JP2001333783A - メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド - Google Patents
メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチドInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＭＲＳＡが産生する細胞壁合成タンパク質ＰＢ
Ｐ―２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子又はこれら遺伝子
に由来するＲＮＡを特異的に切断したり、増幅したり、
これらの検出及び同定を高感度で行うための有用なオリ
ゴヌクレオチドの提供。 【解決手段】ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子又は該遺伝子に
由来するＲＮＡを、切断、検出又は増幅するために有用
なオリゴヌクレオチドであって、ｍｅｃＡ遺伝子又は該
遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能である、特
定な配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチド又はそれらのオリゴヌクレオチドと
相補的であるオリゴヌクレオチド。
Ｐ―２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子又はこれら遺伝子
に由来するＲＮＡを特異的に切断したり、増幅したり、
これらの検出及び同定を高感度で行うための有用なオリ
ゴヌクレオチドの提供。 【解決手段】ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子又は該遺伝子に
由来するＲＮＡを、切断、検出又は増幅するために有用
なオリゴヌクレオチドであって、ｍｅｃＡ遺伝子又は該
遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能である、特
定な配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチド又はそれらのオリゴヌクレオチドと
相補的であるオリゴヌクレオチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査における
ＭＲＳＡ検出用のオリゴヌクレオチドに関するものであ
る。本発明で提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ
やＤＮＡの切断、増幅そして検出といった操作を行う遺
伝子診断用の試薬として、また、ＲＮＡの逆転写や翻訳
を阻害するための薬剤として有用である。特に、本発明
で提供されるオリゴヌクレオチドの配列は、ＭＲＳＡの
定量や診断用の試薬等に有用である。
ＭＲＳＡ検出用のオリゴヌクレオチドに関するものであ
る。本発明で提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ
やＤＮＡの切断、増幅そして検出といった操作を行う遺
伝子診断用の試薬として、また、ＲＮＡの逆転写や翻訳
を阻害するための薬剤として有用である。特に、本発明
で提供されるオリゴヌクレオチドの配列は、ＭＲＳＡの
定量や診断用の試薬等に有用である。
【０００２】
【従来の技術】ＭＲＳＡは、院内感染の主要な病原菌で
あり、メシチリンをはじめとするβ−ラクタム系の抗菌
薬全般に耐性を示す。また近年では、治療薬の切り札的
存在とみなされているバンコマイシンに軽度耐性を示す
菌株も検出されている。このように、ＭＲＳＡは決定的
な抗菌薬がないために大きな医療問題となっている。従
って、臨床検査における正確・迅速な検出は、診断と治
療における重大な課題である。
あり、メシチリンをはじめとするβ−ラクタム系の抗菌
薬全般に耐性を示す。また近年では、治療薬の切り札的
存在とみなされているバンコマイシンに軽度耐性を示す
菌株も検出されている。このように、ＭＲＳＡは決定的
な抗菌薬がないために大きな医療問題となっている。従
って、臨床検査における正確・迅速な検出は、診断と治
療における重大な課題である。
【０００３】通常、黄色ブドウ球菌が産生する細胞壁合
成タンパク質ＰＢＰ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）はＰＢＰ−１からＰＢＰ−４
の４種類存在するが、ＭＲＳＡではＰＢＰ−２’と名付
けられた新たなＰＢＰも産生される。このＰＢＰはβ−
ラクタム系の抗生物質への結合親和力の弱い特異的なタ
ンパク質であり、耐性の中心的な役割を果たすことが知
られている。
成タンパク質ＰＢＰ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｂｉｎｄ
ｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ）はＰＢＰ−１からＰＢＰ−４
の４種類存在するが、ＭＲＳＡではＰＢＰ−２’と名付
けられた新たなＰＢＰも産生される。このＰＢＰはβ−
ラクタム系の抗生物質への結合親和力の弱い特異的なタ
ンパク質であり、耐性の中心的な役割を果たすことが知
られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ＰＢＰ−２’をコード
する遺伝子ｍｅｃＡの配列は既に知られている（ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７?１７１、１９８７年、
他）。そこで、ＭＲＳＡの検出及び同定には、ｍｅｃＡ
遺伝子に特異的な遺伝子プローブを用いるハイブリダイ
ゼーション法が試みられているが、試料の調製に患者検
体から採取した菌の培養が必要なため、迅速性に課題が
あった。
する遺伝子ｍｅｃＡの配列は既に知られている（ＦＥＢ
Ｓ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７?１７１、１９８７年、
他）。そこで、ＭＲＳＡの検出及び同定には、ｍｅｃＡ
遺伝子に特異的な遺伝子プローブを用いるハイブリダイ
ゼーション法が試みられているが、試料の調製に患者検
体から採取した菌の培養が必要なため、迅速性に課題が
あった。
【０００５】このように、ＭＲＳＡの検出及び同定に
は、培養に長時間を要し、また短時間で試料中に存在す
る極微量のｍｅｃＡ遺伝子を検出することは困難であっ
たため、臨床診断の分野では迅速かつ高感度な検出法の
出現が望まれている。さらには、検査をより簡便にする
ために、自動検査装置の開発も望まれている。
は、培養に長時間を要し、また短時間で試料中に存在す
る極微量のｍｅｃＡ遺伝子を検出することは困難であっ
たため、臨床診断の分野では迅速かつ高感度な検出法の
出現が望まれている。さらには、検査をより簡便にする
ために、自動検査装置の開発も望まれている。
【０００６】検出を高感度で行うためには、検出及び同
定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ（以
下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅した
うえで検出等することが好適である。
定しようとする遺伝子や該遺伝子に由来するＲＮＡ（以
下これらを標的核酸とする）中の特定の配列を増幅した
うえで検出等することが好適である。
【０００７】標的核酸がＤＮＡである場合の増幅法とし
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的及び相同な一組のプライマーと熱
耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマー
・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行う
ことによって前記特定の配列を増幅する方法である。こ
の時、前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記特
定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要で
あり、更にその検出及び同定を高感度で行うためには、
標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
である。そこで、特定の配列のオリゴヌクレオチドを用
いて、ｍｅｃＡ遺伝子をＰＣＲ法で黄色ブドウ球菌の染
色体ＤＮＡ上で検出する試みがなされている。しかしな
がら、試料の調製に患者検体から採取した菌の培養が必
要なため、前記のハイブリダイゼーション法と同様、迅
速性に課題があった。また、染色体ＤＮＡ上のｍｅｃＡ
遺伝子を検出したとしても、実際にＰＢＰ−２’の発現
を同定したことにはならないために、臨床的意義上の問
題点も挙げられる。また、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温
を繰り返すという複雑操作が必要であり、そのことが自
動化への障害となる。
ては、ポリメレースチェインリアクション（ＰＣＲ）法
が知られている。この方法は、標的ＤＮＡ中の特定の配
列の両末端部に相補的及び相同な一組のプライマーと熱
耐性ＤＮＡポリメレース存在下で、熱変性、プライマー
・アニール、伸長反応からなるサイクルを繰り返し行う
ことによって前記特定の配列を増幅する方法である。こ
の時、前記特定の配列をＰＣＲ法で増幅するには前記特
定の配列との特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要で
あり、更にその検出及び同定を高感度で行うためには、
標的ＤＮＡとの特異性が高いオリゴヌクレオチドが必要
である。そこで、特定の配列のオリゴヌクレオチドを用
いて、ｍｅｃＡ遺伝子をＰＣＲ法で黄色ブドウ球菌の染
色体ＤＮＡ上で検出する試みがなされている。しかしな
がら、試料の調製に患者検体から採取した菌の培養が必
要なため、前記のハイブリダイゼーション法と同様、迅
速性に課題があった。また、染色体ＤＮＡ上のｍｅｃＡ
遺伝子を検出したとしても、実際にＰＢＰ−２’の発現
を同定したことにはならないために、臨床的意義上の問
題点も挙げられる。また、ＰＣＲ法は急激な昇温・降温
を繰り返すという複雑操作が必要であり、そのことが自
動化への障害となる。
【０００８】一方、標的核酸がＲＮＡである場合の増幅
法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法の他、逆転写酵素及びＲＮ
Ａポリメレースの協奏的作用によって前記特定配列を増
幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。この
方法は、標的ＲＮＡ中の特定の配列に対し、プロモータ
ー配列を含むプライマーと逆転写酵素、及びリボヌクレ
エースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ
を合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレ
ースにより、前記特定塩基配列を含むＲＮＡを合成する
とともに、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む
２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものであ
る。ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が
可能であり、自動化へ適している方法と考えられる。こ
の場合、ＰＢＰ−２’をコードするｍＲＮＡを定性又は
定量等することにより、ｍｅｃＡ遺伝子の存在、更には
その存在量を測定することが可能である。しかも、ｍＲ
ＮＡは発現するＰＢＰ−２’の被翻訳遺伝子であるた
め、染色体ＤＮＡ上のｍｅｃＡ遺伝子のコピー数と比較
して遙かに多量存在する。従って、検体から菌の培養を
経ることなくｍｅｃＡ遺伝子を検出することができ、迅
速診断として有用である。この時、前記特定の配列をＮ
ＡＳＢＡ法などで増幅するには前記特定の配列との特異
性が高いオリゴヌクレオチドが必要であり、更にその検
出及び同定を高感度で行うためには、標的ＲＮＡとの特
異性が高いオリゴヌクレオチドが必要である。そこで、
特定の配列のオリゴヌクレオチドを用いて、ｍｅｃＡ遺
伝子をＮＡＳＢＡ法で黄色ブドウ球菌の染色体ＤＮＡ上
に検出する試みが知られている。しかし、ＮＡＳＢＡ法
などは比較的低温（例えば４１℃）で増幅反応を行うた
めに、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーの
結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性が考えられ
る。従って、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行う
ことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの
結合効率を向上させるための操作が必要であった。ま
た、更には、低温でＲＮＡの検出等を行う場合にも、前
記のような分子内構造を形成したＲＮＡに対して結合し
得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
法としては、ＲＴ−ＰＣＲ法の他、逆転写酵素及びＲＮ
Ａポリメレースの協奏的作用によって前記特定配列を増
幅するＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法等が知られている。この
方法は、標的ＲＮＡ中の特定の配列に対し、プロモータ
ー配列を含むプライマーと逆転写酵素、及びリボヌクレ
エースＨにより、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ
を合成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメレ
ースにより、前記特定塩基配列を含むＲＮＡを合成する
とともに、該ＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む
２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行うものであ
る。ＮＡＳＢＡ法や３ＳＲ法は一定温度での核酸増幅が
可能であり、自動化へ適している方法と考えられる。こ
の場合、ＰＢＰ−２’をコードするｍＲＮＡを定性又は
定量等することにより、ｍｅｃＡ遺伝子の存在、更には
その存在量を測定することが可能である。しかも、ｍＲ
ＮＡは発現するＰＢＰ−２’の被翻訳遺伝子であるた
め、染色体ＤＮＡ上のｍｅｃＡ遺伝子のコピー数と比較
して遙かに多量存在する。従って、検体から菌の培養を
経ることなくｍｅｃＡ遺伝子を検出することができ、迅
速診断として有用である。この時、前記特定の配列をＮ
ＡＳＢＡ法などで増幅するには前記特定の配列との特異
性が高いオリゴヌクレオチドが必要であり、更にその検
出及び同定を高感度で行うためには、標的ＲＮＡとの特
異性が高いオリゴヌクレオチドが必要である。そこで、
特定の配列のオリゴヌクレオチドを用いて、ｍｅｃＡ遺
伝子をＮＡＳＢＡ法で黄色ブドウ球菌の染色体ＤＮＡ上
に検出する試みが知られている。しかし、ＮＡＳＢＡ法
などは比較的低温（例えば４１℃）で増幅反応を行うた
めに、標的ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライマーの
結合を阻害し、反応効率を低下させる可能性が考えられ
る。従って、増幅反応の前に標的ＲＮＡの熱変性を行う
ことで、標的ＲＮＡの分子内構造を壊し、プライマーの
結合効率を向上させるための操作が必要であった。ま
た、更には、低温でＲＮＡの検出等を行う場合にも、前
記のような分子内構造を形成したＲＮＡに対して結合し
得るオリゴヌクレオチドが必要であった。
【０００９】そこで本願発明は、ＭＲＳＡが産生する細
胞壁合成タンパク質ＰＢＰ―２’をコードするｍｅｃＡ
遺伝子又はこれら遺伝子に由来するＲＮＡを特異的に切
断したり、増幅したり、これらの検出及び同定を高感度
で行うために有用なオリゴヌクレオチドの提供を目的と
するものである。また、ＲＮＡの逆転写や翻訳を阻害す
るための薬剤として有用なオリゴヌクレオチドの配列を
提供することにある。
胞壁合成タンパク質ＰＢＰ―２’をコードするｍｅｃＡ
遺伝子又はこれら遺伝子に由来するＲＮＡを特異的に切
断したり、増幅したり、これらの検出及び同定を高感度
で行うために有用なオリゴヌクレオチドの提供を目的と
するものである。また、ＲＮＡの逆転写や翻訳を阻害す
るための薬剤として有用なオリゴヌクレオチドの配列を
提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
になされた本願請求項１の発明は、ＭＲＳＡの遺伝子要
素であるｍｅｃＡ遺伝子（細胞壁合成タンパク質ＰＢＰ
―２’をコードする）又は該遺伝子に由来するＲＮＡ
を、切断、検出又は増幅するために有用なオリゴヌクレ
オチドであって、ｍｅｃＡ遺伝子又は該遺伝子に由来す
るＲＮＡと特異的に結合可能である、配列番号１から１
７に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなるオリゴヌクレオチド又はそれらのオリ
ゴヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドであ
る。
になされた本願請求項１の発明は、ＭＲＳＡの遺伝子要
素であるｍｅｃＡ遺伝子（細胞壁合成タンパク質ＰＢＰ
―２’をコードする）又は該遺伝子に由来するＲＮＡ
を、切断、検出又は増幅するために有用なオリゴヌクレ
オチドであって、ｍｅｃＡ遺伝子又は該遺伝子に由来す
るＲＮＡと特異的に結合可能である、配列番号１から１
７に示したいずれかの配列中の少なくとも連続した１０
塩基以上からなるオリゴヌクレオチド又はそれらのオリ
ゴヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレオチドであ
る。
【００１１】本願請求項２の発明は、前記請求項１の発
明に係り、前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡ伸長反応の
ためのオリゴヌクレオチドプライマーであることを特徴
とする。本願請求項３の発明は、前記請求項１の発明に
係り、前記オリゴヌクレオチドの一部が修飾され又は検
出可能な標識物質により標識されたオリゴヌクレオチド
プローブであることを特徴とする。そして本願請求項４
の発明は、請求項３の発明に係り、前記オリゴヌクレオ
チドの塩基の一部がオリゴヌクレオチドプローブとして
の機能を損なわない範囲で変換された合成オリゴヌクレ
オチドであることを特徴とする。以下、本願発明を詳細
に説明する。
明に係り、前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡ伸長反応の
ためのオリゴヌクレオチドプライマーであることを特徴
とする。本願請求項３の発明は、前記請求項１の発明に
係り、前記オリゴヌクレオチドの一部が修飾され又は検
出可能な標識物質により標識されたオリゴヌクレオチド
プローブであることを特徴とする。そして本願請求項４
の発明は、請求項３の発明に係り、前記オリゴヌクレオ
チドの塩基の一部がオリゴヌクレオチドプローブとして
の機能を損なわない範囲で変換された合成オリゴヌクレ
オチドであることを特徴とする。以下、本願発明を詳細
に説明する。
【００１２】本願発明のオリゴヌクレオチドは、前記し
たＲＮＡの増幅に際して、標的ＲＮＡの分子内構造フリ
ーな領域に対して特異的に相補結合を形成するオリゴヌ
クレオチドであり、前記したような熱変性を行うことな
しに標的ＲＮＡと特異的に結合可能である。このように
本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０
℃、好ましくは４１℃）で、ＰＢＰ―２’をコードする
ｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡの分子内構造フリー領
域に対して結合するオリゴヌクレオチドであり、ｍｅｃ
Ａ遺伝子を特異的に切断、増幅、又は検出等するために
有用なオリゴヌクレオチドである。より具体的には、本
願発明はＰＣＲ法によって前記標的ＤＮＡを増幅するた
めのオリゴヌクレオチドプライマー、ＮＡＳＢＡ法等に
よって前記標的ＲＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオ
チドプライマー、そしてかかる増幅なしに、或いはかか
る増幅の後に標的核酸を検出等するためのオリゴヌクレ
オチドプローブとして利用することで、迅速かつ高感度
な検出を達成するためのオリゴヌクレオチドである。な
お、最近、遺伝子検出技術向上のために、アデニン・グ
アニン・シトシン・チミン（又はウラシル）塩基塩基に
よる相補的配列の認識というオリゴヌクレオチドプロー
ブとしての機能を損なわない、新しい化学合成物質の開
発が進められている。一例として、核酸ＤＮＡの骨格構
造である糖およびリン酸の骨格をポリアミド骨格に置き
換えたＰｅｐｔｉｄｅ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＰＮ
Ａ）を挙げることができる。従って本発明の検出プロー
ブとしては、ＰＮＡのように塩基配列認識の機能を損な
わない範囲で変換されたものも含まれる。
たＲＮＡの増幅に際して、標的ＲＮＡの分子内構造フリ
ーな領域に対して特異的に相補結合を形成するオリゴヌ
クレオチドであり、前記したような熱変性を行うことな
しに標的ＲＮＡと特異的に結合可能である。このように
本願発明は、比較的低温かつ一定温度（３５℃〜５０
℃、好ましくは４１℃）で、ＰＢＰ―２’をコードする
ｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡの分子内構造フリー領
域に対して結合するオリゴヌクレオチドであり、ｍｅｃ
Ａ遺伝子を特異的に切断、増幅、又は検出等するために
有用なオリゴヌクレオチドである。より具体的には、本
願発明はＰＣＲ法によって前記標的ＤＮＡを増幅するた
めのオリゴヌクレオチドプライマー、ＮＡＳＢＡ法等に
よって前記標的ＲＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオ
チドプライマー、そしてかかる増幅なしに、或いはかか
る増幅の後に標的核酸を検出等するためのオリゴヌクレ
オチドプローブとして利用することで、迅速かつ高感度
な検出を達成するためのオリゴヌクレオチドである。な
お、最近、遺伝子検出技術向上のために、アデニン・グ
アニン・シトシン・チミン（又はウラシル）塩基塩基に
よる相補的配列の認識というオリゴヌクレオチドプロー
ブとしての機能を損なわない、新しい化学合成物質の開
発が進められている。一例として、核酸ＤＮＡの骨格構
造である糖およびリン酸の骨格をポリアミド骨格に置き
換えたＰｅｐｔｉｄｅ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ（ＰＮ
Ａ）を挙げることができる。従って本発明の検出プロー
ブとしては、ＰＮＡのように塩基配列認識の機能を損な
わない範囲で変換されたものも含まれる。
【００１３】配列番号１から１７は、ｍｅｃＡ遺伝子に
由来するＲＮＡを切断、増幅又は検出等するために有用
な本願発明のオリゴヌクレオチドの一例を示すものであ
る。ここで、ｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡとは、こ
れら遺伝子を鋳型として製造されるＲＮＡをも含む。本
願発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１から１７と
してそれぞれ記載した全塩基配列を含むものであっても
良いが、ｍｅｃＡ遺伝子等との特異的な結合には１０塩
基程度あれば十分であることから、それぞれ記載した塩
基配列のうち少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドであれば良く、また更にはこれらの
相補的なオリゴヌクレオチドであっても良い。
由来するＲＮＡを切断、増幅又は検出等するために有用
な本願発明のオリゴヌクレオチドの一例を示すものであ
る。ここで、ｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡとは、こ
れら遺伝子を鋳型として製造されるＲＮＡをも含む。本
願発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１から１７と
してそれぞれ記載した全塩基配列を含むものであっても
良いが、ｍｅｃＡ遺伝子等との特異的な結合には１０塩
基程度あれば十分であることから、それぞれ記載した塩
基配列のうち少なくとも連続した１０塩基以上からなる
オリゴヌクレオチドであれば良く、また更にはこれらの
相補的なオリゴヌクレオチドであっても良い。
【００１４】本願発明のオリゴヌクレオチドは、例えば
核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用
できる。本願発明のオリゴヌクレオチドをプライマーと
して核酸増幅法を実施すれば、標的核酸、即ちｍｅｃＡ
のみを増幅可能である。増幅方法としてはＰＣＲ法、Ｌ
ＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等が例示できるが、中
でもＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度で
実施できる核酸増幅法が好ましい。この増幅産物を種々
の方法により検出等することで、ＭＲＳＡの検出が可能
となる。この場合、増幅で使用したオリゴヌクレオチド
以外の上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し
ても良いし、増幅された特定配列の断片を電気泳動等に
より確認しても良い。
核酸増幅用のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用
できる。本願発明のオリゴヌクレオチドをプライマーと
して核酸増幅法を実施すれば、標的核酸、即ちｍｅｃＡ
のみを増幅可能である。増幅方法としてはＰＣＲ法、Ｌ
ＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等が例示できるが、中
でもＬＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度で
実施できる核酸増幅法が好ましい。この増幅産物を種々
の方法により検出等することで、ＭＲＳＡの検出が可能
となる。この場合、増幅で使用したオリゴヌクレオチド
以外の上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用し
ても良いし、増幅された特定配列の断片を電気泳動等に
より確認しても良い。
【００１５】本願発明のオリゴヌクレオチドは、例えば
その一部を修飾し又は検出可能な標識物質により標識す
ることにより、プローブとして使用することができる。
標的核酸を検出しようとする場合、検出可能な標識物質
により標識された本願発明のオリゴヌクレオチドを一本
鎖の標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズし
たプローブについて前記標識を検出等すれば良い。標識
の検出等は、標識物質に適した方法を採用すれば良く、
例えば、オリゴヌクレオチドの標識にインターカレータ
ー性蛍光色素を用いた場合は、標的核酸とオリゴヌクレ
オチドプローブからなる二本鎖核酸にインターカレーシ
ョンすることで蛍光強度が増加する性質の色素等を用い
れば、標的核酸とハイブリダイズしていないプローブを
除去等することなく、ハイブリダイズしたプローブのみ
を検出することが容易に実施できる。通常の蛍光色素等
を標識として使用した場合には、標的核酸とハイブリダ
イズしていないプローブを除去等した後に検出すれば良
い。なお、検出に当たっては、試料中の標的核酸をＰＣ
Ｒ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法などといった種々の核酸
増幅法により検出可能な量まで増幅させることが望まし
く、中でもＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増
幅法が最も望ましい。ここで、上記オリゴヌクレオチド
を標識したプローブを増幅の際に反応液に中に共存させ
る場合は、プローブがヌクレオチドプライマーとして機
能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸を
付加する等の修飾を行うことが特に望ましい。
その一部を修飾し又は検出可能な標識物質により標識す
ることにより、プローブとして使用することができる。
標的核酸を検出しようとする場合、検出可能な標識物質
により標識された本願発明のオリゴヌクレオチドを一本
鎖の標的核酸とハイブリダイズさせ、ハイブリダイズし
たプローブについて前記標識を検出等すれば良い。標識
の検出等は、標識物質に適した方法を採用すれば良く、
例えば、オリゴヌクレオチドの標識にインターカレータ
ー性蛍光色素を用いた場合は、標的核酸とオリゴヌクレ
オチドプローブからなる二本鎖核酸にインターカレーシ
ョンすることで蛍光強度が増加する性質の色素等を用い
れば、標的核酸とハイブリダイズしていないプローブを
除去等することなく、ハイブリダイズしたプローブのみ
を検出することが容易に実施できる。通常の蛍光色素等
を標識として使用した場合には、標的核酸とハイブリダ
イズしていないプローブを除去等した後に検出すれば良
い。なお、検出に当たっては、試料中の標的核酸をＰＣ
Ｒ法、ＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法などといった種々の核酸
増幅法により検出可能な量まで増幅させることが望まし
く、中でもＮＡＳＢＡ法、３ＳＲ法等の一定温度核酸増
幅法が最も望ましい。ここで、上記オリゴヌクレオチド
を標識したプローブを増幅の際に反応液に中に共存させ
る場合は、プローブがヌクレオチドプライマーとして機
能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸を
付加する等の修飾を行うことが特に望ましい。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下、本願発明を実施例により更
に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により限定
されるものではない。
【００１７】実施例 １ ｍｅｃＡ−ＲＮＡに対して、本願発明のオリゴヌクレオ
チドが４１℃で特異的に結合するかを確認した。なお、
ｍｅｃＡ−ＲＮＡは、ｍｅｃＡの塩基配列を含む二本鎖
ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製さ
れたＲＮＡである。
チドが４１℃で特異的に結合するかを確認した。なお、
ｍｅｃＡ−ＲＮＡは、ｍｅｃＡの塩基配列を含む二本鎖
ＤＮＡを鋳型としたインビトロ転写により合成、精製さ
れたＲＮＡである。
【００１８】まず、ＰＢＰ―２’に由来するｍｅｃＡ−
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７から１７１
頁に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６ｍｅｒ）を試
料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ
希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．
０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓ
ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い２．０×１０-12ｍｏ
ｌ／μｌとなるよう希釈した。
ＲＮＡの塩基番号１〜２０１３（ＲＮＡの塩基番号は松
橋ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２１、１６７から１７１
頁に従った）を含む標準ＲＮＡ（２０１６ｍｅｒ）を試
料とし、２６０ｎｍの紫外部吸収により定量後、ＲＮＡ
希釈液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８．
０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μｌ ＲＮａｓ
ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を用い２．０×１０-12ｍｏ
ｌ／μｌとなるよう希釈した。
【００１９】次に、市販の０．５ｍｌ容ＰＣＲ用チュー
ブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅ
ｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー
（株）製）に以下の各試薬を分注した。
ブ（商品名；Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｔｈｉｎ−Ｗａｌｌｅ
ｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ、パーキンエルマー
（株）製）に以下の各試薬を分注した。
【００２０】 ０．９０μｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６） ０．２０μｌ １Ｍ 塩化マグネシウム ０．６７μｌ ２Ｍ 塩化カリウム ０．１５μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ ０．３３μｌ １１９Ｕ／μｌ ＲＮａｓｅインヒビター ９．９５μｌ 蒸留水 ０．６μｌ ２ｐｍｏｌ／μｌ ｍｅｃＡ−ＲＮＡ試料 １．２μｌ １．０μＭオリゴヌクレオチド溶液 なお、オリゴヌクレオチド溶液としては、以下の番号の
オリゴヌクレオチド溶液のうち、いずれか一つを用い
た。
オリゴヌクレオチド溶液のうち、いずれか一つを用い
た。
【００２１】１．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号２４１か
ら２６１に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１） ２．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号２６４から２８３に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号２） ３．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号２９６から３１５に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号３） ４．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号３４９から３６８に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号４） ５．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４０２から４２１に相
補的なオリゴヌクレオチド ６．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４２５から４４４に相
補的なオリゴヌクレオチド ７．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４５６から４７５に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号５） ８．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４９９から４８０に相
補的なオリゴヌクレオチド ９．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５５１から５３２に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号６） １０．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５５６から５７５に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号７） １１．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５８１から６００に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号８として記載し
た配列の５’端１６番目から３５番目までのオリゴヌク
レオチド） １２．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号６０６から６２５に
相補的なオリゴヌクレオチド １３．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号６７２から６９１に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号９） １４．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号９４１から９６１に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１０） １５．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号９６７から９８６に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１１） １６．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１１３４から１１５
３に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１２） １７．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１１５４から１１７
３に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１３） １８．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１２２１から１２４
０に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１４） １９．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１６５６から１６７
５に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１５） ２０．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１７０１から１７２
０に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１６） ２１．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１８５２から１８７
１に相補的なオリゴヌクレオチド ２２．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１９０６から１９２
５に相補的なオリゴヌクレオチド ２３．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５９６から６１５に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号８として記載し
た配列の５’端１番目から２０番目までのオリゴヌクレ
オチド） ２４．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５７７から６１５に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号８） ２５．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１０８７から１１０
０に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１７） 次に、上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、ＡＭＶ
―ＲＴａｓｅ（宝酒造（株）製、ＡＭＶ―ＲＴａｓｅは
ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡを切断する酵素である）
を含む溶液を１μｌ添加し、引き続きＰＣＲチューブを
４１℃に５分間保温した。
ら２６１に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１） ２．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号２６４から２８３に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号２） ３．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号２９６から３１５に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号３） ４．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号３４９から３６８に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号４） ５．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４０２から４２１に相
補的なオリゴヌクレオチド ６．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４２５から４４４に相
補的なオリゴヌクレオチド ７．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４５６から４７５に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号５） ８．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号４９９から４８０に相
補的なオリゴヌクレオチド ９．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５５１から５３２に相
補的なオリゴヌクレオチド（配列番号６） １０．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５５６から５７５に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号７） １１．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５８１から６００に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号８として記載し
た配列の５’端１６番目から３５番目までのオリゴヌク
レオチド） １２．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号６０６から６２５に
相補的なオリゴヌクレオチド １３．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号６７２から６９１に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号９） １４．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号９４１から９６１に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１０） １５．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号９６７から９８６に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１１） １６．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１１３４から１１５
３に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１２） １７．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１１５４から１１７
３に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１３） １８．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１２２１から１２４
０に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１４） １９．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１６５６から１６７
５に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１５） ２０．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１７０１から１７２
０に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１６） ２１．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１８５２から１８７
１に相補的なオリゴヌクレオチド ２２．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１９０６から１９２
５に相補的なオリゴヌクレオチド ２３．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５９６から６１５に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号８として記載し
た配列の５’端１番目から２０番目までのオリゴヌクレ
オチド） ２４．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号５７７から６１５に
相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号８） ２５．ｍｅｃＡ―ＲＮＡの塩基番号１０８７から１１０
０に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１７） 次に、上記の反応液を、４１℃で５分間保温後、ＡＭＶ
―ＲＴａｓｅ（宝酒造（株）製、ＡＭＶ―ＲＴａｓｅは
ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮＡを切断する酵素である）
を含む溶液を１μｌ添加し、引き続きＰＣＲチューブを
４１℃に５分間保温した。
【００２２】反応後の切断断片を確認するため、ポリア
クリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は５％、尿素７
Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後に市販の染色液
（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）
製）により染色を行った。標的ＲＮＡの特定部位にオリ
ゴヌクレオチドが結合すると、ＡＭＶ―ＲＴａｓｅのリ
ボヌクレースＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲ
ＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
クリルアミドゲル（アクリルアミド濃度は５％、尿素７
Ｍ）電気泳動を実施した。電気泳動後に市販の染色液
（商品名；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＩ、宝酒造（株）
製）により染色を行った。標的ＲＮＡの特定部位にオリ
ゴヌクレオチドが結合すると、ＡＭＶ―ＲＴａｓｅのリ
ボヌクレースＨ活性により、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲ
ＮＡが切断され、特定バンドが観察される。
【００２３】電気泳動結果を図１に示した。各レーンに
おいて新たに出現したバンドのうち、用いた１つのオリ
ゴヌクレオチドにより特異的に切断された結果生じた２
つのバンドが観察されたレーンについて、長さが短いほ
うのバンドを矢印で示した。また、非特異的な切断バン
ドが顕著なものについてそのバンドを丸で囲んで示し
た。これより、上記オリゴヌクレオチドのうち、配列番
号１から１７及び配列番号８を含むオリゴヌクレオチド
溶液を用いた場合のみ、いずれも顕著な非特異切断バン
ドの無い、特異的な切断バンドが確認できたため、これ
らのオリゴヌクレオチドはいずれもｍｅｃＡ−ＲＮＡに
４１℃で強く結合している事が示された。
おいて新たに出現したバンドのうち、用いた１つのオリ
ゴヌクレオチドにより特異的に切断された結果生じた２
つのバンドが観察されたレーンについて、長さが短いほ
うのバンドを矢印で示した。また、非特異的な切断バン
ドが顕著なものについてそのバンドを丸で囲んで示し
た。これより、上記オリゴヌクレオチドのうち、配列番
号１から１７及び配列番号８を含むオリゴヌクレオチド
溶液を用いた場合のみ、いずれも顕著な非特異切断バン
ドの無い、特異的な切断バンドが確認できたため、これ
らのオリゴヌクレオチドはいずれもｍｅｃＡ−ＲＮＡに
４１℃で強く結合している事が示された。
【００２４】
【発明の効果】以上の説明のように、本願発明のオリゴ
ヌクレオチドは、ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライ
マーやプローブの結合を阻害しかねない、比較的低温か
つ一定温度（３５〜５０℃、好ましくは４１℃）条件下
でも、ＰＢＰ―２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子に由来
するＲＮＡと相補的に結合するオリゴヌクレオチドであ
る。従って、標的ＲＮＡを熱変性することなく、オリゴ
ヌクレオチドを特異的に結合させることが可能となる。
このように本願発明のオリゴヌクレオチドは、ＭＲＳＡ
の遺伝子要素であるｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡを
切断、増幅又は検出等するため、すなわちＲＮＡの増幅
で使用するオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌク
レオチドプローブとして有用である。
ヌクレオチドは、ＲＮＡが分子内構造を形成し、プライ
マーやプローブの結合を阻害しかねない、比較的低温か
つ一定温度（３５〜５０℃、好ましくは４１℃）条件下
でも、ＰＢＰ―２’をコードするｍｅｃＡ遺伝子に由来
するＲＮＡと相補的に結合するオリゴヌクレオチドであ
る。従って、標的ＲＮＡを熱変性することなく、オリゴ
ヌクレオチドを特異的に結合させることが可能となる。
このように本願発明のオリゴヌクレオチドは、ＭＲＳＡ
の遺伝子要素であるｍｅｃＡ遺伝子に由来するＲＮＡを
切断、増幅又は検出等するため、すなわちＲＮＡの増幅
で使用するオリゴヌクレオチドプライマーやオリゴヌク
レオチドプローブとして有用である。
【００２５】上記以外にも、本願発明のオリゴヌクレオ
チドは、ｍｅｃＡ遺伝子を増幅し又は検出等するために
有用である。また更には二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法等で増
幅したり、ＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡを検出
等するためには、上記した具体的なオリゴヌクレオチド
と相補的であるオリゴヌクレオチドも有用である。
チドは、ｍｅｃＡ遺伝子を増幅し又は検出等するために
有用である。また更には二本鎖ＤＮＡをＰＣＲ法等で増
幅したり、ＲＮＡを逆転写して得られるｃＤＮＡを検出
等するためには、上記した具体的なオリゴヌクレオチド
と相補的であるオリゴヌクレオチドも有用である。
【００２６】本願発明のオリゴヌクレオチドは、配列表
に記載した塩基配列（２０ｍｅｒ）のものに限られず、
これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からな
るオリゴヌクレオチドであれば良い。これは、比較的低
温（好ましくは４１℃）条件下で、プライマー又はプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０ｍｅ
ｒ程度の塩基配列があれば十分であることから明らかで
ある。
に記載した塩基配列（２０ｍｅｒ）のものに限られず、
これら配列中の少なくとも連続した１０塩基以上からな
るオリゴヌクレオチドであれば良い。これは、比較的低
温（好ましくは４１℃）条件下で、プライマー又はプロ
ーブの標的核酸への特異性を確保するためには１０ｍｅ
ｒ程度の塩基配列があれば十分であることから明らかで
ある。
【００２７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TOSOH Corporation <120> メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド <130> PA211-0187 <160> 17 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 1 ttttttattt tacgatcctg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 2 ctcgtttttt atttttagat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 3 gtagtttgtt ttaattttat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 4 cacataccat cttctttaac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 5 tgtttcggtc taaaatttta 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 6 ttataatctt ttttagatac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 7 atacttagtt ctttagcgat 20 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 8 cccaattttg atccatttgt tgttgatata gtcttcaga 39 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 9 atttttttgc gaaatcactt 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 10 ttttcttttt ctctattaat g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 11 gttagttgaa tatctttgcc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 12 atttattata ttcttcgtta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 13 ttctttttta tcttcggtta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 14 tcattgctgt taatattttt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 15 ctttgttttt cgtgtctttt 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 16 ttaatagatt gatattttct 20 <210> 17 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ｍｅｃＡ又は該遺伝子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能であるオリゴ ヌクレオチド <400> 17 gaaggtgtgc ttac 14
【図１】図１は、オリゴヌクレオチドの状態を示すため
の写真（白黒反転）であり、ＰＢＰ−２’をコードする
ｍｅｃＡ−ＲＮＡの分子内構造フリー領域に対し設計し
たオリゴヌクレオチドを用いて、４１℃でのｍｅｃＡ−
ＲＮＡへの結合実験を行った後のサンプルの７Ｍ尿素−
５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真である。図
中、レーンＭはＲＮＡマーカー、レーン１からレーン２
５は、実施例１で示したオリゴヌクレオチド溶液の番号
であり、レーン２６はオリゴヌクレオチドを用いなかっ
た場合である。
の写真（白黒反転）であり、ＰＢＰ−２’をコードする
ｍｅｃＡ−ＲＮＡの分子内構造フリー領域に対し設計し
たオリゴヌクレオチドを用いて、４１℃でのｍｅｃＡ−
ＲＮＡへの結合実験を行った後のサンプルの７Ｍ尿素−
５％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動写真である。図
中、レーンＭはＲＮＡマーカー、レーン１からレーン２
５は、実施例１で示したオリゴヌクレオチド溶液の番号
であり、レーン２６はオリゴヌクレオチドを用いなかっ
た場合である。
Claims (4)
- 【請求項１】メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈ
ｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ、以下ＭＲＳＡとする）
の遺伝子要素であるｍｅｃＡ遺伝子又は該遺伝子に由来
するＲＮＡを、切断、検出又は増幅するために有用なオ
リゴヌクレオチドであって、ｍｅｃＡ遺伝子又は該遺伝
子に由来するＲＮＡと特異的に結合可能である、配列番
号１から１７に示したいずれかの配列中の少なくとも連
続した１０塩基以上からなるオリゴヌクレオチド又はそ
れらのオリゴヌクレオチドと相補的であるオリゴヌクレ
オチド。 - 【請求項２】前記オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ伸長反
応のためのオリゴヌクレオチドプライマーである、請求
項１のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】前記オリゴヌクレオチドは、その一部が修
飾され又は検出可能な標識物質により標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブである、請求項１のオリゴヌクレ
オチド。 - 【請求項４】前記オリゴヌクレオチドは、その塩基の一
部がオリゴヌクレオチドプローブとしての機能を損なわ
ない範囲で変換された合成オリゴヌクレオチドである、
請求項３のオリゴヌクレオチド。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000163149A JP2001333783A (ja) | 2000-05-29 | 2000-05-29 | メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド |
| DE60133321T DE60133321T2 (de) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Methoden zur Detektion des mecA Gens beim methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus |
| US09/865,579 US7297517B2 (en) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Oligonucleotides and method for detection of meca gene of methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| EP04026759A EP1512756B1 (en) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Methods for detection mecA gene of methicillin-resistant Staphylococcus Aureus |
| EP01112100A EP1160333A3 (en) | 2000-05-29 | 2001-05-29 | Oligonucleotides and method for detection of mecA gene of methicillin-resistant staphylococcus aureus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000163149A JP2001333783A (ja) | 2000-05-29 | 2000-05-29 | メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド |
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|---|---|---|---|---|
| WO2010061981A1 (ja) * | 2008-11-28 | 2010-06-03 | 東ソー株式会社 | サイトケラチン１９ ｍＲＮＡの測定方法 |
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| JP2002509436A (ja) * | 1997-07-03 | 2002-03-26 | アイディー バイオメディカル コーポレイション | メチシリン耐性ブドウ球菌を迅速に検出するための方法 |
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2000
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