JP2002509436A - メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法 - Google Patents

メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法

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Abstract

(57)【要約】 生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を決定するための組成物および方法が提供され、これには以下の一般的工程が包含される:(a)生物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的1本鎖核酸分子を露出する工程;(b)標的1本鎖核酸と、抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的である、切断されやすい(scissile)結合を含む核酸と、2本鎖の標的-プローブ複合体を切断する酵素とを、標的およびプローブが、2本鎖の標的−プローブ複合体を形成させるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる条件下で反応させる工程であって、この酵素分子は、1つ以上の核酸プローブのフラグメントが上記の複合体から放出されるように標的−プローブ複合体の切断されやすい結合を切断し得る、工程;および(c)上記の核酸プローブから放出された、検出するプローブのフラグメントの切断された部分が生成されるか否かを決定する工程であって、それによって、抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出する工程。

Description

【発明の詳細な説明】 メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法 技術分野 本発明は、一般的に医学的診断に関し、そしてより詳細には、メチシリン耐性 ブドウ球菌のmecA遺伝子を検出するための方法、プローブおよびプライマーに関 する。 発明の背景 Staphylococcus aureus(MRSA)によるメチシリンに対する耐性は、急速に全世 界に伝播した、極めて毒性の抗生物質耐性形態のStaphylococcus aureusである 。MRSAは、多くの病院で一般的に見出されており、1%未満から80%超の範囲で 蔓延している(PittetおよびWaldvogel、Q.J.Med.239-241,1997)。不運なことに 、もはや、MRSAは、病院に関連した病原体であると見なされるだけではない。な ぜなら、共同体で獲得されるMRSAもまた増加しつつあるからである。 メチシリン耐性Staphylococcus aureusは、通常のペニシリン結合タンパク質( PBP)に加えて、PBP2aまたはPBP2'と呼ばれる、低親和性PBPの発現によって引き 起こされる(HartmanおよびTomasz、J.Bacteriol.158:513-516;1984;Murakami およびTomasz、J.Bacteriol.171:874-879;1989)。PBP2'をコードする応答性mec A遺伝子(mecA)は、耐性株において存在するが、PBPに感受性ではなく(Hartmanお よびTomasz、J.Bacteriol.158:513-516;1984;Matsuhashiら、J.Bacteriol.167 .975-980;1986)、株間にわずかな配列変動があるに過ぎない(Ryffelら、Gene94 :137-138,1990)。mecA遺伝子を有するMRSA株はまた、アミノグリコシド系、マク ロライド系、キノロン系、β-ラクタム系、モノバクタム、イミペネム、メロペ ネムのような他の抗生物質に対する耐性を示す傾向がある(Mapleら、LancetI:5 37-540、1989;Kayser、Chemotherapy 42(増補2):2-12;Bowler、Q.J.Med.90: 243-246,1997に引用されるChambersら)。 いくつかのS.aureus株は、mecA遺伝子の発現について不均一性を示し得る(Har tmanら、Antimicrob.Agents Chemother.29:85-92,1986;Hiramatsuら,Microblol. Immunol.36:445-453,1992;Ryffelら、Antimicrob.Agents Chemother.38:724-728 ,1994)。これらの集団内においては、全ての細胞がmecAを有するが、大部分の細 胞は、低濃度の抗生物質に感受性であり、わずかな細胞が(105〜106に1つ)、耐 性を発現するに過ぎない(Hackbarthら、Antimicrob.Agents Chemother.33:991-9 94,1989;Ryffelら、Antimicrob.Agents Chemother.38:724-728,1994)。結論と して、これらの株は、低MICを示し、そしてメチシリン感受性であると間違って 特徴付けられ得る。逆に、いくつかのmecA遺伝子を欠失するS.aureus株は、耐性 の機構を交替することに起因して、メチシリンに対して境界型または低レベルの 耐性を示し得る(Chambersら、Antimicrob.Agents Chemother.33:424-428,1989; Hiramatsuら、前出)。過剰なβ-ラクタマーゼ産生、メチシリナーゼ産生、また は改変されたBPBの合成(Knappら、J.Clin.Microbiol.34:1603-1605,1996;McDou galら、J.Clin.Microbiol.23:832-839,1986;Tomazsら、Antimicrob.Agents Che mother.33:1869-1874,1989)に起因して、低レベルのメチシリン耐性は、従来の 感受性試験によってMRSAであると間違って診断され得る。 メチシリン耐性Staphylococcus(MRS)種の伝播の予防および処置のための迅速 な検出は、ともに、全世界の優先事項になっている。MRSを検出するための診断 分野には、多くの利用可能な技術が存在し、これらには、従来の生化学的試験お よび免疫学的試験が挙げられる。例えば、MRSの検出のために受け入れられた1 つの方法は、4% NaClおよび6μg/mlのオキサシリンを含有するMueller-Hinto n寒天における単離物についてのスクリーニングである。今や、多くの研究機関 が、Microscan API(Dade)およびVitek GPS-SAカード(bioMerieux,Hazlewood,MO) のような自動化スクリーニング系を使用している。これは、24時間以内に感受性 ockeysville,MD)は、4〜6時間後の診断を可能にする、より迅速な感受性試験 である(Walletら、J.Antimicrobiol.Chemother.37:901-909;Martlnezら、Rev.E sp.Quimioterap.9:130-133,1996)。しかし、感受性試験は、不均質のMRSAと境界 型オキサシリン耐性S.aureusとの間では信頼できる区別をまったくすることがで きない(BORSA、Knappら、前出;Lencastreら、Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Di s.12:S13-S18)。 多くのこれら技術はまた、検出の時間、特異性および感受性の欠如に関する欠 点を有する。このような論点に注意を向けるために、ポリメラーゼ連鎖反応(「P CR」)を利用するmecA遺伝子の検出がまた、試みられてきた。簡潔には、PCRは、 mecA遺伝子を検出するためのいくつかの研究において用いられてきたが、この方 法を使用する試験結果は高価であり、かつ6時間を要し得る(Walletら、前出)。 さらに、このような方法と関連した多くの問題が存在し、これらには、バックグ ラウンド夾雑、持ち越し夾雑(carry over contamination)、サーモサイクリング 、特定の部屋が必要であること、必要なプライマーおよびプローブの数を考慮す る扱いにくさ、サンプルプロセシングに関与する工程の数および時間、ならびに 必要とされる特別の訓練が挙げられる。その高感受性および多重適用に起因して 分子生物学分野においてPCRが広範に使用されているにも関わらず、FDA認可PCR または他の標的増幅ベースの診断製品が、わずかに存在するに過ぎない。診療診 断設定におけるこれらの技術の使用を制限する主な因子は、アンプリコン夾雑と いう本質的な問題である。夾雑の問題を低減するかまたは排除するために開発さ れた化学的または物理学的方法がいくつか存在する。一般的に、これらの方法は 、余分な工程が加えられ、かつ高価である。 上記の方法を使用してMRSAを検出し得るが、院内外の設置においてmecA遺伝子 を検出するための、迅速で、使いやすく、かつ信頼できる方法の差し迫った必要 性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たすmecA遺伝子を検出するための プローブ、プライマー、および方法を提供する。さらに、本発明は、他の関連す る利点を提供する。 発明の要旨 簡潔に述べると、本発明は、メチシリン耐性ブドウ球菌のmecA遺伝子を検出す るための組成物および方法を提供する。 本発明の1つの局面において、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺 伝子の存在を決定するための方法が提供され、これには以下の工程が包含される :(a)生物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的1本鎖核酸分子を 露出する工程、(b)標的1本鎖核酸と、抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的 である、切断されやすい(scissile)結合を含む核酸プローブと、2本鎖の標的- プローブ複合体を切断する酵素とを、標的およびプローブが、2本鎖の標的-プ ローブ複合体を形成させるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる 条件下で反応させる工程であって、この酵素分子は、1つ以上の核酸プローブの フラグメントが上記の複合体から放出されるように標的−プローブ複合体の切断 されやすい結合を切断し得る、工程、および(c)核酸プローブの切断された部分 が生成されるか否かを決定する工程であって、それによって、抗生物質耐性mecA 遺伝子の存在を検出する工程。種々の実施態様において、切断されたプローブが 産生されるか否かの決定は、核酸プローブの切断された部分を直接検出するかお よび/または切断されなかったプローブの量における減少を検出することによっ て達成され得る。 1つの実施態様において、プローブは、以下のヌクレオチド配列: の少なくとも一部分を含む。さらなる実施態様において、プローブは、本質的に 以下のヌクレオチド配列: の少なくとも一部分からなる。他の代表的なプローブは、以下: を含み、ここで、大文字は、デオキシリボヌクレオチドを示し、そして小文字は 、リボヌクレオチドを示す。本明細書中に利用されるように、プローブは、少な くとも8ヌクレオチド長であるべきであり、そして10、12、14、15、16、18、20 、30、またはさらに100以上のヌクレオチド長であり得る。 種々の実施態様において、mecA遺伝子は、コアギュラーゼ陽性(例えば、S.aur eus)またはコアギュラーゼ陰性(例えば、S.epidemidis,S.sciuri)のいずれかの ブドウ球菌種由来である。 本発明の他の関連する局面において、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性 mecA遺伝子の存在を検出するためのプローブが提供され、ここで、上記のプロー ブは、以下の配列: の少なくとも一部分を含む。切断されやすい結合を切断する酵素(例えば、RNase H)とともにこのようなプローブを含むキットもまた提供される。 さらなる局面において、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の 存在を検出するためのキットが提供され、これは、以下を含む:(a)1つ以上の 切断されやすい結合を含む核酸プローブ、および(b)プローブが標的に結合され る場合、切断されやすい結合を切断し得る酵素。種々の実施態様において、この 酵素は、RNase Hである。さらなる実施態様において、mecA遺伝子は、ブドウ球 菌種由来である。 本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参 照する際に明らかになる。さらに、特定の手順または組成物(例えば、プラスミ ドなど)をより詳細に記載する種々の参考文献が、本明細書中に示され、従って 、これらの全体が参考として援用される。 図面の簡単な説明 図1は、サイクリングプローブ反応の1つの実施態様の模式図である。 図2は、サイクリングプローブ技術反応を使用して、粗溶解物からのmecA遺伝 子について、S.aureus、S.epidemidisを含む、285のStaphylococcus単離物をス クリーニングした結果の度数分布を示すヒストグラムである。32P標識したキメ ラプローブは、mecA945-29(配列番号6)であり、反応混合物は、1.0mMエチレン ビス(オキシエチレニトリロ)-四酢酸(EGTA)および2.0mMスペルミンの組み合わせ を含んだ。この単離物は、パーセントプローブ切断に基づいて、mecA陽性または mecA陰性に分けられ得る。 図3は、非アイソトープCPTアッセイの模式図である。1本鎖標的(I)は、CPT の触媒として作用する。プローブ(F-DNA-RNA-DNA-B)(II)およびRNase H(III)の 存在下で、プローブ-標的複合体(IV)のRNA部分は、RNase Hによって切断される 。より短い切断されたプローブフラグメントが標的から分離され、これによって 、さらなるサイクリング工程(V)のための標的DNAが再生される。西洋ワサビペル オキシダーゼとカップリングされた抗蛍光抗体(抗-F-HRP)が添加されて(VI)、反 応物は、ストレプトアビジンをコートしたプレートに移される。抗-F-HRPと結合 した未切断のプローブは、プレート(VII)を使用して捕捉される。過剰な抗体は 洗浄され(VIII)、HRP基質が添加されて(IX)、切断されなかったプローブの量を 測定する。吸光度または発色(X)は、標的DNAの量に反比例する。 図4は、蛍光化してかつビオチン化したキメラプローブFmecA945-29B(配列番 号5)を使用して、非アイソトープCPTアッセイによってmecA遺伝子の検出に基づ いた120のS.aureus臨床単離物の度数分布を示すヒストグラムである。このアッ ッセイは粗抽出物において行われ、そして単離物は、650nmにおける吸光度値(A6 50 )に基づいて、2つの非重複集団としてMRSA(mecA陽性)およびMSSA(mecA陰性) に区別され得る。 図5は、プレート形式を使用する蛍光化してかつビオチン化したキメラプロー ブを使用したCPT直接蛍光アッセイによるmecA遺伝子の検出に基づいて、58のS.a ureus臨床単離物の度数分布を示すヒストグラムである。このキメラプローブは 、FmecA945-29(XL)4B3(配列番号5)であり、CPTアッセイを粗溶解物において行 った。この単離物は、相対的蛍光単位(RFU)に基づいて、2つの非重複集団とし て、MRSA(mecA陽性)およびMSSA(mecA陰性)に区別され得る。 図6は、単一試験管形式を使用するmecA遺伝子についての120の臨床Staphyloc occus aureus単離物のブラインドスクリーニングに由来するCPT直接蛍光アッセ イにより得られた蛍光強度の結果のヒストグラムである。このキメラプローブは 、FmecA945-29(XL)4B3(配列番号5)であり、CPTアッセイを、実施例8に記載の ように、粗溶解物において行った。これらの結果は、MRSAおよびMSSA単離物が、 RFUに基づく2つの非重複集団として容易に区別され得ることを示す。 図7は、CPTによってPCRアンプリコンを検出するために、1つの実施態様を行 うためのフローチャートである。 図8は、CPT-酵素イムノアッセイ(CPT-EIA、8A)およびPCRアンプリコン標準の 検出についてEt-Br染色したアガロースゲル(8B)の比較についての結果を示す。 図9は、MRSAおよびMSSAに由来するmecA遺伝子の検出のためのエチジウムブロ ミド染色したゲル(9B)に対する、PCR CPT-EIA(9A)の感受性の比較を示す。 図10は、MRSAおよびMSSAに由来するmecA遺伝子の検出のためのCPT-EIA(10A)お よびエチジウムブロミド染色したアガロースゲル(10B)による検出におけるPCRサ イクル数の効果の結果を示す。 発明の詳細な説明 定義 「核酸分子」とは、重合体のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、こ れは、天然起源または合成起源のいずれかであり得る。核酸分子の代表的な例と しては、DNA(ds-DNAまたはss-DNA)、RNA、DNA-RNAハイブリッド、もしくは核酸 アナログ(例えば、天然に存在するヌクレオチドのα-エナンチオマー形態)から 構成されるか、またはそれを含む核酸分子が挙げられる。さらに、ヌクレオチド は、それらの糖部分、またはピリミジン塩基もしくはプリン塩基部分において改 変され得る。糖部分に対する改変の例としては、例えば、1つ以上のヒドロキシ ル基の別の基での改変または置換が挙げられる。塩基部分に対する改変としては 、アルキルまたはアシル化のピリミジンおよびプリンが挙げられる。さらに、核 酸単量体が、ホスホジエステル結合、またはこのような結合のアナログ(例えば 、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダイトなど)によ って結合され得る。 「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムDNAに組み込まれない核酸分子を いう。単離された核酸分子としては、例えば、プローブおよび合成的または組換 え的に生成された他の核酸分子が挙げられる。 「切断されやすい結合」とは、分子自体または標的核酸配列の核酸配列を全く 切断または破壊することなく、切断または破壊され得る核酸分子をいう。切断さ れやすい結合としては、2つの核酸配列を結合し、かつ結合される核酸配列を切 断することなく選択的に切断され得る、任意の結合させる化学構造が挙げられる 。切断されやすい結合は、単結合または複数単位配列であり得る。このような化 学構造の例は、RNA配列である。他の切断されやすい結合として適切な化学構造 は、DNA配列、アミノ酸配列、無塩基性ヌクレオチド配列、もしくは無塩基性ヌ クレオチド、または任意の炭水化物ポリマー(すなわち、セルロースまたはデン プン)である。切断されやすい結合が核酸配列である場合、これは、(下記に記載 される)NA1およびNA2の核酸配列とは異なる。 「切断されやすい結合を含むプローブ」とは、標的核酸分子に相補的または実 質的に相補的である公知の配列を考慮して構築される合成核酸分子をいう。特定 の実施態様において、プローブは、構造「NA1--S--NA2nを含み、ここで、NA1お よびNA2は、異なる非相補的な核酸分子であり、Sは、切断されやすい結合であり 、そしてnは、1〜10の整数である。 「リボヌクレアーゼH」(「RNase H」)とは、RNA:DNAのハイブリッド二重鎖 におけるRNA鎖を特異的に切断し得る酵素をいう(一般的には、CrouchおよびDirk ensen in Nucleases,LinnおよびRoberts編、211-241頁、Cold Spring Harbor La boratory Press,Plainview,NY,1982を参照のこと)。 従って、上記のように、生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の 存在を決定するための方法が提供され、これは、以下の工程を包含する:(a)生 物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的1本鎖核酸分子を露出する工 程、(b)標的1本鎖核酸と、抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的である、切 断されやすい結合を含む核酸プローブと、2本鎖の標的-プローブ複合体を切断 する酵素とを、標的およびプローブが、2本鎖の標的−プローブ複合体を形成さ せるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる条件下で反応させる工 程であって、この酵素分子は、1つ以上の核酸プローブのフラグメントが上記の 複合体から放出されるように標的−プローブ複合体の切断されやすい結合を切断 し得る、工程、および(c)核酸プローブの切断された部分が生成されるか否かを 決定する工程であって、それによって、抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出す る工程。このような方法を利用することによって、当業者は、試験サンプルから 同日に結果を提供し得る、正確かつ迅速な結果を生成し得る。これは、患者につ いての抗体を適切に使用し、これによって、バンコマイシンの使用を低減するこ とが可能である。なおさらに、このような方法は、急激な発生をモニターするた め、または院内外の設置において日常的に監視するために容易に利用され得る。 このような方法を利用して、生物学的サンプル内に所望の標的核酸分子の存在 を検出し得る。生物学的サンプルの代表的な例としては、培養サンプル(例えば 、細菌学的培地で増殖される)または臨床サンプル(例えば、鼻粘膜拭い液(swab) 、血液、尿、糞便、膿瘍、または髄液からのサンプルを含む)が挙げられる。標 的核酸分子を生成するための方法は、本明細書中に提供される開示によって、当 業者により容易に達成され得る(一般的に、Sambrookら.,Molecular Cloning:A L aboratory Manual(第2版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989を参照 のこと)。 上記に記載されるように、本発明の1つの局面内で、標的核酸分子は、切断さ れやすい結合を有する、相補的な一本鎖核酸プローブと反応される。簡単に言う と、切断されやすい結合を有する広範な種々の核酸プローブは、本発明の文脈内 で利用され得る。好ましくは、このプローブは、酵素(これは、切断されやすい 結合でプローブ−標的複合体を特異的に切断し得る)による切断の際に、プロー ブ部分が検出可能に放出されるように設計される(米国特許第4,876,187号、同 第5,011,769号および同第5,403,711号を参照のこと)。 本発明の好ましいプローブ分子は、一般に[(NA1)x(-S-)z(-NA2)yn構造を有 する。ここでNA1およびNA2は、核酸または核酸アナログから構成される分子であ り、-S-は切断されやすい結合であり、そしてx、yおよびzは、1〜100の整数 であり、そしてnは、1〜10の整数である。本発明の特定の特に好ましい実施態 様内で、NA1およびNA2は、3から40ヌクレオチドの範囲であり得る。そしてSが 核酸から構成される場合、NA1およびNA2は、2から20ヌクレオチドのサイズの範 囲であり得る。さらに、本発明の文脈内で利用されるように、各々のx、yおよび zは、nの各反復によって変わり得ることが理解されるべきである。本発明の種 々の実施態様内で、一本鎖プローブが使用され、一本鎖標的配列と反応するかあ るいはハイブリダイズするが、上記に記載される方法は、相補的プローブおよび 標的配 列とのペアが、二本鎖を形成するような状況のみに限定されないべきである。 一本鎖核酸分子は、標準的な技術(例えば、Sambrookら、「Molecular Clonln g:A Laboratory Mannual」,Cold Spring Harbor,1989を参照のこと)を使用 して標的細胞または生物から直接得られるかおよび/または調製され得るか、あ るいは広範な種々の技術(例えば、PCR、NASBA、RNAの逆転写、SDA、分枝鎖DNA などを含む)のいずれかを利用して調製され得る。 1つの実施態様内で、上記に記載されるようなNA1およびNA2は、DNA分子であり 、同じ配列を有してもよいし、有さなくともよい。あるいは、NA1およびNA2は、 RNA分子(これは、同じ配列を有してもよいし、有さなくてもよい)またはRNAお よびDNA分子の組合わせから構築され得る。利用されるDNA分子またはRNA分子は 、天然に存在する供給源から誘導され得るか、あるいはこれらは、合成的に形成 され得る。各々のNA1およびNA2は、約5塩基〜10,000塩基長であり得る。特定の 改変体内で、プローブおよび標的核酸分子は、好ましくは、相補的である必要は ないが、実際、1つ、2つ、3つまたはそれ以上の核酸によってわざと異なり得 る(例えば、PCT出願WO95/14106および米国特許第5,660,988号を参照のこと)。 さらなる改変体内で、標的核酸分子は、ゲノム核酸の不均質集団中に存在する。 他の実施態様内で、NA1またはNA2は、メチルホスホネート、カルバメート、ア ミデート、トリエステル、または「ペプチド核酸」(「PNA」)のような、核酸 アナログから構成され得る。例えば、PNAオリゴマーは、非常に高い特異性で相 補的な標的オリゴヌクレオチド(DNAまたはRNA)配列とハイブリダイズし得る。こ のような二本鎖は、対応するDNA-DNAまたはDNA-RNA二本鎖よりも安定である(Egh olmら、Nature 365:556-568,1993)。さらにPNAは、鎖置換によって二本鎖(ds)D NAに結合し得(Nielsenら、Science 254:1497-1500,1991)、それゆえサンプル調 製において、慣用的な二本鎖変性の必要性を除き得る。低濃度の塩(50mM/L以下 のNa+)が、一般的にdsDNAへのPNAの結合のために好ましい。中程度の濃度の塩 は、dsDNAへのPNAの二本鎖置換を通して結合を阻止し得る。しかし、一旦結合し たPNA/DNA二重鎖は、高濃度の塩に対して安定である。さらにこれらの二重鎖は また、オリゴヌクレオチド/オリゴヌクレオチド二重鎖と比べて熱的に安定であ る(PNA/DNAの二重鎖は、対応するDNA/DNAと比較して、塩基対あたり約1℃ほ ど、より安定である)。標的オリゴヌクレオチドに対する高度な配列特異性、一 旦形成した二重鎖の高塩濃度に対するより高い熱安定性および耐性の必要性に基 づくと、PNAは、しばしば本明細書に記載される方法における使用のための理想 分子である。特定の実施態様内で、2つの短いPNAが、切断されやすい結合と共 に連結され得、そして高度な配列特異的プローブとして使用され得る。 本発明のプローブはまた、一方の末端または両末端(例えば、NA1またはNA2) に付加される1つ以上の検出可能なマーカーを有し得る。マーカーは、検出され 得る実質的に任意の分子または試薬(これらの代表的な例は、放射性同位体また は放射標識された分子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素または化学発光触媒を含む) であり得る。本発明の特定の実施態様内で、プローブは、蛍光標識または酵素的 標識(例えば、消光された蛍光対、または蛍光標識および酵素標識)、またはビ オチンのような標識および結合分子(例えば、切断されるかあるいは切断されな い状態のいずれかで、このプローブは標識分子および結合分子の両方に共有結合 または非共有結合され得る)のような1つ以上の標識を含み得る(例えば、米国 特許第5,731,146号もまた参照のこと)。 上記に記載されるように、核酸プローブは、切断されやすい結合(これは、分 子自身の任意の核酸配列または標的核酸配列の、切断または破壊することなしに 切断または破壊され得る)を有する。本発明の文脈内で使用されるように、切断 されやすい結合は、任意の接続する化学的構造(これは2つの核酸配列を結合し 、そして結合される核酸配列の切断なく選択的に切断され得る)である。切断さ れやすい結合は、単一結合または複数単位配列であり得る。このような化学的構 造の例は、RNA分子であり得る。他の化学的構造(これは、切断されやすい結合 として適切であり得る)は、DNA分子、アミノ酸配列、無塩基性ヌクレオチド分 子または任意の炭水化物ポリマー(例えば、セルロースまたはデンプン)である 。切断されやすい結合が核酸分子である場合、これはNA1およびNA2の核酸配列と は異なるはずである。 上記に記載される核酸プローブにおいて、nが1よりも大きい場合、単位NA1- S-NA2は繰り返す。本明細書中に提供される開示によって当業者に容易に理解さ れべきであるように、この単位は各繰り返し内に同一であり得るか、または定義 されるパターンにおいてランダムに変化し得る。さらに、切断されやすい結合も また、単位から単位へ変化し得る。例えば、1つの切断されやすい結合は、アミ ノ酸配列であり得、そして別の切断されやすい結合は、RNA分子であり得る。 上記に記載されるように、本発明のプローブはまた、固体支持体へ直接的また は、化学的リンカーを通してのいずれかで連結され得る。固体支持体の代表的な 例は、シリカ物質、セルロース物質、ポリマーベース物質またはプラスチック物 質を含む。 本発明の特定の好ましい実施態様内で、核酸プローブは構造:[NA1-S-NA2]nを 有する。ここで、NA1およびNA2は核酸配列であり、-S-は、切断されやすい核酸 連結であり、そしてnは1から10の整数である。この実施態様内で、NA1およびN A2は、種々の核酸配列(これは、互いに非相補的である)であり、そして-S-は 、切断されやすい結合(これは、NA1もしくはNA2、またはNA1もしくはNA2配列に ハイブリダイズし得る標的核酸配列を切断または破壊することなく、切断される かまたは破壊され得る)である。ここで切断されやすい結合が核酸配列であるな らば、NA1およびNA2の両方がDNA配列である場合、これはRNAであり、またはNA1 およびNA2の両方がRNA配列である場合、切断されやすい結合はDNAである。 このような核酸プローブを構築するための方法は、本明細書中に提供される所 定の開示により、当業者によって容易に達成され得る。例えば、特に好ましい方 法は:MatteucciおよびCaruthers,J.Am.Chem.Soc.103:3185,1981;Beaucag eおよびCaruthers,Tetrahedron Lett.22:1859-1862,1981;米国特許第4,876,1 87号および同5,011,769号;Ogilvieら、Proc.Natl.Acad.Sci USA 85:8783-879 8,1987;Usmanら、J.Am.Chem.Soc.109:7845-7854,1987;Wuら、Tetrahedron Lett.29:4249-4252,1988;Chaixら、Nuc.Acids Res.17:7381-7393:1989;Wu ら、Nuc.Acids Res.17:3501-3517,1989;McBrideおよびCaruthers,Tetrahedr on Lett.24:245-248,1983;Sinhaら、Tetrahedron Lett.24:5843-5846,1983: SinhaらNuc.Acids Res.12:4539-4557,1984;およびGasparuttoら、Nuc.Acids Res.20:5159-5166,1992によって記載される。 特に好ましいプローブ(および合成の標的)は、Songら、FEBS Letters 221:1 67-171,1987(EMBL受託番号Y00688)によって記載される、S.aureus mecA遺 伝子に基づく。種々のMRSA株由来のmecAのDNA配列は、ほんの少数の変化を示す( Ryffelら、Gene 94:137-138,1990,S.aureus EMBL受託番号X52593およびS.ep idermidis EMBL受託番号X52592)。mecA遺伝子はまた、コアギュラーゼ陰性ブド ウ球菌中に分布し、そしてメチシリン耐性と関連する(Kobayashiら、Epidemiol .Infect.113:259-266,1994で引用される)。 単一のプローブが設計され、米国仮特許出願(代理人整理番号第480094.423P2) に記載されるような保存された領域または普遍的な塩基もしくは無塩基性部位の 使用または他の改変を選択することによって、一般的にmecA遺伝子を検出し得る 。 簡単にいうと、オリゴヌクレオチド合成は、各サイクルが、1ヌクレオチドご とにオリゴヌクレオチドを伸長させるサイクルにおいて達成される。各サイクル は、4つの工程からなる:(1)固体支持体上のヌクレオシドまたはオリゴヌクレ オチドの5'末端を脱保護する工程、(2)固相に固定されたヌクレオチドへ次のヌ クレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる工程、(3)固定されたヌク レオチドの数パーセントの5'OH基(これは、添加されたホスホルアミダイトにカ ップリングしない)をキャッピングする工程、および(4)オリゴヌクレオチドの連 結をホスホトリエステル連結に酸化させる工程。 オリゴヌクレオチドを合成するための、およびオリゴヌクレオチドのビオチン 化ならびに蛍光化のための代表的な方法が、実施例1に示される。検出反応 上記に記載されるように、所望の標的核酸分子の検出のための広範な種々の循 環反応は、上記に記載される一般的な工程に従って容易に実施され得る((米国特 許第5,011,769号および同第5,403,711号もまた参照のこと)。 1つの局面内で、このような方法は、一般的に(a)生物学的サンプル内に含ま れる細胞を処理して、標的一本鎖核酸分子を曝露する工程、(b)標的の一本鎖核 酸と、切断しやすい連結を含む核酸プローブ(これは、抗生物質耐性mecA遺伝子 の一部分に相補的である)と、二重鎖標的-プローブ複合体を切断する酵素とを 標的およびプローブが、二本鎖標的−プローブ複合体を形成するように、互いに ハイブリダイズさせる条件下で反応させる工程であって、この酵素分子は、核酸 プローブの1つ以上のフラグメントが標的−プローブ複合体から放出されるよう に切断されやすい結合を切断し得る工程、および(c)核酸プローブの切断部分が 産生されるかどうかを決定する工程であってそれによって抗菌性mecA遺伝子の存 在を検出する工程を含む。他の関連する局面内で、本明細書中に提供される組成 物および方法は、広範な他の/関連する方法で使用される(例えば、米国特許第5, 210,015号;同第5,487,972号;同第5,422,253号:同第5,691,142号;同第5,719,028 号;同第5,130,238号;同第5,409,818号;同第5,554,517号;同第5,589,332号;同第5 ,399,491号;同第5,480,784号;同第5,215,899号;同第5,169,766号;同第5,194,37 0号;同第5,474,916号;同第5,698,400号;同第5,656,430号;およびPCT公開番号WO 88/10215;同WO92/08800,同WO 96/02668;同WO 97/19193:同WO 97/09444;同WO96/ 21144:同WO92/22671)。 本発明の特定の実施態様内で、本明細書中に提供される検出反応は、ポリアミ ン(例えば、スペルミン)またはリボソームタンパク質(これは、反応の感受性 、特異性および/または速度を増加させる)のような添加物を使用して実施され 得る。これらのおよび他の関連する局面は、1998年5月18日に提出された米国仮 出願「ADDITIVES FOR USE IN CYCLING PROBE REACTIONS」(代理人整理番号4800 94.419P2);および1998年5月18日に提出された「METHODS FOR accelerating H YBRIDIZATION OF NUCLEIC ACID MOLECULES」(代理人整理番号480094.422P2)に 記載される。 別の実施態様において、CPTは、任意の標的増幅技術によって産生されたアン プリコンを検出するために使用され得る。実施例10は、PCRアンプリコンの検出 のためのCPT酵素イムノアッセイ(CPT-EIA)の使用を例示する。CPTは、PCRアンプ リコンの検出を迅速かつ正確にする。さらに、CPTは、標的をさらに増幅するこ とがないこと以外は、第二のレベルの増幅を付加し、そしてそれゆえ、有意に少 ないPCRサイクル数を使用することが可能になる。これは、夾雑の機会および偽 陽性を減少させる。CPTは第二のレベルの特異性(これは、非特異的アンプリコ ンおよびプライマー-ダイマーの検出を防止する)を付加する。PCR-CPT方法もま た、ミスマッチ遺伝子検出のために使用され得る。このアッセイの他の変異は、 米国特許第5,403,711号(米国特許第5,747,255号もまた参照のこと)に記載され るような「指数関数的な」循環反応を含む。 例えば、米国特許第4855240号および同第4703017号に記載されるような外側フ ローデバイス(ストリップまたはディップスティック)は、MRSAアッセイのため の検出形式のための別の実施態様を表す。ストレプトアビジンでコートしたウェ ル(すなわち、EIA形式)上の未切断mecAプローブを検出する工程に代わって、 未切断プローブは、膜(すなわち、ストリップ形式)上に染み込んだストレプト アビジンによって捕獲される。この形式を使用するいくつかの利点がある。必要 とされるさらなる検出試薬は無く、実施時間が短く、そして検出時間が短い。上 記の任意のアッセイを含むさらに適切なアッセイ形式の代表的な例は、ディップ スティック、磁気ビーズなどのような固体支持体上で実施される(一般に、米国 特許第5,639,428号;同第5,635,362号;同第5,578,270号;同第5,547,861号;同第5, 514,785号;同第5,457,027号;同第5,399,500号;同第5,369,036号;同第5,260,025 号;同第5,208,143号;同第5,204,061号;同第5,188,937号;同第5,166,054号;同第5 ,139,934号;同第5,135,847号;同第5,093,231号;同第5,073,340号;同第4,962,024 号;同第4,920,046号;同第4,904,583号;同第4,874,710号;同第4,865,997号;同第4 ,861,728号;同第4,855,240号;および同第4,847,194号を参照のこと)。 別の実施態様において、CPTは、2つのセットの核酸プローブ分子(これは、 米国特許第5,403,711号に記載されるような固体支持体上に固定される)と共に 指数関数的な形式を使用して実施され得る。このアッセイは単一の容器で実施さ れ得、信号は経時的にモニターされ得、そして非常に迅速でかつ感度良いアッセ イを生じるので、これは有利である。 なお他の実施態様において、CPT-EIAは、米国特許第5,403,711号に記載される ようにmecA遺伝子によって発現されるmRNAからcDNAを転写するために逆転写酵 素の使用、次いで、循環プローブ技術(RT-CPT)によってMRSAについての検出のた めに使用され得る。未切断プローブ特異的cDNAは、EIAによってより検出され得 る。 以下の例は、限定されるためではなく、例示によって提供される。 実施例 実施例1 核酸プローブの構築 核酸分子は、自動化固相合成機(例えば、PerSeptive Blosystems Expedite D NA synthesizer(Boston、MA)、PE Applied Biosystems,Inc.のModel 391 DNA s ynthesizer(PCR-MATE EP)またはPE Applied Biosystems,Inc.のModel 394 DNA/ RNA Synthesizer(Foster City,CA))において、標準的な化学を利用して合成さ れ得る。好ましくは、PerSeptive Biosystems Expedite DNA synthesizerが使用 され、そしてオリゴヌクレオチドを作製するための製造者の改変したプロトコル が実施される。 オリゴヌクレオチドの合成のための試薬は、合成機製造業者(例えば、PerSep tive Biosystems,PE Applied Biosystems Inc.,Glen Research(Sterling,VA) およびBiogenex)を含む、種々の供給源から市販されている。DNAおよびRNA合成 のために、好ましいフルオレセインアミダイト、デオキシヌクレオチドおよびリ ボヌクレオチドのホスホルアミダイト、2’-O-メチルおよび活性化剤、CapA、C apB、酸化剤のような試薬、およびトリチル脱ブロッキング試薬は、PerSeptive Biosystemsから入手可能である。Biotin-TEG-ホスホルアミダイトおよびBiotin- TEG-CPGは、Glen Researchから入手可能である。オリゴヌクレオチドの検出のた めに使用される水酸化アンモニウム(28%)を、Aldrichから購入する。2'-O-tert- ブチルジメチルシリル基を除去するために使用する1Mのテトラブチルアンモニウ ムフルオライド(TBAF)を、Aldrichから購入し、そして24時間の分子ふるいを 通して乾燥後に使用する。全ての緩衝液を、高圧滅菌水から調製し、そして0.2 μmフィルターを通して濾過する。 以下の手順を、ビオチン化および/または蛍光化オリゴヌクレオチドを調製す るために使用する。ビオチン-TEG-CPG(1μmol)を合成カラム中へ充填する。 次いで、ヌクレオシドホスホルアミダイトを連結して、オリゴヌクレオチドを作 製するためのPerSeptive Biosystemの改変されたプロトコルを使用して、規定さ れた核酸配列を作製する。フルオレセインアミダイトを最終濃度の0.1Mまでアセ トニトリル中に溶解する。フルオレセインアミダイトを合成機にロードし、そし てオリゴヌクレオチドの5’末端に付加する。あるいは、ホスホルアミダイトを 含むチオリンカーを、改変されたプロトコルを使用して、キメラプローブの5'末 端に付加させる。以下に記載される脱保護工程の後、このプローブをMilliporeR 2樹脂(これは、オリゴヌクレオチドを含むトリチルを保持する)を使用して、 逆相HPLCによって精製する。遊離の反応性チオ基を作製するために、HPLC精製し たプローブを室温にて90分間硝酸銀と共に、続いてジチオスレイトール(DTT)に よる硝酸銀の中和によって処理する。次いで、蛍光上清をプローブの遊離チオ基 に添加し、そして次いで、以下に記載されるようにHPLCまたは電気泳動のいずれ かによって精製する。 オリゴヌクレオチド配列の合成後、オリゴヌクレオチドに結合した樹脂を、最 初1時間室温にて、そして続いて密閉した試験管内で16時間55℃で、25%のエタ ノールアンモニウム酸化物(4ml)で処理する。試験管を冷却し、上製を除去し、 そしてアンモニアを除去するために、乾燥するまで濃縮する。残留物を1mlの 水に溶解し、そして0.2μmのフィルターを通して濾過する。OD260を決定し、そ してOD260単位が約2であるアリコートをBiocadのHPLCのR-2カラムへ注入し、キ メラプローブのtert-ブチルジメチルシリル基について、クロマトグラムにおい てベースラインを得る。 残存のプローブ溶液を1.5ml微小遠心管中で、遠心真空エバポレーター(Labcon co)によって凍結乾燥する。得られたオリゴヌクレオチド残留物を、24時間1.0M のTBAFで脱保護する。脱シリル化(これはすでに生じている)の範囲を決定する ために、pH6.5の50mMのトリエチルアンモニウムアセテート(TEAA)中、0か ら60%の直線勾配を使用して、TBAF反応混合物のアリコートをHPLC(R2カラム)へ 注入する。部分的な脱シリル化のみが生じる場合、TBAF反応混合物を、保護基の 完全な除去のためにさらに12〜16時間の間続ける。TBAF反応混合物を100mMのNaO Ac、pH5.5でクエンチングし、そして乾燥するまでエバポレートさせる。粗製の オリゴヌクレオチド産物をP-6カラム(2cm×10cm、Bio-Rad)で脱塩し、この画 分を濃縮して約1mlにし、そしてこの濃縮物をOD260で測定する。 粗オリゴヌクレオチドを、20%ポリアクリルアミド-7M尿素を使用してポリア クリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により精製する。泳動ゲル緩衝液は1×TBE(Tr is-ホウ酸-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、pH8.3)であり、そして電気泳動を50 mA電流で3.5〜4時間実行する。このオリゴヌクレオチドバンドをUV光で可視化 し、切り出し、15mlプラスチックコニカルチューブ中に入れ、そして5mlの50mM NaOAc(pH5.5)中で約12時間ゲルを破砕しそして浸たすことにより抽出した。次に 、このチューブを3000RPMで遠心分離し、パスツールピペットを用いて上清を注 意深く除去した。このゲルを2mlの抽出バッファーでリンスして、残りの生成物 をすべて取り出した。合わせた抽出物を約1mlの容量まで濃縮し、そしてP6カラ ム上で脱塩した。プローブを含む画分をプールし、そして約2mlの最終容量にま で濃縮した。オリゴヌクレオチドの分析的純度を[γ32P]-ATPおよびT4-ポリヌク レオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの5'末端をラベルすること、およ び次いでPAGE上でラベルオリゴヌクレオチドを泳動することによりチェックする 。OD260を、Hewlett Packard's 845X UV分光光度計を使用して測定する。オリゴ ヌクレオチド溶液を、0.2μmフィルターを通して濾過し、そして-20℃で保存す る。 上記の手順を利用して、以下のオリゴマーを合成し得る。これらの配列におい て、大文字はデオキシリボヌクレオチドを示すため、小文字はリボヌクレオチド を示すため、下線文字は2'-O-メチル結合を示すため、大文字Fはフルオレセイン ラベルを示すため、大文字Bはビオチンを示すため、大文字XLはXLリンカー(Gle n ResearchまたはClontechより入手可能)を示すため、そして下付け数字は指示 部分の繰り返しを示すために利用した。 実施例2 同位体サイクリングプローブ技術反応 サイクリングプローブ技術(CPT)反応および条件を、以前に公開された方法( WO 95/14106;Bekkaouiら,BioTechniques 20(2):240-248,1996)からの改変手順を 利用して実行する。簡単には、特異的なキメラのプローブを、[32P]-ATP(Du Pon t,Sambrookら,1990)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(RTG;Pharmacia Biotech ,Piscataway,NJ)を使用して放射性32Pで5'標識する。単一のチューブのRTGは15 μlの水に再懸濁する。1pmolのプローブを、5μlのγ-32PATPおよび3μlのRTG を合わせる。最終容量を水で10μlに調整し、そして37℃で30分間インキュベー トする。取り込まれなかったγ-32PATPを、G50 Nickカラム(Pharmacia)を使用す ることによりキナーゼ処理したプローブから分離する。回収したプローブはSSC 緩衝液(15mM NaCl,1.5mMクエン酸ナトリウム,pH7.0)中に0.1倍に調整し、そし て-20℃で保存する。 他に指示されなければ、CPT反応を以下:TESサイクリング緩衝液、キメラの標 識プローブ、RNase Hを順に添加してサイクリングカクテル(これを、次に試験 される、変成したサンプルに添加する)を与えることにより実行する。サイクリ ング反応混合物は、以下の最終濃度を有するTESサイクリング緩衝液(TES-CB)中 に特定の濃度のキメラプローブ、精製ゲノムDNAまたは粗溶解物標的のいずれか エチレンビス(オキシエチレンニトリロ(oxyethylenitrilo))四酢酸(EGTA)、20 mM TES緩衝剤、pH6.8。サンプル調製、試験添加物の添加、およびサイクリング 反応に使用する他の成分と特定の実施例において記載する。 他に特定されなければ、CPT反応物を、56℃で30分間インキュベートし、次い で56℃で尿素ローディング緩衝液(8M尿素、100mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA) およびそれぞれ0.25%のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール,80m Mリン酸緩衝剤)を添加することにより停止する。次いでこの反応混合物を冷却し ながら、500ボルトで7M尿素-20%アクリルアミド/ビスアクリルアミド(19.1)ゲ ル電気泳動(SDS-PAGE)により分離する。このゲルを、ImageQuantTMソフトウェア を利用するPhosphorImagerTM(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)上で分析する 。サイクルプローブの量を、インタクトなまたは切断プローブと一致するバンド の面積の積分により見積もる。 他に述べられなければ、CPT反応において、パーセントプローブ切断はインプ ットプローブの総量に対するプローブ切断の総量である(方程式番号1): パーセントプローブ切断=(プローブ切断/総インプットプローブ)×100 (1) 単純なCPT系において、C1バックグラウンドとはRNase Hも相同標的も存在し ない反応緩衝液中のパーセントプローブ切断をいう。C2とは、相同標的を伴わ ないRNase Hの存在下でのパーセントプローブ切断をいう(方程式番号2): C2=(プローブ切断/総インプットプローブ)×100 (2) 複雑なCPT系について、C3とは、RNase Hの非存在下でサンプル(異種DNAま たはタンパク質のような外来の成分を含む生物学サンプル)中のパーセントプロ ーブ切断をいう。C4とは、RNase Hの存在下であるが異種標的の非存在下での 、生物学的サンプル中のパーセントプローブ切断をいう。(方程式番号3): C4=(プローブ切断/総インプットプローブ)×100 (3) 正味のパーセントプローブ切断は、相同標的に起因するプローブ切断のパーセ ントであり、そしてパーセント切断からバックグラウンドC2(単純系)または C4(複雑系)を差し引くことにより計算される(それぞれ、方程式番号4また は5)。 正味のパーセントプローブ切断=パーセント切断C2 (4) 正味のパーセントプローブ切断=パーセント切断C4 (5) CPTについてシグナル対ノイズの比(S:N)は、C2(単純系、方程式番号6)ま たはC4(複雑系、方程式番号7)に対する、相同標的の存在下でのパーセント プローブ切断の比として定義する。 S:N=パーセント切断/C2 (6) S:N=パーセント切断/C4 (7) 実施例3 耐熱性RNase Hの調製 以下の実施例は、Thermus thermophilusから耐熱性RNase Hを調製する1つの 代表的な方法について記載する。 この耐熱性遺伝子のクローニングおよびその発現は、KanayaおよびItaya,J.Bi ol.Chem.267:10184-10192,1992による方法の改変に基づく、WO 95/05480およびB ekkaouiら,BioTechniques 20:240-248,1996に詳細に記載される。簡単には、T.t hermophilus RNase H遺伝子(KanayaおよびItaya,前出)をPCRによりベクターpT7- 7(pIDB9)中にクローニングし、ベクターpET11a(Novagen)中にサブクローンし、 プラスミドpIDB33を生じた。続いてプラスミドpIDB33で、細菌株BL21(DE3)(Nova gen,Madison,WI)を形質転換する。pIDB33を含むBL21(DE3)細胞を、0.1mg/mlアン ピシリンを含むLB培地(Sambrookら、1990)中に37℃で増殖する。培養物が0.6〜0 .8、OD600であるときにIPTGを0.5mMの最終濃度になるように添加し、そして細胞 をさらに4時間培養する。RNase Hは、pIDB33構築物を有する封入体中に発現す る。 細胞を3000×gで4℃15分間の遠心分離により採取する。細胞ペレットを、5ml のTEバッファー(10mM Tris,pH7.4、1mM EDTA緩衝液)中に、1g新鮮重で再懸濁す る。この細胞を、超音波処理器(Branson,モデル450)を使用してドライアイス/ エタノール槽中で溶解し、そして15000x gで4℃30分間で遠心分離する。このペ レットを、TE緩衝液pH8.0中の7M尿素に再懸濁し、そして4℃で2時間攪拌し ながらインキュベートする。再懸濁した細胞を氷上で2分間超音波処理し、次い で12,000×gで10分間の遠心分離を行い、そして上清液を採取して11の尿素酢酸 ナトリウム緩衝液(8M尿素、20mM酢酸ナトリウム、pH5.5)を2回交換して一晩透 析する。20分間31,000×gの遠心分離後、明瞭なタンパク質上清溶液(150ml) を収集し、そして約25mlの予め膨潤したホスホセルロース(カラム緩衝液中で2 回平衡化した、P11、Whatman International Ltd.,Kent,UK)と3時間混合する。 得られたスラリーを尿素酢酸ナトリウム緩衝液で2回洗浄し、そしてカラムに注 ぐ。このカラムを尿素酢酸ナトリウム緩衝液中140mMおよび210mMNaClで2回洗浄 したFPLCシステム(Pharmacia)および工程に連結する。次にこのタンパク質を、 尿素酢酸ナトリウム緩衝液中0.21〜0.7M NaCl直線勾配を使用して溶出する。こ のカラムを、この塩勾配の終わりに、この全てのタンパク質が溶出するまで0.7M NaClに維持する。画分をSDS-PAGEで解析し、そしてRNase Hを含む画分をプール し、そして、20mM酢酸ナトリウム、pH5.5中、150mM NaClを含む緩衝液を有するS ephadex G-25カラムを使用して脱塩した。溶出したタンパク質画分を、プールし 、Centriprep 10フィルター(Amicon,Beverly,MA)で濃縮し、そしてグリセロール 保存緩衝液中-20℃で保存する(40%グリセロール、150mM NaClおよび20mM酢酸ナ トリウム、pH5.5)。 実施例4 CPT反応を使用したmecA遺伝子の検出によるStaphylococcus aureusの メチシリン耐性状態の決定 以下の実施例は、S.aureus単離物の粗溶解物からのmecA遺伝子の検出について の、キメラプローブmecA945-29(配列番号5)の有用性ならびにCPT反応における スペルミンおよびEGTAの有効性を実証する。 この実験を、粗溶解物を使用したMRSA単離物のmecA遺伝子の検出について、CP T反応におけるスペルミンおよびEGTAの効果を試験するように設計した。 この実験について、MRSA(ATCC 33592,アメリカンタイプカルチャーコレクショ ン、Rockville、MD)およびMSSA(ATTC 11632)単離物を、37℃で一晩、5%ヒツジ 血液(PML Microbiologics,Richmond,BC)でトリプティカーゼ(trypticase)ダイ ズ寒天(TSA)プレート上で増殖した。滅菌スワブを使用してTSAプレートからこの コロニーを取りだし、次に2mlの20mM TES緩衝液(pH6.8)中の0.05%Triton X-1 度(約1.5x109細胞/ml)に調整した。次に50μlの細胞懸濁液(約7.5x107細胞) を微量遠心管に移した。この細胞の溶解を、アクロモペプチダーゼ(achromo pep tidase)(Wako Bioproducts,Richmond,VA)を、1サンプルあたり最終濃度の150ユ ニット/mlに添加して実施した。この懸濁液を混合し、そして37℃で20分間イン キュベートした。 このキメラプローブmecA945-29を、実施例1および2に記載したとおりに、合 成および標識した。耐熱性RNaseHを実施例3に記載したとおりに生成した。CPT 反応および解析を、以下を除いて実施例2のとおりに実施した:1.8fmol mecA94 5-29キメラプローブを使用し、そして試験した添加濃度は1mM EDTA、2mMスペル ミンまたは1mM EDTAおよび2mMスペルミンの組み合せであった。50μlの粗溶解物 サンプルを、95℃5分間でヒーティングブロック中で熱変成させ、次に、58℃水 浴に直接移した(反応温度は56℃であった)。反応カクテル(50μl)を直ちに添 加し、そしてインキュベーションをさらに20分間続けた。インキュベーションの 終わりに、水浴中で40mM PB(100μl)を含む等量のローディング色素をこのサン プルに添加した。次にサンプルを95℃のヒーティングブロックに5分間移した。 サンプルを手短に遠沈し、そして20μlを電気泳動のためにアクリルアミドゲル にロードした。表1はMRSA溶解物からmecA遺伝子の検出のためのCPT反応中スペ ルミンおよびEGTAの効果の結果を要約する。簡単には、スペルミンおよびEGTAの 非存在下では、高いC4バックグラウンドに起因して単離物MRSAとMSSAとの間で 区別がなかったことが観察される。EGTA単独の添加は、MRSAおよびMSSAの両方中 のパーセントプローブ切断を減少したが、まだなおこの2者間の区別を可能にし なかった。CPT反応物へのスペルミン単独の添加は、C4バックグラウンドを低 下することによりMRSAの検出が可能になり、約5のシグナル対ノイズの比をもた らした。CPT反応物へのEGTAおよびスペルミンの両方の添加は、標的の検出を劇 的に改良した。表1に見られるように、C4バックグラウンドに主な減少があり 、そしてmecA MRSAは20ので顕著なシグナル対ノイズの比で検出し得た。これら の結果は、MRSA単離物とMSSA単離物との間で明らかな区別を得るために、サイク リング反応物へのスペルミンおよびEGTA両方の添加の必要性を明らかに示す。 表1.MRSAの粗溶解物からmecA遺伝子の検出のためのCPT反応中のスペルミンおよ びEGTAの効果 上記実施例は、添加物スペルミンおよびEGTAの存在下で、mecA遺伝子検出によ ってMSSAからMRSAを区別するための、同位体標識したキメラのmecA945-29プロー ブの成功した使用を実証する。 実施例5 CPT反応を使用するmecA遺伝子の検出による、 メチシリン耐性ブドウ球菌単離物の臨床スクリーニング 以下の実施例は、ブドウ球菌臨床単離物の粗溶解物からmecA遺伝子を検出する ためのCPT反応における、同位体標識されたキメラプローブおよび付加物(スペ ルミンおよびEGTA)の首尾よい使用を示す。 この実験は、32P標識キメラプローブmecA945-29(配列番号5)の使用、なら びに285個のブドウ球菌単離物の粗溶解物からmecA遺伝子を検出するためのCPT反 応におけるスペルミン(2.0mM)とEGTA(1.0mM)との組み合わせを試験する。こ れらの単離物は、以下の供給源に由来した:Wishart Memorial Hospital(India na polis,IN)、Cleveland Clinic Foundation(Cleveland,0hio)、Vancouve r General Hospital(Vancouver,BC)および25個の参照株。全部で、238個のS .aureusおよび47個のS.epidermidis単離物であった。 粗溶解物調製、プローブ合成、CPT手順、および分析を、1μlのプラスチック ループ(PML Microbiological,Richmond,BC,Canada)を用いてTSA血液プレート から細胞を採取して、50μlの20mM TES緩衝液(pH6.8)中の0.05%Triton X- 施例4に記載されるように、アクロモペプチラーゼ(achromopeptidase)(Wako Bioproducts)を添加して溶解した。DNAを、使用前に95℃で5分間、熱変性さ せた。実験は、オペレーターブラインド研究として行なった。単離物もまた、4 %NaClを使用するE試験を使用して、従来のオキサシリンスクリーニング寒天(PM L Microbiological)、Kirby-Bauer Disc拡散、最小阻害濃度(MIC)によっ eckton Dickinson)を用いて試験した。 CPT反応結果をオキサシリン寒天スクリーニングと比較した場合、4つの矛盾 したサンプルが見つかった。これらの単離物は、寒天スクリーニング陽性である が、CPT陰性であることが観察された。PCRによる矛盾した解析(実施例7)の後 、mecA遺伝子がこれらの単離物において存在しないことが確認された。上記の実 験結果は、単離物の数対パーセントプローブ切断の頻度分布ヒストグラムとして 図2に示される。簡潔には、パーセントプローブ切断の頻度分布は、オペレータ ーブラインド研究を使用して、mecA遺伝子の存在または非存在に基づいて、単離 物を2つの異なる集団に分離する。 この研究において使用される各々の感受性試験は、いくつかのブドウ球菌単離 物を正確に同定し損なった。金の標準オキサシリン寒天スクリーニングは、4つ のS.aureus単離物をMRSAと同定したが、mecA遺伝子は存在しないことが示され た。これらの4つの単離物の各々は、オキサシリンに対する境界型耐性(MICの 3〜16μg/ml)を示し、そしてMIC E試験およびオキサシリンディスク拡散によ ってさらに誤って同定された。これらの4つの単離物のうちの1つは、さらにBB L Crystal ID MRSA Systemによって誤って同定された。mecA遺伝子を欠如するさ らなる31個のS.aureus単離物は、オキサシリンMICの3〜12μg/mlでのE試験に よってMRSAと称され、そしてこれらの単離物のうちの2つもまた、オキサシリン ディスク拡散によって間違われた。これらの境界型オキサシリン耐性S.aureus (BORSA)単離物の各々は、ディスク拡散によるclavulanic acidの存在において 、オキサシリンに感受性であることがさらに示された。 従来の感受性試験は、オキサシリン境界型感受性S.aureus単離物と低MICを有 する異種耐性MRSA単離物との間を確実に区別することは出来ない。 表2.感受性試験によって不正確に同定された単離物 1MRSEは、メチシリン耐性Staphylococcus epidermidisをいう。 CPTアッセイは、S.aureus単離物およびS.epidermidis単離物におけるmecA遺 伝子を正確に検出し、そしてメチシリン感受性ブドウ球菌からメチシリン耐性ブ ドウ球菌の正確な同定を可能にした。このアッセイはまた、mecA遺伝子を含まな いBORSAからmecA陽性MRSAを区別し得た。 上記の実施例は、コアギュラーゼ陽性および陰性の両方のブドウ球菌臨床単離 物の粗溶解物からmecA遺伝子について同位体標識したmecA945-29プローブの感受 性および特異性を実証する。 実施例6 mecA遺伝子のPCR検出 矛盾した分析のためのPCRを以下の方法によって行なう。 MRSAのmecA配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対mecA834-25および mecALl039-22(配列番号9および配列番号10)を、実施例1に記載されるように 合成した。MRSAおよびMSSA ATCC単離物の粗溶解物をコントロールとして使用し 、そしてTaqポリメラーゼを使用するホットスタートの後、PCRを行なった。 ホットスタートPCRは、95℃5分間の変性後、80℃でのTaqポリメラーゼの添加 によって50μl容量において実施した。最終PCR反応混合物は、以下を含んだ:50 μlの最終反応容量中、200μMの各dNTP混合物(dATP、dGTP、dCTP、dTTP、Pharm acia)、1.5mMのMgCl2、50mM KCl、20mM Tris HCl、pH8.4、(1×PCR緩衝液、G ibco-BRL)、0.5μMの各プライマー対、1UのTaq DNAポリメラーゼ(Gibco-BRL )および2ngのブドウ球菌DNA粗溶解物サンプル。サンプルを、サーマルサイク ラー(PTC 100,MJ Research Inc.)中で、94℃で40秒間、53℃で40秒間、およ び72℃で90秒間のサイクルを使用して、サイクルにかけた。増幅を50サイクル行 なった。 増幅後、0.5μg/mlのエチジウムブロミド含有の1.8%アガロースゲルを使用し て、サンプルを電気泳動を用いて分析した。分子量マーカーもまた含まれた。22 7bpのアンプリコンが検出された場合、サンプルを陽性とみなした。このアンプ リコンはATCC MRSAコントロールにおいて検出されたが、ATCC MSSAコントロール またはいかなる矛盾したS.aureus単離物においても検出されなかった。 実施例7 非同位体MRSAアッセイ 以下の実施例は、S.aureusの臨床単離物におけるmecA遺伝子の検出のための 迅速な非同位体CPTアッセイを示す。 CPTを酵素イムノアッセイ(CPT-EIA)と組み合わせる非同位体MRSAアッセイを 、図3に概略的に示す。この迅速なMRSA試験は、mecA遺伝子の相補塩基配列に結 合した場合にRNase H感受性の切断されやすい結合を提供する、蛍光標識化およ びビオチン化されたキメラプローブを使用する。切断されないプローブ(mecA陰 性)は、固体表面へのプローブの結合、および西洋ワサビペルオキシダーゼ(こ れは基質を発色最終産物に転換させる)と結合した抗体の結合によって、検出さ れる。プローブの切断(mecA陽性)は、固体表面へのプローブ-抗体複合体の結 合を妨害し、従って、発色最終産物の形成を妨害する。結果は90分後に生じる。 この実験は、蛍光標識化されたキメラプローブFmecA945-29B(配列番号5)の 使用、および102個のブドウ球菌単離物の粗溶解物からmecA遺伝子を検出するた めの、CPT反応物中のスペルミンとEGTAとの結合を試験する。S.aureus単離物の 供給源は、以下からであった:Wishard Memorial Hospital,Cleveland ClinicF oundation、Vancouver General Hospital、およびATCC。全部で、51個のMRSAお よび51個のMSSA単離物が存在した。 MRSAおよびMSSAの両方の効果的な溶解を行い、そして最適化した。溶解試薬の 組成物は以下である:200単位/mlのアクロモペプチダーゼ(Wako Bioproducts, Wako)、0.02mg/mlリゾスタフィン(lysostaphin)(Sigma,St.Louis,MO)、 キメラプローブFmecA945-29Bを合成し、実施例1に記載されるように、蛍光標 識化およびビオチン化した。精製熱安定性RNase Hを実施例3に記載されるよう に調製した。単離物を実施例4に記載されるように増殖させ、そして1μlのル ープで培養増殖物を、50μLの溶解試薬を含有する1.5mlの微量遠心管に入れた。 サンプルを54℃または室温で10分間インキュベートした。DNAを、CPT反応の前に 95℃で2分間変性させた。減算アッセイのための最適化CPT反応試薬は以下であ った:100μlの最終反応容量中、20fmol/反応のFmecA945-29B、50μlの粗溶解物 、 反応のRNase H、20mM TES、pH6.8。使用したコントロールは、mecA陽性S.aureu s(ATCC 33592)およびmecA陰性S.aureus(ATCC 11632)であった。CPT反応を 、54℃で25分間行なった。 サイクルの後、100μlの結合試薬(ペルオキシダーゼ安定化緩衝液、DAKO、Mi ssissauga,ON)、ヒツジポリクローナル抗フルオレセイン西洋ワサビペルオキ シダーゼ結合抗体(1/750 希釈、NEN、Boston、MA)をチューブに添加した。検出 を、ストレプトアビジンコートストリップウェル(Boehringer Mannheim GmbH, Germany,Boeringer)を使用して行なった。CPT反応を、ストレプトアビジンコ ートストリップウェルに移し、そして10秒間混合し、そして10分間室温でインキ ュベートした。液体を廃棄し、そして300μlの洗浄緩衝液(137mM NaCl、2.7mM KCl、1.8mM KH2PO4、10.1mM Na2HPO4、0.5%Tween 20、pH7.3)で2回洗浄した 。続いて、200μlの基質(テトラメチルベンジジン/H2O2、Sigma)を添加し、そ し て室温で3分間発色させた。発色を、100μlの検出停止試薬(750mM Tris,1.5 %(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム、pH7.7)を使用して停止させた。プレートを、 650nmのOD(OD650)に設定したVmaxプレートリーダー(Molecular Devices)を 使用して読み取る。 表3および図4は、減算CPTアッセイを使用することによる、MRSAのmecA遺伝 子についてのスクリーニングの結果を要約する。 表3.減算CPTアッセイを使用する、MRSA(n=51)およびMSSA(n=51)臨床単離 物溶解物の検出を試験する実験からの、650nm(A650)での吸光度の平均および 標準偏差(SD)。 結果は、51個のMRSAまたはMSSAの全てのデータの点が、それらの対応する平均 の3つの標準偏差(SD)内にあることを示す。それゆえ、MRSA平均+3×SDとMS SA平均−3×SDとの間には重複が存在しない。これは、MSSA集団からMRSA集団を 分ける明瞭な試験結果を可能にする。 上記の実施例は、キメラの蛍光標識化およびビオチン化されたmecA945-29プロ ーブが、mecA遺伝子を検出することによってMSSAからMRSAを区別するために、非 同位体CPT-EIAにおいて首尾よく使用され得ることを示す。 実施例8 MRSA試験:形式、試薬、およびキット組成物 以下は、MRSAからmecA遺伝子を検出するためのキットの例示的な1実施例であ る。 このキットは、非同位体CPTアッセイ(CPT-EIA)を使用するmecA遺伝子の検出 によってMRSAの迅速な検出を可能にし、そして溶解しにくいMRSA単離物(矛盾物 )またはヌクレアーゼを産生するMRSA単離物(矛盾物)の検出を最適化する。 迅速なMRSA試験キット(48試験)を以下の項目と比較する: *MRSA溶解試薬(2) *ストレプトアビジンコートマイクロウェル(48) *MRSAサイクル試薬(48) *洗浄緩衝液(1×50mL) *MRSA溶解再生緩衝液(1×3mL) *検出基質試薬(1×12mL) *サイクル再生緩衝液(1×6mL) *検出停止試薬(1×5.5mL) *MRSAサイクル停止試薬(1×6.8mL) *トランスファーピペット(50) *200μL Dropstir(50) *200μL Dropstir(50) 以下は、キットの一部を構成する組成物、試薬、および材料を記載する。 *MRSA溶解再生緩衝液:水、および20ppm ProClin 300TM(Sigma)。 アクロモペプチダーゼ(Wako)およびEGTA *サイクル再生緩衝液:4mM MgCl2および20ppm ProClin 300TM。 *MRSAサイクル試薬(凍結乾燥):トレハロース、ポリビニルピロリドン、TES 、 *MRSAサイクル停止試薬:西洋ワサビペルオキシダーゼ(1/1000最終希釈)に 結合した抗フルオレセイン抗体を含む緩衝化塩溶液(DAKO)。 *ストレプトアビジンコートマイクロウェル(Boehringer)。 *洗浄緩衝液:137mM NaCl、2.7mM KCl、1.8mM KH2PO4、10.1mM Na2HPO4、0.5 %Tween 20および20ppm ProClin 300。 *検出基質試薬:テトラメチルベンジジン(Sigma)およびH2O2。 *検出停止試薬:0.75mM Trisおよび1.5%ドデシル硫酸ナトリウム。 S.aureusの粗溶解物からmecA遺伝子を検出するためのアッセイを実施する手 順は以下である:A.MRSA溶解試薬の再生: 1.MRSA溶解試薬のバイアルに、1.5mLのMRSA溶解再生緩衝液をピペットで移 す。 2.旋回して溶解する。 3.使用前に室温で2〜3分間静置する。 4.2℃〜8℃で保存した場合、一旦再生されると、1バイアルのMRSA溶解試 薬は2週間使用され得る。B.MRSAサイクル試薬の再生 1.再生は、検体調製のインキュベーション工程の間に行なうべきである。 2.1バイアルのMRSAサイクル試薬に2滴のサイクル再生緩衝液を添加する。 3.旋回して溶解する。 4.これは単回使用試薬である。この試薬は再生の30分以内に使用しなければ ならない。C.サンプル調製 1.50μLのDropstirを使用して、1滴の再生MRSA溶解試薬を各1.5mL微量遠心 管に添加する(1サンプルあたり1チューブ)。 2.5%ヒツジ血液を含有するトリプチックソイ寒天プレート上での18時間〜 24時間培養からの増殖物を1μLループ添加する。完全に細胞増殖物を懸濁する まで良く混合する。 3.55℃で20分間放置。 4.95℃で5分間放置。D.サイクリングプローブ技術 1.溶解物を含むチューブを55℃に移す。 2.50μLのDropstirを使用して、1滴の再生MRSAサイクル試薬を各チューブ に添加する。 3.55℃で25分間インキュベートする。 4.チユーブを55℃に置き、3滴のMRSAサイクル停止試薬を添加する。 E.検出 1.必要数のストレプトアビジンコートのマイクロウェルを(1サンプル当たり 1マイクロウェル)マイクロウェルフレームに配置する。 2.サイクル反応物全体を、ストレプトアビジンコートのマイクロウェルへ、ト ランスファーピペットを用いて移す。 3.10分間室温でインキュベートする。 4.ストレプトアビジンコートのマイクロウェルを反転させて液体を捨てる。 5.洗浄緩衝液で、各ストレプトアビジンコートのマイクロウェルを完全に満た す。 6.ストレプトアビジンコートのマイクロウェルを反転させて液体を捨てる。 7.各ストレプトアビジンコートのマイクロウェルをドライペーパータオル上で 5回軽く叩く 8.工程5〜7を反復する。 9.200μLのDropstirを用いて、各ストレプトアビジンコートのマ イクロウェルに1滴の検出基質試薬を添加する。 10.室温で5分間放置する。 11.各ストレプトアビジンコートのマイクロウェルに4滴の検出終結試薬を添 加する。 12.10秒間混合する。 13.室温で3分間インキュベートする。 14.30分以内に視覚的に読み取り、そして着色領域を記録するかまたはOD650 を測定/記録する。 実施例9 MECA MRSAについての直接蛍光CPTアッセイ 以下の例は、粗溶解物を用いたCPTによるMRSA単離物におけるmecA 遺伝子の検出のための直接蛍光アッセイの使用を示す。 CPTと組み合わせた直接蛍光アッセイ(DFA)(CPT−DFA)を用い る2つの実験を、臨床単離物からmecA遺伝子の検出のために実施した。第一 の実験において、58の単離物を、プレートリーダー形式を用いてスクリーニン グし、そして第二の実験において、120の単離物を単一のチューブリーダー形 式を用いてスクリーニングした。手短には、このアッセイは、MRSAに存在す るが、MSSAには存在しない、mecA遺伝子内の配列に相補的な、フルオレ セイン化およびビオチン化されたキメラプローブを使用する。プローブは、5’ 末端ではフルオレセインを用いて、および3’末端ではビオチンを用いて標識す る。CPTアッセイを、RNase Hおよびキメラプローブの存在下でSta phylococcus細胞からの粗溶解調製物を用いて実施する。サイクル反 応後、ストレプトアビジンコート磁気ビーズを添加して、切断されていないプロ ーブを結合させる。フルオレセインで標識された切断されていない断片を含む上 清を、磁石を用いてビーズから分離し、そして上清を蛍光測定のために、ガラス チューブまたはマイクロタイタープレートに移す。 A.臨床単離物およびサンプル調製物の供給源 58の臨床単離物の供給源を、Cleveland Hospital、Wi shard Memorial and Vancouver General Hospitalから得た。全てのMRSAおよびMSSA細胞を、溶解物を 2×McFarland No.5標準密度または50μ容量中の1μlループ の細胞のいずれかとして調製したこと以外は、本質的に実施例4に記載のとおり に、調製および溶解した。1μlループの細胞は、5×McFarland N o.5標準とほぼ等価である。 B.ストレプトアビジンコート磁気ビーズを用いたビオチン化プローブの結合 ストレプトアビジンコート磁気ビーズ(Dynal M−280、Oslo、 Norway)を、等量のTESサイクル緩衝液(4mM MagCl2、0. 洗浄することによって調製した。次いで、ビーズを、NaClを含むサイクル緩 衝液で元の溶液の10倍容量中で再懸濁した。希釈したビーズをビオチン化プロ ーブを含む反応物へ添加して、最終濃度を50μgのビーズ/反応物および1. 5MのNaClとした。結合を、13×100分-1の速度での混合で10分間、 37℃でサーモミキサー(Eppendorf)中で行った。次いで、上清を、 MPC磁石(Dynal)を用いてビーズから分離した。 C.結合後のプローブの蛍光検出 プローブをFluoroskan蛍光プレートリーダー(Labsystem S、Needham、MA)を用いて、切断されたプローブを含む上清をMic roFluor「U」黒色丸底プレート(Dynatech、Chantill y、VA)ウェル中に配置することによって結合後に検出した。サンプルを含む 各ウェルへ、150μlの0.22M DEA pH10を添加した。ウェル中 の泡をKimwipe(Roswell、GA)の端を使用してすべて取り除い た。プレートをプレートリーダー中で485nmの励起波長、538nmの発光 波長、および20×0.1秒のスキャン/ウェル時間を用いて室温でスキャンし た。Beacon−2000チューブリーダー(Panvera、Madiso n、Wisconsin)を用いた類似の検出を、プローブを含む上清を、11 μlの2.0M DEA、pH10を含むホウ珪素ガラスチューブ(Kimbl e、Toledo、OH)中に配置することによって行った。次いで、サンプル をボルテックスし、そして蛍光強度を、Beacon−2000装置の静止モー ドを使用して測定した。励起波長および発光波長は、それぞれ、485nmおよ び515nmであり、そして25℃での10リードサイクルの平均を使用した。 D.MRSAまたはMSSAの粗溶解物を用いたCPT手順 アッセイは、5’末端をフルオレセインで、および3’末端を3つのビオチン で標識したキメラプローブFmecA945−29(XL)43(配列番号5) を用いた。粗溶解物を用いたサイクル反応を25μlの粗溶解物を含む50μl 反応物中で行った。溶解物を、95℃で2分間変性させた。CPT反応を行い、 そして最終条件は以下のとおりであった:50μlの最終反応容量中に、1pm olキメラプローブ、25μlの粗溶解物、50μM EDTA、0.5mMス ペルミン、1.5μgのRNase H。すべての反応を、60℃の水浴中で、 微量遠沈管(蓋をしていない)中で50分間サイクルさせた。反応を、水浴中に なお存在させながら等量の希釈したビーズ(50μgのビーズ/サイクル緩衝液 およびNaCl中の1反応物)を添加して終結させた。結合および検出を、上記 に記載のとおりに行った。正味の相対蛍光単位(RFU)を、MRSAとMSS Aとの間の蛍光強度の差異として計算する。 Fluoroskanプレートリーダーを58の単離物の初期臨床スクリーニ ングにおいて使用して蛍光を測定した。これらの結果を図5に頻度分布ヒストグ ラムとしてまとめる。手短には、これらの結果は、MRSAおよびMSSA単離 物が、2つの重複していない集団として容易に識別され得ることを示し、そして 、アッセイが培養およびPCR解像度と比較してmecA遺伝子の検出について 100%の感度および100%の特異性を有すると結論付けられた(実施例5を 参照のこと)。 続くアッセイにおいて、S.aureus単離物(MSSAまたはMRSAの いずれか)を、Beacon−2000チューブ蛍光測定器を用いて、1pmo lのプローブを用いたDFAによってアッセイする。Beacon−2000を 用いた120の単離物のスクリーニング結果を図6に示す。MSSAサンプルの 範囲は、58.1〜101.7RFUであり、そしてMRSAサンプルの範囲は 、 144.2〜191,9である。MSSAサンプルの最高と、MRSAサンプル の最低との間の正味のギャップは42.5RFUである。このスクリーニングに おいて、1つの感受性の単離物が耐性の単離物として誤って同定され、100% の感度および98%の特異性を与えた。この誤った同定は、MSSAサンプルの 不完全な溶解に起因していた。この株は、より長い溶解時間を用いて再試験をし た場合には正確に同定された(データは示さず)。 上記の実施例は、mecA945−29プローブ配列が、直接CPT蛍光アッ セイを用いた粗溶解物において、そしてstaphylococcus種のme cA遺伝子の検出について非常に特異的かつ高感度であることを実証する。 実施例10 以下の実施例は、少数のPCRサイクル後のPCRアンプリコンの迅速な検出 についてのCPTの有用性を実証する。 MRSA由来のmecA遺伝子をモデル系として使用した。最初に、PCRを 実施し、次いでCPTを行い、そして検出を、酵素免疫アッセイ(CPT−EI A)によって行った。CPT−EIAアッセイは、上記の実施例7に記載されて おり、そして図3に例示されている。CPT−EIAによるアンプリコン検出の ための手順を、図7に示す。 MSSA株(ATCC11632)およびMRSA株(ATCC 33592 )の粗溶解物を37℃で、5%のヒツジ血液(PML Microbiolog icals、Tualatin、OR)を有するトリプシン消化ダイズ寒天上で 増殖させた。細胞懸濁物を、TES緩衝液(20mM TES(pH6.8)、 0.05%Triton X−100)中で作製して5×McFarland# 5の濁度標準(7.5×109細胞/ml)と等価な細胞密度を得た。細胞を、 150U/mlアクロモペプチダーゼ(achromopeptidase)( Wako)を用いて25分間、37℃で溶解した。溶解後、細胞を、−20℃で 保存した。適切な希釈を脱イオン滅菌水中で行った。 PCR反応を、20mM Tris(pH8.3)、1.5mM MgCl2 、0.2mM dNTP(Pharmacia)、6.25pmolの各プライ マ ー(表1)および0.5U AmpliTaq Gold(Perkin El mer)を含む25μlの反応物中で行った。PTC−100 Program mable Thermal Cycler(MJ Research,Inc .)を、以下のPCRプログラムを用いて使用した:95℃で10分間、20× (95℃で40秒間、53℃で40秒間、および72℃で1.5分間)。反応に 、72℃で5分間の最終の伸長工程を適用し、次いで分析の前に4℃で維持した 。PCR反応物を、CPTによって、以下に記載するように、または2%アガロ ースゲルおよびエチジウムブロミド(Et−Br)染色を用いて分析した。 227bpのmecA PCR産物を標準として用いて、CPT−EIAおよ びEt−Br染色ゲルの感度を決定した。アンプリコンを、以下のように調製し た:いくつかの100μl反応物を、30サイクルのPCRに供し、そしてアン プリコンをQiagen PCR精製キットを用いて製造者によって推奨される とおりに精製した。227bpの産物を、分光光度計によって定量し、そして標 準として用いた。 アンプリコン産物の量を、以下の式を用いて見積もった:N=N0(1+E)n 、ここで、Nはアンプリコン分子の数であり、N0は標的分子の出発量であり、 nはサイクル数であり、そしてEはPCR効率である。 表4.PCRプライマーおよびCPTプローブ配列。文字は以下を示す:大文字 はDNAであり、小文字はRNAであり、Fはフルオレセインであり、そしてB はビオチンである。 CPT−EIA。25μlのPCR反応物を、95℃で2分間熱変性させ、次 いで54℃に配置した。この25μlにおけるCPT成分に、PCR反応物を添 加して、CPT反応容量を、50μlとした。PCR成分に加えて、反応物は以 下を含んだ:20mM TES、pH6.8、4mM MgCl2、0.05% Triton X−100、1mM EGTA、1mMスペルミン、10fmo l FmecA945−29Bプローブ(表4)および1.42μg RNas e H。CPT反応物を、54℃で30分間インキュベートし、そしてPero xidase Stabilizing Buffer(DAKO、Missi ssauga、ON)中で結合体化させた、1/600希釈の抗フルオレセイン HRP(NEN、Boston、MA)を含む100μlの結合試薬を用いて終 結させた。 54℃から取り出したあと、サンプルを室温で3分間冷却させた。次いで、サ ンプルを、ストレプトアビジンコートストリップウェル(Boehringer Mannheim)へと移し、そして振盪させながら、10分間室温でインキ ュベートした。ウェルを、洗浄緩衝液(137mM NaCl、2.7mM K Cl、1.8mM KH2PO4、10.1mM Na2HPO4、0.5%Twe en 20、20ppm ProClin 300、pH7.3))を用いて2 回洗浄し、次いで200μlのSingle Component TMB P erosidase EIA基質(Biorad、Hercules、CA)を 添加した。3分後、発色を、検出終結試薬(750mM Tris、1.5% SDS、20ppm ProCLin300、pH7.7)を用いて停止させ、 そしてプレートをOD650nmで、Vmax分光光度計(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)を用いて読み取った。正味のO D650(=ODcontrol−ODsample)を用いて、特異的な標的の存在を特徴付け た。標的をサイクルさせた回数(T)を以下のように見積もった:T=切断され た分子数/標的分子の数。 標準的なmecA227bpアンプリコンを用いたCPT−EIAの検出感度 が50amol、すなわち7.6pg(図8A?)であったことが見い出された 。同じアンプリコンを使用すると、Et−Br染色アガロースゲルの検出限界が 50,000amolすなわち7.6pg(図8B?)であった。従って、CP T EIA検出の感度は、Et−Br検出よりも3桁(log)良好であった。 さらに、ゲルによる分析についての1.5時間と比較して、標準的なアンプリコ ン のCPT−EIAによる分析には約1時間かかった。CPT−EIAによる分析 は、半定量的であるのに対して、ゲルによる分析は定性的である。 CPT−EIAを、MSSAおよびMRSAの粗溶解物の連続希釈物から調製 したPCRアンプリコンを使用して行った。図9における結果は、CPT−EI Aが、100以上のMRSA細胞を用いて開始した20サイクルのPCR反応か らのアンプリコンを検出し得たことを示した。MSSAを用いて観察されたシグ ナルは、バックグラウンドと等価であった。ゲルによって分析された類似の反応 は、Et−Br染色でのバンドを検出するために、100,000細胞を用いて 開始したPCR反応を必要とした(図10)。 プローブの80%が、サンプルと等価な100のMRSA細胞を用いて切断さ れると見積もられた。PCRの効率が100%であると仮定すると、反応におい て生成された分子数は、175amolである。従って、標的がCPTにおいて サイクルされた回数は、少なくとも50である。この増幅を用いれば、通常のP CR実験(30以上のサイクル)よりも有意に少ないサイクル(20)を使用す ることが可能である。より少ないサイクルを用いることには2つの利点がある。 第一に、上記に言及したようにアンプリコンの持ち越しの機会が減少し、そして 第二にPCR反応についての時間が1時間短縮される。非常に迅速なサーモサイ クラーが近年開発されているが、ほとんどのサーモサイクラーは、20サイクル についての2時間と比較して、30サイクルのPCRについて約3時間必要とす る。PCR−CPTに必要な時間の合計は、3時間未満である。 PCRサイクルの数は、100のMRSAまたはMSSA細胞の等価物を用い れば20と40との間で変動する。CPT−EIAは、20サイクルのPCR後 にMRSAサンプルを検出した(図11A)が、ゲルアガロース分析は、30サ イクル後にやっとサンプルを検出した(図11B)。20に対する30のPCR サイクルにおいて生成されるアンプリコンの数における理論的な差異は、それぞ れ、175amolに対して175fmolである。これは、1000倍の感度 の差異に対応する。これは、上記に記載の実験と一致する。 装置を必要とせずに特異的な標的の存在または非存在を可視的に識別すること が可能であった(データは示さず)。特異的な標的の存在は、プローブの切断に 起因して青色の非常にわずかまたは非存在によって示されるが、他方、標的の非 存在は、濃い青色をもたらす。 迅速さおよび夾雑の危険の低減に加えて、PCR−CPTは、PCRに第二の レベルの特異性を付加する。実際、CPTは、ハイブリダイゼーションに基づく 。そして、使用した条件下においては、非特異的なアンプリコンは検出されない 。この方法は、一歩前進であり、そして特定の適用においてサザンまたはネステ ィドPCRの使用、および高度に特殊な検出手段の使用を排除し得る。 CPTは、PCRアンプリコンの迅速かつ正確な検出を可能にする。さらに、 CPTは、第二のレベルの増幅を付加するが、標的をさらに増幅することはない 。従って、有意により少ない回数のPCRサイクルを使用することが可能である 。これは、夾雑および擬陽性の機会を減少させる。CPTは、第二のレベルの特 異性(これは、非特異的なアンプリコンおよびプライマーダイマーの検出を妨害 する)を付加する。PCR−CPT法もまた、ミスマッチ遺伝子検出について使 用され得る。 上記のことから、本発明の特定の実施態様が本明細書において例示の目的で記 載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくな され得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲による以外に は限定されない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12R 1:45) C12R 1:445) (C12N 15/00 ZNAA (31)優先権主張番号 60/090,276 (32)優先日 平成10年6月22日(1998.6.22) (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR, NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,L S,MW,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL ,AM,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR, BY,CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,E E,ES,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU ,ID,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR, KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M D,MG,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL ,PT,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK, SL,TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,U Z,VN,YU,ZW (72)発明者 クロニー,リン ピー. カナダ国 ブイ5ワイ 3ジェイ8 ブリ ティッシュ コロンビア,バンクーバー, エリザベス ストリート 5438

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1.生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を決定するための 方法であって: (a)該生物学的サンプル内に含まれる細胞を処理して、標的1本鎖核酸分子を 露出する工程; (b)該標的1本鎖核酸分子と、該抗生物質耐性mecA遺伝子の一部に相補的であ る、切断されやすい結合を含む核酸プローブと、2本鎖の標的-プローブ複合体 を切断する酵素とを、標的およびプローブが、該2本鎖の標的−プローブ複合体 を形成させるように互いにハイブリダイズすることを可能にさせる条件下で反応 させる工程であって、該酵素分子は、1つ以上の該核酸プローブのフラグメント が該複合体から放出されるように、該標的−プローブ複合体の該切断されやすい 結合を切断し得る、工程; および (c)該核酸プローブの切断された部分が生成されるか否かを決定する工程であ って、それによって、該抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出する工程、 を包含する、方法。 2.前記決定する工程が、切断されなかったプローブの量の減少を検出する工程 であって、それによって、該核酸プローブの切断された部分が生成されるか否か を決定する工程を包含する、請求項1に記載の方法。 3.前記決定する工程が、前記核酸プローブの切断された部分を直接検出する工 程を包含する、請求項1に記載の方法。 4.前記プローブが、本質的に以下のヌクレオチド配列: 5.前記プローブが、本質的に以下のヌクレオチド配列:の少なくとも一部分からなる、請求項1に記載の方法。 6.前記プローブが、以下のヌクレオチド配列: を有する、請求項2に記載の方法。 7.前記プローブが、本質的に以下のヌクレオチド配列: ここで、大文字は、デオキシリボヌクレオチドを表し、そして小文字は、リボヌ クレオチドを表す、からなる、請求項1に記載の方法。 8.前記mecA遺伝子が、ブドウ球菌種に由来する、請求項1に記載の方法。 9.前記mecA遺伝子が、コアギュラーゼ陽性ブドウ球菌種に由来する、請求項8 に記載の方法。 10.前記mecA遺伝子が、S.aureusに由来する、請求項9に記載の方法。 11.前記mecA遺伝子が、コアギュラーゼ陰性ブドウ球菌種からなる群に由来す る、請求項8に記載の方法。 12.前記mecA遺伝子が、S.epidermidisに由来する、請求項11に記載の方法 。 13.前記生物学的サンプルが、鼻粘膜拭い液、血液、尿、糞便、膿瘍、または 髄液からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。 14.前記生物学的サンプルが、細菌増殖培地において最初に増殖されたかまた は単離された、請求項1に記載の方法。 15.生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出するため のプローブであって、該プローブが以下の配列:を含む、プローブ。 16.生物学的サンプルにおける抗生物質耐性mecA遺伝子の存在を検出するため のキットであって、(a)1つ以上の切断されやすい結合を含む核酸プローブ、お よび(b)該プローブが標的に結合される場合、該切断されやすい結合を切断し得 る酵素を含む、キット。 17.前記酵素がRNaseHである、請求項16に記載のキット。 18.前記mecA遺伝子が、ブドウ球菌種に由来する、請求項16に記載のキット 。
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