JP2002509436A - メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法 - Google Patents
メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を決定するための組成物および方法が提供され、これには以下の一般的工程が包含される：(a)生物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的１本鎖核酸分子を露出する工程；(b)標的１本鎖核酸と、抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的である、切断されやすい(scissile)結合を含む核酸と、２本鎖の標的-プローブ複合体を切断する酵素とを、標的およびプローブが、２本鎖の標的−プローブ複合体を形成させるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる条件下で反応させる工程であって、この酵素分子は、１つ以上の核酸プローブのフラグメントが上記の複合体から放出されるように標的−プローブ複合体の切断されやすい結合を切断し得る、工程；および(c)上記の核酸プローブから放出された、検出するプローブのフラグメントの切断された部分が生成されるか否かを決定する工程であって、それによって、抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出する工程。
Description
【発明の詳細な説明】
メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法
技術分野
本発明は、一般的に医学的診断に関し、そしてより詳細には、メチシリン耐性
ブドウ球菌のmecA遺伝子を検出するための方法、プローブおよびプライマーに関
する。
発明の背景
Staphylococcus aureus(MRSA)によるメチシリンに対する耐性は、急速に全世
界に伝播した、極めて毒性の抗生物質耐性形態のStaphylococcus aureusである
。MRSAは、多くの病院で一般的に見出されており、１％未満から80％超の範囲で
蔓延している(PittetおよびWaldvogel、Q.J.Med.239-241,1997)。不運なことに
、もはや、MRSAは、病院に関連した病原体であると見なされるだけではない。な
ぜなら、共同体で獲得されるMRSAもまた増加しつつあるからである。
メチシリン耐性Staphylococcus aureusは、通常のペニシリン結合タンパク質(
PBP)に加えて、PBP2aまたはPBP2'と呼ばれる、低親和性PBPの発現によって引き
起こされる(HartmanおよびTomasz、J.Bacteriol.158:513-516；1984；Murakami
およびTomasz、J.Bacteriol.171:874-879；1989)。PBP2'をコードする応答性mec
A遺伝子(mecA)は、耐性株において存在するが、PBPに感受性ではなく(Hartmanお
よびTomasz、J.Bacteriol.158:513-516；1984；Matsuhashiら、J.Bacteriol.167
.975-980；1986)、株間にわずかな配列変動があるに過ぎない(Ryffelら、Gene94
:137-138,1990)。mecA遺伝子を有するMRSA株はまた、アミノグリコシド系、マク
ロライド系、キノロン系、β-ラクタム系、モノバクタム、イミペネム、メロペ
ネムのような他の抗生物質に対する耐性を示す傾向がある(Mapleら、LancetI：5
37-540、1989；Kayser、Chemotherapy 42(増補２)：2-12；Bowler、Q.J.Med.90:
243-246,1997に引用されるChambersら)。
いくつかのS.aureus株は、mecA遺伝子の発現について不均一性を示し得る(Har
tmanら、Antimicrob.Agents Chemother.29:85-92,1986;Hiramatsuら,Microblol.
Immunol.36:445-453,1992;Ryffelら、Antimicrob.Agents Chemother.38:724-728
,1994)。これらの集団内においては、全ての細胞がmecAを有するが、大部分の細
胞は、低濃度の抗生物質に感受性であり、わずかな細胞が(105〜106に１つ)、耐
性を発現するに過ぎない(Hackbarthら、Antimicrob.Agents Chemother.33:991-9
94,1989；Ryffelら、Antimicrob.Agents Chemother.38:724-728,1994)。結論と
して、これらの株は、低MICを示し、そしてメチシリン感受性であると間違って
特徴付けられ得る。逆に、いくつかのmecA遺伝子を欠失するS.aureus株は、耐性
の機構を交替することに起因して、メチシリンに対して境界型または低レベルの
耐性を示し得る(Chambersら、Antimicrob.Agents Chemother.33:424-428,1989；
Hiramatsuら、前出)。過剰なβ-ラクタマーゼ産生、メチシリナーゼ産生、また
は改変されたBPBの合成(Knappら、J.Clin.Microbiol.34:1603-1605,1996；McDou
galら、J.Clin.Microbiol.23:832-839,1986；Tomazsら、Antimicrob.Agents Che
mother.33:1869-1874,1989)に起因して、低レベルのメチシリン耐性は、従来の
感受性試験によってMRSAであると間違って診断され得る。
メチシリン耐性Staphylococcus(MRS)種の伝播の予防および処置のための迅速
な検出は、ともに、全世界の優先事項になっている。MRSを検出するための診断
分野には、多くの利用可能な技術が存在し、これらには、従来の生化学的試験お
よび免疫学的試験が挙げられる。例えば、MRSの検出のために受け入れられた１
つの方法は、４％ NaClおよび６μg/mlのオキサシリンを含有するMueller-Hinto
n寒天における単離物についてのスクリーニングである。今や、多くの研究機関
が、Microscan API(Dade)およびVitek GPS-SAカード(bioMerieux,Hazlewood,MO)
のような自動化スクリーニング系を使用している。これは、24時間以内に感受性
ockeysville,MD)は、４〜６時間後の診断を可能にする、より迅速な感受性試験
である(Walletら、J.Antimicrobiol.Chemother.37:901-909；Martlnezら、Rev.E
sp.Quimioterap.9:130-133,1996)。しかし、感受性試験は、不均質のMRSAと境界
型オキサシリン耐性S.aureusとの間では信頼できる区別をまったくすることがで
きない(BORSA、Knappら、前出；Lencastreら、Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Di
s.12:S13-S18)。
多くのこれら技術はまた、検出の時間、特異性および感受性の欠如に関する欠
点を有する。このような論点に注意を向けるために、ポリメラーゼ連鎖反応(「P
CR」)を利用するmecA遺伝子の検出がまた、試みられてきた。簡潔には、PCRは、
mecA遺伝子を検出するためのいくつかの研究において用いられてきたが、この方
法を使用する試験結果は高価であり、かつ６時間を要し得る(Walletら、前出)。
さらに、このような方法と関連した多くの問題が存在し、これらには、バックグ
ラウンド夾雑、持ち越し夾雑(carry over contamination)、サーモサイクリング
、特定の部屋が必要であること、必要なプライマーおよびプローブの数を考慮す
る扱いにくさ、サンプルプロセシングに関与する工程の数および時間、ならびに
必要とされる特別の訓練が挙げられる。その高感受性および多重適用に起因して
分子生物学分野においてPCRが広範に使用されているにも関わらず、FDA認可PCR
または他の標的増幅ベースの診断製品が、わずかに存在するに過ぎない。診療診
断設定におけるこれらの技術の使用を制限する主な因子は、アンプリコン夾雑と
いう本質的な問題である。夾雑の問題を低減するかまたは排除するために開発さ
れた化学的または物理学的方法がいくつか存在する。一般的に、これらの方法は
、余分な工程が加えられ、かつ高価である。
上記の方法を使用してMRSAを検出し得るが、院内外の設置においてmecA遺伝子
を検出するための、迅速で、使いやすく、かつ信頼できる方法の差し迫った必要
性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たすmecA遺伝子を検出するための
プローブ、プライマー、および方法を提供する。さらに、本発明は、他の関連す
る利点を提供する。
発明の要旨
簡潔に述べると、本発明は、メチシリン耐性ブドウ球菌のmecA遺伝子を検出す
るための組成物および方法を提供する。
本発明の１つの局面において、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺
伝子の存在を決定するための方法が提供され、これには以下の工程が包含される
：(a)生物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的１本鎖核酸分子を
露出する工程、(b)標的１本鎖核酸と、抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的
である、切断されやすい(scissile)結合を含む核酸プローブと、２本鎖の標的-
プローブ複合体を切断する酵素とを、標的およびプローブが、２本鎖の標的-プ
ローブ複合体を形成させるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる
条件下で反応させる工程であって、この酵素分子は、１つ以上の核酸プローブの
フラグメントが上記の複合体から放出されるように標的−プローブ複合体の切断
されやすい結合を切断し得る、工程、および(c)核酸プローブの切断された部分
が生成されるか否かを決定する工程であって、それによって、抗生物質耐性mecA
遺伝子の存在を検出する工程。種々の実施態様において、切断されたプローブが
産生されるか否かの決定は、核酸プローブの切断された部分を直接検出するかお
よび/または切断されなかったプローブの量における減少を検出することによっ
て達成され得る。
１つの実施態様において、プローブは、以下のヌクレオチド配列：
の少なくとも一部分を含む。さらなる実施態様において、プローブは、本質的に
以下のヌクレオチド配列：
の少なくとも一部分からなる。他の代表的なプローブは、以下：
を含み、ここで、大文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、そして小文字は
、リボヌクレオチドを示す。本明細書中に利用されるように、プローブは、少な
くとも８ヌクレオチド長であるべきであり、そして10、12、14、15、16、18、20
、30、またはさらに100以上のヌクレオチド長であり得る。
種々の実施態様において、mecA遺伝子は、コアギュラーゼ陽性(例えば、S.aur
eus)またはコアギュラーゼ陰性(例えば、S.epidemidis，S.sciuri)のいずれかの
ブドウ球菌種由来である。
本発明の他の関連する局面において、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性
mecA遺伝子の存在を検出するためのプローブが提供され、ここで、上記のプロー
ブは、以下の配列：
の少なくとも一部分を含む。切断されやすい結合を切断する酵素(例えば、RNase
H)とともにこのようなプローブを含むキットもまた提供される。
さらなる局面において、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の
存在を検出するためのキットが提供され、これは、以下を含む：(a)１つ以上の
切断されやすい結合を含む核酸プローブ、および(b)プローブが標的に結合され
る場合、切断されやすい結合を切断し得る酵素。種々の実施態様において、この
酵素は、RNase Hである。さらなる実施態様において、mecA遺伝子は、ブドウ球
菌種由来である。
本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参
照する際に明らかになる。さらに、特定の手順または組成物(例えば、プラスミ
ドなど)をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示され、従って
、これらの全体が参考として援用される。
図面の簡単な説明
図１は、サイクリングプローブ反応の１つの実施態様の模式図である。
図２は、サイクリングプローブ技術反応を使用して、粗溶解物からのmecA遺伝
子について、S.aureus、S.epidemidisを含む、285のStaphylococcus単離物をス
クリーニングした結果の度数分布を示すヒストグラムである。32Ｐ標識したキメ
ラプローブは、mecA945-29(配列番号６)であり、反応混合物は、1.0mMエチレン
ビス(オキシエチレニトリロ)-四酢酸(EGTA)および2.0mMスペルミンの組み合わせ
を含んだ。この単離物は、パーセントプローブ切断に基づいて、mecA陽性または
mecA陰性に分けられ得る。
図３は、非アイソトープCPTアッセイの模式図である。１本鎖標的(I)は、CPT
の触媒として作用する。プローブ(F-DNA-RNA-DNA-B)(II)およびRNase H(III)の
存在下で、プローブ-標的複合体(IV)のRNA部分は、RNase Hによって切断される
。より短い切断されたプローブフラグメントが標的から分離され、これによって
、さらなるサイクリング工程(V)のための標的DNAが再生される。西洋ワサビペル
オキシダーゼとカップリングされた抗蛍光抗体(抗-F-HRP)が添加されて(VI)、反
応物は、ストレプトアビジンをコートしたプレートに移される。抗-F-HRPと結合
した未切断のプローブは、プレート(VII)を使用して捕捉される。過剰な抗体は
洗浄され(VIII)、HRP基質が添加されて(IX)、切断されなかったプローブの量を
測定する。吸光度または発色(X)は、標的DNAの量に反比例する。
図４は、蛍光化してかつビオチン化したキメラプローブFmecA945-29B(配列番
号５)を使用して、非アイソトープCPTアッセイによってmecA遺伝子の検出に基づ
いた120のS.aureus臨床単離物の度数分布を示すヒストグラムである。このアッ
ッセイは粗抽出物において行われ、そして単離物は、650nmにおける吸光度値(A6 50
)に基づいて、２つの非重複集団としてMRSA(mecA陽性)およびMSSA(mecA陰性)
に区別され得る。
図５は、プレート形式を使用する蛍光化してかつビオチン化したキメラプロー
ブを使用したCPT直接蛍光アッセイによるmecA遺伝子の検出に基づいて、58のS.a
ureus臨床単離物の度数分布を示すヒストグラムである。このキメラプローブは
、FmecA945-29(XL)4B3(配列番号５)であり、CPTアッセイを粗溶解物において行
った。この単離物は、相対的蛍光単位(RFU)に基づいて、２つの非重複集団とし
て、MRSA(mecA陽性)およびMSSA(mecA陰性)に区別され得る。
図６は、単一試験管形式を使用するmecA遺伝子についての120の臨床Staphyloc
occus aureus単離物のブラインドスクリーニングに由来するCPT直接蛍光アッセ
イにより得られた蛍光強度の結果のヒストグラムである。このキメラプローブは
、FmecA945-29(XL)4B3(配列番号５)であり、CPTアッセイを、実施例８に記載の
ように、粗溶解物において行った。これらの結果は、MRSAおよびMSSA単離物が、
RFUに基づく２つの非重複集団として容易に区別され得ることを示す。
図７は、CPTによってPCRアンプリコンを検出するために、１つの実施態様を行
うためのフローチャートである。
図８は、CPT-酵素イムノアッセイ(CPT-EIA、8A)およびPCRアンプリコン標準の
検出についてEt-Br染色したアガロースゲル(8B)の比較についての結果を示す。
図９は、MRSAおよびMSSAに由来するmecA遺伝子の検出のためのエチジウムブロ
ミド染色したゲル(9B)に対する、PCR CPT-EIA(9A)の感受性の比較を示す。
図10は、MRSAおよびMSSAに由来するmecA遺伝子の検出のためのCPT-EIA(10A)お
よびエチジウムブロミド染色したアガロースゲル(10B)による検出におけるPCRサ
イクル数の効果の結果を示す。
発明の詳細な説明
定義
「核酸分子」とは、重合体のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、こ
れは、天然起源または合成起源のいずれかであり得る。核酸分子の代表的な例と
しては、DNA(ds-DNAまたはss-DNA)、RNA、DNA-RNAハイブリッド、もしくは核酸
アナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα-エナンチオマー形態)から
構成されるか、またはそれを含む核酸分子が挙げられる。さらに、ヌクレオチド
は、それらの糖部分、またはピリミジン塩基もしくはプリン塩基部分において改
変され得る。糖部分に対する改変の例としては、例えば、１つ以上のヒドロキシ
ル基の別の基での改変または置換が挙げられる。塩基部分に対する改変としては
、アルキルまたはアシル化のピリミジンおよびプリンが挙げられる。さらに、核
酸単量体が、ホスホジエステル結合、またはこのような結合のアナログ(例えば
、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダイトなど)によ
って結合され得る。
「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNAに組み込まれない核酸分子を
いう。単離された核酸分子としては、例えば、プローブおよび合成的または組換
え的に生成された他の核酸分子が挙げられる。
「切断されやすい結合」とは、分子自体または標的核酸配列の核酸配列を全く
切断または破壊することなく、切断または破壊され得る核酸分子をいう。切断さ
れやすい結合としては、２つの核酸配列を結合し、かつ結合される核酸配列を切
断することなく選択的に切断され得る、任意の結合させる化学構造が挙げられる
。切断されやすい結合は、単結合または複数単位配列であり得る。このような化
学構造の例は、RNA配列である。他の切断されやすい結合として適切な化学構造
は、DNA配列、アミノ酸配列、無塩基性ヌクレオチド配列、もしくは無塩基性ヌ
クレオチド、または任意の炭水化物ポリマー(すなわち、セルロースまたはデン
プン)である。切断されやすい結合が核酸配列である場合、これは、(下記に記載
される)NA1およびNA2の核酸配列とは異なる。
「切断されやすい結合を含むプローブ」とは、標的核酸分子に相補的または実
質的に相補的である公知の配列を考慮して構築される合成核酸分子をいう。特定
の実施態様において、プローブは、構造「NA1--S--NA2」nを含み、ここで、NA1お
よびNA2は、異なる非相補的な核酸分子であり、Sは、切断されやすい結合であり
、そしてｎは、１〜10の整数である。
「リボヌクレアーゼＨ」(「RNase H」)とは、RNA：DNAのハイブリッド二重鎖
におけるRNA鎖を特異的に切断し得る酵素をいう(一般的には、CrouchおよびDirk
ensen in Nucleases,LinnおよびRoberts編、211-241頁、Cold Spring Harbor La
boratory Press,Plainview,NY,1982を参照のこと)。
従って、上記のように、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の
存在を決定するための方法が提供され、これは、以下の工程を包含する：(a)生
物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的１本鎖核酸分子を露出する工
程、(b)標的１本鎖核酸と、抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的である、切
断されやすい結合を含む核酸プローブと、２本鎖の標的-プローブ複合体を切断
する酵素とを、標的およびプローブが、２本鎖の標的−プローブ複合体を形成さ
せるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる条件下で反応させる工
程であって、この酵素分子は、１つ以上の核酸プローブのフラグメントが上記の
複合体から放出されるように標的−プローブ複合体の切断されやすい結合を切断
し得る、工程、および(c)核酸プローブの切断された部分が生成されるか否かを
決定する工程であって、それによって、抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出す
る工程。このような方法を利用することによって、当業者は、試験サンプルから
同日に結果を提供し得る、正確かつ迅速な結果を生成し得る。これは、患者につ
いての抗体を適切に使用し、これによって、バンコマイシンの使用を低減するこ
とが可能である。なおさらに、このような方法は、急激な発生をモニターするた
め、または院内外の設置において日常的に監視するために容易に利用され得る。
このような方法を利用して、生物学的サンプル内に所望の標的核酸分子の存在
を検出し得る。生物学的サンプルの代表的な例としては、培養サンプル(例えば
、細菌学的培地で増殖される)または臨床サンプル(例えば、鼻粘膜拭い液(swab)
、血液、尿、糞便、膿瘍、または髄液からのサンプルを含む)が挙げられる。標
的核酸分子を生成するための方法は、本明細書中に提供される開示によって、当
業者により容易に達成され得る(一般的に、Sambrookら.,Molecular Cloning:A L
aboratory Manual(第２版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989を参照
のこと)。
上記に記載されるように、本発明の１つの局面内で、標的核酸分子は、切断さ
れやすい結合を有する、相補的な一本鎖核酸プローブと反応される。簡単に言う
と、切断されやすい結合を有する広範な種々の核酸プローブは、本発明の文脈内
で利用され得る。好ましくは、このプローブは、酵素（これは、切断されやすい
結合でプローブ−標的複合体を特異的に切断し得る）による切断の際に、プロー
ブ部分が検出可能に放出されるように設計される（米国特許第4,876,187号、同
第5,011,769号および同第5,403,711号を参照のこと）。
本発明の好ましいプローブ分子は、一般に［(NA1)x(-S-)z(-NA2)y］n構造を有
する。ここでNA1およびNA2は、核酸または核酸アナログから構成される分子であ
り、-S-は切断されやすい結合であり、そしてｘ、ｙおよびｚは、１〜100の整数
であり、そしてnは、１〜10の整数である。本発明の特定の特に好ましい実施態
様内で、NA1およびNA2は、３から40ヌクレオチドの範囲であり得る。そしてSが
核酸から構成される場合、NA1およびNA2は、２から20ヌクレオチドのサイズの範
囲であり得る。さらに、本発明の文脈内で利用されるように、各々のx、yおよび
zは、ｎの各反復によって変わり得ることが理解されるべきである。本発明の種
々の実施態様内で、一本鎖プローブが使用され、一本鎖標的配列と反応するかあ
るいはハイブリダイズするが、上記に記載される方法は、相補的プローブおよび
標的配
列とのペアが、二本鎖を形成するような状況のみに限定されないべきである。
一本鎖核酸分子は、標準的な技術（例えば、Sambrookら、「Molecular Clonln
g：A Laboratory Mannual」，Cold Spring Harbor，1989を参照のこと）を使用
して標的細胞または生物から直接得られるかおよび/または調製され得るか、あ
るいは広範な種々の技術（例えば、PCR、NASBA、RNAの逆転写、SDA、分枝鎖DNA
などを含む）のいずれかを利用して調製され得る。
1つの実施態様内で、上記に記載されるようなNA1およびNA2は、DNA分子であり
、同じ配列を有してもよいし、有さなくともよい。あるいは、NA1およびNA2は、
RNA分子（これは、同じ配列を有してもよいし、有さなくてもよい）またはRNAお
よびDNA分子の組合わせから構築され得る。利用されるDNA分子またはRNA分子は
、天然に存在する供給源から誘導され得るか、あるいはこれらは、合成的に形成
され得る。各々のNA1およびNA2は、約5塩基〜10,000塩基長であり得る。特定の
改変体内で、プローブおよび標的核酸分子は、好ましくは、相補的である必要は
ないが、実際、１つ、２つ、３つまたはそれ以上の核酸によってわざと異なり得
る（例えば、PCT出願WO95/14106および米国特許第5,660,988号を参照のこと）。
さらなる改変体内で、標的核酸分子は、ゲノム核酸の不均質集団中に存在する。
他の実施態様内で、NA1またはNA2は、メチルホスホネート、カルバメート、ア
ミデート、トリエステル、または「ペプチド核酸」（「PNA」）のような、核酸
アナログから構成され得る。例えば、PNAオリゴマーは、非常に高い特異性で相
補的な標的オリゴヌクレオチド(DNAまたはRNA)配列とハイブリダイズし得る。こ
のような二本鎖は、対応するDNA-DNAまたはDNA-RNA二本鎖よりも安定である(Egh
olmら、Nature 365:556-568，1993)。さらにPNAは、鎖置換によって二本鎖(ds)D
NAに結合し得(Nielsenら、Science 254:1497-1500，1991)、それゆえサンプル調
製において、慣用的な二本鎖変性の必要性を除き得る。低濃度の塩（50mM/L以下
のNa+）が、一般的にdsDNAへのPNAの結合のために好ましい。中程度の濃度の塩
は、dsDNAへのPNAの二本鎖置換を通して結合を阻止し得る。しかし、一旦結合し
たPNA/DNA二重鎖は、高濃度の塩に対して安定である。さらにこれらの二重鎖は
また、オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオチド二重鎖と比べて熱的に安定であ
る（PNA/DNAの二重鎖は、対応するDNA/DNAと比較して、塩基対あたり約1℃ほ
ど、より安定である）。標的オリゴヌクレオチドに対する高度な配列特異性、一
旦形成した二重鎖の高塩濃度に対するより高い熱安定性および耐性の必要性に基
づくと、PNAは、しばしば本明細書に記載される方法における使用のための理想
分子である。特定の実施態様内で、２つの短いPNAが、切断されやすい結合と共
に連結され得、そして高度な配列特異的プローブとして使用され得る。
本発明のプローブはまた、一方の末端または両末端（例えば、NA1またはNA2）
に付加される１つ以上の検出可能なマーカーを有し得る。マーカーは、検出され
得る実質的に任意の分子または試薬（これらの代表的な例は、放射性同位体また
は放射標識された分子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素または化学発光触媒を含む）
であり得る。本発明の特定の実施態様内で、プローブは、蛍光標識または酵素的
標識（例えば、消光された蛍光対、または蛍光標識および酵素標識）、またはビ
オチンのような標識および結合分子（例えば、切断されるかあるいは切断されな
い状態のいずれかで、このプローブは標識分子および結合分子の両方に共有結合
または非共有結合され得る）のような１つ以上の標識を含み得る（例えば、米国
特許第5,731,146号もまた参照のこと）。
上記に記載されるように、核酸プローブは、切断されやすい結合（これは、分
子自身の任意の核酸配列または標的核酸配列の、切断または破壊することなしに
切断または破壊され得る）を有する。本発明の文脈内で使用されるように、切断
されやすい結合は、任意の接続する化学的構造（これは２つの核酸配列を結合し
、そして結合される核酸配列の切断なく選択的に切断され得る）である。切断さ
れやすい結合は、単一結合または複数単位配列であり得る。このような化学的構
造の例は、RNA分子であり得る。他の化学的構造（これは、切断されやすい結合
として適切であり得る）は、DNA分子、アミノ酸配列、無塩基性ヌクレオチド分
子または任意の炭水化物ポリマー（例えば、セルロースまたはデンプン）である
。切断されやすい結合が核酸分子である場合、これはNA1およびNA2の核酸配列と
は異なるはずである。
上記に記載される核酸プローブにおいて、ｎが１よりも大きい場合、単位NA1-
S-NA2は繰り返す。本明細書中に提供される開示によって当業者に容易に理解さ
れべきであるように、この単位は各繰り返し内に同一であり得るか、または定義
されるパターンにおいてランダムに変化し得る。さらに、切断されやすい結合も
また、単位から単位へ変化し得る。例えば、１つの切断されやすい結合は、アミ
ノ酸配列であり得、そして別の切断されやすい結合は、RNA分子であり得る。
上記に記載されるように、本発明のプローブはまた、固体支持体へ直接的また
は、化学的リンカーを通してのいずれかで連結され得る。固体支持体の代表的な
例は、シリカ物質、セルロース物質、ポリマーベース物質またはプラスチック物
質を含む。
本発明の特定の好ましい実施態様内で、核酸プローブは構造：[NA1-S-NA2]nを
有する。ここで、NA1およびNA2は核酸配列であり、-S-は、切断されやすい核酸
連結であり、そしてｎは１から10の整数である。この実施態様内で、NA1およびN
A2は、種々の核酸配列（これは、互いに非相補的である）であり、そして-S-は
、切断されやすい結合(これは、NA1もしくはNA2、またはNA1もしくはNA2配列に
ハイブリダイズし得る標的核酸配列を切断または破壊することなく、切断される
かまたは破壊され得る)である。ここで切断されやすい結合が核酸配列であるな
らば、NA1およびNA2の両方がDNA配列である場合、これはRNAであり、またはNA1
およびNA2の両方がRNA配列である場合、切断されやすい結合はDNAである。
このような核酸プローブを構築するための方法は、本明細書中に提供される所
定の開示により、当業者によって容易に達成され得る。例えば、特に好ましい方
法は：MatteucciおよびCaruthers，J．Am．Chem．Soc．103:3185，1981;Beaucag
eおよびCaruthers，Tetrahedron Lett．22:1859-1862，1981;米国特許第4,876,1
87号および同5,011,769号;Ogilvieら、Proc．Natl．Acad．Sci USA 85:8783-879
8，1987;Usmanら、J．Am．Chem．Soc．109:7845-7854，1987;Wuら、Tetrahedron
Lett．29:4249-4252，1988;Chaixら、Nuc．Acids Res．17:7381-7393:1989;Wu
ら、Nuc．Acids Res．17:3501-3517，1989;McBrideおよびCaruthers，Tetrahedr
on Lett．24:245-248，1983;Sinhaら、Tetrahedron Lett．24:5843-5846，1983:
SinhaらNuc．Acids Res．12:4539-4557，1984;およびGasparuttoら、Nuc．Acids
Res．20:5159-5166，1992によって記載される。
特に好ましいプローブ（および合成の標的）は、Songら、FEBS Letters 221:1
67-171，1987（EMBL受託番号Y00688)によって記載される、S．aureus mecA遺
伝子に基づく。種々のMRSA株由来のmecAのDNA配列は、ほんの少数の変化を示す(
Ryffelら、Gene 94:137-138，1990，S．aureus EMBL受託番号X52593およびS．ep
idermidis EMBL受託番号X52592)。mecA遺伝子はまた、コアギュラーゼ陰性ブド
ウ球菌中に分布し、そしてメチシリン耐性と関連する(Kobayashiら、Epidemiol
．Infect．113:259-266，1994で引用される)。
単一のプローブが設計され、米国仮特許出願(代理人整理番号第480094.423P2)
に記載されるような保存された領域または普遍的な塩基もしくは無塩基性部位の
使用または他の改変を選択することによって、一般的にmecA遺伝子を検出し得る
。
簡単にいうと、オリゴヌクレオチド合成は、各サイクルが、１ヌクレオチドご
とにオリゴヌクレオチドを伸長させるサイクルにおいて達成される。各サイクル
は、４つの工程からなる：(1)固体支持体上のヌクレオシドまたはオリゴヌクレ
オチドの5'末端を脱保護する工程、(2)固相に固定されたヌクレオチドへ次のヌ
クレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる工程、(3)固定されたヌク
レオチドの数パーセントの5'OH基(これは、添加されたホスホルアミダイトにカ
ップリングしない)をキャッピングする工程、および(4)オリゴヌクレオチドの連
結をホスホトリエステル連結に酸化させる工程。
オリゴヌクレオチドを合成するための、およびオリゴヌクレオチドのビオチン
化ならびに蛍光化のための代表的な方法が、実施例１に示される。検出反応
上記に記載されるように、所望の標的核酸分子の検出のための広範な種々の循
環反応は、上記に記載される一般的な工程に従って容易に実施され得る((米国特
許第5,011,769号および同第5,403,711号もまた参照のこと)。
１つの局面内で、このような方法は、一般的に(a)生物学的サンプル内に含ま
れる細胞を処理して、標的一本鎖核酸分子を曝露する工程、(b)標的の一本鎖核
酸と、切断しやすい連結を含む核酸プローブ（これは、抗生物質耐性mecA遺伝子
の一部分に相補的である）と、二重鎖標的-プローブ複合体を切断する酵素とを
標的およびプローブが、二本鎖標的−プローブ複合体を形成するように、互いに
ハイブリダイズさせる条件下で反応させる工程であって、この酵素分子は、核酸
プローブの１つ以上のフラグメントが標的−プローブ複合体から放出されるよう
に切断されやすい結合を切断し得る工程、および(c)核酸プローブの切断部分が
産生されるかどうかを決定する工程であってそれによって抗菌性mecA遺伝子の存
在を検出する工程を含む。他の関連する局面内で、本明細書中に提供される組成
物および方法は、広範な他の/関連する方法で使用される(例えば、米国特許第5,
210,015号;同第5,487,972号;同第5,422,253号:同第5,691,142号;同第5,719,028
号;同第5,130,238号;同第5,409,818号;同第5,554,517号;同第5,589,332号;同第5
,399,491号;同第5,480,784号;同第5,215,899号;同第5,169,766号；同第5,194,37
0号;同第5,474,916号;同第5,698,400号;同第5,656,430号;およびPCT公開番号WO
88/10215;同WO92/08800，同WO 96/02668;同WO 97/19193:同WO 97/09444;同WO96/
21144:同WO92/22671)。
本発明の特定の実施態様内で、本明細書中に提供される検出反応は、ポリアミ
ン（例えば、スペルミン）またはリボソームタンパク質（これは、反応の感受性
、特異性および/または速度を増加させる）のような添加物を使用して実施され
得る。これらのおよび他の関連する局面は、1998年５月18日に提出された米国仮
出願「ADDITIVES FOR USE IN CYCLING PROBE REACTIONS」（代理人整理番号4800
94.419P2）；および1998年５月18日に提出された「METHODS FOR accelerating H
YBRIDIZATION OF NUCLEIC ACID MOLECULES」（代理人整理番号480094.422P2）に
記載される。
別の実施態様において、CPTは、任意の標的増幅技術によって産生されたアン
プリコンを検出するために使用され得る。実施例10は、PCRアンプリコンの検出
のためのCPT酵素イムノアッセイ(CPT-EIA)の使用を例示する。CPTは、PCRアンプ
リコンの検出を迅速かつ正確にする。さらに、CPTは、標的をさらに増幅するこ
とがないこと以外は、第二のレベルの増幅を付加し、そしてそれゆえ、有意に少
ないPCRサイクル数を使用することが可能になる。これは、夾雑の機会および偽
陽性を減少させる。CPTは第二のレベルの特異性（これは、非特異的アンプリコ
ンおよびプライマー-ダイマーの検出を防止する）を付加する。PCR-CPT方法もま
た、ミスマッチ遺伝子検出のために使用され得る。このアッセイの他の変異は、
米国特許第5,403,711号（米国特許第5,747,255号もまた参照のこと）に記載され
るような「指数関数的な」循環反応を含む。
例えば、米国特許第4855240号および同第4703017号に記載されるような外側フ
ローデバイス（ストリップまたはディップスティック）は、MRSAアッセイのため
の検出形式のための別の実施態様を表す。ストレプトアビジンでコートしたウェ
ル（すなわち、EIA形式）上の未切断mecAプローブを検出する工程に代わって、
未切断プローブは、膜（すなわち、ストリップ形式）上に染み込んだストレプト
アビジンによって捕獲される。この形式を使用するいくつかの利点がある。必要
とされるさらなる検出試薬は無く、実施時間が短く、そして検出時間が短い。上
記の任意のアッセイを含むさらに適切なアッセイ形式の代表的な例は、ディップ
スティック、磁気ビーズなどのような固体支持体上で実施される（一般に、米国
特許第5,639,428号;同第5,635,362号;同第5,578,270号;同第5,547,861号;同第5,
514,785号;同第5,457,027号;同第5,399,500号;同第5,369,036号;同第5,260,025
号;同第5,208,143号;同第5,204,061号;同第5,188,937号;同第5,166,054号;同第5
,139,934号;同第5,135,847号;同第5,093,231号;同第5,073,340号;同第4,962,024
号;同第4,920,046号;同第4,904,583号;同第4,874,710号;同第4,865,997号;同第4
,861,728号;同第4,855,240号;および同第4,847,194号を参照のこと)。
別の実施態様において、CPTは、２つのセットの核酸プローブ分子（これは、
米国特許第5,403,711号に記載されるような固体支持体上に固定される）と共に
指数関数的な形式を使用して実施され得る。このアッセイは単一の容器で実施さ
れ得、信号は経時的にモニターされ得、そして非常に迅速でかつ感度良いアッセ
イを生じるので、これは有利である。
なお他の実施態様において、CPT-EIAは、米国特許第5,403,711号に記載される
ようにmecA遺伝子によって発現されるｍRNAからｃDNAを転写するために逆転写酵
素の使用、次いで、循環プローブ技術(RT-CPT)によってMRSAについての検出のた
めに使用され得る。未切断プローブ特異的cDNAは、EIAによってより検出され得
る。
以下の例は、限定されるためではなく、例示によって提供される。
実施例
実施例１
核酸プローブの構築
核酸分子は、自動化固相合成機（例えば、PerSeptive Blosystems Expedite D
NA synthesizer(Boston、MA)、PE Applied Biosystems，Inc.のModel 391 DNA s
ynthesizer(PCR-MATE EP)またはPE Applied Biosystems，Inc.のModel 394 DNA/
RNA Synthesizer(Foster City，CA)）において、標準的な化学を利用して合成さ
れ得る。好ましくは、PerSeptive Biosystems Expedite DNA synthesizerが使用
され、そしてオリゴヌクレオチドを作製するための製造者の改変したプロトコル
が実施される。
オリゴヌクレオチドの合成のための試薬は、合成機製造業者（例えば、PerSep
tive Biosystems，PE Applied Biosystems Inc.，Glen Research(Sterling，VA)
およびBiogenex）を含む、種々の供給源から市販されている。DNAおよびRNA合成
のために、好ましいフルオレセインアミダイト、デオキシヌクレオチドおよびリ
ボヌクレオチドのホスホルアミダイト、２’-O-メチルおよび活性化剤、CapA、C
apB、酸化剤のような試薬、およびトリチル脱ブロッキング試薬は、PerSeptive
Biosystemsから入手可能である。Biotin-TEG-ホスホルアミダイトおよびBiotin-
TEG-CPGは、Glen Researchから入手可能である。オリゴヌクレオチドの検出のた
めに使用される水酸化アンモニウム(28%)を、Aldrichから購入する。2'-O-tert-
ブチルジメチルシリル基を除去するために使用する1Mのテトラブチルアンモニウ
ムフルオライド(TBAF)を、Aldrichから購入し、そして２４時間の分子ふるいを
通して乾燥後に使用する。全ての緩衝液を、高圧滅菌水から調製し、そして0.2
μmフィルターを通して濾過する。
以下の手順を、ビオチン化および/または蛍光化オリゴヌクレオチドを調製す
るために使用する。ビオチン-TEG-CPG（１μmol）を合成カラム中へ充填する。
次いで、ヌクレオシドホスホルアミダイトを連結して、オリゴヌクレオチドを作
製するためのPerSeptive Biosystemの改変されたプロトコルを使用して、規定さ
れた核酸配列を作製する。フルオレセインアミダイトを最終濃度の0.1Mまでアセ
トニトリル中に溶解する。フルオレセインアミダイトを合成機にロードし、そし
てオリゴヌクレオチドの５’末端に付加する。あるいは、ホスホルアミダイトを
含むチオリンカーを、改変されたプロトコルを使用して、キメラプローブの5'末
端に付加させる。以下に記載される脱保護工程の後、このプローブをMilliporeR
2樹脂（これは、オリゴヌクレオチドを含むトリチルを保持する）を使用して、
逆相HPLCによって精製する。遊離の反応性チオ基を作製するために、HPLC精製し
たプローブを室温にて90分間硝酸銀と共に、続いてジチオスレイトール(DTT)に
よる硝酸銀の中和によって処理する。次いで、蛍光上清をプローブの遊離チオ基
に添加し、そして次いで、以下に記載されるようにHPLCまたは電気泳動のいずれ
かによって精製する。
オリゴヌクレオチド配列の合成後、オリゴヌクレオチドに結合した樹脂を、最
初１時間室温にて、そして続いて密閉した試験管内で16時間55℃で、25％のエタ
ノールアンモニウム酸化物(4ml)で処理する。試験管を冷却し、上製を除去し、
そしてアンモニアを除去するために、乾燥するまで濃縮する。残留物を1ｍｌの
水に溶解し、そして0.2μmのフィルターを通して濾過する。OD260を決定し、そ
してOD260単位が約２であるアリコートをBiocadのHPLCのR-2カラムへ注入し、キ
メラプローブのtert-ブチルジメチルシリル基について、クロマトグラムにおい
てベースラインを得る。
残存のプローブ溶液を1.5ml微小遠心管中で、遠心真空エバポレーター(Labcon
co)によって凍結乾燥する。得られたオリゴヌクレオチド残留物を、24時間1.0M
のTBAFで脱保護する。脱シリル化（これはすでに生じている）の範囲を決定する
ために、ｐＨ6.5の50ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート(TEAA)中、０か
ら60％の直線勾配を使用して、TBAF反応混合物のアリコートをHPLC(R2カラム)へ
注入する。部分的な脱シリル化のみが生じる場合、TBAF反応混合物を、保護基の
完全な除去のためにさらに12〜16時間の間続ける。TBAF反応混合物を100mMのNaO
Ac、pH5.5でクエンチングし、そして乾燥するまでエバポレートさせる。粗製の
オリゴヌクレオチド産物をP-6カラム（2cm×10cm、Bio-Rad）で脱塩し、この画
分を濃縮して約1mlにし、そしてこの濃縮物をOD260で測定する。
粗オリゴヌクレオチドを、20％ポリアクリルアミド-7M尿素を使用してポリア
クリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により精製する。泳動ゲル緩衝液は１×TBE(Tr
is-ホウ酸-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH8.3)であり、そして電気泳動を50
mA電流で3.5〜４時間実行する。このオリゴヌクレオチドバンドをUV光で可視化
し、切り出し、15mlプラスチックコニカルチューブ中に入れ、そして５mlの50mM
NaOAc(pH5.5)中で約12時間ゲルを破砕しそして浸たすことにより抽出した。次に
、このチューブを3000RPMで遠心分離し、パスツールピペットを用いて上清を注
意深く除去した。このゲルを2mlの抽出バッファーでリンスして、残りの生成物
をすべて取り出した。合わせた抽出物を約１mlの容量まで濃縮し、そしてP6カラ
ム上で脱塩した。プローブを含む画分をプールし、そして約２mlの最終容量にま
で濃縮した。オリゴヌクレオチドの分析的純度を[γ32P]-ATPおよびT4-ポリヌク
レオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの5'末端をラベルすること、およ
び次いでPAGE上でラベルオリゴヌクレオチドを泳動することによりチェックする
。OD260を、Hewlett Packard's 845X UV分光光度計を使用して測定する。オリゴ
ヌクレオチド溶液を、0.2μmフィルターを通して濾過し、そして-20℃で保存す
る。
上記の手順を利用して、以下のオリゴマーを合成し得る。これらの配列におい
て、大文字はデオキシリボヌクレオチドを示すため、小文字はリボヌクレオチド
を示すため、下線文字は2'-O-メチル結合を示すため、大文字Fはフルオレセイン
ラベルを示すため、大文字Bはビオチンを示すため、大文字XLはXLリンカー（Gle
n ResearchまたはClontechより入手可能）を示すため、そして下付け数字は指示
部分の繰り返しを示すために利用した。
実施例２
同位体サイクリングプローブ技術反応
サイクリングプローブ技術（CPT）反応および条件を、以前に公開された方法(
WO 95/14106;Bekkaouiら,BioTechniques 20(2):240-248,1996)からの改変手順を
利用して実行する。簡単には、特異的なキメラのプローブを、[32P]-ATP(Du Pon
t,Sambrookら,1990)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(RTG;Pharmacia Biotech
,Piscataway,NJ)を使用して放射性32Pで5'標識する。単一のチューブのRTGは15
μlの水に再懸濁する。１pmolのプローブを、5μlのγ-32PATPおよび３μlのRTG
を合わせる。最終容量を水で10μlに調整し、そして37℃で30分間インキュベー
トする。取り込まれなかったγ-32PATPを、G50 Nickカラム(Pharmacia)を使用す
ることによりキナーゼ処理したプローブから分離する。回収したプローブはSSC
緩衝液（15mM NaCl,1.5mMクエン酸ナトリウム,pH7.0）中に0.1倍に調整し、そし
て-20℃で保存する。
他に指示されなければ、CPT反応を以下：TESサイクリング緩衝液、キメラの標
識プローブ、RNase Hを順に添加してサイクリングカクテル（これを、次に試験
される、変成したサンプルに添加する）を与えることにより実行する。サイクリ
ング反応混合物は、以下の最終濃度を有するTESサイクリング緩衝液(TES-CB)中
に特定の濃度のキメラプローブ、精製ゲノムDNAまたは粗溶解物標的のいずれか
エチレンビス（オキシエチレンニトリロ(oxyethylenitrilo)）四酢酸(EGTA)、20
mM TES緩衝剤、pH6.8。サンプル調製、試験添加物の添加、およびサイクリング
反応に使用する他の成分と特定の実施例において記載する。
他に特定されなければ、CPT反応物を、56℃で30分間インキュベートし、次い
で56℃で尿素ローディング緩衝液(8M尿素、100mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)
およびそれぞれ0.25％のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール,80m
Mリン酸緩衝剤)を添加することにより停止する。次いでこの反応混合物を冷却し
ながら、500ボルトで7M尿素-20％アクリルアミド／ビスアクリルアミド(19.1)ゲ
ル電気泳動(SDS-PAGE)により分離する。このゲルを、ImageQuantTMソフトウェア
を利用するPhosphorImagerTM(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)上で分析する
。サイクルプローブの量を、インタクトなまたは切断プローブと一致するバンド
の面積の積分により見積もる。
他に述べられなければ、CPT反応において、パーセントプローブ切断はインプ
ットプローブの総量に対するプローブ切断の総量である（方程式番号１）：
パーセントプローブ切断=(プローブ切断/総インプットプローブ)×100 (1)
単純なCPT系において、Ｃ１バックグラウンドとはRNase Hも相同標的も存在し
ない反応緩衝液中のパーセントプローブ切断をいう。Ｃ２とは、相同標的を伴わ
ないRNase Hの存在下でのパーセントプローブ切断をいう（方程式番号２）：
Ｃ２＝（プローブ切断／総インプットプローブ）×100 (2)
複雑なCPT系について、Ｃ３とは、RNase Hの非存在下でサンプル（異種DNAま
たはタンパク質のような外来の成分を含む生物学サンプル）中のパーセントプロ
ーブ切断をいう。Ｃ４とは、RNase Hの存在下であるが異種標的の非存在下での
、生物学的サンプル中のパーセントプローブ切断をいう。（方程式番号３）：
Ｃ４＝（プローブ切断／総インプットプローブ）×100 (3)
正味のパーセントプローブ切断は、相同標的に起因するプローブ切断のパーセ
ントであり、そしてパーセント切断からバックグラウンドＣ２（単純系）または
Ｃ４（複雑系）を差し引くことにより計算される（それぞれ、方程式番号４また
は５）。
正味のパーセントプローブ切断＝パーセント切断Ｃ２ (4)
正味のパーセントプローブ切断＝パーセント切断Ｃ４ (5)
CPTについてシグナル対ノイズの比(S:N)は、Ｃ２（単純系、方程式番号６）ま
たはＣ４（複雑系、方程式番号７）に対する、相同標的の存在下でのパーセント
プローブ切断の比として定義する。
Ｓ：Ｎ＝パーセント切断／Ｃ２ (6)
Ｓ：Ｎ＝パーセント切断／Ｃ４ (7)
実施例３
耐熱性RNase Hの調製
以下の実施例は、Thermus thermophilusから耐熱性RNase Hを調製する１つの
代表的な方法について記載する。
この耐熱性遺伝子のクローニングおよびその発現は、KanayaおよびItaya,J.Bi
ol.Chem.267:10184-10192,1992による方法の改変に基づく、WO 95/05480およびB
ekkaouiら,BioTechniques 20:240-248,1996に詳細に記載される。簡単には、T.t
hermophilus RNase H遺伝子(KanayaおよびItaya,前出)をPCRによりベクターpT7-
7(pIDB9)中にクローニングし、ベクターpET11a(Novagen)中にサブクローンし、
プラスミドpIDB33を生じた。続いてプラスミドpIDB33で、細菌株BL21(DE3)(Nova
gen,Madison,WI)を形質転換する。pIDB33を含むBL21(DE3)細胞を、0.1mg/mlアン
ピシリンを含むLB培地(Sambrookら、1990)中に37℃で増殖する。培養物が0.6〜0
.8、OD600であるときにIPTGを0.5mMの最終濃度になるように添加し、そして細胞
をさらに４時間培養する。RNase Hは、pIDB33構築物を有する封入体中に発現す
る。
細胞を3000×gで４℃15分間の遠心分離により採取する。細胞ペレットを、5ml
のTEバッファー(10mM Tris,pH7.4、1mM EDTA緩衝液)中に、1g新鮮重で再懸濁す
る。この細胞を、超音波処理器(Branson,モデル450)を使用してドライアイス／
エタノール槽中で溶解し、そして15000x gで４℃30分間で遠心分離する。このペ
レットを、TE緩衝液pH8.0中の７Ｍ尿素に再懸濁し、そして４℃で２時間攪拌し
ながらインキュベートする。再懸濁した細胞を氷上で２分間超音波処理し、次い
で12,000×gで10分間の遠心分離を行い、そして上清液を採取して11の尿素酢酸
ナトリウム緩衝液(8M尿素、20mM酢酸ナトリウム、pH5.5)を２回交換して一晩透
析する。20分間31,000×gの遠心分離後、明瞭なタンパク質上清溶液(150ml)
を収集し、そして約25mlの予め膨潤したホスホセルロース(カラム緩衝液中で２
回平衡化した、P11、Whatman International Ltd.,Kent,UK)と３時間混合する。
得られたスラリーを尿素酢酸ナトリウム緩衝液で２回洗浄し、そしてカラムに注
ぐ。このカラムを尿素酢酸ナトリウム緩衝液中140mMおよび210mMNaClで２回洗浄
したFPLCシステム(Pharmacia)および工程に連結する。次にこのタンパク質を、
尿素酢酸ナトリウム緩衝液中0.21〜0.7M NaCl直線勾配を使用して溶出する。こ
のカラムを、この塩勾配の終わりに、この全てのタンパク質が溶出するまで0.7M
NaClに維持する。画分をSDS-PAGEで解析し、そしてRNase Hを含む画分をプール
し、そして、20mM酢酸ナトリウム、pH5.5中、150mM NaClを含む緩衝液を有するS
ephadex G-25カラムを使用して脱塩した。溶出したタンパク質画分を、プールし
、Centriprep 10フィルター(Amicon,Beverly,MA)で濃縮し、そしてグリセロール
保存緩衝液中-20℃で保存する(40％グリセロール、150mM NaClおよび20mM酢酸ナ
トリウム、pH5.5)。
実施例４
CPT反応を使用したmecA遺伝子の検出によるStaphylococcus aureusの
メチシリン耐性状態の決定
以下の実施例は、S.aureus単離物の粗溶解物からのmecA遺伝子の検出について
の、キメラプローブmecA945-29(配列番号５)の有用性ならびにCPT反応における
スペルミンおよびEGTAの有効性を実証する。
この実験を、粗溶解物を使用したMRSA単離物のmecA遺伝子の検出について、CP
T反応におけるスペルミンおよびEGTAの効果を試験するように設計した。
この実験について、MRSA(ATCC 33592,アメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン、Rockville、MD)およびMSSA(ATTC 11632)単離物を、37℃で一晩、５％ヒツジ
血液（PML Microbiologics,Richmond,BC）でトリプティカーゼ(trypticase)ダイ
ズ寒天(TSA)プレート上で増殖した。滅菌スワブを使用してTSAプレートからこの
コロニーを取りだし、次に２mlの20mM TES緩衝液(pH6.8)中の0.05％Triton X-1
度（約1.5x109細胞/ml）に調整した。次に50μlの細胞懸濁液（約7.5x107細胞）
を微量遠心管に移した。この細胞の溶解を、アクロモペプチダーゼ(achromo pep
tidase)(Wako Bioproducts,Richmond,VA)を、１サンプルあたり最終濃度の150ユ
ニット/mlに添加して実施した。この懸濁液を混合し、そして37℃で20分間イン
キュベートした。
このキメラプローブmecA945-29を、実施例１および２に記載したとおりに、合
成および標識した。耐熱性RNaseHを実施例３に記載したとおりに生成した。CPT
反応および解析を、以下を除いて実施例２のとおりに実施した：1.8fmol mecA94
5-29キメラプローブを使用し、そして試験した添加濃度は1mM EDTA、2mMスペル
ミンまたは1mM EDTAおよび2mMスペルミンの組み合せであった。50μlの粗溶解物
サンプルを、95℃５分間でヒーティングブロック中で熱変成させ、次に、58℃水
浴に直接移した（反応温度は56℃であった）。反応カクテル(50μl)を直ちに添
加し、そしてインキュベーションをさらに20分間続けた。インキュベーションの
終わりに、水浴中で40mM PB(100μl)を含む等量のローディング色素をこのサン
プルに添加した。次にサンプルを95℃のヒーティングブロックに５分間移した。
サンプルを手短に遠沈し、そして20μlを電気泳動のためにアクリルアミドゲル
にロードした。表１はMRSA溶解物からmecA遺伝子の検出のためのCPT反応中スペ
ルミンおよびEGTAの効果の結果を要約する。簡単には、スペルミンおよびEGTAの
非存在下では、高いＣ４バックグラウンドに起因して単離物MRSAとMSSAとの間で
区別がなかったことが観察される。EGTA単独の添加は、MRSAおよびMSSAの両方中
のパーセントプローブ切断を減少したが、まだなおこの２者間の区別を可能にし
なかった。CPT反応物へのスペルミン単独の添加は、Ｃ４バックグラウンドを低
下することによりMRSAの検出が可能になり、約５のシグナル対ノイズの比をもた
らした。CPT反応物へのEGTAおよびスペルミンの両方の添加は、標的の検出を劇
的に改良した。表１に見られるように、Ｃ４バックグラウンドに主な減少があり
、そしてmecA MRSAは20ので顕著なシグナル対ノイズの比で検出し得た。これら
の結果は、MRSA単離物とMSSA単離物との間で明らかな区別を得るために、サイク
リング反応物へのスペルミンおよびEGTA両方の添加の必要性を明らかに示す。
表１.MRSAの粗溶解物からmecA遺伝子の検出のためのCPT反応中のスペルミンおよ
びEGTAの効果 上記実施例は、添加物スペルミンおよびEGTAの存在下で、mecA遺伝子検出によ
ってMSSAからMRSAを区別するための、同位体標識したキメラのmecA945-29プロー
ブの成功した使用を実証する。
実施例５
CPT反応を使用するmecA遺伝子の検出による、
メチシリン耐性ブドウ球菌単離物の臨床スクリーニング
以下の実施例は、ブドウ球菌臨床単離物の粗溶解物からmecA遺伝子を検出する
ためのCPT反応における、同位体標識されたキメラプローブおよび付加物（スペ
ルミンおよびEGTA）の首尾よい使用を示す。
この実験は、32P標識キメラプローブmecA945-29（配列番号５）の使用、なら
びに285個のブドウ球菌単離物の粗溶解物からmecA遺伝子を検出するためのCPT反
応におけるスペルミン（2.0mM）とEGTA（1.0mM）との組み合わせを試験する。こ
れらの単離物は、以下の供給源に由来した：Wishart Memorial Hospital（India
na polis，IN）、Cleveland Clinic Foundation（Cleveland，0hio）、Vancouve
r General Hospital（Vancouver，BC）および25個の参照株。全部で、238個のS
．aureusおよび47個のS．epidermidis単離物であった。
粗溶解物調製、プローブ合成、CPT手順、および分析を、１μlのプラスチック
ループ(PML Microbiological，Richmond，BC，Canada)を用いてTSA血液プレート
から細胞を採取して、50μlの20mM TES緩衝液（pH6.8）中の0.05％Triton X-
施例４に記載されるように、アクロモペプチラーゼ（achromopeptidase）（Wako
Bioproducts）を添加して溶解した。DNAを、使用前に95℃で５分間、熱変性さ
せた。実験は、オペレーターブラインド研究として行なった。単離物もまた、４
％NaClを使用するE試験を使用して、従来のオキサシリンスクリーニング寒天(PM
L Microbiological)、Kirby-Bauer Disc拡散、最小阻害濃度（MIC）によっ
eckton Dickinson）を用いて試験した。
CPT反応結果をオキサシリン寒天スクリーニングと比較した場合、４つの矛盾
したサンプルが見つかった。これらの単離物は、寒天スクリーニング陽性である
が、CPT陰性であることが観察された。PCRによる矛盾した解析（実施例７）の後
、mecA遺伝子がこれらの単離物において存在しないことが確認された。上記の実
験結果は、単離物の数対パーセントプローブ切断の頻度分布ヒストグラムとして
図２に示される。簡潔には、パーセントプローブ切断の頻度分布は、オペレータ
ーブラインド研究を使用して、mecA遺伝子の存在または非存在に基づいて、単離
物を２つの異なる集団に分離する。
この研究において使用される各々の感受性試験は、いくつかのブドウ球菌単離
物を正確に同定し損なった。金の標準オキサシリン寒天スクリーニングは、４つ
のS．aureus単離物をMRSAと同定したが、mecA遺伝子は存在しないことが示され
た。これらの４つの単離物の各々は、オキサシリンに対する境界型耐性（MICの
３〜16μg/ml）を示し、そしてMIC E試験およびオキサシリンディスク拡散によ
ってさらに誤って同定された。これらの４つの単離物のうちの１つは、さらにBB
L Crystal ID MRSA Systemによって誤って同定された。mecA遺伝子を欠如するさ
らなる31個のS．aureus単離物は、オキサシリンMICの３〜12μg/mlでのＥ試験に
よってMRSAと称され、そしてこれらの単離物のうちの２つもまた、オキサシリン
ディスク拡散によって間違われた。これらの境界型オキサシリン耐性S．aureus
（BORSA）単離物の各々は、ディスク拡散によるclavulanic acidの存在において
、オキサシリンに感受性であることがさらに示された。
従来の感受性試験は、オキサシリン境界型感受性S．aureus単離物と低MICを有
する異種耐性MRSA単離物との間を確実に区別することは出来ない。
表２．感受性試験によって不正確に同定された単離物
1MRSEは、メチシリン耐性Staphylococcus epidermidisをいう。
CPTアッセイは、S．aureus単離物およびS．epidermidis単離物におけるmecA遺
伝子を正確に検出し、そしてメチシリン感受性ブドウ球菌からメチシリン耐性ブ
ドウ球菌の正確な同定を可能にした。このアッセイはまた、mecA遺伝子を含まな
いBORSAからmecA陽性MRSAを区別し得た。
上記の実施例は、コアギュラーゼ陽性および陰性の両方のブドウ球菌臨床単離
物の粗溶解物からmecA遺伝子について同位体標識したmecA945-29プローブの感受
性および特異性を実証する。
実施例６
mecA遺伝子のPCR検出
矛盾した分析のためのPCRを以下の方法によって行なう。
MRSAのmecA配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対mecA834-25および
mecALl039-22（配列番号９および配列番号10）を、実施例1に記載されるように
合成した。MRSAおよびMSSA ATCC単離物の粗溶解物をコントロールとして使用し
、そしてTaqポリメラーゼを使用するホットスタートの後、PCRを行なった。
ホットスタートPCRは、95℃5分間の変性後、80℃でのTaqポリメラーゼの添加
によって50μl容量において実施した。最終PCR反応混合物は、以下を含んだ：50
μlの最終反応容量中、200μMの各dNTP混合物（dATP、dGTP、dCTP、dTTP、Pharm
acia）、1.5mMのMgCl2、50mM KCl、20mM Tris HCl、pH8.4、（１×PCR緩衝液、G
ibco-BRL）、0.5μMの各プライマー対、１UのTaq DNAポリメラーゼ（Gibco-BRL
）および２ngのブドウ球菌DNA粗溶解物サンプル。サンプルを、サーマルサイク
ラー（PTC 100，MJ Research Inc.）中で、94℃で40秒間、53℃で40秒間、およ
び72℃で90秒間のサイクルを使用して、サイクルにかけた。増幅を50サイクル行
なった。
増幅後、0.5μg/mlのエチジウムブロミド含有の1.8％アガロースゲルを使用し
て、サンプルを電気泳動を用いて分析した。分子量マーカーもまた含まれた。22
7bpのアンプリコンが検出された場合、サンプルを陽性とみなした。このアンプ
リコンはATCC MRSAコントロールにおいて検出されたが、ATCC MSSAコントロール
またはいかなる矛盾したS．aureus単離物においても検出されなかった。
実施例７
非同位体MRSAアッセイ
以下の実施例は、S．aureusの臨床単離物におけるmecA遺伝子の検出のための
迅速な非同位体CPTアッセイを示す。
CPTを酵素イムノアッセイ（CPT-EIA）と組み合わせる非同位体MRSAアッセイを
、図３に概略的に示す。この迅速なMRSA試験は、mecA遺伝子の相補塩基配列に結
合した場合にRNase H感受性の切断されやすい結合を提供する、蛍光標識化およ
びビオチン化されたキメラプローブを使用する。切断されないプローブ（mecA陰
性）は、固体表面へのプローブの結合、および西洋ワサビペルオキシダーゼ（こ
れは基質を発色最終産物に転換させる）と結合した抗体の結合によって、検出さ
れる。プローブの切断（mecA陽性）は、固体表面へのプローブ-抗体複合体の結
合を妨害し、従って、発色最終産物の形成を妨害する。結果は90分後に生じる。
この実験は、蛍光標識化されたキメラプローブFmecA945-29B（配列番号５）の
使用、および102個のブドウ球菌単離物の粗溶解物からmecA遺伝子を検出するた
めの、CPT反応物中のスペルミンとEGTAとの結合を試験する。S．aureus単離物の
供給源は、以下からであった：Wishard Memorial Hospital，Cleveland ClinicF
oundation、Vancouver General Hospital、およびATCC。全部で、51個のMRSAお
よび51個のMSSA単離物が存在した。
MRSAおよびMSSAの両方の効果的な溶解を行い、そして最適化した。溶解試薬の
組成物は以下である：200単位/mlのアクロモペプチダーゼ（Wako Bioproducts，
Wako）、0.02mg/mlリゾスタフィン（lysostaphin）（Sigma，St．Louis，MO）、
キメラプローブFmecA945-29Bを合成し、実施例１に記載されるように、蛍光標
識化およびビオチン化した。精製熱安定性RNase Hを実施例３に記載されるよう
に調製した。単離物を実施例４に記載されるように増殖させ、そして１μlのル
ープで培養増殖物を、50μLの溶解試薬を含有する1.5mlの微量遠心管に入れた。
サンプルを54℃または室温で10分間インキュベートした。DNAを、CPT反応の前に
95℃で２分間変性させた。減算アッセイのための最適化CPT反応試薬は以下であ
った：100μlの最終反応容量中、20fmol/反応のFmecA945-29B、50μlの粗溶解物
、
反応のRNase H、20mM TES、pH6.8。使用したコントロールは、mecA陽性S．aureu
s（ATCC 33592）およびmecA陰性S．aureus（ATCC 11632）であった。CPT反応を
、54℃で25分間行なった。
サイクルの後、100μlの結合試薬（ペルオキシダーゼ安定化緩衝液、DAKO、Mi
ssissauga，ON）、ヒツジポリクローナル抗フルオレセイン西洋ワサビペルオキ
シダーゼ結合抗体（1/750 希釈、NEN、Boston、MA）をチューブに添加した。検出
を、ストレプトアビジンコートストリップウェル（Boehringer Mannheim GmbH，
Germany，Boeringer）を使用して行なった。CPT反応を、ストレプトアビジンコ
ートストリップウェルに移し、そして10秒間混合し、そして10分間室温でインキ
ュベートした。液体を廃棄し、そして300μlの洗浄緩衝液（137mM NaCl、2.7mM
KCl、1.8mM KH2PO4、10.1mM Na2HPO4、0.5％Tween 20、pH7.3）で２回洗浄した
。続いて、200μlの基質（テトラメチルベンジジン/H2O2、Sigma）を添加し、そ
し
て室温で３分間発色させた。発色を、100μlの検出停止試薬（750mM Tris，1.5
％(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、pH7.7）を使用して停止させた。プレートを、
650nmのOD（OD650）に設定したVmaxプレートリーダー（Molecular Devices）を
使用して読み取る。
表３および図４は、減算CPTアッセイを使用することによる、MRSAのmecA遺伝
子についてのスクリーニングの結果を要約する。
表３．減算CPTアッセイを使用する、MRSA（n=51）およびMSSA（n=51）臨床単離
物溶解物の検出を試験する実験からの、650nm（A650）での吸光度の平均および
標準偏差（SD）。
結果は、51個のMRSAまたはMSSAの全てのデータの点が、それらの対応する平均
の３つの標準偏差（SD）内にあることを示す。それゆえ、MRSA平均＋３×SDとMS
SA平均−３×SDとの間には重複が存在しない。これは、MSSA集団からMRSA集団を
分ける明瞭な試験結果を可能にする。
上記の実施例は、キメラの蛍光標識化およびビオチン化されたmecA945-29プロ
ーブが、mecA遺伝子を検出することによってMSSAからMRSAを区別するために、非
同位体CPT-EIAにおいて首尾よく使用され得ることを示す。
実施例８
MRSA試験：形式、試薬、およびキット組成物
以下は、MRSAからmecA遺伝子を検出するためのキットの例示的な１実施例であ
る。
このキットは、非同位体CPTアッセイ（CPT-EIA）を使用するmecA遺伝子の検出
によってMRSAの迅速な検出を可能にし、そして溶解しにくいMRSA単離物（矛盾物
）またはヌクレアーゼを産生するMRSA単離物（矛盾物）の検出を最適化する。
迅速なMRSA試験キット（48試験）を以下の項目と比較する：
*MRSA溶解試薬（2）
*ストレプトアビジンコートマイクロウェル（48）
*MRSAサイクル試薬（48）
*洗浄緩衝液（１×50mL）
*MRSA溶解再生緩衝液（１×３mL）
*検出基質試薬(１×12mL)
*サイクル再生緩衝液（１×６mL）
*検出停止試薬（１×5.5mL）
*MRSAサイクル停止試薬（１×6.8mL）
*トランスファーピペット（50）
*200μL Dropstir（50）
*200μL Dropstir（50）
以下は、キットの一部を構成する組成物、試薬、および材料を記載する。
*MRSA溶解再生緩衝液：水、および20ppm ProClin 300TM（Sigma）。
アクロモペプチダーゼ（Wako）およびEGTA
*サイクル再生緩衝液：４mM MgCl2および20ppm ProClin 300TM。
*MRSAサイクル試薬（凍結乾燥）：トレハロース、ポリビニルピロリドン、TES
、
*MRSAサイクル停止試薬：西洋ワサビペルオキシダーゼ（1/1000最終希釈）に
結合した抗フルオレセイン抗体を含む緩衝化塩溶液（DAKO）。
*ストレプトアビジンコートマイクロウェル（Boehringer）。
*洗浄緩衝液：137mM NaCl、2.7mM KCl、1.8mM KH2PO4、10.1mM Na2HPO4、0.5
％Tween 20および20ppm ProClin 300。
*検出基質試薬：テトラメチルベンジジン（Sigma）およびH2O2。
*検出停止試薬：0.75mM Trisおよび1.5％ドデシル硫酸ナトリウム。
S．aureusの粗溶解物からmecA遺伝子を検出するためのアッセイを実施する手
順は以下である：Ａ．MRSA溶解試薬の再生：
１．MRSA溶解試薬のバイアルに、1.5mLのMRSA溶解再生緩衝液をピペットで移
す。
２．旋回して溶解する。
３．使用前に室温で２〜３分間静置する。
４．２℃〜８℃で保存した場合、一旦再生されると、１バイアルのMRSA溶解試
薬は２週間使用され得る。Ｂ．MRSAサイクル試薬の再生
１．再生は、検体調製のインキュベーション工程の間に行なうべきである。
２．１バイアルのMRSAサイクル試薬に２滴のサイクル再生緩衝液を添加する。
３．旋回して溶解する。
４．これは単回使用試薬である。この試薬は再生の30分以内に使用しなければ
ならない。Ｃ．サンプル調製
１．50μLのDropstirを使用して、１滴の再生MRSA溶解試薬を各1.5mL微量遠心
管に添加する（１サンプルあたり１チューブ）。
２．５％ヒツジ血液を含有するトリプチックソイ寒天プレート上での18時間〜
24時間培養からの増殖物を１μLループ添加する。完全に細胞増殖物を懸濁する
まで良く混合する。
３．55℃で20分間放置。
４．95℃で５分間放置。Ｄ．サイクリングプローブ技術
１．溶解物を含むチューブを55℃に移す。
２．50μLのDropstirを使用して、１滴の再生MRSAサイクル試薬を各チューブ
に添加する。
３．55℃で25分間インキュベートする。
４．チユーブを55℃に置き、３滴のMRSAサイクル停止試薬を添加する。
Ｅ．検出
１．必要数のストレプトアビジンコートのマイクロウェルを（１サンプル当たり
１マイクロウェル）マイクロウェルフレームに配置する。
２．サイクル反応物全体を、ストレプトアビジンコートのマイクロウェルへ、ト
ランスファーピペットを用いて移す。
３．１０分間室温でインキュベートする。
４．ストレプトアビジンコートのマイクロウェルを反転させて液体を捨てる。
５．洗浄緩衝液で、各ストレプトアビジンコートのマイクロウェルを完全に満た
す。
６．ストレプトアビジンコートのマイクロウェルを反転させて液体を捨てる。
７．各ストレプトアビジンコートのマイクロウェルをドライペーパータオル上で
５回軽く叩く
８．工程５〜７を反復する。
９．２００μＬのＤｒｏｐｓｔｉｒを用いて、各ストレプトアビジンコートのマ
イクロウェルに１滴の検出基質試薬を添加する。
１０．室温で５分間放置する。
１１．各ストレプトアビジンコートのマイクロウェルに４滴の検出終結試薬を添
加する。
１２．１０秒間混合する。
１３．室温で３分間インキュベートする。
１４．３０分以内に視覚的に読み取り、そして着色領域を記録するかまたはＯＤ650
を測定／記録する。
実施例９
ＭＥＣＡ ＭＲＳＡについての直接蛍光ＣＰＴアッセイ
以下の例は、粗溶解物を用いたＣＰＴによるＭＲＳＡ単離物におけるｍｅｃＡ
遺伝子の検出のための直接蛍光アッセイの使用を示す。
ＣＰＴと組み合わせた直接蛍光アッセイ（ＤＦＡ）（ＣＰＴ−ＤＦＡ）を用い
る２つの実験を、臨床単離物からｍｅｃＡ遺伝子の検出のために実施した。第一
の実験において、５８の単離物を、プレートリーダー形式を用いてスクリーニン
グし、そして第二の実験において、１２０の単離物を単一のチューブリーダー形
式を用いてスクリーニングした。手短には、このアッセイは、ＭＲＳＡに存在す
るが、ＭＳＳＡには存在しない、ｍｅｃＡ遺伝子内の配列に相補的な、フルオレ
セイン化およびビオチン化されたキメラプローブを使用する。プローブは、５’
末端ではフルオレセインを用いて、および３’末端ではビオチンを用いて標識す
る。ＣＰＴアッセイを、ＲＮａｓｅ Ｈおよびキメラプローブの存在下でＳｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ細胞からの粗溶解調製物を用いて実施する。サイクル反
応後、ストレプトアビジンコート磁気ビーズを添加して、切断されていないプロ
ーブを結合させる。フルオレセインで標識された切断されていない断片を含む上
清を、磁石を用いてビーズから分離し、そして上清を蛍光測定のために、ガラス
チューブまたはマイクロタイタープレートに移す。
Ａ．臨床単離物およびサンプル調製物の供給源
５８の臨床単離物の供給源を、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｗｉ
ｓｈａｒｄ Ｍｅｍｏｒｉａｌ ａｎｄ Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。全てのＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ細胞を、溶解物を
２×ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎｏ．５標準密度または５０μ容量中の１μｌループ
の細胞のいずれかとして調製したこと以外は、本質的に実施例４に記載のとおり
に、調製および溶解した。１μｌループの細胞は、５×ＭｃＦａｒｌａｎｄ Ｎ
ｏ．５標準とほぼ等価である。
Ｂ．ストレプトアビジンコート磁気ビーズを用いたビオチン化プローブの結合
ストレプトアビジンコート磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０、Ｏｓｌｏ、
Ｎｏｒｗａｙ）を、等量のＴＥＳサイクル緩衝液（４ｍＭ ＭａｇＣｌ2、０．
洗浄することによって調製した。次いで、ビーズを、ＮａＣｌを含むサイクル緩
衝液で元の溶液の１０倍容量中で再懸濁した。希釈したビーズをビオチン化プロ
ーブを含む反応物へ添加して、最終濃度を５０μｇのビーズ／反応物および１．
５ＭのＮａＣｌとした。結合を、１３×１００分-1の速度での混合で１０分間、
３７℃でサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中で行った。次いで、上清を、
ＭＰＣ磁石（Ｄｙｎａｌ）を用いてビーズから分離した。
Ｃ．結合後のプローブの蛍光検出
プローブをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ蛍光プレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ
Ｓ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）を用いて、切断されたプローブを含む上清をＭｉｃ
ｒｏＦｌｕｏｒ「Ｕ」黒色丸底プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ、Ｃｈａｎｔｉｌｌ
ｙ、ＶＡ）ウェル中に配置することによって結合後に検出した。サンプルを含む
各ウェルへ、１５０μｌの０．２２Ｍ ＤＥＡ ｐＨ１０を添加した。ウェル中
の泡をＫｉｍｗｉｐｅ（Ｒｏｓｗｅｌｌ、ＧＡ）の端を使用してすべて取り除い
た。プレートをプレートリーダー中で４８５ｎｍの励起波長、５３８ｎｍの発光
波長、および２０×０．１秒のスキャン／ウェル時間を用いて室温でスキャンし
た。Ｂｅａｃｏｎ−２０００チューブリーダー（Ｐａｎｖｅｒａ、Ｍａｄｉｓｏ
ｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いた類似の検出を、プローブを含む上清を、１１
μｌの２．０Ｍ ＤＥＡ、ｐＨ１０を含むホウ珪素ガラスチューブ（Ｋｉｍｂｌ
ｅ、Ｔｏｌｅｄｏ、ＯＨ）中に配置することによって行った。次いで、サンプル
をボルテックスし、そして蛍光強度を、Ｂｅａｃｏｎ−２０００装置の静止モー
ドを使用して測定した。励起波長および発光波長は、それぞれ、４８５ｎｍおよ
び５１５ｎｍであり、そして２５℃での１０リードサイクルの平均を使用した。
Ｄ．ＭＲＳＡまたはＭＳＳＡの粗溶解物を用いたＣＰＴ手順
アッセイは、５’末端をフルオレセインで、および３’末端を３つのビオチン
で標識したキメラプローブＦｍｅｃＡ９４５−２９（ＸＬ）4Ｂ3（配列番号５）
を用いた。粗溶解物を用いたサイクル反応を２５μｌの粗溶解物を含む５０μｌ
反応物中で行った。溶解物を、９５℃で２分間変性させた。ＣＰＴ反応を行い、
そして最終条件は以下のとおりであった：５０μｌの最終反応容量中に、１ｐｍ
ｏｌキメラプローブ、２５μｌの粗溶解物、５０μＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭス
ペルミン、１．５μｇのＲＮａｓｅ Ｈ。すべての反応を、６０℃の水浴中で、
微量遠沈管（蓋をしていない）中で５０分間サイクルさせた。反応を、水浴中に
なお存在させながら等量の希釈したビーズ（５０μｇのビーズ／サイクル緩衝液
およびＮａＣｌ中の１反応物）を添加して終結させた。結合および検出を、上記
に記載のとおりに行った。正味の相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、ＭＲＳＡとＭＳＳ
Ａとの間の蛍光強度の差異として計算する。
Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎプレートリーダーを５８の単離物の初期臨床スクリーニ
ングにおいて使用して蛍光を測定した。これらの結果を図５に頻度分布ヒストグ
ラムとしてまとめる。手短には、これらの結果は、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡ単離
物が、２つの重複していない集団として容易に識別され得ることを示し、そして
、アッセイが培養およびＰＣＲ解像度と比較してｍｅｃＡ遺伝子の検出について
１００％の感度および１００％の特異性を有すると結論付けられた（実施例５を
参照のこと）。
続くアッセイにおいて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単離物（ＭＳＳＡまたはＭＲＳＡの
いずれか）を、Ｂｅａｃｏｎ−２０００チューブ蛍光測定器を用いて、１ｐｍｏ
ｌのプローブを用いたＤＦＡによってアッセイする。Ｂｅａｃｏｎ−２０００を
用いた１２０の単離物のスクリーニング結果を図６に示す。ＭＳＳＡサンプルの
範囲は、５８．１〜１０１．７ＲＦＵであり、そしてＭＲＳＡサンプルの範囲は
、
１４４．２〜１９１，９である。ＭＳＳＡサンプルの最高と、ＭＲＳＡサンプル
の最低との間の正味のギャップは４２．５ＲＦＵである。このスクリーニングに
おいて、１つの感受性の単離物が耐性の単離物として誤って同定され、１００％
の感度および９８％の特異性を与えた。この誤った同定は、ＭＳＳＡサンプルの
不完全な溶解に起因していた。この株は、より長い溶解時間を用いて再試験をし
た場合には正確に同定された（データは示さず）。
上記の実施例は、ｍｅｃＡ９４５−２９プローブ配列が、直接ＣＰＴ蛍光アッ
セイを用いた粗溶解物において、そしてｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種のｍｅ
ｃＡ遺伝子の検出について非常に特異的かつ高感度であることを実証する。
実施例１０
以下の実施例は、少数のＰＣＲサイクル後のＰＣＲアンプリコンの迅速な検出
についてのＣＰＴの有用性を実証する。
ＭＲＳＡ由来のｍｅｃＡ遺伝子をモデル系として使用した。最初に、ＰＣＲを
実施し、次いでＣＰＴを行い、そして検出を、酵素免疫アッセイ（ＣＰＴ−ＥＩ
Ａ）によって行った。ＣＰＴ−ＥＩＡアッセイは、上記の実施例７に記載されて
おり、そして図３に例示されている。ＣＰＴ−ＥＩＡによるアンプリコン検出の
ための手順を、図７に示す。
ＭＳＳＡ株（ＡＴＣＣ１１６３２）およびＭＲＳＡ株（ＡＴＣＣ ３３５９２
）の粗溶解物を３７℃で、５％のヒツジ血液（ＰＭＬ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌｓ、Ｔｕａｌａｔｉｎ、ＯＲ）を有するトリプシン消化ダイズ寒天上で
増殖させた。細胞懸濁物を、ＴＥＳ緩衝液（２０ｍＭ ＴＥＳ（ｐＨ６．８）、
０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で作製して５×ＭｃＦａｒｌａｎｄ＃
５の濁度標準（７．５×１０9細胞／ｍｌ）と等価な細胞密度を得た。細胞を、
１５０Ｕ／ｍｌアクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（
Ｗａｋｏ）を用いて２５分間、３７℃で溶解した。溶解後、細胞を、−２０℃で
保存した。適切な希釈を脱イオン滅菌水中で行った。
ＰＣＲ反応を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、６．２５ｐｍｏｌの各プライ
マ
ー（表１）および０．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ
ｍｅｒ）を含む２５μｌの反応物中で行った。ＰＴＣ−１００ Ｐｒｏｇｒａｍ
ｍａｂｌｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ
．）を、以下のＰＣＲプログラムを用いて使用した：９5℃で１０分間、２０×
（９５℃で４０秒間、５３℃で４０秒間、および７２℃で１．５分間）。反応に
、７２℃で５分間の最終の伸長工程を適用し、次いで分析の前に４℃で維持した
。ＰＣＲ反応物を、ＣＰＴによって、以下に記載するように、または２％アガロ
ースゲルおよびエチジウムブロミド（Ｅｔ−Ｂｒ）染色を用いて分析した。
２２７ｂｐのｍｅｃＡ ＰＣＲ産物を標準として用いて、ＣＰＴ−ＥＩＡおよ
びＥｔ−Ｂｒ染色ゲルの感度を決定した。アンプリコンを、以下のように調製し
た：いくつかの１００μｌ反応物を、３０サイクルのＰＣＲに供し、そしてアン
プリコンをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ精製キットを用いて製造者によって推奨される
とおりに精製した。２２７ｂｐの産物を、分光光度計によって定量し、そして標
準として用いた。
アンプリコン産物の量を、以下の式を用いて見積もった：Ｎ＝Ｎ0（１＋Ｅ）n
、ここで、Ｎはアンプリコン分子の数であり、Ｎ0は標的分子の出発量であり、
ｎはサイクル数であり、そしてＥはＰＣＲ効率である。
表４．ＰＣＲプライマーおよびＣＰＴプローブ配列。文字は以下を示す：大文字
はＤＮＡであり、小文字はＲＮＡであり、Ｆはフルオレセインであり、そしてＢ
はビオチンである。
ＣＰＴ−ＥＩＡ。２５μｌのＰＣＲ反応物を、９５℃で２分間熱変性させ、次
いで５４℃に配置した。この２５μｌにおけるＣＰＴ成分に、ＰＣＲ反応物を添
加して、ＣＰＴ反応容量を、５０μｌとした。ＰＣＲ成分に加えて、反応物は以
下を含んだ：２０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ６．８、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．０５％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭスペルミン、１０ｆｍｏ
ｌ ＦｍｅｃＡ９４５−２９Ｂプローブ（表４）および１．４２μｇ ＲＮａｓ
ｅ Ｈ。ＣＰＴ反応物を、５４℃で３０分間インキュベートし、そしてＰｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ＤＡＫＯ、Ｍｉｓｓｉ
ｓｓａｕｇａ、ＯＮ）中で結合体化させた、１／６００希釈の抗フルオレセイン
ＨＲＰ（ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を含む１００μｌの結合試薬を用いて終
結させた。
５４℃から取り出したあと、サンプルを室温で３分間冷却させた。次いで、サ
ンプルを、ストレプトアビジンコートストリップウェル（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）へと移し、そして振盪させながら、１０分間室温でインキ
ュベートした。ウェルを、洗浄緩衝液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ Ｋ
Ｃｌ、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１０．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、０．５％Ｔｗｅ
ｅｎ ２０、２０ｐｐｍ ＰｒｏＣｌｉｎ ３００、ｐＨ７．３））を用いて２
回洗浄し、次いで２００μｌのＳｉｎｇｌｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＴＭＢ Ｐ
ｅｒｏｓｉｄａｓｅ ＥＩＡ基質（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を
添加した。３分後、発色を、検出終結試薬（７５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．５％
ＳＤＳ、２０ｐｐｍ ＰｒｏＣＬｉｎ３００、ｐＨ７．７）を用いて停止させ、
そしてプレートをＯＤ６５０ｎｍで、Ｖｍａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて読み取った。正味のＯ
Ｄ650（＝ＯＤcontrol−ＯＤsample）を用いて、特異的な標的の存在を特徴付け
た。標的をサイクルさせた回数（Ｔ）を以下のように見積もった：Ｔ＝切断され
た分子数／標的分子の数。
標準的なｍｅｃＡ２２７ｂｐアンプリコンを用いたＣＰＴ−ＥＩＡの検出感度
が５０ａｍｏｌ、すなわち７．６ｐｇ（図８Ａ？）であったことが見い出された
。同じアンプリコンを使用すると、Ｅｔ−Ｂｒ染色アガロースゲルの検出限界が
５０，０００ａｍｏｌすなわち７．６ｐｇ（図８Ｂ？）であった。従って、ＣＰ
Ｔ ＥＩＡ検出の感度は、Ｅｔ−Ｂｒ検出よりも３桁（ｌｏｇ）良好であった。
さらに、ゲルによる分析についての１．５時間と比較して、標準的なアンプリコ
ン
のＣＰＴ−ＥＩＡによる分析には約１時間かかった。ＣＰＴ−ＥＩＡによる分析
は、半定量的であるのに対して、ゲルによる分析は定性的である。
ＣＰＴ−ＥＩＡを、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡの粗溶解物の連続希釈物から調製
したＰＣＲアンプリコンを使用して行った。図９における結果は、ＣＰＴ−ＥＩ
Ａが、１００以上のＭＲＳＡ細胞を用いて開始した２０サイクルのＰＣＲ反応か
らのアンプリコンを検出し得たことを示した。ＭＳＳＡを用いて観察されたシグ
ナルは、バックグラウンドと等価であった。ゲルによって分析された類似の反応
は、Ｅｔ−Ｂｒ染色でのバンドを検出するために、１００，０００細胞を用いて
開始したＰＣＲ反応を必要とした（図１０）。
プローブの８０％が、サンプルと等価な１００のＭＲＳＡ細胞を用いて切断さ
れると見積もられた。ＰＣＲの効率が１００％であると仮定すると、反応におい
て生成された分子数は、１７５ａｍｏｌである。従って、標的がＣＰＴにおいて
サイクルされた回数は、少なくとも５０である。この増幅を用いれば、通常のＰ
ＣＲ実験（３０以上のサイクル）よりも有意に少ないサイクル（２０）を使用す
ることが可能である。より少ないサイクルを用いることには２つの利点がある。
第一に、上記に言及したようにアンプリコンの持ち越しの機会が減少し、そして
第二にＰＣＲ反応についての時間が１時間短縮される。非常に迅速なサーモサイ
クラーが近年開発されているが、ほとんどのサーモサイクラーは、２０サイクル
についての２時間と比較して、３０サイクルのＰＣＲについて約３時間必要とす
る。ＰＣＲ−ＣＰＴに必要な時間の合計は、３時間未満である。
ＰＣＲサイクルの数は、１００のＭＲＳＡまたはＭＳＳＡ細胞の等価物を用い
れば２０と４０との間で変動する。ＣＰＴ−ＥＩＡは、２０サイクルのＰＣＲ後
にＭＲＳＡサンプルを検出した（図１１Ａ）が、ゲルアガロース分析は、３０サ
イクル後にやっとサンプルを検出した（図１１Ｂ）。２０に対する３０のＰＣＲ
サイクルにおいて生成されるアンプリコンの数における理論的な差異は、それぞ
れ、１７５ａｍｏｌに対して１７５ｆｍｏｌである。これは、１０００倍の感度
の差異に対応する。これは、上記に記載の実験と一致する。
装置を必要とせずに特異的な標的の存在または非存在を可視的に識別すること
が可能であった（データは示さず）。特異的な標的の存在は、プローブの切断に
起因して青色の非常にわずかまたは非存在によって示されるが、他方、標的の非
存在は、濃い青色をもたらす。
迅速さおよび夾雑の危険の低減に加えて、ＰＣＲ−ＣＰＴは、ＰＣＲに第二の
レベルの特異性を付加する。実際、ＣＰＴは、ハイブリダイゼーションに基づく
。そして、使用した条件下においては、非特異的なアンプリコンは検出されない
。この方法は、一歩前進であり、そして特定の適用においてサザンまたはネステ
ィドＰＣＲの使用、および高度に特殊な検出手段の使用を排除し得る。
ＣＰＴは、ＰＣＲアンプリコンの迅速かつ正確な検出を可能にする。さらに、
ＣＰＴは、第二のレベルの増幅を付加するが、標的をさらに増幅することはない
。従って、有意により少ない回数のＰＣＲサイクルを使用することが可能である
。これは、夾雑および擬陽性の機会を減少させる。ＣＰＴは、第二のレベルの特
異性（これは、非特異的なアンプリコンおよびプライマーダイマーの検出を妨害
する）を付加する。ＰＣＲ−ＣＰＴ法もまた、ミスマッチ遺伝子検出について使
用され得る。
上記のことから、本発明の特定の実施態様が本明細書において例示の目的で記
載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくな
され得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲による以外に
は限定されない。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:45） Ｃ１２Ｒ 1:445）
(Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(31)優先権主張番号 ６０／０９０，２７６
(32)優先日 平成10年６月22日(1998．6．22)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，
ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ
Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ
，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，
ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ
Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，
ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ
Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 クロニー，リン ピー.
カナダ国 ブイ５ワイ ３ジェイ８ ブリ
ティッシュ コロンビア，バンクーバー,
エリザベス ストリート 5438
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を決定するための 方法であって： (a)該生物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的１本鎖核酸分子を 露出する工程； (b)該標的１本鎖核酸分子と、該抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的であ る、切断されやすい結合を含む核酸プローブと、２本鎖の標的-プローブ複合体 を切断する酵素とを、標的およびプローブが、該２本鎖の標的−プローブ複合体 を形成させるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる条件下で反応 させる工程であって、該酵素分子は、１つ以上の該核酸プローブのフラグメント が該複合体から放出されるように、該標的−プローブ複合体の該切断されやすい 結合を切断し得る、工程； および (c)該核酸プローブの切断された部分が生成されるか否かを決定する工程であ って、それによって、該抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出する工程、 を包含する、方法。 ２．前記決定する工程が、切断されなかったプローブの量の減少を検出する工程 であって、それによって、該核酸プローブの切断された部分が生成されるか否か を決定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。 ３．前記決定する工程が、前記核酸プローブの切断された部分を直接検出する工 程を包含する、請求項１に記載の方法。 ４．前記プローブが、本質的に以下のヌクレオチド配列： ５．前記プローブが、本質的に以下のヌクレオチド配列：の少なくとも一部分からなる、請求項１に記載の方法。 ６．前記プローブが、以下のヌクレオチド配列： を有する、請求項２に記載の方法。 ７．前記プローブが、本質的に以下のヌクレオチド配列： ここで、大文字は、デオキシリボヌクレオチドを表し、そして小文字は、リボヌ クレオチドを表す、からなる、請求項１に記載の方法。 ８．前記mecA遺伝子が、ブドウ球菌種に由来する、請求項１に記載の方法。 ９．前記mecA遺伝子が、コアギュラーゼ陽性ブドウ球菌種に由来する、請求項８ に記載の方法。 １０．前記mecA遺伝子が、S.aureusに由来する、請求項９に記載の方法。 １１．前記mecA遺伝子が、コアギュラーゼ陰性ブドウ球菌種からなる群に由来す る、請求項８に記載の方法。 １２．前記mecA遺伝子が、S.epidermidisに由来する、請求項１１に記載の方法 。 １３．前記生物学的サンプルが、鼻粘膜拭い液、血液、尿、糞便、膿瘍、または 髄液からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 １４．前記生物学的サンプルが、細菌増殖培地において最初に増殖されたかまた は単離された、請求項１に記載の方法。 １５．生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出するため のプローブであって、該プローブが以下の配列：を含む、プローブ。 １６．生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出するため のキットであって、(a)１つ以上の切断されやすい結合を含む核酸プローブ、お よび(b)該プローブが標的に結合される場合、該切断されやすい結合を切断し得 る酵素を含む、キット。 １７．前記酵素がRNaseHである、請求項１６に記載のキット。 １８．前記mecA遺伝子が、ブドウ球菌種に由来する、請求項１６に記載のキット 。
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