gene 61 : 253 (1987)]에 기술된 바와 같이, 키론 시스템은 상당히 복잡하다. 이는 가교 결합된 12개의 포착 올리고뉴클레오티드 탐침, 36개의 표지된 올리고뉴클레오티드, 20개의 바이오틴화된 고정 탐침을 이용하여 20개 이상의 효소-표지된 탐침을 제조한다. 다수의 세척 및 시약 첨가 단계를 요구하는 순차적인 방식으로 이런 거대한 복합체를 제조한다. 사이클이 없기 때문에 증폭은 제한된다. 탐침은 단순히 큰 네트웍을 형성한다.
임클론 시그널 증폭
임클론 기술은 키론과 유사한 네트웍 개념을 이용하지만, 접근 방식은 완전히 상이하다. 문헌[참조: Kohlbert et al., Mol. and Cell Probes 3 : 59 (1989)] 에서는 임클론 기술에 관해 기술하고 있다. 우선 임클론은 표적화된 탐침을 함유한 일본쇄 M 13 파아지 DNA와 결합한다. 이를 위해 용액 내에서 단지 한쪽 말단은 결합하고 다른쪽 말단은 자유롭게 그대로 둔채 부착된 원형 DNA를 약 5개의 추가적인 DNA 단편과 하이브리드화시킨다. 또다른 탐침 세트를 이전의 탐침 세트의 돌출 부위와 하이브리드화시킨다. 후자의 세트를 효소로 직접적으로 표지하거나 바이오틴화시킨다. 이것이 바이오틴화되면, 스트렙타비딘 효소 복합체에 의해 검출한다. 여하튼, 검출은 효소 색 반응을 통해 이루어진다. 키론법과 같이, 임클론법은 큰 네트웍의 제조에 의존한다. 반복되는 사이클이 없기 때문에, 반응은 기하학적으로 확장되지 못하고 결국 제한된 증폭이 이루어진다.
앞서 기술된 핵산 증폭법이 상대적으로 소량의 표적 핵산 분자의 검출을 허용함에도 불구하고, 보다 적은 백그라운드의 간섭하에 단기간에 걸쳐 표적 핵산 분자를 검출하는 능력이 필요하다. PCR 및 다른 증폭 기술에 근본적인 문제는 수집 기술 동안 및 앰플리콘(증폭된 표적 DNA)의 존재하에 샘플 오염과 관련이 있다. 밀접하게 관련된 서열 및 프라이머 이합체의 생성에 의해 중재되는 비특이 표적 증폭과 관련된 문제도 존재한다. 또한 특이성의 약한 조절로 인해 그릇된 양성 반응을 야기시키고, 감도의 약한 조절로 인해 그릇된 음성 반응을 야기시키기도 한다. PCR 결과는 때로 탐침 하이브리드화, 서던 블로팅 또는 동일 반응계내 하이브리드화와 같은 다른 기술에 의해 유효함을 검증받고 정당화되어진다.
또한, PCR 및 증폭 기술은 최대 1 마이크로그램의 범위에서, 매우 소량의 초기 샘플 DNA와 함께만이 사용될 수 있다. 이는 낮은 복제본 수의 핵산 표적 검출을 위한 PCR 기술의 사용을 부정하는 것이 된다. 예를 들면, 최초의 바이러스 감염 후 곧바로 행한, HIV 감염의 초기 검출은 PCR을 사용해서는 거의 불가능할 수도 있다.
따라서, 특정 핵산서열을 검출하고 분리할 수 있는 조성물, 방법 및 키트가 필요하다. 특히 낮은 복제수의 핵산 표적 서열을 검출하도록 하는 방법 및 키트가 필요하다. 또한, 유연성을 제공하고 원하는 수준의 특이성을 사용하여 핵산서열을 분리하도록 하는 방법 및 키트가 필요하다.
또한 필요한 것은 증폭 기술을 사용하지는 않지만, 임의 양, 특히 다량의 초기 핵산으로부터 특정 표적 서열의 분리를 허용하고, 원하는 특이성의 수준에 따라, 여러 수준의 특이성에서 분리를 수행하기 위해 유연성을 보유하는 방법이다.
발명의 요약
본 발명에 따라, 세포 또는 조직원으로부터 특정 핵산서열의 검출을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 좀더 특히, 본 발명은 삼본쇄 또는 이본쇄 핵산 구조와 같은 보호된 핵산서열 (PNAS)을 형성하고 표적 핵산서열을 포함하는 보호 분자를 사용하여 핵산서열의 검출을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 표적 핵산서열은 검출되는 특정 서열이다. 본 발명의 방법을 사용하는 분석은 그릇된 양성 시그널을 최소화하기 위해 1, 2 또는 3 수준의 특이성을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하는 분석은 높은 수준의 감도를 지닌 단독 시험에서 과량의 정제된 DNA 상에서 수행될 수 있는데, 이리하여 시험관 내에서의 DNA 증폭 과정에 대한 필요를 없앨 수 있다.
표적 핵산서열이 이본쇄인 경우, 보호 분자로 형성된 구조는 삼본쇄이다. 표적 핵산서열이 일본쇄인 경우, 보호 분자로 형성된 구조는 이본쇄이다. 본 명세서에서는, 삼본쇄 구조에 관해 논하고 있는데, 이는 이본쇄 구조 또는 PNA(펩티드-핵산) 및 적당한 뉴클레아제를 사용하는 구조로 치환될 수도 있다. 본 발명의 방법을 사용하는 분석을 TPA(표적 보호 분석)라고 언급될 수 있다.
초기 수준의 특이성은 관심있는 특정 표적 서열과 결합하기 위해 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드-핵산(PNA)과 같은 보호 분자를 이용한다. 후그스타인형 수소 결합의 형성에 의해 이러한 결합을 달성할 수 있다. 표적 핵산서열과 결합된 보호 분자는 보호된 핵산서열(PNAS)을 형성한다. 일단 용액 내에서 이러한 PNAS 구조를 형성하고 안정화시킨 후, 비특이성 DNA를 절단한다. 예를 들면, 엔도뉴클레아제 및 DNA 엑소뉴클레아제 III(Exo III)와 같은 이본쇄-의존 엑소뉴클레아제의 배합으로 이러한 절단을 달성한다. 이러한 예에서 사용된 엔도뉴클레아제는 서열의 각 측면에서 DNA의 대략 20개의 염기쌍을 남기고, PNAS의 양쪽 측면 모두는 절단하도록 고안되어 있다. 삼중 나선 구조는 3' 말단으로부터 DNA의 한 본쇄를 점진적으로 절단하는 엑소뉴클레아제인 Exo III를 방해한다. 배합된 뉴클레아제를 사용하여, 비보호된 DNA 서열을 완전히 절단한다. 보다 낮은 수준의 특이성과 관련된 본 발명의 방법은 포착을 위한 친화성 분자 및 보호 탐침과 함께 표지를 위한 리포터 분자를 적용할 수도 있다.
그러나, 보다 높은 수준의 특이성을 요구한다면, PNAS의 한쪽 또는 양쪽 측면 모두에 5' 측면 영역을 만들 수 있게되어 추가적인 두가지 수준의 특이성을 적용하는 분석을 가능하게 해 준다. 형성된 구조, 즉 측면 영역을 가진 PNAS를 PNAS/테일이라 명명한다. PNAS 주변의 선택적인 절단에 이어, 일본쇄 측면 영역 중 하나와 상보적인 올리고뉴클레오티드와 같은 포착 탐침을 첨가한다. 포착 탐침을 일본쇄 영역과 하이브리드화시킨다. 예를 들면, 포착 탐침은 일본쇄 영역과 결합하고 부착된 친화성 분자를 가진 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 친화성 분자는 디독시게나인 또는 바이오틴일 수 있다. 포착 탐침은 친화성 분자를 포함하고 PNAS와 결합될 수 있다.
포착 시스템을 사용하여 부착된 포착 탐침과 PNAS를 분리한다. 포착 탐침과 결합할 수 있고 혼합물로부터 친화성 분자와 PNAS/테일을 분리할 수 있는 임의의 포착 시스템이 고려되고 있다. 앞서 사용된 예에서, 이러한 포착 시스템은 디독시게나인-포착 탐침 부위와 결합하기 위한 항-디독시게나인 항체, 또는 바이오틴-포착 탐침 부위와 결합하기 위한 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드의 사용을 포함할 수 있다. 마그네틱 비드에 부착된 친화성 분자를 지닌 PNAS/테일을 비특이성 복합체로부터 분리하고 임의의 비특이성 핵산서열을 제거하기 위해 세척한다. 이러한 세척은 당해 분야에 공지된 임의의 세척 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 자기 입자 홀더를 사용할 수 있다. 또한, 이러한 수준의 특이성이 요구된다면, 본 발명은 보호 분자 또는 포착 탐침과 결합된 리포터 분자도 가지는 분석을 포함한다.
제 3 수준의 특이 검출은 표지된 리포터 탐침의 첨가와 관련된다. 리포터 탐침은 검출 가능한 표지를 포함하고 PNAS와 결합할 수 있다. 예를 들면, 탐침된 리포터는 PNAS/테일의 부분인 5' 일본쇄 테일과 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이 5' 영역은 포착 탐침과 결합하는 정반대 측면 테일일 가능성도 있고 아닐 수도 있다. 간접적인 검출을 위해 바이오틴 또는 디독시게나인, 또는 직접적으로 예를 들면, 형광, 또는 화학발광 또는 생물발광 표지와 같은 형광 리포터 분자로 표지된 것과 같이 방사능 또는 비방사능 표지처럼 당해 분야에 공지된 임의의 표지로 리포터 탐침을 표지시킬 수 있다. 과량의 리포터 탐침을 세척된 마그네틱 비드 삼중 복합체에 첨가하고 하이브리드화시킨다. 세척 후 사용된 유형의 표지에 특이적인 검출 장치를 사용함으로써 결합 표지된 리포터 탐침의 검출을 달성할 수 있다. 예를 들어, 형광 표지된 리포터 탐침을 사용한다면, 형광 분석기를 사용하거나 형광 현미경을 통해 비드를 관찰함으로써 표지된 서열을 검출할 수 있다. 대안으로, Abbott TDM 분석기와 같은 분석기로 형광 이방성에 의해 결합된 탐침의 양을 직접적으로 평가한다.
본 발명의 조성물은 본원에서 교시된 방법을 실행하기 위한 성분으로 구성된 조성물을 포함한다. 예를 들면, 친화성 분자와 함께 표지된 보호 분자로 구성된 조성물은 제 1 수준의 특이성 분석에 사용될 수 있다. 표지된 보호 분자 및 포착 탐침으로 구성된 조성물은 두가지 수준의 특이적인 분석에 사용될 수 있다. 보호 분자, 포착 탐침 및 리포터 탐침으로 구성된 조성물은 세가지 수준의 분석에 사용될 수 있다. 개개의 분자, 탐침 및 성분을 따로따로 제공할 수도 있음이 이해될 수 있다.
본 발명은 특정 유전자 서열을 검출하는데 있어 특히 유용하다. 본 발명은 매우 다량의 정제된 핵산을 프로세싱함으로써, 특정 표적 서열의 분석이 가능한 동안에는, PCR과 같은 인공적인 증폭 과정에 대한 필요성을 없애도록 하는 이점을 지닌 모든 형태에서 표적 보호 분석(TPA)과 같은 방법을 포함한다. 또한, 특이성의 3 가지 수준 - PNAS 형성, 포착 탐침의 결합, 및 리포터 탐침의 결합은 비특이성 증폭 및/또는 하이브리드화로부터 그릇된 양성 시그널과 결합된 것과 같은 기술상의 문제를 감소시킨다.
본 발명은 표적 핵산서열을 포함하는 것으로 여겨지는 샘플로부터 분리된 핵산서열을 수득하는 것을 포함하는 표적 핵산서열의 검출; PNAS를 형성하기에 충분한 하이브리드화 조건하에 보호 분자와 핵산서열과의 접촉; 및 PNAS의 검출 방법을 포함한다. 본 방법은 PNAS의 검출 단계 이전에, 하나 이상의 PNAS를 함유한 분리된 핵산을 핵산 분해 효소로 절단하여 PNAS/테일을 형성하고; 포착 분자를 PNAS/테일과 하이브리드화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 방법은 PNAS의 검출 단계 이전에, 리포터 분자와 PNAS/테일의 하이브리드화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 특정 핵산서열을 검출하는 방법은 표적 핵산서열을 함유하는 것으로 여겨지는 샘플로부터 분리된 핵산서열의 수득; PNAS를 형성하기에 충분한 하이브리드화 조건하에 보호 분자와 핵산서열의 접촉; PNAS/테일을 형성하기 위해 하나 이상의 PNAS를 함유한 분리된 핵산을 핵산 분해 효소로 절단; 포착 분자와 PNAS/테일의 하이브리드화; 및 PNAS의 검출을 포함한다.
본 발명은 특정 핵산서열과 결합할 수 있는 보호 분자로 구성된 특정 핵산서열의 검출을 위한 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 포착 분자를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 리포터 분자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 바이러스 및 사람, 동물 및 식물의 병원균과 같은 다른 미생물의 검출 및 HLA 타이핑과 같은 다형 유전자 서열의 유전자 분석에 있어 이상적이라 할 수 있겠다. 본 발명의 방법은 법의학, 친자 확인, 조직 또는 피부 이식, 또는 유전병 분석에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 특정 유전 서열을 검출하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 삼중 나선 뉴클레오티드 구조와 관련된 특정 DNA 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 이중 나선 뉴클레오티드 구조와 관련된 특정 DNA 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 이중 나선 뉴클레오티드 구조와 관련된 특정 RNA 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 구조와 관련된 특정 RNA 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 구조와 관련된 특정 DNA 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 항체와 관련된 특정 DNA 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 항체와 관련된 특정 RNA 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 방사능으로 표지된 핵산과 관련된 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 비방사능으로 표지된 핵산과 관련된 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 다양한 수준의 특이성을 지닌 특정 유전 서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 미생물의 속명 또는 종명의 결정을 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 사람 병원균의 속명 또는 종명의 결정을 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 동물 병원균의 속명 또는 종명의 결정을 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 식물 병원균의 속명 또는 종명의 결정을 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 샘플의 친자 또는 종의 동정과 같은 유전 관계의 결정을 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 이식을 위해 기관 또는 조직의 잠재적인 제공자의 결정 또는 혈액 공급의 보호를 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 법의학적 확인에 사용하기 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적은 유전병 분석을 위한 핵산서열의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 미생물 또는 다른 병원균을 검출하기 위해 체액 또는 조직액의 시험 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 이외의 다른 목적, 양태 및 이점은 명세된 양태의 하기 상세한 설명 및 첨부된 청구항의 개관 후 분명해 질 것이다.
본 발명은 핵산서열을 검출하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 좀더 특히, 본 발명은 핵산 표적 보호법을 사용하여 특정 유전자 서열의 검출을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 사람, 동물 및 식물의 전염병 진단, 혈액 생성물 분석 및 종양의 조기 검출, 법의학, 친자 확인, 조직 또는 장기 이식 및 유전병 확인과 같은 분야의 용도를 위한 유전자 분석의 경우에 있어 미생물 검출에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법의 단계를 도시하고 있다. 도 1에서 도시한 바와 같이 TPA 과정은 5가지의 개개 단계로 구성된다: DNA의 분리; 도 1에서는 삼본쇄 형성인 PNAS 형성; 엔도/엑소뉴클레아제 절단; 도 1에서는 디독시게나인인 친화성 분자를 지닌 포착 탐침의 첨가; 마그네틱 비드의 첨가에 의해 포착 탐침을 지닌 PNAS/테일의 분리; 표지(이 경우에 있어서는 표지가 FITC(플루오레신 이소티오시아네이트)임)를 지닌 리포터 탐침의 첨가 및 리포터 및 포착 탐침을 지닌 표지된 PNAS/테일의 첨가.
본 발명은 표적 핵산서열을 포함하는 보호된 핵산서열(PNAS) 구조를 형성하는 보호 분자를 사용하여 특정 표적 핵산서열의 검출 방법을 포함한다. 본 발명의 방법을 사용하는 분석은 TPA(표적 보호 분석)라 명명될 수 있다. 본 발명의 한 양태는 특정 DNA 서열의 검출 방법이다. 본 발명은 또한 특정 RNA 서열의 검출 방법도 포함한다. 본 명세서에서는, 핵산 DNA를 사용할 것이지만 RNA를 포함하는 임의의 핵산에도 본 발명의 방법이 이용될 수 있음이 이해될 것이다. 특정 뉴클레아제로 명명되는 경우, 명명된 뉴클레아제를 특정 작용을 수행할 수 있는 임의의 뉴클레아제로 치환할 수 있다.
본 발명의 방법인 표적 보호 분석(TPA)법의 단계는 표적 핵산서열에 특이적인 유일한 핵산 진단 장치에 이르도록 하는 여러 기술의 병용과 관련된다. DNA 표적 핵산을 지시하는 본 발명의 바람직한 방법은 1) DNA의 분리; 2) PNAS의 형성; 3), 비보호된 DNA의 효소적인 분해; 4) PNAS의 포착; 5) PNAS의 표지 및 6) PNAS의 검출 단계와 관련된다.
본원에서 요약된 다수의 개개 과정은 문헌에 교시되거나, 키트의 형태로 시판되는 여러 변형체와 함께, 분자 생물학의 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기술을 이용할 수 있다. 본 발명은 동일한 작용을 수행할 수 있거나 기술된 것을 대신할 수 있는 임의의 기술을 제외하고는, 특별히 명세된 기술에만 제한되지는 않는 것으로 이해해야 할 것이다. 예를 위해, TPA 과정 중의 각 단계에서는 한가지 기술에 관해 기술하고 있다. 적절한 곳에서는 적당한 대용 기술에 관해서도 주석을 달아 두었다. 그러나, 본 발명은 제한되는 것이 아니라, 다수의 다른 적당한 대용물도 본 발명의 범위 내에 포함되도록 의도될 수 있다.
본 발명은 범위 내에 DNA(일본쇄 및 이본쇄) 및 RNA(일본쇄 및 이본쇄)와 같은 핵산 표적물도 포함한다. 본 발명의 방법은 방대하게 과량인 비표적 핵산에서 매우 적은 복제본 수의 핵산 표적물의 존재를 특이적으로 검출하는데 유용하다.
본 발명의 방법은 뉴클레아제의 공격으로부터 보호 분자, 일본쇄 DNA 또는 RNA와 같은 분자 또는 펩티드 핵산(PNA)을 지닌 표적 핵산서열의 보호와 관련된다. 보호 분자를 선별하고 표적 핵산서열과 특이적으로 결합하도록 고안한다. 표적 핵산서열과 결합된 보호 분자는 구조, PNAS를 형성한다. 예를 들면, PNAS는 삼본쇄 및 이본쇄 핵산 구조, 펩티드 핵산 및 항체 관련 구조를 포함하지만, 이것에만 한정되지는 않는다.
본 발명의 방법은 용액내에서 고정 기질과 PNAS의 결합을 허용하는 친화성 분자와 결합된 보호 분자를 포함할 수 있다. 친화성 분자의 존재는 과도한 이질 핵산의 제거를 가능케 한다. 본 발명의 방법은 표적 핵산의 존재를 보여주도록 하는 리포터 분자와 추가로 관련된다.
최하 수준의 특이성을 허용하는 본 발명의 분석은 PNAS를 형성하기 위해 특정 표적 핵산서열과 보호 분자와의 결합과 관련된다. 진단 기술은 높은 특이성(그릇된 양성 반응이 거의 없음) 및 높은 감도(그릇된 음성 반응이 거의 없음)를 달성하는 경우에만 가치가 있다. 보다 높은 수준의 특이성을 제공하기 위해, 본 발명은 PNAS를 형성하기 위해 보호 분자에 의해 결합될 경우 뉴클레아제의 공격으로부터 핵산서열을 보호하고, 친화성 분자를 함유한 포착 탐침과의 하이브리드화를 위한 PNAS의 한쪽 또는 양쪽 측면상에서, 효소학적으로 제조된 하나 또는 두개의 5'DNA 테일을 제조하는 방법을 포함한다. 포착 탐침을 선별하고 테일 함유 PNAS의 테일 영역과 특이적으로 결합하도록 고안한다. 이러한 분석은 보호 분자의 두가지 수준의 특이성-결합 및 표적 핵산의 테일과 친화성 분자와의 결합을 야기시킨다. 친화성 분자는 고정 기질에 부착될 수 있도록 결합된 친화성 분자를 지닌 전 보호 구조의 부착을 허용한다. 두가지 수준의 특이성을 지닌 분석의 이러한 예에서, 당해 분야의 숙련인에게 공지된 임의 유형의 라벨로 친화성 분자 또는 보호 분자를 표지한다. 표지는 친화성 분자를 가진 PNAS의 검출을 허용한다.
보호 분자가 결합된 표적 핵산서열 이상으로 확장하는 두가지 상이한 테일 영역, 바람직하게는 표적 핵산의 각 측면 중 하나의 제조에 의해 본 발명에서 계획중인 분석을 위해 제 3 수준의 특이성을 첨가할 수 있다. 보호된 구조내에는 테일 영역이 포함되지만 보호 분자와 결합하지는 않고 이 구조는 PNAS/테일이라 명명된다. 하나의 테일 영역은 표적물을 고정된 기질(친화성 분자에 의해)에 정착시키기 위해 포착 탐침과 결합할 수 있고, 나머지 테일 영역은 핵산 표적물의 존재를 보여주기 위해 표지와 리포터 탐침을 결합시키는데 사용될 수 있다. PNAS의 테일 영역은 원하는 특이성의 수준에 따른 용도에 필수적일 수도 필수적이 아닐 수도 있다. 바람직하게는, 포착 탐침 및 리포터 탐침을 하나의 테일 또는 나머지 테일과 특이적이면서 독점적으로 결합하도록 선별하거나 고안함으로써, 두가지 탐침 각각이 PNAS/테일과 하이브리드화하도록 하게끔 할 수 있다.
특이성의 수준을 증가시킴에 따라 분석의 특이성도 증가하지만(그릇된 양성 반응이 없음), 과도한 수준의 특이성은 형성된 감도의 수준을 감소시킬 수도 있다(그릇된 음성 반응이 높음). 본 발명은 임의의 특정 핵산 표적물을 처리하고 임의의 다양한 원하는 수준의 특이성을 생성하도록 알맞게 제조될 수 있는 동적인 진단 기술인 분석을 포함한다.
핵산 분리
핵산을 당해분야의 숙련인에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 본원에 사용되는 핵산은 세포에서 발견되거나 분자생물학적 기술에 의해서 작제된 모든 형태의 DNA 및 RNA 모두를 의미한다.
사용된 DNA 분리 방법은 주로 추출될 물질의 양 및 유형에 좌우될 것이다. 실질적으로 게놈 또는 미토콘드리아 DNA, 또는 임의의 시판되는 DNA 분리 키트를 생성하는 문헌에 보고된 DNA 분리 과정으로 충분할 것이다. 본 방법은 각각의 분석에 사용 가능한 DNA 샘플 양을 시험되는 DNA의 용해도에 따라 용적이 0.1 내지 1.0 ㎖의 범위가 되도록 농축하는 것을 고려중에 있다. 보다 큰 DNA 샘플은 보다 굉장한 크기로 된 용적의 사용을 요구할 수 있다. 본 발명의 방법은 피코그램 양 내지 밀리그램 양의 샘플 핵산의 양을 시험할 수 있다. 반응 성분은 예를 들면, 성분의 하이브리드화를 위해 적당한 양이 제공되도록 조절되어야 한다. 반응 성분은 시험된 샘플의 크기 및 존재하는 표적 서열의 상대적인 수에 비례한다. 샘플 DNA의 양이 샘플의 크기 및 종류에 좌우될 것임이 이해될 수 있다.
DNA를 이중나선 또는 삼중나선 형성 올리고뉴클레오티드(DFO 또는 TFO) 또는 펩티드 핵산을 사용하여 이중 또는 삼중 구조와 같은 PNAS의 형성에 적당한 완충 용액에 배치한다. 완전 혈액, 분리된 혈액 세포, 혈청 및 혈장, 생 조직, 냉동 조직 또는 제조 조직, 및 조직 배양 세포를 포함하는 여러 공급원으로부터 고분자량 DNA의 분리에 대한 다수의 과정이 보고되고 있다.
당해분야에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 RNA도 또한 분리할 수 있다. 공표된 RNA 분리 프로토콜은 리보뉴클레아제를 변성시키고 기타 RNA 및 기타 세포 거대분자로부터 해당 RNA 유형을 분획화하는 화학적 환경에서 세포를 용해시킨다. 사용된 RNA 분리 방법은 RNA가 분리되는 세포 유형 및 RNA의 최종 용도에 의해 좌우된다.
진핵 세포로부터 모든 RNA에 대한 제조 방법이 공표되어 있고, 이러한 방법은 본원에서 참고문헌으로 인용된다. 문헌[참조: Favaloco, et al., 1997] 및 문헌[참조: Chomczynski and Sacchi, 1987]에서는, 구아니디늄 이소티오시아네이트를 사용하여 세포를 용해시킨다. 이러한 방법은 조작이 거의 없고 다수의 공급원으로부터 맑은 RNA를 수득하며 고수준의 내인성 RNAse를 갖는 조직을 위한 선택 방법이다. Palmiter, 1974의 제 3 방법에서는, 세포를 페놀과 SDS로 용해시킨다. 이는 대량의 식물 세포로부터 맑은 고분자량 RNA를 생성하고 또한 일부 포유동물 세포 및 조직에 있어서도 효과가 좋다.
원핵 세포로부터 모든 RNA를 제조하기 위해 공표된 방법은 단백질 제거를 위한 프로테아제 분해 및 유기 추출 및 DNA 제거를 위한 뉴클레아제 분해를 사용하여 그램-음성 및 그램-양성 세균으로부터 RNA를 추출하는 프로토콜 (Reddy, et al., 1990); 및 유기 추출, 프로테아제, 또는 뉴클레아제 처리없이 RNA를 이.콜라이로부터 신속하게 분리하는 단순한 프로토콜 (Summers, 1970)을 포함한다. 결국 공표된 방법 (Aviv and Leder, 1972)은 mRNA상에 유일하게 존재하는 폴리(A) 테일을 기본으로하여 mRNA를 rRNA 및 tRNA로부터 분획화할 수 있다.
PNAS 형성
핵산을 분리한 후, 본 발명의 다음 단계는 PNAS의 형성을 포함한다. 이 단계는 제 1 수준의 특이성을 분석에 도입한다. 이 단계는 표적 핵산서열에 특이적인 TFO 또는 DFO 또는 PNA를 사용하는 PNAS의 형성과 관련된다. 후에, 바람직한 양태의 예로 TFO를 사용할 것이지만, 본 발명에서는 삼중 및 이중 구조, 및 PNA도 또한 고려하고 있음이 이해될 수 있다.
TFO의 서열은 검출될 특정 표적 서열에 의해 좌우될 것이다. 가장 잘 특징화된 삼중 구조는 이본쇄 호모퓨린-호모피리미딘 나선 및 일본쇄 호모피리미딘 계통 간에 형성된 것이다. 이러한 구조의 형성은 당해분야에 익히 공지되어 있다. 본원에서 참조문헌으로 인용되는 하기의 참조문헌에서는 이러한 구조 형성의 상세한 설명에 관해 기재하고 있다. S. W. Blume, J. E. Gee, K. Shrestha, and D. M. Miller. Triple helix formation by purine-rich oligonucleotides targeted to the human dihydrofolate reductase promoter. Nucl. Acids Res. 20: 1777-1784 (1992).
삼중 나선의 제 1 유형에서, 제 3 호모피리미딘 본쇄는 후그스타인 수소 결합에 의해 왓슨-크릭 이본쇄 DNA의 호모퓨린 본쇄에 평행한 주구에 결합한다. 제 3 본쇄 타이미딘 (T)은 T:A:T 트리플릿을 형성하는 아데닌-타이민(A:T) 염기쌍을 인식하고, N-3 위치에서 양자화된 제 3 본쇄 사이토신 (C)은 C+:G:C 트리플릿을 형성하는 구아니딘-사이토신 (G-C) 염기쌍을 인식한다. 호모피리미딘 올리고뉴클레오티드는 보다 큰 이본쇄 DNA에서 상응하는 호모퓨린 부위를 갖는 국부적 삼중 나선을 형성하는 것으로 나타났다. 이와는 다른 삼중 구조는 이본쇄 호모피리미딘-호모퓨린 나선 및 일본쇄 호모퓨린 계통 (TFO)이다. 그러나, 기타 다른 삼중 구조는 두가지 기재된 구조를 병행하고 있다.
TFO의 디자인은 일반적으로는 앞서 기술된 피리미딘-퓨린-피리미딘 결합 규칙을 따르거나, 필요하다면 퓨린-퓨린-피리미딘 삼중 나선을 형성하도록 고안될 수 있다. 이러한 구조는 당해분야에 익히 공지되어 있다. 그러나, 기타 결합 모티프도 또한 예: I. 4 염기 영역에서 결합하는 Rec A 매개 TFO (용액에서 잔존하기 위해 요구되는 Rec A); II. 삼중 퓨린 및 삼중 피리미딘 삼중 나선을 적용한다. Rec A는 유사한 상동성을 가진 두 DNA 본쇄간에 재조합을 촉매하는 재조합 효소이다.
하기의 이론에 구애됨이 없이, 진단용으로 DNA의 특정 영역을 선별하기 위한 TFO 사용의 전제는 표적 서열로부터 보존된 DNA 서열을 가지고 하이브리드화 및 선택성을 보장하기에 충분한 길이의 서열을 가지는 것이 요구된다. 사람 게놈은 대략 5 x 109개의 DNA 염기쌍을 보유하고 있다. 독특한 서열을 가지기 위해서는 대략 16 내지 20개의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 요구한다. DNA 내의 인트론 서열의 존재로 인해 실제적인 개수는 아마도 좀더 적을 것이다. 보다 긴 서열은 특이성을 감소시킴에 비해 TFO 및 DNA 간의 하이브리드화를 증가시킨다.
TFO의 선별은 표적 영역 중의 폴리-퓨린/피리미딘 확장에 대한 실제적인 조사를 기본으로 하고 있다. 본 발명의 방법에서는, DNA/단백질 상호작용과 같은 여러 방해 요인이 표적 서열과 TFO의 결합을 방해하지 않도록 해야 한다. 또한, 좀더 효율적인 TFO 결합을 형성하도록 하는 온도도 제 2 구조에 영향을 미칠 수 있다. 때로는 서열이 중간 중간 혼용된 피리미딘을 함유하는 것을 제외하고는 반드시 호모퓨린 본쇄인 것은 아니다. 비록 피리미딘의 도입이 이중 나선 DNA에 대한 TFO의 친화성을 낮출 수도 있겠지만, 전체 서열은 제안된 하이브리드화 온도에서 선택적인 결합을 여전히 허용한다. 삼중 나선 구조를 형성하기 위한 조건도 또한 표적 서열에 따라 달라질 수 있으나, 차후 단계에서 사용된 뉴클레아제와 친화성이 존재해야 한다. 예를 들면, 과정의 다음 단계를 위해 선택된 엑소뉴클레아제 III(Exo III) 및 제한 엔도뉴클레아제에 의한 활성 조건을 조절할 필요가 있을 수 있다(다음 단락 참조).
삼중 나선 구조의 형성을 보조하기 위해서는, 낮은 pH 완충액 (pH 6.8-7.4)이 최적이다. 이는 또한 효소 분해 단계 동안 구조의 안정화를 돕는 작용을 한다. 당해분야에 공지된 추가적인 안정화 과정도 또한 적용될 수 있다. 예를 들면, 댜양한 상황하에 TFO가 효과가 좋은 반면, 삼중 나선 형성에 있어 유일한 두가지 기본적인 문제가 존재한다. 하나는 CT 모티프의 경우에 있어, 삼중 나선 형성을 위해 산성 pH를 요구한다는 것이다. 두번 째는 인식 서열이 올리고퓨린에 한정된다는 것이다. 첫번째 문제는 당해 분야에서 교시한 바와 같이, 화학적 변형에 의한 핵산의 변성에 의해 접근될 수 있다. J. S. Lee, L. J. Woodsworth, P. Latimer, and A. R. Morgan. Poly(pyrimidine) poly(purine) synthetic DNA's containing 5'-methylcytosine form stable triplexes at neutral pH. Nucleic Acids Res. 12: 6603-6614(1984) 참조. 이는 dC를 5-메틸-dC, C-5 프로핀 피리미딘, 6-메틸-8-옥소-2'-데옥시아데노신, 또는 2'-O-메틸슈도시스테인과 같은 변형된 염기로 대체하여 행해진다.
또다른 접근법은 표적 서열과의 상호 작용을 증가시키고 안정화시키기 위해 링커를 첨가하는 것이다. 추가적인 접근법에서 삼중 나선 구조를 형성하도록 하는 유일한 화학 그룹과 TFO도 또한 결합될 수 있다(일반적으로는 그렇지 않음). 높은 이온 농도 또는 마그네슘과 같은 양이온의 존재, 및 삼중 나선 복합체에 삽입되는 벤조피리도인돌(BPI)이라 불리는 삼중 나선 특이 리간드에 의해 삼본쇄 DNA 복합체를 안정화시킬 수 있다. 본 발명은 당해 분야에 익히 공지된 모든 방법 및 동일한 방법으로 작용하는 기타 결합 체계를 고려하고 있다.
반드시 최적은 아니지만, 보다 낮은 pH 조건은 Exo III 및 대부분의 제한 엔도뉴클레아제와 친화적이다. 또한, 이러한 조건은 차후 분해 단계를 위해 필요한 승온(37℃)에서 삼중 나선 형성을 허용한다.
하기에서는 삼중 나선 형성에 관한 예를 제공하고 있다. 10 배 이상의 과몰 TFO를 분리된 DNA(10 pmol TFO/ μg DNA)에 첨가하고 10 분 동안 삼중 나선 구조를 형성한다. DNA 및 TFO를 동량 혼합할 경우, 삼중 나선 형성의 동역학은 반감기(t1/2)가 150 내지 390 초로 특징지워진다. 반면, TFO가 DNA를 10 배 초과하는 경우에는 동역학이 훨씬 더 빨라 t1/2이 19 내지 28 초로 감소된다. 삼중 나선의 속도는 106의 속도 상수를 지닌 이중 나선 재배합 속도보다 약 3 배 정도 느리게 나타난다. 삼중 나선 형성의 속도 상수와 관련된 겉보기 활성화 에너지는 작고 음의 값(E1= 26 ± 15 kJ/mol)을 가진다. 삼중 나선 형성의 1 차 속도 상수(k-1)는 온도에 의해 좌우되고 10-7내지 10-5s-1(각각 20 ℃ 및 33 ℃)의 범위인 반면, 겉보기 활성화 에너지는 크고 양의 값(E1 = 355 ± 33 kJ/mol)이다. 삼중 나선 형성의 속도도 또한 완충 용액(17, 23, 24)의 이온 강도(I)에 좌우되어 나타나고 있다. 137 mM 에서 57 mM로의 I의 감소는 관련 상수에 있어 6 배의 감소를 야기시킨다.
DNA의 효소 분해
본 발명의 방법에서 이 단계는 PNAS로부터 상류 및 하류에 대략 적어도 20개의 염기쌍을 지닌 5'테일이 형성되도록 하게끔 해 준다. 이 테일은 포착 및 검출 단계를 위해 유용하다. 이 단계는 또한 비특이 핵산을 분해시키고 TFO, DFO 및 PNA 분자와 결합하지 못하도록 하여 잠재적인 그릇된 양성 시그널을 감소시킨다.
좀더 특히, 일단 PNAS를 형성하고 안정화시킨 다음에는, 엑소- 및 엔도뉴클레아제의 혼합을 혼합물에 첨가한다. 엔도뉴클레아제는 각 측면상의 대략 20 개(일반적으로는 이것 이상)의 염기쌍을 남기고, 표적 핵산 부위의 측부로부터 선택된 서열 특이 제한 효소이다. 표적 핵산서열이 이본쇄 DNA인 경우, 엑소뉴클레아제는 특이 탐침과 하이브리드화를 위해 입수 가능한 다량의 일본쇄 DNA를 남기고, 오직 하나의 본쇄(3' 에서 5' 또는 5' 에서 3')만을 분해하는 이본쇄 DNA 의존형이어야 한다. 바람직한 효소(및 모든 실시예에서 사용된 효소)는 Exo III이다. Exo III는 자유로운 3'-OH 말단을 지닌 이본쇄 DNA로부터 3' 에서 5'방향으로 5'-모노뉴클레오티드의 단계적인 제거를 촉매하는 28,000 돌턴의 단량체 단백질이다. Exo III는 또한 3'포스퍼타제 활성 및 RNAse H 활성도 본질적으로 함유하고 있다. 따라서, Exo III는 또한 RNA 표적 서열을 사용하는 본 발명의 방법에도 사용될 수 있다.
본 발명에서는 표 1에서 나타낸 효소를 사용할 수 있다. 본 발명은 명세된 효소에만 한정되지는 않는다.
몇몇 포유 동물 뉴클레아제의 특성
효소 기질 작용양식1 pH2 Mg1+ 반응 생성물3 분자량
DNAse I ds/ss DNA 엔도 7.1 + 5' 올리고 31 Kdal
DNAse II ds/ss DNA 엔도 4.1 - 3' 올리고 38 Kdal
DNAse III ss 이중나선 DNA 엑소 8.5 + 5' 모노디뉴클레오티드 152 Kdal
DNAse IV 이중 나선 DNA 엑소3'5' 8.5 + 5' 모노 42 Kdal
DNAse V 이중 나선DNA 엑소3'5'/5'3' 8.8 + 5' 모노 12 Kdal
DNAse VI ss DNA 엔도 9.5 + 5' 올리고 45 Kdal
DNAseVII ss 및 니킹된 ds DNA 엑소 3'5' 7.8 + 5' 모노 43 Kdal
DNAseVIII 5'ss 및 니킹됨 엑소 5'3' 9.5 + 5' 올리고 31 Kdal
Correxo ss DNA니킹된UV'd ds DNA4 엑소 3'5'/5'3' 8.0 + 5' 올리고 30-35 Kdal
리소좀 또는 비장엑소뉴클레아제 5'말단을 지닌 RNA 또는DNA 엑소 5'3' 5.5 - 3' 모노 70 Kdal
1엔도 = 엔도뉴클레올리틱. 엑소 = 엑소뉴클레올리틱2최적 pH3나타낸 올리고뉴클레오티드는 주요한 반응 산물. 올리고 = 올리고뉴클레오티드 모노 = 모노뉴클레오티드4UV 조사된 이본쇄 DNA
Exo III는 싼 가격에 다수의 공급원으로부터 시판되고 있고, 표적 DNA와 이웃한 바람직한 일본쇄 영역을 형성할 것이다. 가장 중요하게는, Exo III는 삼중 나선 구조인 이본쇄 DNA를 분해시키지 않을 것이기 때문에, 표적 서열을 지닌 PNAS를 분해로부터 보호할 것이다. 1 단위의 Exo III는 37℃에서 10 분간 50 ng의 게놈 DNA를 분해할 것이다. 엔도뉴클레아제의 주요 목적은 TFO 표적 부위와 이웃한 자유로운 이본쇄 DNA 말단을 생성하여 Exo III 엔도뉴클레아제가 샘플 DNA의 용해성을 증가시키고 완전한 분해가 비특이 상호 작용원인 비표적 DNA를 제거하도록 돕는 것이다. 몇몇 반응에서는, 핵산의 용해성을 증가시키고 시험 가능한 용액 용적을 최소화하도록 불간섭 뉴클레아제로 전처리시킬 수 있다. 이는 완전한 길이의 게놈 DNA를 분해하기 위해 요구되는 것보다 더 적은 Exo III의 사용을 허용할 것이다. 또한, 원하는 생성물을 수득하기 위해 완전한 엔도뉴클레아제도 반드시 요구되는 것은 아니다.
가장 단순한 형태에서, 본 발명의 방법은 단일한 수준의 특이성과 함께 분석 결과를 생성하는, 포착 시스템을 위한 분자 및 PNAS의 표적 동정을 위한 리포터 분자를 동시에 도입시키는 이러한 단일 보호 단계에 의해 달성될 수 있다. 비결합된 TFO 및 비특이 시그널로부터의 방해를 막기 위해 추가적인 뉴클레아제 단계가 필요할 수 있다. 특이성의 수준을 증가시키기 위해, 부가적인 올리고뉴크레오티드 탐침과 관련된 추가적인 단계를 첨가할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 탐침 - 포착 시스템
본 발명의 방법에서의 추가적인 단계는 제 2 수준의 특이성을 포함한다. 이 단계는 분해된 PNAS/테일에 대한 친화성 분자(바이오틴 또는 디그옥시게닌) 및 유도된 고체 지지체(마그네틱 비드, 마이크로타이터 플레이트 또는 막)와 복합체의 결합을 함유하는 포착 탐침의 하이브리드화와 관련된다. 이 단계는 표적 서열의 집결, 완충액 교환 및 비표적 핵산이 제거에 사용될 수 있기 때문에 보다 많은 샘플 조작이 허용된다.
포착 탐침의 서열은 뉴클레아제 분해 단계에 의해 발생된 PNAS의 측부 일본쇄 DNA 영역 중 하나와 상보적(왓슨-크릭 염기쌍)일 것이다. 예를 들면, 특정 하이브리드화를 선호하는 조건하에 10 배 이상의 과몰의 포착 탐침을 PNAS/테일에 첨가할 수 있다. 이러한 조건은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 50℃, pH 4.5에서 한 시간 동안 2.0 M NaCl, 0.2 M 아세트산 나트륨을 사용할 수 있다. 하이브리드화에 이어서, 복합체를 동일한 조건하에 추가적인 1 시간 동안 유도된 고체 지지체와 함께 배양시킨 다음, 결합하지 않은 복합체를 적당히 세척(예를 들면, 혼성화 완충액의 8 배)하여 정제할 것이다.
이 시점에서, 원한다면, 해리 완충액으로 지지체로부터 복합체를 해리할 수 있다. 이러한 조건은 당해 분야의 숙련인에게 공지되어있다. 예를 들면, pH 9에서 20 분 동안 1.0 M 트리스-HCl, 0.5 mM EDTA를 사용할 수 있다.
친화성 포착 시스템에 대한 선택은 다양하고 당해 분야에 익히 공지되어 있다. 이러한 포착 시스템은 두가지 대부분의 인용 시스템, 바이오틴(스트렙타비딘과 함께 포착) 및 디그옥시게닌(항-디그 항체로 포착된 Dig, 뵈링거-맨하임)을 포함하지만, 이것에만 한정되지는 않는다. 그러나, 임의의 다른 유사한 시스템을 사용할 수 있다.
고체 지지체의 경우, 조건은 유사하다. 유도된 막(나일론)의 사용은 문헌에서 널리 응용되고 있고, 본 발명에서 필름 노출 또는 인광체 상(방사능 또는 화학루미네센스)을 이용하여 원하는 검출 부위가 어딘지에 사용될 수 있다. 이 지지체는 또한 비방사능 색 생성 기질을 지닌 입수 가능한 효소 결합체 시스템(알칼라인 포스퍼타제[AP] 또는 홀스래디시 퍼록시다제[HRP])에서도 효과가 있다.
고체 지지체에 대한 다른 선택은 유도된 마이크로타이터 플레이트이다. 이 플레이트는 여러 원으로부터 다수의 선택에 있어 유용하다. 마이크로타이터 플레이트의 한 가지 이점은 자동화 조작(즉, 세척 단계) 및 검출 선택(방사능, U.V. 및 가시광 분광술 및 형광)을 위한 다수의 지지체 시스템의 유용성이다. 이 시스템은 상대적으로 작은 용적(100 - 200 μℓ/웰)에 제한되는 단점을 가진다.
집단적으로 빠르게 자라는 시스템에서는 유도된 마그네틱 비드(Dynal)를 사용한다. 수년간 친화성 포착 및 정제를 위해 비마그네틱 비드(일반적으로 아가로스 또는 세파로스)를 사용해 왔다. 마그네틱 비드 시스템은 본 발명의 방법에 필요한 조작을 위해 바람직한 시스템이고, 본 원의 실시예를 위해 사용된 시스템일 것이다. 이 비드는 스트렙타비딘 및 항-디그 모두에서 유도되어 입수 가능하다.
이러한 수준의 특이성을 수용할 수 있는 시점에서 분석을 완료할 수 있다. 포착된 PNAS를 검출하기 위해 포착 탐침 또는 보호 분자를 표지할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 탐침 검출
리포터 탐침을 사용하여 본 발명의 방법에 있어 제 3 수준의 특이성을 달성한다. 또한 이 시점에서 특이적인 검출 메카니즘을 도입한다. 리포터 탐침은 뉴클레아제 분해에 의해 생성된 반대편 일본쇄 말단(포착 시스템에 부착되도록 사용되지는 않음)에 상보적인 합성 일본쇄 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 이 검출 단계의 조성물은 사용된 방법에 따라 달라질 것이다. 모든 검출 방법은 포착된 PNAS상의 특정 서열과 결합할 때 특이적으로 검출되는 리포터 탐침의 존재를 요구할 것이다. 본 발명 방법을 위해서는 양성 결과로 규정지을 수 있도록 특정 탐침-복합체 상호 작용을 검출하기에 충분한 감도만이 필요하다.
올리고뉴클레오티드 탐침의 조성물은 사용된 검출 방법에 좌우될 것이다. 탐침의 직접적인 검출을 위해, 탐침은 단순히 올리고뉴클레오티드의 특정 상호 작용을 검출할 수 있는 임의의 물리적 방법에 의해 상호 작용이 검출되는 PNAS/테일 상의 특정 서열에 상보적인 특정 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 이러한 검출 기술의 예는 비결합된 탐침의 제거없이 결합된 상대적인 탐침의 양을 직접적으로 측정할 수 있는 형광 이방성법이다.
형광 이방성법의 경우, 비결합된 탐침을 제거함이 없이 상대적인 수준의 결합된 탐침을 직접적으로 측정할 수 있다. 분리를 기본으로 한 방법은 탐침의 평형 결합을 교란시켜 잘못된 결론을 유도해낼 수도 있다. 이방성 분광 광도계 측정의 용도에 있어, 크로모포어(즉, 하이브리드화 후 분자량의 변화에 기인)의 관찰 가능한 변화에 의해 자유 물질 및 결합 물질의 농도를 측정한다. 결합된 분획은 fb= (robs- rin)/(rb- rin)으로 표현될 수 있고, 여기서 fb는 결합된 분획이고, rin은 초기 이방성이며, robs는 하이브리드화 후 관찰된 이방성이며, rb는 총 결합(과량의 결합제로 소 농도의 탐침을 적정함으로서 결정)이다. 이러한 정보로, 소 분자 및 거대분자 모두에 대한 결합 동역학을 알아낼 수 있다. 이 방법론은 용액 내에서 올리고뉴클레오티드의 하이브리드화를 관찰하는데 적용되고, TPA 분석에서 사용된다.
기타 물리적인 방법은 단백질 또는 핵산이 표면과 특징적으로 상호 작용할 경우 표면의 물리적 특성에 있어서의 변화를 검출하는 이브네선트 파장 기술을 포함할 수 있다. 결합 및 자유롭게 표지된 올리고뉴클레오티드의 분리없이 특정 상호 작용을 측정할 수 있는 곳에서 사용될 수 있는 다수의 관련 물리적 방법이 존재한다.
올리고뉴클레오티드 탐침의 직접적인 검출은 표적 DNA 삼중 나선과 특이적으로 결합될 경우 시그널을 발산할 수 있는 표지로 올리고뉴클레오티드를 유도하는 PNAS/테일의 일부분 상의 5' 테일과 상보적인 특정 뉴클레오티드 서열과 관련될 수 있다. 특이성 검출을 위해, 비결합되고 직접적으로 표지된 올리고뉴클레오티드를 검출 이전에 결합된 형태로부터 분리해야 할 것이다. 올리고뉴클레오티드로 직접적으로 혼입될 수 있는 표지의 예는 섬광 또는 감마 계수 장치를 사용하여 검출된3H,14C,32P,125I와 같은 방사성 동위 원소, 형광계에 의해 검출될 수 있는 형광성 염료, 광도계로 정량될 수 있는 광을 생성하는 특정 유도 장치를 사용하여 검출 가능한 생물 발광, 화학 발광 또는 전기 화학 발광 표지를 포함한다.
핵산서열을 표지하는 다양한 유형의 표지 및 방법이 당해 분야의 숙련인에게 익히 공지되어 있다. 제 1 또는 제 2 수준의 특이성을 지닌 앞서 기술된 분석에서 다수의 이러한 표지 포맷을 사용할 수 있다. 몇몇 특정 표지 또는 리포터 그룹에 관해서는 하기에서 상술하고 있다.
예를 들면, 표지는32P,3H,14C,35S,125I, 또는131I와 같은 방사성 동위 원소로 식별 가능하지만, 이것에만 제한되지는 않는다.32P는 닉-해독, 말단-표지 또는 표지된 뉴클레오티드의 혼입에 의해 탐침 서열로 혼입될 수 있다.3H,14C 또는35S 표지는 표지된 전구체의 혼입 또는 화학적인 변형에 의해 탐침 서열로 혼입될 수 있다.125I 또는131I 표지는 화학적인 변형에 의해 탐침 서열로 혼입될 수 있다. 섬광 계산, 감마선 분광 분석 또는 방사선 사진술과 같은 방법에 의해 표지 검출을 할 수 있다.
표지는 또한 예를 들어,13C,15N 또는19O와 같은 질량 또는 핵 자기 공명(NMR)표지일 수도 있다. 질량 분광 분석법 또는 NMR에 의해 이러한 표지를 검출할 수 있다.
탐침을 표지하기 위해 염료 및 플루오로겐도 또한 사용될 수 있다. 염료의 예는 에티디움 브로마이드, 아크리딘, 프로피듐 및 기타 삽입 염료, 및 4'6'-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)(Sigma Chemical Company, 미주리 세인트 루이스) 또는 기타 특허 핵산 염료를 포함한다. 플루오로겐의 예는 형광체 및 유도체, 피코에리트린, 알로-피코시아닌, 피코시아닌, 로드아민, 텍사스 레드 또는 기타 특허 플루오로겐을 포함한다. 일반적으로는 화학적 변형에 의해 플루오로겐을 부착시킨다. 분광 광도계로 염료 표지를 검출할 수 있고 형광 검출기로 플루오로겐을 검출할 수 있다.
대안적으로는 효소 또는 친화성 표지를 제공하기 위해 크로모겐으로 탐침을 표지할 수 있다. 예를 들면, 효소 또는 플루오로겐과 같은 표지와도 결합할 수 있는 바이오틴-애비딘 반응에 이용될 수 있도록 탐침을 바이오틴화시킬 수 있다. 기질의 첨가시 크로모겐 또는 플루오로겐 반응을 제공하는 퍼록시다제, 알칼라인 포스퍼타제 또는 기타 효소로 탐침을 표지할 수 있다. 예를 들어, 5-아미노-2,3-디하이드로-1,4-프탈라진디온(LuminolTM으로도 공지되어 있음)(Sigma Chemical Company, 미주리 세인트 루이스)과 같은 첨가제 및 p-하이드록시바이페닐(p-페닐페놀로도 공지되어 있음)(Sigma Chemical Company, 미주리 세인트 루이스)과 같은 속도 증진제는 발광 반응을 통한 홀스래디시 퍼록시다제와 같은 효소를 증폭시키기 위해 사용될 수 있고; 효소 기질의 발광체 또는 플루오로겐 디옥세탄 유도체도 또한 사용될 수 있다.
제한 효소 부위와 같은 효소에 대한 인식 부위를 탐침으로 혼입시켜 검출 가능한 표지를 제공할 수도 있다. 또한 임의의 변형된 염기 또는 특정 항체에 의해 인식 가능한 화학 그룹을 함유한 변형된 염기가 혼입된 입의의 표지를 함유한 전구체를 혼입시키거나, 면역형광 또는 면역-효소 반응을 포함하는 다양한 방법에 의해 임의의 결합된 항체 복합체를 검출함으로써 표지를 만들 수 있다. 효소-결합 면역분석(ELISA)을 사용하거나, 분광 광도계에 의한 색 변화를 조사함으로써 이러한 표지를 검출할 수 있다. 당해 분야의 숙련인은 기타 리포터 그룹도 또한 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
올리고뉴클레오티드 탐침의 간접적인 검출은 다른 시제 또는 실물의 존재하에 검출 가능한 시그널을 생성하도록 야기될 수 있는 시제 또는 실물로 올리고뉴클레오티드를 유도하는 PNAS/테일 상의 특정 서열과 상보적인 특정 뉴클레오티드 서열과 관련될 수 있다. 간접적인 검출 시스템의 예는 결합 파트너에 의해 유일하게 인식될 수 있는 독특한 화학 구조를 지닌 올리고뉴클레오티드 탐침의 공유 유도화이다; 즉, 바이오틴 또는 디그옥시게닌과 같은 햅텐 표지 또는 독특한 핵산 부위 또는 아비딘, 항-디그옥시게닌, 또는 핵산 자체의 상보적인 서열을 직접 표지하고 특이적으로 결합된 표지로부터 임의의 자유 표지를 제거한 후 물리적인 방법에 의해 검출할 수 있는 핵산 관련 물질. 간접적인 표지의 다른 예는 기질을 물리적인 방법에 의해 검출될 수 있는 검출성 화합물 또는 방출 에너지로 전환시킬 수 있는 효소를 이용해 공유적으로 유도된 올리고뉴클레오티드이다. 간접적인 검출을 위해 사용 가능한 효소-기질 쌍의 예는 하기의 것이 포함된다:
1) a) 기질을 형성하는 상이한 파장에서 빛을 흡수하고; b) 특정 형광을 생성할 수 있으며; c) 발광하며; d) 검출가능한 시그널을 생성하기 위해 제 2 기질과 함께 포함될 수 있는 제 2 효소에 대한 기질이 되는 화합물에 의해 탈인산화될 경우 인산화된 화합물의 첨가에 의해 검출될 수 있는 알칼라인 포스퍼타제와 같은 포스퍼타제.
2) 퍼록시다제, 예를 들면, 홀스래디시 퍼록시다제의 반응 생성물은 적절한 화합물의 존재하에 a) 기질을 형성하는 상이한 파장에서 빛을 흡수하고; b) 특정 형광을 생성할 수 있으며; c) 발광하며; d) 검출 가능한 시그널을 생성하기 위해 제 2 기질과 함께 포함될 수 있는 제 2 효소에 대한 기질이 되는 화합물을 발생시킨다.
3) 적절한 기질 및 보조 인자의 첨가에 의해 검출될 수 있는 루시퍼라제는 빛을 생성시킨다. 대안으로, 기질이 인산의 제거 후 루시퍼라제에 의해서만 작용하는 인산화된 루시페린인 분석에서 루시퍼라제를 제 2 효소로 포함할 수 있다. 본원에서 실린 특이 효소를 제외한 기타 가수 분해 효소를 간접적인 효소 표지로 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 과량의 핵산을 포함하여, 임의 크기의 샘플로부터 단독 복제본 또는 낮은 복제본수의 핵산서열을 검출하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 분석의 뜻밖의 이점은 큰 핵산 샘플을 프로세싱하고 큰 샘플에서 복잡한 서열 혼합물의 소 성분만을 구성하는 특정 뉴클레오티드 서열을 검출하고 정량하는 능력이다.
특정 샘플 크기로부터 수득될 수 있는 표적물의 양으로 배합된 유용한 검출 시스템의 평가에 의해 감도 범위를 추측할 수 있다. 핵산 검출에 매우 민감한 시스템은 광단백질, AquaLiteR을 기본으로한 생물 발광 기술이다. 본원에서 참조 문헌으로 인용된 "Actor et al., NIH Res. 8 (10):62 (1996)"에서는 이 기술에 관해 전부 기술하고 있다. 이 시스템은 높은 시그널 : 백그라운드 잡음의 비를 가지고 하이브리드화 면역분석 기술에서 3 x 106의 특정 DNA 서열을 검출할 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 본 발명의 방법에서 사용된 2-3 디그옥시게닌 분자를 함유한 디그옥시게닌으로 표지된 리포터 탐침을 검출하기 위해 항-디그옥시게닌 항체와 결합된 AquaLiteR의 생물 발광 결합체를 사용한다. 이 시점에서, 생물 발광 단백질에 의해 생성된 최소 범위의 시그널 검출은 생성된 3 x 106시그널을 요구한다. PCR과 같은 증폭 시스템은 이러한 수준의 검출에 이르도록 선택된 서열의 증폭을요구한다. 반면에, 본 발명의 방법을 사용할 경우에는 적어도 3 x 106의 특정 서열을 함유하고 큰 샘플로부터 직접 검출하는 큰 원본 샘플을 가지고 시작할 수 있다.
제한 단계는 본 발명의 방법의 분석이 아니라, 시그널 검출 시스템이다. 보다 낮은 검출 한계를 제공하기 위해 기타 기술을 이용할 수 있다. TPA를 병용하는 시그널 증폭 시스템의 경우, 100 μℓ 정도의 소액 혈액 샘플로부터 단일 복제본 유전자 DNA 샘플을 검출할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 방법으로 HIV에 의한 최초 감염을 검출할 수 있다. TPA없이, 초기 감염 후 6 주 동안 감염자가 HIV에 대한 항체를 생성할 때까지는 HIV에 대한 최초 검출은 행해지지 않는다. TPA를 사용할 경우에는, 류코포리시스에 의해 모든 백혈구를 분리한 다음, DNA(대략 5-8 mg/전체 혈액 중 500 mL)를 추출하고, 2-3 디그옥시게닌을 지닌 표지된 리포터 탐침을 사용하는 본 발명의 방법에 의해 분석한 다음, 항-디그옥시게닌 항체와 결합된 AquaLiteR를 지닌 HIV 서열을 검출함으로써 가능한 HIV 감염 후 즉시 혈액을 시험할 수 있다. 초기 샘플에서 시그널 검출 시스템을 위한 충분한 서열이 존재하지 않더라도, 이런 큰 샘플 크기의 핵산을 지닌 TPA를 적용할 수 있기 때문에 차후 혈액 샘플을 취하고 수집할 수 있다. 이 시험 과정은 HIV감염에 대한 최초 검출을 제공할 수 있다.
본 발명은 표적 핵산서열을 함유하는 것으로 여겨지는 샘플로부터 분리된 핵산서열을 수득하는 것을 포함한 표적 핵산서열의 검출; PNAS를 형성하기에 충분한 하이브리드화 조건하에 핵산서열과 보호 분자의 접촉; 및 PNAS의 검출 방법을 포함한다. 본 방법은 PNAS의 검출 단계 이전에, PNAS/테일을 형성하기 위해 핵산 분해 효소를 지닌 하나 이상의 PNAS를 함유한 분리된 핵산의 분해; 및 포착 분자와 PNAS/테일의 하이브리드화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 방법은 PNAS의 검출 단계 이전에, PNAS/테일과 리포터 분자의 하이브리드화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 표적 핵산서열을 함유하는 것으로 여겨지는 샘플로부터 분리된 핵산서열을 수득하는 것을 포함하는 특정 핵산서열의 검출; PNAS를 형성하기에 충분한 하이브리드 조건하에 보호 분자와 핵산서열의 접촉; PNAS/테일을 형성하기 위해 핵산 분해 효소를 지닌 하나 이상의 PNAS를 함유한 분리된 핵산의 분해; 리포터 분자와 PNAS/테일의 하이브리드화; 및 PNAS의 검출 방법이 존재한다.
본 발명은 특정 핵산서열과 결합할 수 있는 보호 분자를 포함한 특정 핵산서열의 검출 조성물을 포함한다. 본 발명의 조성물은 포착 분자를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 리포터 분자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법에서의 과정 변형
앞서 논의 한 바와 같이, 본 발명의 방법은 앞서 기술된 각각의 단계 내에서 치환될 수 있는 광범위한 대안 방법을 포함한다. 전체 방법은 동일 반응계내(완전 세포 사용)에서 수행될 수 있고 현미경 또는 유동 사이토미터로 분석될 수 있다. 또한, 원하는 결과를 위해 단계 자체도 또한 변형될 수 있다. 예를 들면, 단계 2(PNAS의 형성) 및 단계 3(외부 핵산의 분해)을 한 단계로 만들 수 있다. 이는 PNAS의 형성(단계 2)에 관해 기술된 조건이 보호 탐침과 표적 서열(상기 삼중 나선 형성 동역학 참조)의 빠른 결합을 허용하기 때문에 달성될 수 있다. 보호 구조의 형성이 엑소뉴클레아제에 의한 핵산의 분해(단계 3)보다 상당히 빠르다면, 여전히 표적 서열을 지닌 보호 구조의 완전한 보호가 행해질 것이다. 대부분의 경우에 있어 요구될 수 없더라도, 단계 2 형성을 위해서는 적어도 대략 10 분의 소요 시간을 포함하게 되는데 이는 효소적인 DNA 분해보다 보호 탐침의 결합에 좀더 유리하도록 해 준다.
이 점에서, 단계 4 및 5도 또한 그 사이에 정제를 행함이 없이 하이브리드화/포착의 단일 단계화할 수 있다. 각각의 탐침은 자신의 표적 서열에만 특이적이기때문에, 그릇된 시그널을 생성하기 위한 가교 하이브리드화의 위험은 존재하지 않는다. 이에 대한 확률은 각각의 탐침이 상이한 표지(즉, Dig를 지닌 포착 대 FITC를 지닌 리포터)를 지닌다는 사실에 의해 추가로 감소된다. 하이브리드화 및 세척 과정은 각각의 단계에서 일치하기 때문에, 이 두 과정을 합치면 본 발명의 방법의 단계를 상당히 단순화시킬 수도 있다. 결국 다수의 방법 단계는 원하는 수준의 특이성에 좌우된다. 과다한 단계는 감도에 음성적인 효과를 미칠 수도 있다. 당해 분야의 숙련인은 원하는 수준의 특이성 및 이 수준에서 수행되어야 하는 분석에 관해 익히 숙지하고 있을 것이다.
본 발명의 방법은 특정 유전 서열의 검출에 특히 유용하다. 본 발명은 단일 표적 서열을 검출할 수 있는 반면, 상당히 과량인(> 1 mg) 정제된 DNA를 프로세싱하여, PCR과 같은 인공 증폭 과정의 필요성을 없애는 이점을 지닌 표적 보호 분석(TPA)과 같은 방법을 포함한다. 또한, 3가지 수준의 특이성-표적 보호, 포착 탐침, 및 리포터 탐침-은 그릇된 양성 DNA 증폭 및/또는 하이브리드화 시그널과 관련된 기술적인 문제를 과감히 감소시킨다.
본 발명의 방법은 바이러스 및 사람과 동물의 병원균과 같은 기타 미생물의 검출, 및 HLA 타이핑과 같은 다형 유전자 서열의 유전 분석을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 세포, 미생물, 동물, 식물 또는 유기체를 함유한 임의의 기타 핵산의 분류상의 목적을 위해서 사용될 수 있다. 사람, 동물, 식물 또는 기타 유기체에서 발견되는 질병의 진단을 위해서는 특정 핵산서열의 분리를 이용할 수 있다. 본 발명의 방법은 법의학, 친자 확인, 기관 또는 조직의 이식, 또는 유전병 분석에 이용될 수 있다. 미생물 핵산서열은 바이러스, 세균, 마이코플라즈마, 진균, 비로이드, 슬로우 바이러스, 및 스크래피형 유기체(이들에만 한정되지는 않음)와 같은 미생물로부터 유래된 핵산서열로 정의되고 있다.
본 발명의 방법은 핵산서열의 검출에 사용될 수 있고 따라서 다양한 용도에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법의 용도목록은 다음과 같다:
감염제의 전파를 예방하기 위한 혈액공급원의 시험
혈액, 혈액제품, 및 장기제공자 공급물에서의 감염제의 검출
감염 진행 초기에 HIV 상태의 검출
소아과 AIDS의 진단확인
유전질환의 진단
감염된 사람, 동물 및 식물의 체액 또는 조직으로부터 감염성 질환의 조기 검출
정상조직에서 종양세포의 조기검출
태아발생 중 유형 I 당뇨병의 검출
약물투여에 앞서 내약성 측정
법의학적 신원 검사
예를 들면, 본 발명의 방법은 체액으로부터 및 환경원, 예를 들면, 공기 또는 물로부터 취한 샘플내 핵산 검출에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법으로 다량의 핵산을 함유하는 샘플로부터 특정 핵산서열을 분리해낼 수 있기 때문에, 핵산원은 본원에서 교시되는 예에 국한되지는 않는다.
본 발명은 하기 실시예로 더욱 상세히 설명되며, 이로써 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다. 이와 대조적으로, 본원의 설명을 숙독한 후 본 발명의 취지 및/또는 첨부된 청구의 범위로부터 일탈함이 없이 당해분야의 숙련인에게 제안될 수 있는 각종 기타 양태, 변형, 및 이의 등가물이 가능함이 명백히 숙지된다.
실시예 1
삼본쇄 형성에 의해 매개된 PNAS에 의한 이본쇄 DNA 표적 서열을 이용한 표적 보호 분석의 일반 포맷
DNA의 분리
하기 프로토콜은 다량의 완전혈액으로부터 DNA를 신속히 분리하는 대표적인 방법이다: 정맥천자관(헤파린, ACD 또는 EDTA)에 수집한 혈액 150 ㎖를 함께 모아 500 ㎖ 원심분리병내 150 ㎖ Isoton II (Coulter Diagnostics)으로 희석한다. 30 ㎖의 10 % 트리톤 X-100을 가하고 3 초간 격렬히 혼합한다. 세포핵을 5 분간 최대속도(12,000 x g)에서 펠릿화한다. 상등액을 제거한 후, 펠릿을 10 ㎖ PK 혼합물(10 M Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.5 % 트윈 20, 0.5 % NP-40, 및 2.5 ㎎/㎖ Protease K)에 재현탁시키고, 55 ℃에서 15 분간, 95 ℃에서 10 분간(프로테아제 K를 불활성화하기 위해) 배양한 다음, 실온으로 서냉한다. 이어서 샘플을 원심분리관으로 옮긴다음 12,000 x g에서 10 분간 회전시킨다. 상등액을 회수하고 DNA를 10 M 암모늄 아세테이트 0.2 용적 및 에탄올 2 용적을 가하여 펠릿화한다. 침전된 DNA를 5,000 x g에서 10 분간 펠릿화하고, 70 % 에탄올로 2 회 세척한 다음 멸균수 0.5 ㎖에 재현탁시킨다. 펠릿의 완전한 용해를 이루기 위해서는 온화한 음파처리 또는 전단이 요구될 수도 있다. 대략 1 ㎎이 전체 게놈 DNA가 150 ㎖의 완전혈액(대략 150 x 106핵형성 세포)으로부터 회수된다. 어떠한 RNA 예비기술도 사용될 수 있다.
삼본쇄 형성에 의해 매개된 PNAS의 형성
수중 0.5 ㎖ DNA 샘플에 50 ㎕ 10 x TFO 완충액(0.25 M Tris-아세테이트, pH 7.0, 0.5 M NaCl, 100 mM MgCl2, 50 mM-머캅토에탄올, 0.10 ㎎/㎖ BSA, 및 40 mM 스퍼민-HCl)을 가하고, 이어서 특이적 TFO 10 nmol을 가한다. 안정한 PNAS 형성에 충분한 시간 및 온도에서, 예를 들면 37 ℃에서 10 분간, 후속 단계에 앞서 배양한다.
효소분해
각각의 제한효소 500 단위(대부분의 경우 50 ㎕) 및 Exo III 4,000 단위(100,000μ/㎖ 스톡 40 ㎕)를 가한다. 37 ℃에서 추가로 50 분간 반응물을 배양한 다음, 생화학적 또는 생물학적 방법으로 효소를 불활성화시킨다. 샘플은 절차 중의 후속단계에 바로 사용될 준비가 된다.
포착 시스템
분해된 DNA 혼합물에, 10 nmol의 Dig 표지된 포착 탐침 및 0.5 ㎖ 2.5 x 하이브리드화 완충액(5.0 M NaCl, 0.5 M NcOAc, pH 4.5)을 가한다. 혼합물을 안정한 하이브리드화 복합체 형성에 충분한 시간, 예를 들면 1 시간 동안 배양하고 나서, 100 ㎕의 항-Dig 코팅된 마그네틱 비드를 가하고, 세척한 다음 하이브리드화 완충액에 재현탁시킨다. 추가로 1 시간 더 배양한 후, 마그네틱 입자 농축기를 사용하여 비드를 분리해내고 0.5 ㎖ 하이브리드화 완충액으로 8 회 세척한다. 이렇게 하여 샘플은 DNA 삼본쇄 TPA 과정의 최종단계에 사용될 준비가 된다.
FITC 표지된 리포터 탐침을 사용하고 형광이방성을 이용하여 검출을 수행한다. 하이브리드화 완충액내 리포터 탐침 10 nmol을 함유하는 1.0 ㎖ 용액의 초기 이방성을 측정한 후, 세척한 마그네틱 비드에 가한다. 혼합물을 부드럽게 흔들면서 1 시간 동안 50 ℃에서 배양한 다음, 전 내용물을 애보트 TDM 샘플 바이얼로 옮긴다. 이어서 이방성을 측정하여 분석을 위해 초기값과 비교한다. 결합된 분획은 fb= (robs- rin)/(rb-rin)으로 나타낼 수 있으며, 여기에서 fb는 결합된 분획이고, fin은 초기 이방성이며, fob는 하이브리드화 후 관찰된 이방성이며, fb는 전체 결합이다(과량의 결합제로 적은 농도의 탐침을 적정함으로써 측정).
실시예 2
HIV
사람 면역결핍 바이러스 유형 1 (HIV-1)는 AIDS의 두 병원체 중 하나이다. 현재로는, 항-HIV 항체의 존재를 검출하는 혈청학적 분석이 혈액 및 혈액제품의 스크리닝에 사용되고 있다. 일반적으로 신뢰할만 하지만, 이러한 시험들은 교차반응성 항체에 연유한 오류적인 양성 결과 또는 감염이 측정가능한 면역반응의 개시 전 초기단계에 있는 경우 오류적인 음성 결과를 종종 불러온다. 후자의 경우에 있어서, TPA(표적 검출 분석법, 본 발명의 방법)와 같은 대체방법이 특히 유용할 수 있는데, 그 이유는 다량의 샘플 DNA가 프로세싱될 수 있고 단일분석 튜브에서 시험될 수 있기 때문이다. 민감한 세포주와의 동시배양법을 이용하는 바이러스에 대한 직접 분석법이 존재하기는 하지만, 이러한 방법은 노동 집약적이고 종료하는 데는 수일이 소요된다. 하기의 실시예는 최악의 경우에 대한 다량의 혈액의 추출방법을 기술할 것이다.
1. 실시예 1에서 전술한 바와 같이 150 ㎖ 완전혈액(150 x 106백혈구)로부터 DNA 추출,
정제된 DNA를 0.5 ㎖ 물에 재현탁
2. 50 ㎕ 10 x TFO 완충액 및 10 nmol TFO 첨가:
HIV-1 TFO:
5′- TTT TCT TTT CCC CCC T-3′
3. 37 ℃에서 10 분 배양
4. 500 단위 Sau 3A 및 4,000 단위 Exo III 첨가
5. 37 ℃에서 50 분, 이어서 60 ℃에서 20 분 배양
6. 0.5 ㎖ 2.5 x 하이브리드화 완충액 및 10 nmol의 Dig 표지된 포착 탐침 첨가:
HIV-1 포착 탐침:
5′-ACT GCC ATT TGT ACT GCT GT-Dig-3′
7. 50 ℃에서 1 시간 배양
8. 100 ㎕ 세척된 Dig 코팅된 마그네틱 비드 첨가
9. 교반하에 50 ℃에서 1 시간 배양
10. 마그네틱 농축기에 튜브 배치 및 액체 제거
11. 0.5 ㎖ 하이브리드화 완충액으로 8 회 세척
12. 형광 이방성에 대해 사전에 측정된 10 nmol 리포터 탐침을 함유하는 1.0 ㎖ 하이브리드화 완충액에 비드 재현탁:
HIV-1 리포터 탐침:
5′-GAA TAG TAG ACA TAA TAG TA-FITC-3′
13. 50 ℃에서 1 시간 배양
14. 이방성 재측정 및 상기 공식에 의해 결합탐침(fb)의 분획 분석
이와 달리, 단계 13 후에 비드를 마그네틱 입자 농축기로 재정제하고, 하이브리드화 완충액으로 8 회 세척한 다음, 직접 형광 측정(-exc= 490 nm, -em= 520 nm)을 위해 형광측정기에 넣거나, 비드를 형광 현미경 상에서 관찰하기 위하여 슬라이드 상에 놓을 수 있다.
실시예 3
보렐리아 버그도페리(Borrelia bergdorferi)
스피로헤타 보렐리아 버그도페리는 라임(Lyme)병의 병원체이다. 이러한 병원체는 주로 감염된 진드기에 물려 전파되어, 관절염, 신경학적, 및 류마티스성 증상을 일으키며, 임상학적 진단을 곤란하게 한다. 이러한 병원체에 대한 주된 시험은 혈청학 및 세균 배양이고, 이들 모두는 특히 질병의 초기 단계에서는 민감도에 있어 비교적 낮다. 시험물질원에는 완전혈액, 혈청, 관절액, 뇌척수액, 및 뇨가 포함된다. 하기의 절차는 완전혈액 30 ㎖에 대한 것이다:
1. 실시예 1에서 전술한 바와 같이 150 ㎖ 완전혈액(150 x 106백혈구)로부터 DNA 추출,
정제된 DNA를 0.5 ㎖ 물에 재현탁
2. 50 ㎕ 10 x TFO 완충액 및 2 nmol TFO 첨가:
TFO: 5′- TCC GCC TTT TGT TGT TTT TC-3′
3. 37 ℃에서 10 분 배양
4. 100 단위 Ssp I, 100 단위 XhoI, 및 800 단위 Exo III 첨가
5. 37 ℃에서 50 분, 이어서 60 ℃에서 20 분 배양
6. 0.5 ㎖ 2.5 x 하이브리드화 완충액 및 2 nmol의 Dig 표지된 포착 탐침 첨가:
포착 탐침:
5′-CCA GGC AAA TCT ACT GAA ACG CTG-Dig-3′
7. 50 ℃에서 1 시간 배양
8. 20 ㎕ 세척된 Dig 코팅된 마그네틱 비드 첨가
9. 교반하에 50 ℃에서 1 시간 배양
10. 마그네틱 농축기에 튜브 배치 및 액체 제거
11. 0.5 ㎖ 하이브리드화 완충액으로 8 회 세척
12. 형광 이방성에 대해 사전에 측정된 2 nmol 리포터 탐침을 함유하는 1.0 ㎖ 하이브리드화 완충액에 비드 재현탁:
리포터 탐침:
5′-TAG ACA AGC TTG AGC TTA AAG-FITC-3′
13. 50 ℃에서 1 시간 배양
14. 이방성 재측정 및 상기 공식에 의해 결합탐침(fb)의 분획 분석
이와 달리, 단계 13 후에 비드를 마그네틱 입자 농축기로 재정제하고, 하이브리드화 완충액으로 8 회 세척한 다음, 직접 형광 측정(-exc= 490 nm, -em= 520 nm)을 위해 형광측정기에 넣거나, 비드를 형광 현미경 상에서 관찰하기 위하여 슬라이드 상에 놓을 수 있다.
실시예 4
보렐리아 더마타이티디스(B. dermatitidis)
보렐리아 더마타이티디스는 특히 면역타협된 환자(예를 들면, 조직 이식 수용자)에서 감염사례가 증가일로에 있는 진균 병원체 계통을 대표한다. 진균 병원체에 대한 현재의 시험으로는 혈청학 및 배양이 포함되며, 이러한 방법은 비교적 느리고 무감각하다. DNA 기본 시험(비-PCR)도 보고되어 있지만, 시험전에 병원체의 초기 배양을 요한다. 이러한 병원체에 대한 TPA 절차는 하기의 변형을 제외하고는 선행 실시예와 동일하다: DNA를 0.3 g 습윤 효모 또는 균사 형태로부터 Lee와 Taylor의 방법(39)에 의해 분리해낸다. 삼본쇄 형성단계에서 서열 5′-TTC CTC CGT CGT CCG CGC-3′의 TFO 1 nmol을 사용한다. 100 단위의 Rsa I 및 Msp I, 및 800 단위의 Exo III를 분해단계에 사용한다. 서열 5′-GGT AGC CGT TTC TCA GGC TCC TC-Dig- 3′의 Dig 표지된 포착 탐침 1 nmol, 및 포착을 위한 50 ㎕의 Dig 코팅된 마그네틱 비드를 사용한다. 최종적으로, 서열 5′-GAG GTA GTG ACA ATA AAT ACT GAT-FITC-3′의 리포터 탐침 1 nmol을 검출단계에 사용한다.
실시예 5
바베시아 마이크로타이(Babesia microti)
바베시아 마이크로타이는 사람을 감염시키는 진드기 전파성 원생동물 병원체이며 주로 미국에서 발견되고 있다. 이는 뉴 잉글랜드 해안에서 발병한 낸터켓(Nantucket) 열과 관련된 주 병원체이다. 진단은 주로 항-바베시아 마이크로타이 항체의 혈청학적 검출 또는 적혈구내 봉입체의 가시화에 기초하고 있다. 이러한 병원체에 대한 TPA 절차는 하기 변형을 제외하고는 상기 실시예와 동일하다:
1. 30 ㎖ 완전혈액으로부터 DNA 추출 및 0.5 ㎖ 물에 재현탁
2. 적절한 단계에서 각각의 탐침 2 nmol 사용
TFO;
5′-GGG GCG ACG ACG GGT GAC GGG G-3′
포착:
5′-TCT GAC CTA TCA GCT TTG GAC GGT-Dig-5′
리포터:
5′-TAG ATG TGG TAG CCG TTT CTC AGG- FITC-3′
3. 100 단위의 Xho I 및 Mun I + 800 단위의 Exo III를 분해에 사용한다.
실시예 6
메티실린 내성 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)
약물투여 후 곧 이어서 임상학적 사용을 위해 스태필로코커스 아우레우스의 메티실린 내성 균주를 분리해낸다. 내성균주는 -락탐 항생물질에 대해 낮은 친화성을 갖는 페니실린-결합 단백질을 생성하며, 따라서 병원균이 내성을 띠게 된다. 이러한 단백질은 TPA 검출을 위한 표적인 획득 유전자, 즉 mecA에 의해 생성된다(45). DNA를 Cassiday 등의 방법(46)에 의해 감도 디스크 한천(Nissui) 상에서 생장하는 세균 콜로니로부터, 또는 전술한 바와 같이 혈액 또는 혈청으로부터 직접 분리한다. 하기의 변형이 스태필로코커스 아우레우스의 내약형에 대한 전술한 TPA 절차에 사용될 것이다.
1. 30 ㎖ 완전혈액으로부터 DNA 추출 및 0.5 ㎖ 물에 재현탁
2. 적절한 단계에서 각각의 탐침 2 nmol 사용
TFO;
5′-CCA TTT TTC CCT GAG CTT TTT-3′
포착:
5′-TAA TTC TTC AGA GTT AAT GGG A-Dig-5′
리포터:
5′-AAC ATG AAG ATG GCT ATC GTG TC-FITC-3′
3. 100 단위의 Sal I 및 Mnl I + 800 단위의 Exo III를 분해에 사용한다.
실시예 7
분석의 병행
표적 핵산 및 보호분자의 조합 리스트를 하기에 나타내었다. 본 발명은 이들 실시예에 국한되지는 않으며 기타 조합도 당해분야의 전문가에 의해 사용될 수 있다.
표적핵산 보호분자
ss DNA ss DNA
가교결합제를 갖는 ss DNA
상동성 염기/비-가교결합제를 갖는 제한부위를 포괄하는 ss DNA
가교결합제 및 5′비-상동성 테일이 달린 ss DNA
가교결합제를 갖는 ss RNA
표적의 한 쪽에 비-상동성 RNA 테일을 갖는 ss RNA
가교결합제를 갖는 ss RNA
ss RNA
하이브리드에 대한 ss RNA +항체
비-상보성 RNA 테일(표적서열의 일측 또는 양측)이 달린 ss RNA1
표적의 3′측에 비-상보성 RNA 테일이 달린 ss RNA1
표적핵산 보호분자
ss DNA 표적의 5′측에 비-상보성 RNA 테일이 달린 ss RNA1
플랭킹 영역 너머로 뻗어있고 제한부위를 포괄하는 ss DNA3
표적부위와 상동인 ss DNA3
표적과 상보성인 ss DNA
비-상보성 DNA 테일(표적서열의 일측 또는 양측)이 달린 ss RNA1
표적의 3′측에 비-상보성 DNA 테일이 달린 ss RNA1
표적의 5′측에 비-상보성 DNA 테일이 달린 ss RNA
비-상동성 RNA 테일(표적서열의 일측 또는 양측)이 달린 ss DNA
표적의 3′측에 비-상보성 RNA 테일이 달린 ss DNA
표적의 5′측에 비-상보성 RNA 테일이 달린 ss DNA
비-상보성 5′DNA 테일이 달린 ss DNA
ss RNA + DNA
표적핵산 보호분자
ss DNA 비-상보성 RNA 테일, 5′측 표적이 달린 ss RNA1
TFO와만 특이성인 ss DNA 표적
비-상보성 5′테일이 달린 ss DNA2
하이브리드에 대하여 표적 + 항체의 양측에 비-상보성 RNA 테일이 달린 ss RNA
표적 양측에 비-상보성 RNA 테일이 달린 ss RNA
비-상보성 5′ 테일이 달린 ss RNA2
비-상보성 5′DNA 테일이 달린 ss RNA
ds DNA TFO DNA 또는 RNA
PNA
비-상보성 5′DNA 테일이 달린 PNA
서열 특이성 단백질
ss RNA PNA
DNA/RNA 하이브리드에 대한 ss DNA + 항체
ss RNA3
ss DNA3
가교결합제를 갖는 ss DNA
가교결합제를 갖는 ss DNA
ss RNA 서열 특이성 단백질
ds RNA TFO(RNA)
TFO(DNA)
PNA
1. DNA/RNA 하이브리드에 대한 +항체를 결합보조에 사용할 수 있다.2. pH 및 이온강도에 의해 보조된 결합3. PNA가 또한 첨가될 수 있음
친화성 분자의 위치
ss DNA 탐침 상
ss DNA 상
업스트림 5′DNA(표적핵산) 테일과 상동인 올리고 상
5′ 탐침(보호탐침) 테일과 상동인 올리고 상
ss RNA 탐침 상
ss RNA 상
생성된 5′ DNA(표적핵산) 테일과 상동인 올리고 상
RNA(보호탐침) 테일과 상동인 올리고 상
RNA 테일과 상동인 올리고 상
ss RNA 가교결합된 탐침 상
항체 상
포착 시스템에 사용된 항체 상
하이브리드 보호 구조에 대한 항체 상
PNA(펩티드-핵산) 상
TFO(삼본쇄 형성 올리고) 상
표적의 5′플랭킹 영역과 상보적인 올리고 상
TFO(삼본쇄 형성 올리고) 상
표적의 5′ 플랭킹 영역과 상보적인 올리고 상
5′ DNA 탐침 테일과 상보적인 올리고 상
표적의 5′플랭킹 영역과 상보적인 올리고 상
PNA에 결합된 올리고 상
TFO(DNA/RNA)에 결합된 올리고 상
서열 특이성 단백질 상
리포터 분자의 위치
ss DNA 탐침 상
ss DNA 상
다운스트림 5′ DNA 테일과 상동인 올리고 상
업스트림 5′ DNA 테일과 상동인 올리고 상
생성된 5′ DNA 테일과 상동인 올리고 상
5′ 탐침 테일과 상동인 올리고 상
ss RNA 상
ss RNA 탐침 상
RNA 테일(탐침)과 상동인 올리고 상
ss RNA 가교결합된 탐침 상
항체 상
포착 시스템에 사용된 항체 상
하이브리드 보호 구조에 대한 항체 상
PNA(단백질-핵산) 상
TFO(삼본쇄 형성 올리고) 상
표적의 5′플랭킹 영역에 상보적인 올리고 상
5′ DNA 탐침 테일에 상보적인 올리고 상
표적의 5′플랭킹 영역에 상보적인 올리고 상
PNA에 결합된 올리고 상
TFO에 결합된 올리고 상
서열 특이성 단백질 상
DNA/RNA의 하이브리드 보호구조에 대한 항체, RNA 보호탐침과의 DNA 표적 또는 DNA 보호 탐침과의 RNA 표적이 포착 시스템으로 사용될 수 있다.
펩티드 핵산(PNA)가 제 2 하이브리드화 단계에 사용될 수 있다.
삼본쇄 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)가 제 2 하이브리드화 단계에 사용될 수 있다.
물론, 전술한 기술내용은 단지 본 발명의 바람직한 양태에 관한 것이고 첨부된 청구의 범위에 기재되어 있는 바와 같이 본 발명의 취지 및 범위로부터 일탈함이 없이 다양하게 변형 또는 변경시킬 수 있음이 숙지된다.

Claims (18)

  1. (a) 표적 핵산서열을 함유하는 것으로 추정된 샘플로부터 분리된 핵산서열을 수득하고;
    (b) 보호분자를 PNAS 형성에 충분한 하이브리드화 조건하에서 핵산서열과 접촉시킨 다음;
    (c) PNAS를 검출해내는 단계로 이루어진, 표적 핵산서열의 검출방법.
  2. 제 1 항에 있어서, PNAS 검출단계에 앞서, (a) 하나 이상의 PNAS를 함유하는 분리된 핵산을 핵분해효소로 분해시켜 PNAS/테일을 형성시킨 다음;
    (b) 포착분자를 PNAS/테일과 하이브리드화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, PNAS 검출단계에 앞서, a) 리포터 분자를 PNAS/테일과 하이브리드화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, PNAS가 삼본쇄 구조를 포함하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, PNAS가 이본쇄 구조를 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, PNAS가 단백질을 포함하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 표적 핵산서열이 미생물 핵산을 포함하는 방법.
  8. 제 2 항에 있어서, 표적 핵산서열이 미생물 핵산을 포함하는 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 표적 핵산서열이 미생물 핵산을 포함하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 미생물 핵산이 바이러스 핵산을 포함하는 방법.
  11. 제 8 항에 있어서, 미생물 핵산이 바이러스 핵산을 포함하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 미생물 핵산이 바이러스 핵산을 포함하는 방법.
  13. (a) 표적 핵산서열을 함유하는 것으로 추정된 샘플로부터 분리된 핵산서열을 수득하고;
    (b) 보호분자를 PNAS 형성에 충분한 하이브리드화 조건하에서 핵산서열과 접촉시키며;
    (c) 하나 이상의 PNAS를 함유하는 분리된 핵산을 핵분해효소로 분해시켜 PNAS/테일을 형성시키며;
    (d) 포착분자를 PNAS/테일과 하이브리드화시키며;
    (e) 리포터 분자를 PNAS/테일과 하이브리드화시킨 다음;
    (f) PNAS를 검출해내는 단계로 이루어진 특정 핵산서열의 검출방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 표적 핵산서열이 미생물 핵산을 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 미생물 핵산이 바이러스 핵산을 포함하는 방법.
  16. 특정 핵산서열과 결합할 수 있는 보호분자를 포함하는, 특정 핵산서열 검출용 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 포착분자를 추가로 포함하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 리포터 분자를 추가로 포함하는 조성물.
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