WO2010061981A1 - サイトケラチン１９ ｍＲＮＡの測定方法 - Google Patents

サイトケラチン１９ ｍＲＮＡの測定方法 Download PDF

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WO2010061981A1
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sequence
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尾本大輔
斉藤寿一
大仲悟
林俊典
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東ソー株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6865—Promoter-based amplification, e.g. nucleic acid sequence amplification [NASBA], self-sustained sequence replication [3SR] or transcription-based amplification system [TAS]

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring cytokeratin 19 mRNA using a nucleic acid amplification method. More precisely, the present invention provides an oligonucleotide suitable for amplification and detection of mRNA at a constant temperature (40 to 60 ° C., preferably 43 ° C.). By the present invention, cytokeratin 19 mRNA in a sample can be conveniently and It can be measured quickly. The present invention also provides a reagent for cytokeratin 19 mRNA measurement, which is useful for research and medical care in molecular biology, biochemistry, medical fields and the like.
  • Cytokeratin is an intermediate filament protein that forms the cytoskeleton and is characteristically present in epithelial tissues. To date, more than 20 types of cytokeratin have been identified and classified into acidic type I and neutral to basic type II based on the charge of the protein. Cytokeratin has different expression sites depending on the type, cytokeratins 8, 18, and 19 are mainly expressed in epithelial cells, cytokeratins 5 and 14 are basal cells, and cytokeratins 2, 6, 10, and 11 are basal cells. It is known to be localized in the upper tissue. Cytokeratin is widely recognized in the fields of medicine and the like because it is frequently used for immunostaining using anti-cytokeratin antibodies.
  • diagnosis of cancer is performed pathologically, and it is common to use a specimen obtained by staining a tissue or cell suspected of cancer with hematoxylin and eosin (HE staining).
  • HE staining may make it difficult to distinguish between cancer cells and normal cells, and the discovery of cancer cells may be missed.
  • immunohistochemical staining using anti-cytokeratin antibodies is frequently used. When a positive reaction is observed as a result of immunohistochemical staining of a sample other than epithelial tissue using an anti-cytokeratin antibody, cytokeratin that should have been expressed only in epithelial tissue is expressed in that tissue. Thus, histologically abnormal, that is, pathologically, cancer is judged.
  • Cytokeratin 19 (hereinafter referred to as “CK19”) is known not only to be expressed mainly in epithelial tissues but also in small amounts in other normal tissues, but its expression is enhanced in various cancers. It is clear that In immunostaining using the aforementioned anti-cytokeratin antibody, an antibody that recognizes CK19 as an antigen is often used. Such expression characteristics of CK19 satisfy the condition as a tumor marker and are actually widely used as a tumor marker. CK19 is applied to many cancer types because its expression is enhanced in various cancers, and its usage is diverse, including early diagnosis of cancer, diagnosis of metastasis, and monitoring of therapeutic effects. I can say that. As described above, cancer diagnosis by pathological diagnosis is widely used as a gold standard.
  • nucleic acid amplification methods are already known to be highly sensitive and can be used to amplify specific genes to obtain high specificity. Depending on the measurement method, it is also possible to quantify specific genes in a sample. It is. In other words, information on the magnitude of the expression level of a specific gene can also be provided.
  • RT-PCR Reverse Transfer-Polymerase Chain Reaction
  • CK19 mRNA has also been reported.
  • Non-Patent Document 1 Tao, L. et al., British Journal of Cancer, 94, 1164-1169 ( 2006)
  • Non-Patent Document 2 Wang, HY et al., International Journal of Gynecological Cancer, 16, 643-64. (2006).
  • Non-patent document 3 Weiggelt, B.
  • Non-patent document 4 Kamiya, M. et al., British Journal. of Dermatology, 149, 998-1005 (2003) (Non-Patent Document 5); Makino, H. et al., Hepato-Gastroenterology, 50, 1407-1410 (2003) (Non-Patent Document 6); A. et al., British Journal of Cancer, 79, 1813-1820 (1999) (Fujita, Y. et al., Gastric Cancer, 9, 308-31). (2006) (Non-patent document 8); Japanese translations of PCT publication No.
  • the amplification method is, for example, after extracting RNA from tumor tissue, (A) synthesizing cDNA from the extracted RNA using reverse transcriptase, and (B) a step of amplifying and detecting the cDNA by PCR; And a two-stage process (in some cases, a detection process needs to be carried out separately), suggesting the complexity of operation and the risk of secondary contamination. In addition, two hours or more are usually required to carry out the two-stage process, and there are problems in terms of poor reproducibility due to the execution of a plurality of processes, processing of a large number of samples, and reduction of test costs.
  • OneSTEP RT-PCR method which simultaneously performs the two steps, has been developed to shorten the reaction time.
  • the detection sensitivity is reduced and non-specific amplification products are compared with the RT-PCR method in which each step is performed separately. It is pointed out that it is easy to produce.
  • amplification by the PCR method amplifies double-stranded DNA, there is a concern about the possibility of amplifying the chromosomal DNA to be mixed. Therefore, in order to analyze mRNA expression strictly, digestion with DNase or the like is performed. It was necessary to remove it completely. For this reason, further complicated operations and poor reproducibility are incurred.
  • PCR method needs to raise and lower the reaction temperature abruptly, which has been a barrier for labor saving and cost reduction of the reaction apparatus at the time of automation.
  • RT-LAMP Reverse Transcription-Loop mediated isometric Amplification
  • This consists of mixing two types of inner primer, two types of outer primer, reverse transcriptase, strand displacement DNA synthase, substrate, etc., and keeping the target nucleic acid at a constant temperature (around 65 ° C). It is a method of amplification. However, the amplification method is very complicated because the number of primer designs is large and there are many restrictions in designing individual primers. For example, after selecting three regions at the 3 ′ end and 5 ′ end for the target gene (in this case, the distance between the regions is important), the regions are homologous or complementary. It is necessary to design primers having different lengths by combining specific sequences.
  • the region where the primer can be designed is considerably limited. Furthermore, it is possible to use a loop primer to increase the reaction rate (the detection time is shortened to about 30 minutes by using the loop primer), but it is necessary to design two more primers. Thus, designing a large number of primers is not only difficult, but also disadvantageous in terms of manufacturing cost. Furthermore, in the LAMP method, the amount of the amplified product is relatively estimated by detecting the turbidity of the reaction solution instead of directly detecting the amplified product.
  • the method for detecting turbidity does not directly detect amplified nucleic acid, so not only quantitative detection is not possible when non-specific amplification products are produced, It is not known whether a specific amplification product has been produced. In addition, it is difficult to completely suppress the production of nonspecific amplification products by the LAMP method in which a large number of primers are involved in the reaction. Therefore, it can be said that it is unsuitable to simultaneously amplify and detect a plurality of tumor markers, such as multiplex PCR, which has been partially reported in the PCR method. This is because the turbidity detection method cannot determine which tumor marker has been amplified and detected.
  • the LAMP method like the RT-PCR method, amplifies chromosomal DNA because it amplifies using double-stranded DNA as a template.
  • the temperature during amplification by the LAMP method is constant at 65 ° C., but generally high temperature treatment is required before and after the reaction, which is an obstacle to labor saving and cost reduction of the reaction apparatus.
  • NASBA method see Japanese Patent No. 2650159 (Patent Document 6); Japanese Patent No. 3152927 (Patent Document 7)
  • TMA method Japanese Patent No. 3241717 (See Patent Document 8)).
  • RNA amplification method a double-stranded DNA containing a promoter sequence is synthesized by using a primer containing a promoter sequence for a target RNA, reverse transcriptase and, if necessary, ribonuclease H (RNase H).
  • RNA containing a specific base sequence derived from a target RNA is generated by RNA polymerase using the strand DNA as a template, and this RNA is subsequently subjected to a chain reaction that serves as a template for double-stranded DNA synthesis containing a promoter sequence. Then, after RNA amplification, the amplified RNA is detected by electrophoresis or a hybridization method using a nucleic acid probe bound with a detectable label.
  • the RNA amplification method is suitable for simple RNA measurement because it amplifies only RNA at a constant temperature and in one step.
  • detection by a hybridization method or the like requires complicated operations.
  • the amplification process is at a constant temperature, it is usually necessary to perform preliminary heating (for example, 65 ° C.) before the amplification process, which has been a problem for labor saving and cost reduction of the reaction apparatus.
  • RNA amplification method is carried out in the presence of oligonucleotide probes designed to measure changes in fluorescence characteristics, and RNA amplification and measurement can be performed simultaneously, quickly, and conveniently in a sealed container at a constant temperature, in one step. It is possible to implement. In this method, since an oligonucleotide probe specific to the amplified nucleic acid is used, the amplified nucleic acid can be directly detected, and more than one nucleic acid can be detected by using a plurality of intercalating fluorescent dyes. After amplification, individual amplification products can be detected.
  • RNA-dependent DNA polymerase reverse transcriptase
  • RNA-dependent DNA polymerase reverse transcriptase
  • RNA polymerase is allowed to act on the double-stranded DNA generated in (3) to generate a transcription product (RNA having a specific base sequence). Since the RNA transcript generated in (4) is RNA derived from a specific base sequence, it becomes a template in the reaction of (1), binds to the DNA primer used in the reaction of (1), and (1) To (4) proceeds to cause RNA amplification chain reaction.
  • the feature of the nucleic acid amplification method is that it is not necessary to raise or lower the temperature of the reaction solution as in the PCR method, and that reverse transcription of RNA and the subsequent DNA amplification reaction are not performed separately.
  • an intercalating fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe capable of specifically binding to the amplified RNA transcript coexists in the reaction solution, and simultaneously with the amplification of a specific base sequence or a sequence complementary to the base sequence.
  • the amplification can be directly detected (monitored). Therefore, unlike the usual RNA amplification method, it is not necessary to separately perform hybridization detection and the like, and the time required to obtain a result can be greatly shortened.
  • the nucleic acid amplification method is derived from performing amplification detection of target mRNA under a relatively low temperature (40 to 60 ° C., preferably 43 ° C.) through an amplification reaction.
  • RNA single-stranded RNA such as mRNA
  • the target mRNA forms a higher order structure
  • As an index of RNA higher-order structure it is possible to calculate and estimate the secondary structure from the base sequence using secondary structure analysis software, but it is extremely difficult to estimate the actual higher-order structure from the calculated secondary structure. is there.
  • the binding efficiency is lowered even under constant temperature conditions (40 to 60 ° C., preferably 43 ° C.).
  • an oligonucleotide capable of amplifying and detecting CK19 mRNA and a combination thereof were required.
  • An object of the present invention is to provide a method for rapidly measuring cytokeratin 19 mRNA in a single step operation at a constant temperature from a sample obtained from a human cell or tissue.
  • CK19 cytokeratin 19
  • the first invention relates to a method for measuring CK19 mRNA in a sample, The measurement method described below uses a first primer having a sequence homologous to a part of a specific base sequence in CK19 mRNA, and a second primer having a sequence complementary to a part of the specific base sequence.
  • either one of the first and second primers is a primer having an RNA polymerase promoter sequence added to its 5 ′ end: (1) a step of synthesizing cDNA complementary to a specific base sequence by an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity using RNA as a template; (2) a step of degrading RNA-DNA double-stranded RNA obtained by the reaction of (1) with an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity (generation of single-stranded DNA), (3) Two having a promoter sequence capable of transcribing the specific base sequence or an RNA complementary to the specific base sequence by an enzyme having DNA-dependent DNA polymerase activity using single-stranded DNA as a template Producing a strand DNA; (4) generating an RNA transcript using the double-stranded DNA as a template by an enzyme having RNA polymerase activity; (5) a step of generating an RNA transcript in a chain manner by using the RNA transcript as a template for cDNA synthesis in the reaction of (1)
  • the second invention is the method for measuring CK19 mRNA according to the first invention, wherein the first and second primers are any of the following: (I) The first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 19 to 22, and the second primer is shown in SEQ ID NOs: 29 to 32 An oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in any one of the base sequences, (Ii) The first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 23 or 24, and the second primer is a base shown in SEQ ID NO: 33 or 34 An oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the sequence; (Iii) The first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 or 26, and the second primer is a base shown in SEQ ID NO: 35 or
  • the third invention is the method for measuring CK19 mRNA according to the first or second invention, wherein the step (6) (step of measuring the amount of RNA transcript) is a double strand complementary to the target RNA.
  • the step (6) step of measuring the amount of RNA transcript
  • the fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe is an intercalator fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe in which an intercalator fluorescent dye is bound via a linker. It is a measuring method of description.
  • the intercalator fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe comprises an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 39 to 46 or the complementary sequence. It is a measuring method as described in 4th invention characterized by these.
  • a sixth invention is the method for measuring CK19 mRNA according to any one of the first to fifth inventions, wherein the step (1) (the RNA is used as a template to convert the specific base sequence by an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity).
  • a seventh invention is the measuring method according to the sixth invention, characterized in that the cleaving oligonucleotide is an oligonucleotide having any one of the base sequences shown in SEQ ID NOs: 9 to 18.
  • the eighth invention is an oligonucleotide for specifically amplifying or detecting CK19 mRNA, which is in any one of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 8, or SEQ ID NOs: 39 to 46, or the complementary sequence
  • the oligonucleotide is characterized by comprising an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases.
  • the ninth invention is a reagent for measuring CK19 mRNA, comprising at least one oligonucleotide according to the eighth invention.
  • FIG. 1 shows a calibration curve for CK19 RNA.
  • Combination [30] The vertical axis represents the time when the fluorescence intensity ratio exceeded 1.2 (detection time, minutes), and the horizontal axis represents the initial standard RNA amount (copy number) used for the measurement in log.
  • the linear linear curve equation obtained from each point and the value of R 2 are described.
  • the sample in the present invention means a nucleic acid sample containing RNA.
  • the present invention is based on the method described in, for example, JP-A-7-59572, using human cells, human tissues, body fluids, blood, urine, feces, lymph fluid, milk duct fluid, or abdominal cavity or thoracic cavity lavage fluid as a material.
  • CK19 mRNA contained in human cells or tissues from which the sample is derived is measured.
  • the specific base sequence in the present invention is RNA or DNA homologous to the base sequence from the 5 ′ end of the homologous region with the first primer to the 3 ′ end of the complementary region with the second primer in CK19 mRNA.
  • the base sequence is shown. That is, on CK19 mRNA, the first primer is homologous to at least 15 bases continuous in the 3 ′ direction from the 5 ′ end of the specific base sequence, and the second primer is 5 from the 3 ′ end of the specific base sequence. 'Complementary to at least 15 consecutive bases in the direction. Therefore, in the present invention, an RNA transcript derived from the specific base sequence is amplified.
  • the 5 ′ end site of the homologous region with the first primer in the present invention consists of a partial sequence containing the 5 ′ end of the homologous region within the specific base sequence, and the site is a complementary region to the cleavage oligonucleotide. And a region where homologous regions of the first primer overlap.
  • the promoter in the present invention is a site where RNA polymerase binds and initiates transcription. Promoter sequences specific to various RNA polymerases are known, and the promoter is not particularly limited in the use of the present invention. However, the T7 promoter, SP6 promoter, The T3 promoter is preferred. Further, the sequence may contain an additional sequence related to transcription efficiency.
  • the complementary sequence in the present invention refers to a sequence that can hybridize to a target base sequence under highly stringent conditions.
  • highly stringent conditions the nucleic acid amplification reaction solution composition described in the examples of the present invention can be mentioned.
  • the homologous sequence in the present invention refers to a sequence capable of hybridizing to a completely complementary sequence of a target base sequence under highly stringent conditions. Therefore, the length or the like of the complementary or homologous sequence referred to in the present invention can be arbitrarily set within a range that does not affect the specificity and efficiency of hybridization under highly stringent conditions. Needless to say.
  • nucleotide or nucleic acid in the present invention refers to a nucleotide or nucleoside (including both RNA and DNA) consisting of a naturally occurring base, sugar and intersugar linkage, and its oligomer (oligonucleotide such as 2 to 2). And a polymer (polynucleotide, for example, 100 bases or more).
  • the nucleotide or nucleic acid in the present invention also includes a non-naturally occurring monomer, a fluorescent molecule, and a monomer labeled with a radioisotope that function in the same manner, or an oligomer or polymer containing them.
  • the primer in the present invention refers to a nucleotide that is hybridized with a template in a nucleic acid amplification reaction and is necessary for initiating the nucleic acid amplification reaction. Based on the template desired for amplification in the nucleic acid amplification reaction, the template is used.
  • the primer itself is preferably designed to contain a sequence specific to the template so that a product is obtained.
  • the primer length is usually designed to have a chain length of 15 to 100 bases, preferably 15 to 35 bases, but is not limited thereto. Therefore, the first and second primers of the present invention can be selected from arbitrary sequences of at least 15 consecutive bases within the range of the base sequences described in the present invention.
  • the first and second primers for detecting CK19 mRNA in the present invention are: (I) the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 that is homologous to a part of CK19 mRNA, and the second primer is An oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 5 complementary to a portion of CK19 mRNA; (Ii) the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to the sequence shown in SEQ ID NO: 2 that is homologous to a part of CK19 mRNA, and the second primer is An oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 6 complementary to a portion of CK19 mRNA; (Ii)
  • the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to any of the sequences described in SEQ ID NOs: 19 to 22 homologous to a part of CK19 mRNA; An oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to any sequence set forth in SEQ ID NOs: 29 to 32, wherein the second primer is complementary to a portion of CK19 mRNA; (Ii) the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or 24 homologous to a part of CK19 mRNA; An oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34, wherein the primer is complementary to
  • the first primer is a kind of oligonucleotide selected from the sequences set forth in SEQ ID NOs: 19 to 22, and the second primer is a type of oligonucleotide selected from the sequences set forth in SEQ ID NOs: 29 to 32;
  • the first primer is a kind of oligonucleotide selected from the sequence set forth in SEQ ID NO: 23 or 24, and the second primer is a type of oligonucleotide selected from the sequence set forth in SEQ ID NO: 33 or 34;
  • the first primer is a kind of oligonucleotide selected from the sequence set forth in SEQ ID NO: 25 or 26, and the second primer is a type of oligonucleotide selected from the sequence set forth in SEQ ID NO: 35 or 36;
  • the first primer is a kind of oligonucleotide selected
  • CK19 mRNA is cleaved at the 5 ′ end site of a specific nucleic acid sequence in the RNA before becoming a template for cDNA synthesis.
  • a DNA strand complementary to the promoter sequence of the first primer hybridized to the cDNA is extended by extending the 3 ′ end of the cDNA. It can be synthesized efficiently and results in the formation of a functional double stranded DNA promoter structure.
  • a region overlapping with the 5 ′ end site of the specific base sequence in CK19 mRNA (partial sequence including the 5 ′ end site in the specific base sequence) and adjacent in the 5 ′ direction is used.
  • a method of cleaving an RNA portion of an RNA-DNA double strand formed by adding an oligonucleotide having a complementary sequence (hereinafter referred to as a cleaving oligonucleotide) with an enzyme having ribonuclease H (RNase H) activity can be given.
  • the cleavage oligonucleotide includes an oligonucleotide having a sequence homologous to the sequence described in SEQ ID NOs: 9 to 18 complementary to a part of CK19 mRNA.
  • the target RNA in the present invention refers to a sequence other than the homologous or complementary region of the primer among the specific base sequence on the RNA transcript, and can be complementarily bound to an intercalating fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe.
  • the intercalator fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe has a sequence complementary or homologous to a part of the specific base sequence in the present invention.
  • an intercalating fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe at least a sequence homologous to or complementary to the sequence of SEQ ID NOs: 39 to 46 complementary to a part of CK19 mRNA And a probe containing an oligonucleotide consisting of 15 bases.
  • oligonucleotide whose cleavage oligonucleotide is a sequence homologous to any of the sequences shown in SEQ ID NOs: 9 to 12, and a first primer that is homologous to the sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • Oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the sequence (note that the first primer has a promoter sequence at its 5 ′ end, and the 5 ′ end site of the homologous region with the primer in the specific nucleic acid sequence is a sequence) 15 overlapping oligonucleotides with the complementary region of the sequence described in numbers 9 to 12), at least a 15-base oligonucleotide in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 5, intercalating fluorescence
  • the dye-labeled oligonucleotide probe is at least continuous in a sequence homologous to any of the sequences shown in SEQ ID NOs: 9 to 12, and a first primer that is homolog
  • an oligonucleotide having at least a continuous 15 bases in a sequence homologous to the sequence described in SEQ ID NO: 6, an intercalating fluorescent dye-labeled oligo
  • the nucleotide probe is at least contiguous in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 42 or 43.
  • Probe comprising an oligonucleotide consisting of 15 bases, (Iii) an oligonucleotide whose cleavage oligonucleotide is a sequence homologous to the sequence described in SEQ ID NO: 15 or 16, and a first primer in a sequence homologous to the sequence described in SEQ ID NO: 3 Oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases (note that the first primer has a promoter sequence at its 5 ′ end, and the 5 ′ end site of the homologous region with the primer in the specific nucleic acid sequence is SEQ ID NO: 15 or 16 overlapping with the complementary region of the sequence 16), at least a contiguous 15-base oligonucleotide in the sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 7, an intercalating fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe Is at least a continuous 1 in a sequence homologous to the sequence set forth in SEQ ID NO: 44 or 45 Probe comprising
  • the cleaving oligonucleotide is an oligonucleotide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 9
  • the first primer is an oligonucleotide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 19 (note that the first primer has its 5 ′ end
  • the second primer is a kind of oligonucleotide selected from the sequence described in SEQ ID NO: 29 or 30, and the intercalating fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe is described in SEQ ID NO: 39 or 40
  • the cleaving oligonucleotide is an oligonucleotide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 9
  • the first primer is an oligonucleotide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 19 (note that the first primer has its 5 ′ end
  • the second primer is a kind of oligonucleotide selected from
  • each enzyme an enzyme having RNA-dependent DNA polymerase activity (reverse transcriptase) using single-stranded RNA as a template (reverse transcriptase), an enzyme having RNase H activity, single-stranded DNA is used as a template).
  • An enzyme having a DNA-dependent DNA polymerase activity and an enzyme having an RNA polymerase activity As each enzyme, an enzyme having several activities may be used, or a plurality of enzymes having respective activities may be used.
  • reverse transcriptase having three activities of RNA-dependent DNA polymerase activity using single-stranded RNA as a template, RNase H activity, and DNA-dependent DNA polymerase activity using single-stranded DNA as a template has RNA polymerase activity.
  • an enzyme having RNase H activity may be further added as necessary.
  • the reverse transcriptase is preferably AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, HIV reverse transcriptase, or derivatives thereof widely used in molecular biological experiments, and most preferably AMV reverse transcriptase and derivatives thereof.
  • the enzyme having the RNA polymerase activity examples include bacteriophage-derived T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, SP6 RNA polymerase, and derivatives thereof widely used in molecular biological experiments and the like.
  • the cleavage oligonucleotide is added to CK19 mRNA in a sample, and the RNA is cleaved at the 5 ′ end site of the specific base sequence by the RNase H activity of the reverse transcriptase.
  • the second primer When a reverse transcription reaction with the reverse transcriptase is performed in the presence of the first and second primers using the cleaved RNA as a template, the second primer binds to a specific base sequence in CK19 mRNA, and the reverse CDNA synthesis is performed by the RNA-dependent DNA polymerase activity of the transcriptase.
  • the RNA-DNA duplex thus obtained is decomposed by the RNase H activity of the reverse transcriptase and dissociated, whereby the first primer is bound to the cDNA.
  • double-stranded DNA derived from a specific base sequence and having a promoter sequence at the 5 ′ end is generated by the DNA-dependent DNA polymerase activity of the reverse transcriptase.
  • the double-stranded DNA contains a specific base sequence downstream of the promoter sequence, and an RNA transcript derived from the specific base sequence is produced by the RNA polymerase.
  • the RNA transcript becomes a template for the double-stranded DNA synthesis by the first and second primers, and a series of reactions proceed in a chain, and the RNA transcript is amplified.
  • at least a buffer, a magnesium salt, a potassium salt, a nucleoside-triphosphate, and a ribonucleoside-triphosphate are included as known elements essential to each enzyme. Not too long.
  • the reaction temperature is preferably set in the range of 35 to 65 ° C., more preferably set in the range of 40 to 60 ° C., and a more preferable embodiment is the reaction temperature. Is 43 ° C.
  • the RNA amplification process proceeds at a constant temperature, and the reaction temperature can be set to any temperature at which reverse transcriptase and RNA polymerase exhibit activity.
  • the amount of the amplified RNA transcript can be measured by a known nucleic acid measurement method.
  • Examples of the measurement method include a method using electrophoresis or liquid chromatography, a hybridization method using a nucleic acid probe labeled with a detectable label, and the like.
  • these are multi-step operations, and the amplification products are taken out of the system for analysis, and therefore there is a great risk of scattering of amplification products to the environment causing secondary contamination.
  • a known probe using FRET such as a molecular beacon, can be used as the oligonucleotide probe.
  • a more preferable method is that it is labeled with an intercalating fluorescent dye and is a target nucleic acid.
  • Nucleic acid amplification in the presence of an oligonucleotide probe designed to change the fluorescence characteristics by intercalating the complementary double-stranded portion with the intercalating fluorescent dye portion when a complementary double strand is formed with There is a method of performing a process and measuring a change in fluorescence characteristics (see Patent Document 9 and Non-Patent Document 11).
  • said intercalator fluorescent dye Oxazole yellow, thiazole orange, ethidium bromide, these derivatives, etc. which are used widely can be utilized.
  • the change in the fluorescence characteristics includes a change in fluorescence intensity.
  • fluorescence at 510 nm excitation wavelength: 490 nm
  • the intercalator fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe is an oligonucleotide complementary to the target RNA on the RNA transcript, and is intercalator fluorescent via an appropriate linker at the end, phosphodiester part or base part.
  • the sample includes at least a first primer having a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 47) at the 5 ′ end, a second primer, an intercalating fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe, a cleavage oligonucleotide, Amplification reagents including AMV reverse transcriptase, T7 RNA polymerase, buffer, magnesium salt, potassium salt, nucleoside-triphosphate, ribonucleoside-triphosphate, dimethyl sulfoxide (DMSO) were added, and the reaction temperature was 40 to 60 ° C ( There is provided a method of measuring the fluorescence intensity of a reaction solution over time while reacting at a constant temperature (preferably 43 ° C.).
  • a constant temperature preferably 43 ° C.
  • the fluorescence intensity is measured over time, the measurement can be completed at any time when a significant increase in fluorescence is observed, and the nucleic acid amplification and measurement are usually completed within 30 minutes. Is possible.
  • the CK19 mRNA in the sample is measured, and the information on the obtained fluorescence intensity ratio is compared with the information on the fluorescence intensity ratio when the CK19 RNA at a known concentration is measured. It is possible to calculate the amount (specific RNA copy number) of the specific base sequence present therein.
  • a sandwich assay method using an immobilized and labeled probe capable of complementary binding to a specific base sequence can be applied to a reaction solution obtained by performing the above reaction for a certain period of time.
  • a method using an intercalator fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe that specifically binds to a specific base sequence is preferable.
  • this probe does not inhibit the RNA amplification reaction, a method of performing amplification of the specific base sequence in the presence thereof and monitoring the state of amplification of the specific base sequence is particularly preferable.
  • oligonucleotide probe for example, glycolic acid or biotin is added to its 3 ′ end so that the probe portion does not function as an extension reaction primer. It is preferable to add.
  • the fluorescence signal emitted by the intercalating fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe bound to a specific base sequence is measured by a fluorescence detector, and information obtained from the profile (for example, the intensity of the fluorescence emitted by the fluorescent dye is The reaction time required to reach a certain intensity) is compared with information obtained from a profile for a known amount of standard RNA to confirm the presence or absence of the specific base sequence, or the amount of the specific base sequence amplified.
  • the amount (specific RNA copy number) of the specific nucleic acid sequence present in the sample can be estimated from (RNA copy number). It should be noted that all the samples contained in the measurement reagent can be sealed in a single container.
  • CK19 mRNA can be automatically measured after the operation of dispensing a certain amount of sample into such a single container.
  • This container only needs to be made of a transparent material at least partially so that the signal emitted from the fluorescent dye can be measured from the outside. Any container that can be sealed after dispensing a sample is contaminated. This is particularly preferable for preventing nations. Since the RNA amplification / measurement method of the above embodiment can be carried out at a constant temperature in one step, it can be said that it is a simpler method suitable for automation than RT-PCR. According to the present invention, high specificity, high sensitivity, rapidity, convenience, constant temperature, and direct amplification / detection of CK19 mRNA are possible.
  • double-stranded DNA having a 5′-end of the promoter region of DNA-dependent RNA polymerase is synthesized based on the target RNA (CK19 gene mRNA) in the sample, and a large amount of the DNA is used as a template.
  • Single-stranded RNA is generated, and the amount of the generated single-stranded RNA increases dramatically, and the oligonucleotide probe labeled with the intercalating fluorescent dye is complementarily bound to the generated single-stranded RNA.
  • the CK19 mRNA measurement method of the present invention has a nucleic acid amplification and measurement time of 30 minutes or less, which is the existing RT-PCR method (usually 2 hours or more), NASBA method (90 minutes or more), TMA method (90 minutes). As described above, it has the same or higher speed than the measurement by the RT-LAMP method (usually about 30 to 60 minutes).
  • an oligonucleotide for amplifying and detecting CK19 gene mRNA in one step, that is, providing an oligonucleotide for amplifying CK19 mRNA and an oligonucleotide for detecting CK19 mRNA
  • a simple, rapid, and highly sensitive method for measuring CK19 mRNA-expressing cells, and a quantitative reagent can be provided to biochemistry, molecular biology, medical fields, and the like.
  • Example 1 Preparation of Standard RNA CK19 RNA (hereinafter referred to as standard RNA) used in Examples described later was performed by the method shown in (1) to (2).
  • standard RNA Standard RNA CK19 RNA
  • (1) From the base sequence of CK19 registered in GenBank (GenBank Accession No. NM_002276, 1490 bases), a double-stranded DNA of the 160th to 1353rd bases (1194 bases) was cloned.
  • (2) In vitro transcription was performed using the double-stranded DNA prepared in (1) as a template. Subsequently, the double-stranded DNA was completely digested by DNase I treatment, and then RNA was purified and prepared.
  • RNA was quantified by measuring the absorbance at 260 nm.
  • Example 2 Preparation of Intercalator Fluorescent Dye Labeled Oligonucleotide Probe An oligonucleotide probe labeled with an intercalator fluorescent dye was prepared.
  • Example 3 Measurement of CK19 RNA (Part 1) Among the combinations shown in Table 1, the cleavage oligonucleotide, the first primer, the second primer, and the intercalator fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe (hereinafter referred to as INAF probe) shown in [1] to [28] are used.
  • INAF probe intercalator fluorescent dye-labeled oligonucleotide probe
  • SEQ ID NOs: 19 to 22 are partial sequences of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NOs: 23 and 24 are partial sequences of SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NOs: 25 and 26 are partial sequences of SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NOs: 27 and 28 Is a partial sequence of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NOs: 29 to 32 are partial sequences of SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NOS: 33 and 34 are partial sequences of SEQ ID NO: 6
  • SEQ ID NOS: 35 and 36 are partial sequences of SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 37 And 38 are partial sequences of SEQ ID NO: 8.
  • RNA 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 0.5 U / ⁇ L ribonuclease inhibitor, 5.0 mM DTT). It was diluted to 3 copies / 5 ⁇ L and used as an RNA sample.
  • 20.0 ⁇ L of the reaction solution having the following composition was dispensed into a 0.5 mL PCR tube (Individual PCR tube with cap, manufactured by SSI), and 5 ⁇ L of the RNA sample was added thereto.
  • the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • the second primer is at least continuous in the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the second primer is at least continuous in the base sequence shown in SEQ ID NO: 6
  • a combination which is an oligonucleotide consisting of 15 bases (Iii)
  • the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the second primer is at least continuous in the base sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the first primer is an oligonucleotide consisting of at least 15 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the second primer is at least continuous in the base sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • a combination which is an oligonucleotide consisting of 15 bases By performing an RNA amplification reaction using any of the above, it is possible to detect CK19 RNA rapidly as compared with the CK19 mRNA detection method (usually 2 hours or more) by the RT-PCR method most commonly used in the prior art. Indicated.
  • Example 4 Measurement of CK19 RNA (Part 2) A standard RNA having a lower concentration than that of Example 3 was measured using the combination of oligonucleotides of the present invention.
  • (1) Experimental method It implemented by the method similar to Example 3 except having changed the combination of the oligonucleotide and the RNA sample into the following content.
  • Oligonucleotide combinations Of the combinations shown in Table 1, combinations [5] to [8], [10], [12], [14], [16], [20] to [22], [24], [27] to [27] 30].
  • RNA sample The standard RNA prepared in Example 1, using the RNA diluent used in Example 3 (1), using a diluted to 50 copies / 5 [mu] L, 10 2 copies / 5 [mu] L, and 10 3 copies / 5 [mu] L.
  • (2) Experimental result The time when the enzyme was added was set to 0 minutes, and the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (fluorescence intensity value at a predetermined time ⁇ background fluorescence intensity value) exceeded 1.2. Table 3 shows the results when the time was set as the detection time. In all the oligonucleotide combinations examined this time, 50 copies / 5 ⁇ L of standard RNA was detected within 20 minutes.
  • NM_000224, 1485 bases the 110th to 1434th bases (1325 bases), and the base sequence of CK20 registered in GenBank (GenBank Accession No. NM_019010, 1817 bases), the 40th to 1710th bases ( 1671 base) double-stranded DNA was cloned.
  • 1-2 In vitro transcription was performed using the double-stranded DNA prepared in (1-1) as a template. Subsequently, the double-stranded DNA was completely digested by DNase I treatment, and then RNA was purified and prepared. The RNA was quantified by measuring the absorbance at 260 nm.
  • RNA diluted in standard RNA prepared in (1-2) (10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), 0.1 mM EDTA, 0.5 U / ⁇ L ribonuclease inhibitor, 5.0 mM DTT) was diluted to 10 10 copies / 5 ⁇ L.
  • Oligonucleotide combinations Among the combinations shown in Table 1, combinations [8], [10], [21], and [28] are used.
  • the combination [8] is a combination in which the first primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 1, and the second primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 5,
  • Combination [10] is a combination in which the first primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 2 and the second primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 6,
  • Combination [21] is a combination in which the first primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 3 and the second primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 7,
  • Combination [28] is a combination in which the first primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 4 and the second primer consists of a partial sequence of SEQ ID NO: 8, Respectively.
  • RNA sample Among the RNA samples, CK19 uses the sample used in Example 3, and CK18 and CK20 use the sample prepared in (1) of this example. (3) Experimental result The time when the enzyme was added was 0 minute, and the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (fluorescence intensity value at a predetermined time ⁇ background fluorescence intensity value) exceeded 1.2, Table 4 shows the results when the time of the day was the detection time. In Table 4, N.I. D. Means a sample having a fluorescence intensity ratio of less than 1.2 (negative determination) 30 minutes after the enzyme was added.
  • CK19 RNA amplification detection system using the combination of oligonucleotides of the present invention specifically detects CK19 in cytokeratin.
  • Example 6 Measurement of CK19 RNA (Part 3) Using the oligonucleotide combination of the present invention, various concentrations of standard RNA were measured, and the relationship between detection time and initial standard RNA was confirmed.
  • RNA sample The standard RNA prepared in Example 1 was diluted to 10 2 copies / 5 ⁇ L, 10 3 copies / 5 ⁇ L, 10 4 copies / 5 ⁇ L, and 10 5 copies / 5 ⁇ L using the RNA diluent used in Example 3 (1). Use diluted one.
  • the detection time on the vertical axis, the initial standard RNA concentration amount was plotted (which was expressed copy numbers in log) on the horizontal axis, in all combinations discussed this, the low copy region of 10 2 copies
  • the detection time was dependent on the initial RNA amount, and the calibration curve could be approximated by a linear linear curve. That is, by measuring CK19 mRNA of the present invention for an unknown sample and applying the obtained detection time to the calibration curve shown in FIG. 1, it is shown that the amount of CK19 mRNA contained in the unknown sample can be estimated. It was done.
  • Example 7 Measurement of CK19 RNA (Part 4) Quantification of CK19 mRNA in cultured cell extracts derived from human lung adenocarcinoma was performed using the combination of oligonucleotides of the present invention.
  • PC-3 Human lung adenocarcinoma-derived cultured cells (PC-3) were obtained from Health Science Research Resources Bank (HSRRB) (HSRRB No. JCRB0077).
  • HSRRB Health Science Research Resources Bank
  • PC-3 cells were cultured according to the medium and culture conditions described in the HSRRB website (http://cellbank.nibio.go.jp/celldata/jcrb0077.htm).
  • RNA extraction sample is 50 ⁇ L.
  • RNA sample The RNA extraction sample described in (4) of this example was diluted 10-fold with the RNA diluent described in Example 3 (1), and 5 ⁇ L of the sample was used.
  • RNA sample The RNA extraction sample described in (4) of this example was diluted 10-fold with the RNA diluent described in Example 3 (1), and 5 ⁇ L of the sample was used.
  • Experimental result The time when the enzyme was added was 0 minute, and the fluorescence intensity ratio of the reaction solution (fluorescence intensity value at a predetermined time ⁇ background fluorescence intensity value) exceeded 1.2 was determined as positive.
  • Table 6 RNA extraction sample from PC-3 cells
  • 7 RNA extraction sample from a mixture of PC-3 cells and lymphocytes
  • Tables 6 and 7 The results of calculating the amount of CK19 RNA contained in each RNA sample based on the detection time and the calibration curve (FIG. 1 (b)) obtained in Example 6 are shown in Table 8 (RNA extraction sample from PC-3 cells).
  • And 9 RNA extraction sample from a mixture of PC-3 cells and lymphocytes).
  • RNA extraction sample from cultured PC-3 cells and the RNA extraction sample from the mixture of the cells and lymphocytes, both samples, the amount of CK19 mRNA in each RNA sample determined from the calibration curve is the culture used It was almost proportional to the number of PC-3 cells, and it was shown that the amplification detection method of CK19 RNA using the oligonucleotide of the present invention is concentration-dependent.
  • Example 8 Base Sequence Analysis of CK19 RNA Amplification Product Base sequence analysis of double-stranded DNA contained in the sample after the nucleic acid amplification reaction obtained in Example 7 was performed.
  • the corresponding base sequence was confirmed in all samples when CK19 mRNA was amplified by the combination of oligonucleotides used. That is, in the present invention, it is CK19 RNA that is amplified and detected, and other non-specific RNA is not amplified and detected. In the RNA extract shown in Example 7, miscellaneous RNA is mixed in addition to CK19 RNA. However, when the measurement method of the present invention amplifies and detects only CK19 RNA, the specificity is very high. I can say that.
  • RNA other than CK19 mRNA even in the presence of a large amount of contaminants (RNA other than CK19 mRNA), it is possible to measure even an extract from a very small amount of cultured cells (5 Cells) depending on the number of cultured cells used. It can be said that the measurement method has excellent sensitivity and accuracy.
  • the method for measuring CK19 mRNA of the present invention can measure CK19 mRNA contained in an unknown sample specifically, rapidly and with high sensitivity, and further quantifies by using a calibration curve. It was shown that it is also possible.
  • cytokeratin 19 (CK19) RNA is specific, rapidly and highly sensitive in a single step under relatively low temperature and constant temperature (40 to 60 ° C., preferably 43 ° C.) conditions. Amplification and amplification product can be detected directly.

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Abstract

　サイトケラチン１９　ｍＲＮＡ中の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、相補的な配列を有する第二のプライマー(第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５'末端にプロモーター配列が付加されている)からなるオリゴヌクレオチドの組み合わせを用い、逆転写酵素により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを生成し、該２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写産物を生成し、該ＲＮＡ転写産物が引き続き前記逆転写酵素によるＤＮＡ合成の鋳型となって前記２本鎖ＤＮＡを生成する工程からなるＲＮＡ増幅工程において、増幅されたＲＮＡ産物量を、増幅されたＲＮＡと相補的２本鎖を形成するとシグナル特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブで経時的に測定することによる、サイトケラチン１９のｍＲＮＡの増幅・検出方法。

Description

サイトケラチン１９　ｍＲＮＡの測定方法
　本発明は、核酸増幅法を利用したサイトケラチン１９　ｍＲＮＡの測定方法に関する。より正確には、本発明は一定温度（４０から６０℃。好ましくは４３℃）でのｍＲＮＡの増幅、検出に適したオリゴヌクレオチドを提供し、本発明によって試料中のサイトケラチン１９　ｍＲＮＡを簡便・迅速に測定することができる。また、本発明はサイトケラチン１９　ｍＲＮＡ測定のための試薬も提供し、分子生物学、生化学、医学分野などにおける研究・診療に有用である。
　サイトケラチンは細胞骨格を形成する中間径フィラメントタンパク質で、上皮組織に特徴的に存在する。現在までに２０種以上のサイトケラチンが同定され、また、そのタンパク質の電荷に基づき、酸性のタイプＩと、中性から塩基性のタイプＩＩに分類される。サイトケラチンは種類によって発現部位が異なっており、サイトケラチン８、１８、１９は主として上皮細胞に発現しており、サイトケラチン５、１４は基底細胞に、サイトケラチン２、６、１０、１１は基底上組織にそれぞれ局在していることが知られている。
　サイトケラチンが医療などの分野で広く認識されているのは、抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色が多用されていることが一因である。多くの場合、癌の診断は病理学的に行なわれ、癌が疑われる組織や細胞をヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）した標本を用いるのが一般的である。しかしながら、ＨＥ染色では癌細胞と正常細胞の区別がつきにくいことがあり、癌細胞の発見を見落とすことがある。そこで、抗サイトケラチン抗体を用いた免疫組織染色が多用されている。上皮組織以外の検体を抗サイトケラチン抗体を用いて免疫組織染色した結果、陽性反応が見られた場合、その組織に本来は上皮組織でしか発現していないはずのサイトケラチンが発現していることとなり、組織学的に異常、つまりは病理学的に癌である判断される。
　サイトケラチン１９（以降「ＣＫ１９」と表記）は、主として上皮組織に発現するだけでなく、他の正常組織においても少量発現していることが知られているが、種々の癌でその発現が亢進している事が明らかとなっている。前述の抗サイトケラチン抗体を用いた免疫染色においても、ＣＫ１９を抗原として認識する抗体を使用することが多い。ＣＫ１９のこのような発現特性は、腫瘍マーカーとしての条件を満たすものであり、実際に腫瘍マーカーとして広く使用されている。ＣＫ１９は、種々の癌で発現が亢進することから適用される癌種も多く、使用法も癌の早期診断、転移診断、治療効果のモニタリングなど多岐に亘っており、非常に有用な腫瘍マーカーといえる。
　前述のように病理診断による癌の診断は、ゴールドスタンダードとして広く汎用されているが、病理医の高い技術が必要とされ、使用する検体によっては癌細胞の見落としがあることが指摘されている。近年、こういった見落としの軽減、また各病院などで均一な診断が行えるように遺伝子検査（核酸増幅法）の使用が提案、あるいは一部実用化がなされている。核酸増幅法が高感度であることはすでに知られており、特定の遺伝子を増幅するため高い特異性を得ることができ、また、測定法によっては試料中の特定遺伝子の定量を行なうことも可能である。つまりは、特定遺伝子の発現量の大小に関する情報も提供することができる。
　一般に、核酸増幅法を利用した腫瘍マーカー遺伝子ｍＲＮＡの検出の際には、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が核酸増幅法として広く用いられており、ＣＫ１９　ｍＲＮＡに対する適用も報告されている（Ａｎｎｅ−Ｍａｒｉｅ，Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，７７，２１３−２２０（１９９７）．（非特許文献１）；Ｔａｏ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，９４，１１６４−１１６９（２００６）．（非特許文献２）；Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ，１６，６４３−６４８（２００６）．（非特許文献３）；Ｗｅｉｇｇｅｌｔ，Ｂ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，９０，１５３１−１５３７（２００４）．（非特許文献４）；Ｋａｍｉｙａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１４９，９９８−１００５（２００３）．（非特許文献５）；Ｍａｋｉｎｏ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，５０，１４０７−１４１０（２００３）．（非特許文献６）；Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，７９，１８１３−１８２０（１９９９）．（非特許文献７）；Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇａｓｔｒｉｃ　Ｃａｎｃｅｒ，９，３０８−３１４（２００６）．（非特許文献８）；特表２００３−５２７０９８号公報（特許文献２）；特表２００５−５２２２３１号公報（特許文献３）；特表２００８−５０２３３０号公報（特許文献４）参照）。当該増幅法は、例えば、腫瘍組織からＲＮＡを抽出後、
（ａ）抽出したＲＮＡから逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成する工程、および、
（ｂ）当該ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅し検出する工程、
と二段階の工程（場合によってはさらに検出工程を別個に実施する必要がある）が必要であるため、操作の煩雑性や二次汚染の危険性が示唆される。また、前記二段階の工程を実施するのに通常２時間以上が必要であり、複数の工程の実施による再現性不良、多数検体処理や検査コストの低減の点で問題があった。反応時間短縮のため、前記二段階の工程を同時に行なうＯｎｅＳＴＥＰ　ＲＴ−ＰＣＲ法も開発されているが、各工程を別個に行なうＲＴ−ＰＣＲ法に比べて検出感度の低下や非特異的な増幅産物が産生されやすいことなどが指摘されている。さらに、ＰＣＲ法による増幅は２本鎖ＤＮＡを増幅するため、混入する染色体ＤＮＡも増幅する可能性が懸念されるため、厳密にｍＲＮＡ発現を解析するためにはＤＮａｓｅなどによる消化を行ない染色体ＤＮＡを完全に除く必要があった。このため、操作の更なる煩雑化や再現性不良を招いていた。さらに、ＰＣＲ法は急激に反応温度を昇降させる必要があり、自動化の際の反応装置の省力化や低コスト化のための障壁となっていた。
　また、別の核酸増幅法である、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｌｏｏｐ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ＡＭＰｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を利用したＣＫ１９　ｍＲＮＡの増幅、検出も報告されている（Ｔｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４８０７−４８１６（２００７）．（非特許文献９）；Ｍｉｋｅ，Ｖ．ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ，１２２，２５６２−２５６７（２００８）．（非特許文献１０）；特開２００４−８９１８０号公報（特許文献５）参照）。これは、２種類のインナープライマー、２種類のアウタープライマー、逆転写酵素、鎖置換型ＤＮＡ合成酵素、基質等を混合し、一定温度（６５℃前後）で保温することにより、目的とする核酸を増幅する方法である。しかしながら、前記増幅法は、プライマー設計数が多く、かつ個々のプライマー設計において多くの制約があるため設計が非常に複雑である。例えば、標的遺伝子に対して、３’末端、５’末端においてそれぞれ３つの領域を選定（この際、各領域間の距離などが重要とされている）した上で、各領域の相同的あるいは相補的な配列を組み合わせて長さの異なるプライマーを設計する必要がある。当然ながら、この際各プライマーのＴｍ値やＧＣ含量などが反応性に関連することから、プライマーを設計できる領域はかなり限定される。さらには、反応速度を増加させるためにＬｏｏｐ　Ｐｒｉｍｅｒの使用が可能（Ｌｏｏｐ　Ｐｒｉｍｅｒの使用で検出時間は３０分程度に短縮される）であるが、さらに２つのプライマーを設計する必要がある。このように多数のプライマーを設計するには困難が伴うだけでなく、製造コストの面で不利となる。さらにはＬＡＭＰ法では、増幅産物を直接的に検出するのではなく、反応溶液の濁度を検出することで、相対的に増幅産物の量を推定している。濁度を検出する方法は、直接的に増幅核酸を検出しているわけではないため、非特異的な増幅産物が産生される場合は定量的な検出が行なえないばかりでなく、測定結果から非特異的な増幅産物が産生されたのかどうかが分からない。また、多数のプライマーが反応に関与するＬＡＭＰ法では非特異的な増幅産物の産生を完全に抑制することは困難である。したがって、ＰＣＲ法において一部報告がなされているマルチプレックスＰＣＲのような、複数の腫瘍マーカーを同時に増幅検出するのは不向きといえる。濁度検出法ではどの腫瘍マーカーを増幅検出したのか判断できないからである。また、ＬＡＭＰ法もＲＴ−ＰＣＲ法と同様、２本鎖ＤＮＡを鋳型として増幅を行なうため、染色体ＤＮＡを増幅する可能性がある。他にも、ＬＡＭＰ法による増幅時の温度は６５℃の一定であるが、一般的には反応前後で高温処理を必要とし、これは反応装置の省力化・低コスト化の障害となっている。
　一方、一定温度でＲＮＡのみを増幅する方法として、ＮＡＳＢＡ法（特許第２６５０１５９号公報（特許文献６）；特許第３１５２９２７号公報（特許文献７）参照）、およびＴＭＡ法（特許第３２４１７１７号公報（特許文献８）参照）などが報告されている。前記ＲＮＡ増幅方法は、標的となるＲＮＡに対してプロモーター配列を含むプライマー、逆転写酵素及び必要に応じてリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ　Ｈ）により、プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、この２本鎖ＤＮＡを鋳型としＲＮＡポリメラーゼによって標的ＲＮＡ由来の特定塩基配列を含むＲＮＡを生成し、このＲＮＡが引き続きプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型となる連鎖反応を行なうものである。そして、ＲＮＡ増幅後、電気泳動または検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いたハイブリダイゼーション法などにより増幅されたＲＮＡを検出する。
　前記ＲＮＡ増幅法は一定温度、一段階でＲＮＡのみを増幅することから簡便なＲＮＡ測定に適しているが、ハイブリダイゼーション法などによる検出は煩雑な操作を必要とするため、多数検体処理や自動化に不適であるばかりでなく、結果として再現性不良や増幅核酸の二次汚染を招きやすいという課題がある。また、結果が出るまでに通常、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法ともに９０分以上必要であり、迅速な結果を得るに至っていない。さらに、増幅工程は一定温度であるものの、通例は増幅工程前に予備加温（例えば、６５℃）の必要があり、反応装置の省力化や低コスト化のための課題となっていた。
　簡便にＲＮＡを増幅・測定する方法としては、Ｉｓｈｉｇｕｒｏらの方法（特開２０００−０１４４００号公報（特許文献９）；Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，１２４７−１２５２（２００３）．（非特許文献１１）参照）があげられる。前記方法は、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的に２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変更するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブ存在下、ＲＮＡ増幅方法を実施し、蛍光特性の変化を測定するもので、一定温度、一段階かつ密閉容器内でＲＮＡ増幅および測定を、同時かつ迅速、簡便に実施することが可能である。この方法では、増幅された核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用するため、増幅された核酸を直接的に検出でき、また、複数のインターカレーター性蛍光色素を使用することで、複数の核酸を増幅後、個々の増幅産物を検出することができる。より具体的な態様としては、任意のＲＮＡに存在し、該ＲＮＡを他のＲＮＡから区別し得る特定塩基配列に対して、
（１）当該特定塩基配列の３’末端側に相補的なＤＮＡプライマーとＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を用い、ＲＮＡを鋳型として特定配列と相補的なＤＮＡを生成し、
（２）（１）の逆転写反応によって生じるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖に対して、リボヌクレアーゼＨ活性を有する酵素を作用させてＲＮＡを分解して、１本鎖ＤＮＡを生成させ、
（３）（２）で生成した１本鎖ＤＮＡの３’末端に相補的で、かつ、それ自身がその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するＤＮＡプライマーと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用い、前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、
（４）（３）で生成した２本鎖ＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを作用させて転写産物（特定塩基配列のＲＮＡ）を生成させる方法である。
そして、（４）で生成したＲＮＡ転写産物は特定塩基配列に由来するＲＮＡであるため、前記（１）の反応における鋳型となり、前記（１）の反応で用いるＤＮＡプライマーと結合し、（１）から（４）の反応が進行することでＲＮＡ増幅の連鎖反応が起きる。
　当該核酸増幅法の特徴は、ＰＣＲ法のように反応液の温度を昇降させる必要がなく、またＲＮＡの逆転写と、その後のＤＮＡ増幅反応を分けて実施することがない、という点にある。さらに、増幅されたＲＮＡ転写産物に対して特異的に結合可能な、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを反応液に共存させ、特定塩基配列または当該塩基配列に相補的な配列の増幅と同時に、当該増幅の様子を直接的に検出（モニタリング）することができる。したがって、通常のＲＮＡ増幅法のように、別個にハイブリダイゼーション検出などを行なう必要がないため、結果を得るまでの時間を大幅に短縮可能である。
　しかしながら、当該核酸増幅法に適したＣＫ１９　ｍＲＮＡ増幅用プライマー配列およびその組み合わせ、さらには検出用のオリゴヌクレオチドプローブ配列については知られていない。これは、反応の開始時に一度反応温度よりも高温にし、標的となるＲＮＡの高次構造を変性させる工程を必要とするＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法などの核酸増幅法と異なり、当該核酸増幅法が、増幅反応を通じて、比較的低温の一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下で標的とするｍＲＮＡの増幅検出を行なうことに由来する。つまり、一般にｍＲＮＡのような１本鎖ＲＮＡは高次構造を形成しやすいことが知られており、当該核酸増幅法のような反応条件下では、標的となるｍＲＮＡが高次構造を形成し、プライマーおよびプローブの結合を阻害すると考えられるため、最適なプライマーおよびプローブは高次構造フリー領域に設計する必要がある。ＲＮＡ高次構造の指標として、塩基配列から二次構造を二次構造解析ソフトウェアにより計算・推定することは可能だが、計算上の二次構造から実際の高次構造を推定することは極めて困難である。
　また、当該核酸増幅法のように比較的低温で核酸増幅を実施する場合、高温で実施されるＰＣＲ法に比較してプライマーダイマーといった非特異産物が生産しやすく、非特異産物生成を低減させるためにはプライマーの組み合わせも厳密に選定する必要がある。しかしながら、一般に用いられるプライマーの設計法は、高温で変性する工程を含むこと（例えばＰＣＲ法）を前提としているため、既存のプライマー設計技術では、当該核酸増幅法に適したプライマーを設計することは困難である。よって、前記一定温度ＲＮＡ増幅・測定法による迅速、簡便、高感度なＣＫ１９　ｍＲＮＡ測定を実現するためには、一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下においても結合効率が低下せず、かつＣＫ１９　ｍＲＮＡの増幅、検出が可能なオリゴヌクレオチドおよびその組み合わせが必要であった。
　本発明の目的は、ヒト細胞や組織などから得られた試料に対し、サイトケラチン１９　ｍＲＮＡを一定温度、一段階操作で、迅速に測定する方法を提供することにある。
　本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、サイトケラチン１９（以降ＣＫ１９と表記）ｍＲＮＡを特異的かつ迅速に測定する方法を構築するに至った。
　第一の発明は、試料中のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法において、
前記測定方法が、ＣＫ１９　ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである：
（１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
（２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ　Ｈ）活性を有する酵素による、前記（１）の反応で得られるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
（３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記特定塩基配列、または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
（４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
（６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
かつ、前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法である：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号５で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号３で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号７で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド。
　第二の発明は、第一の発明に記載のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法において、前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法である：
（ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１９から２２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２９から３２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２３あるいは２４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２５あるいは２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号２７あるいは２８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド。
　第三の発明は、第一あるいは第二の発明に記載のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法において、前記（６）の工程（ＲＮＡ転写産物量を測定する工程）が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする、測定方法である。
　第四の発明は、前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする、第三の発明に記載の測定方法である。
　第五の発明は、前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４６に示されるいずれかの塩基配列中、あるいは当該相補配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、第四の発明に記載の測定方法である。
　第六の発明は、第一から第五の発明に記載のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法において、前記（１）の工程（ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によって特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程）の前に、ＣＫ１９　ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、
（ｉ）前記特定塩基配列中の、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複した領域、および当該部位から５’側に隣接する領域に対し相補的な配列を有する、切断用オリゴヌクレオチド、
および、
（ｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ　Ｈ）活性を有する酵素、
を用いて、前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を行なうことを特徴とする、測定方法である。
　第七の発明は、前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９から１８で示されたいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、第六の発明に記載の測定方法である。
　第八の発明は、ＣＫ１９　ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１から８、または配列番号３９から４６に示されたいずれかの塩基配列中または当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチドである。
　第九の発明は、第八の発明に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、ＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定試薬である。
　図１は、ＣＫ１９　ＲＮＡの検量線を示す。（ａ）表１のオリゴヌクレオチド組み合わせ［８］；（ｂ）組み合わせ［１０］；（ｃ）組み合わせ［３０］。縦軸は蛍光強度比が１．２を超えた時間（検出時間、分）であり、横軸は測定に用いた初期の標準ＲＮＡ量（コピー数）をｌｏｇで表したものである。また、各点から求めた線形一次曲線の式およびＲ２の値を記載してある。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明中の試料とは、ＲＮＡを含む核酸試料を意味する。本発明は、ヒト細胞、ヒト組織、体液、血液、尿、便、リンパ液、乳管液、あるいは腹腔や胸腔の洗浄液等を材料として、例えば特開平７−５９５７２号などに記載された方法に基づいて調製した試料を使用し、当該試料を直接的に測定することで、当該試料の由来元であるヒト細胞や組織などに含まれるＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定を行なうものである。
　本発明中の特定塩基配列とは、ＣＫ１９　ｍＲＮＡのうち、第一のプライマーとの相同領域の５’末端から第二のプライマーとの相補領域の３’末端までの塩基配列に相同なＲＮＡまたはＤＮＡの塩基配列を示す。すなわち、ＣＫ１９　ｍＲＮＡ上で、第一のプライマーは特定塩基配列の５’末端から３’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相同的であり、第二のプライマーは特定塩基配列の３’末端から５’方向に少なくとも連続する１５塩基以上と相補的である。よって、本発明では前記特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物が増幅されることになる。本発明中の第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位とは、特定塩基配列内で該相同領域の５’末端を含む部分配列からなり、当該部位は切断用オリゴヌクレオチドとの相補領域と第一のプライマーとの相同領域が重複する部位である。
　本発明中のプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始する部位である。種々のＲＮＡポリメラーゼに特異的なプロモーター配列が知られており、本発明の使用において特にプロモーターを限定するものではないが、分子生物学的実験などで通常用いられている、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーターが好ましい。また前記配列に転写効率に関わる付加配列を含んでいてもよい。
　本発明中の相補的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。高ストリンジェントな条件の一例として、本発明の実施例に記載の核酸増幅反応液組成をあげることができる。また、本発明中の相同的な配列とは、高ストリンジェントな条件において対象となる塩基配列の完全相補配列に対してハイブリダイゼーション可能な配列をいう。したがって、本発明でいう相補的あるいは相同的な配列は、高ストリンジェントな条件においてハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲内であれば長さなどを任意に設定することが可能であることはいうまでもない。さらに、ハイブリダイゼーションの特異性および効率に影響を与えない範囲で、１から数塩基の置換・欠失・挿入がなされた塩基配列を用いてもよい。
　本発明中のヌクレオチドもしくは核酸とは、天然に存在する塩基、糖および糖間結合からなるヌクレオチドまたはヌクレオシド（ＲＮＡおよびＤＮＡの双方を含む）のことをいい、そのオリゴマー（オリゴヌクレオチド、例えば、２から１００塩基程度）およびポリマー（ポリヌクレオチド、例えば、１００塩基以上）を含む総称である。本発明中のヌクレオチドあるいは核酸は、同様に機能する天然に存在しないモノマー、蛍光分子、および放射性同位体で標識されたモノマー、あるいはこれらを含むオリゴマーまたはポリマーなども含む。
　本発明中のプライマーとは、核酸増幅反応において、鋳型とハイブリダイズし、核酸増幅反応を開始するのに必要なヌクレオチドのことをいい、核酸増幅反応において増幅を所望する鋳型を基に、その鋳型とハイブリダイズし、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法、３ＳＲ法、ＴＲＣ法（特許文献９および非特許文献１１参照）といった核酸増幅反応により、鎖長あるいは配列において特異的な生成物が得られるように、好ましくはプライマー自身がその鋳型に特異的な配列を含むよう設計される。
　プライマーの長さは、通常１５から１００塩基、好ましくは１５から３５塩基の鎖長を有するように設計されるが、当該鎖長に限られるものではない。よって、本発明の第一および第二のプライマーは、本願発明に記載する塩基配列の範囲内で、少なくとも連続する１５塩基以上の任意の配列の中から選定することができる。すなわち、本発明におけるＣＫ１９　ｍＲＮＡ検出のための第一および第二のプライマーは、
（ｉ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号１に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号５に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号２に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号３に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号７に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
または、
（ｉｖ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相同的な配列番号４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部と相補的な配列番号８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
である。
　本発明におけるＣＫ１９　ｍＲＮＡ検出のための第一および第二のプライマーのより好ましい態様は、
（ｉ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号１９から２２に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号２９から３２に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号２３あるいは２４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３３あるいは３４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号２５あるいは２６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３５あるいは３６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
または、
（ｉｖ）第一のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相同的な配列番号２７あるいは２８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３７あるいは３８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
である。
　本発明におけるＣＫ１９　ｍＲＮＡ検出のための第一および第二のプライマーの好ましい一態様として、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１９から２２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号２９から３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２３あるいは２４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）第一のプライマーが配列番号２５あるいは２６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）第一のプライマーが配列番号２７あるいは２８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
があげられる。
　さらに本発明の一態様として、ＣＫ１９　ｍＲＮＡはｃＤＮＡ合成の鋳型となる前に該ＲＮＡ内の特定核酸配列の前記５’末端部位で切断される。特定核酸配列の５’末端部位で切断されることで、ｃＤＮＡ合成後に、ｃＤＮＡにハイブリダイズした第一のプライマーのプロモーター配列に相補的なＤＮＡ鎖を、前記ｃＤＮＡの３’末端を伸長することにより効率的に合成することができ、結果として機能的な２本鎖ＤＮＡプロモーター構造を形成する。このような切断方法として、ＣＫ１９　ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の５’末端部位（該特定塩基配列内の５’末端部位を含む部分配列）に重複し、かつ５’方向に隣接する領域に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、切断用オリゴヌクレオチドとする）を添加することによって形成されたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡ部分をリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ　Ｈ）活性を有する酵素などにより切断する方法があげられる。該切断用オリゴヌクレオチドの３’末端にある水酸基は伸長反応を防止するために適当な修飾を施されたもの、例えばアミノ化等されているものを使用することが好ましい。
　本発明の好ましい一態様では、切断用オリゴヌクレオチドとして、ＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号９から１８に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチドがあげられる。
　本発明中の標的ＲＮＡとは、ＲＮＡ転写産物上の特定塩基配列のうち、前記プライマーとの相同あるいは相補領域以外の配列を示し、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとの相補的結合が可能である配列を有する。よって、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、本発明中の特定塩基配列の一部と相補的、または相同的な配列となる。本発明の一態様として、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブとして、ＣＫ１９　ｍＲＮＡの一部に相補的な配列番号３９から４６に記載の配列に対して相同的、または相補的な配列の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブがあげられる。
　本発明におけるＣＫ１９　ｍＲＮＡ検出のためのオリゴヌクレオチドの組み合わせの一態様として、
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９から１２に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号１に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号９から１２に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号５に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４１に記載のいずれかの配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１３あるいは１４に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号２に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１３あるいは１４に記載の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４２あるいは４３に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
（ｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１５あるいは１６に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号３に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１５あるいは１６の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号７に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４４あるいは４５に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
（ｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７あるいは１８に記載の配列に対して相同的な配列からなるオリゴヌクレオチド、第一のプライマーが配列番号４に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有し、かつ特定核酸配列中の当該プライマーとの相同領域の５’末端部位は配列番号１７あるいは１８の配列の相補領域と重複する）、第二のプライマーが配列番号８に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基のオリゴヌクレオチド、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４６に記載の配列に対して相同的な配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むプローブ、
があげられる。なお、（ｉ）において、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの相補配列と、第一のプライマーの相同配列および第二のプライマーの相補配列とは重複しないように設計する必要がある。
　本発明におけるＣＫ１９　ｍＲＮＡ検出のためのオリゴヌクレオチドの組み合わせのより好ましい態様として、
（ｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９あるいは４０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号１９に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９あるいは４０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｖｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０あるいは４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号２９あるいは３０に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｖｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３１あるいは３２に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４０あるいは４１に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｉｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２３に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４２あるいは４３に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２４に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４２あるいは４３に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２５に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４４あるいは４５に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４４あるいは４５に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｉｉ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２７に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
（ｘｉｖ）切断用オリゴヌクレオチドが配列番号１８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドであり、第一のプライマーが配列番号２８に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド（なお、第一のプライマーはその５’末端にプロモーター配列を有する）であり、第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８に記載の配列より選ばれる一種のオリゴヌクレオチドであり、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号４６に記載の配列からなるオリゴヌクレオチド、
があげられる。
　本発明のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法では、各酵素（１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素（逆転写酵素）、ＲＮａｓｅ　Ｈ活性を有する酵素、１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、およびＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素）が必要となる。各酵素は、いくつかの活性を合わせ持つ酵素を使用してもよいし、それぞれの活性を持つ複数の酵素を使用してもよい。また、１本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮａｓｅ　Ｈ活性、および１本鎖ＤＮＡを鋳型とするＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性の三つの活性を有する逆転写酵素に、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を添加するのみだけでなく、必要に応じてＲＮａｓｅ　Ｈ活性を有する酵素をさらに添加してもよい。前記逆転写酵素は、分子生物学的実験などで汎用されているＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、あるいはこれらの誘導体が好ましく、ＡＭＶ逆転写酵素とその誘導体が最も好ましい。また、前記ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、分子生物学的実験などで汎用されているバクテリオファージ由来のＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３　ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼ、およびこれらの誘導体を例示できる。
　本発明の一態様では、試料中のＣＫ１９　ｍＲＮＡに前記切断用オリゴヌクレオチドを添加し、前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ　Ｈ活性により前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する。切断された前記ＲＮＡを鋳型として前記第一および第二のプライマーの存在下で前記逆転写酵素による逆転写反応を実施すると、第二のプライマーがＣＫ１９　ｍＲＮＡ内の特定塩基配列に結合し、前記逆転写酵素のＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性によりｃＤＮＡ合成が行なわれる。得られたＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖は前記逆転写酵素のＲＮａｓｅ　Ｈ活性によってＲＮＡ部分が分解され、解離することによって第一のプライマーが前記ｃＤＮＡに結合する。引き続いて、前記逆転写酵素のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性により特定塩基配列由来で、かつ５’末端にプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡが生成される。該２本鎖ＤＮＡは、プロモーター配列下流に特定塩基配列を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼにより特定塩基配列に由来するＲＮＡ転写産物を生産する。該ＲＮＡ転写産物は、前記第一および第二のプライマーによる前記２本鎖ＤＮＡ合成のための鋳型となって、一連の反応が連鎖的に進行し、前記ＲＮＡ転写産物が増幅されていく。
　このような連鎖反応を進行させるために、前記各酵素に必須な既知の要素として、少なくとも、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸を含むことはいうまでもない。また、反応効率を調節するための添加剤として、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、糖などを添加してもよい。
　たとえば、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを用いる場合は３５から６５℃の範囲で反応温度を設定することが好ましく、４０から６０℃の範囲で設定することがより好ましく、さらに好ましい態様は反応温度が４３℃である。前記ＲＮＡ増幅工程は一定温度で進行し、逆転写酵素およびＲＮＡポリメラーゼが活性を示す任意の温度に反応温度を設定することが可能である。
　増幅されたＲＮＡ転写産物量は、既知の核酸測定法により測定することが可能である。前記測定法としては、電気泳動や液体クロマトグラフィーを用いた方法、検出可能な標識で標識された核酸プローブによるハイブリダイゼーション法などがあげられる。しかし、これらは操作が多工程であり、また増幅産物を系外に取り出して分析するため二次汚染の原因となる増幅産物の環境への飛散の危険性が大きい。これらの課題を克服するためには標的核酸と相補結合することによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブを用いるのが好ましい。該オリゴヌクレオチドプローブとしてモレキュラービーコンといったＦＲＥＴを利用した既知のプローブを使用することができるが、プローブ設計やプローブ合成の容易性から、より好ましい方法として、インターカレーター性蛍光色素で標識され、かつ標的核酸と相補的２本鎖を形成するとインターカレーター性蛍光色素部分が前記相補的２本鎖部分にインターカレートすることによって蛍光特性が変化するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブの存在下、前記核酸増幅工程を実施し、蛍光特性の変化を測定する方法があげられる（特許文献９および非特許文献１１参照）。
　前記インターカレーター性蛍光色素としては特に限定されないが汎用されているオキサゾールイエロー、チアゾールオレンジ、エチジウムブロマイド、およびこれらの誘導体などが利用できる。前記蛍光特性の変化としては蛍光強度の変化があげられる。たとえばオキサゾールイエローの場合、２本鎖ＤＮＡにインターカレートすることによって５１０ｎｍの蛍光（励起波長４９０ｎｍ）が顕著に増加することが知られている。前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブは、前記ＲＮＡ転写産物上の標的ＲＮＡに対して相補的なオリゴヌクレオチドで、末端あるいはリン酸ジエステル部あるいは塩基部分に適当なリンカーを介してインターカレーター性蛍光色素が結合され、さらに、３’末端の水酸基からの伸長を防止する目的で該３’末端の水酸基が適当な修飾をなされている構造を有する（特許文献９および非特許文献１１参照）。
　オリゴヌクレオチドへのインターカレーター性蛍光色素の標識は、既知の方法でオリゴヌクレオチドに官能基を導入し、インターカレーター性蛍光色素を結合させることが可能である（特許文献９および非特許文献１１参照）。また、前記官能基の導入方法としては、市販されているＬａｂｅｌ−ＯＮ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）などを用いても可能である。
　本発明の一態様として、試料に少なくとも、５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４７）を有する第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ、切断用オリゴヌクレオチド、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、緩衝剤、マグネシウム塩、カリウム塩、ヌクレオシド−三リン酸、リボヌクレオシド−三リン酸、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む増幅試薬を添加し、反応温度４０から６０℃（好ましくは４３℃）の一定温度で反応させると同時に反応液の蛍光強度を経時的に測定する方法を提供する。
　前記態様においては、蛍光強度を経時的に測定することから有意な蛍光増加が認められた任意の時間で測定を終了することが可能であり、核酸増幅および測定をあわせて通例３０分以内で終了することが可能である。
　本発明の一態様として、前記試料中のＣＫ１９　ｍＲＮＡを測定し、得られた蛍光強度比の情報と、既知の濃度のＣＫ１９　ＲＮＡを測定した際の蛍光強度比の情報を比較することで、試料中に存在した特定塩基配列の量（対象となったＲＮＡコピー数）を算出することが可能である。特定塩基配列の検出は、例えば一定時間上記反応を行なった反応液に対して、特定塩基配列に対して相補的に結合し得る固定化および標識化プローブを用いるサンドイッチアッセイ法を適用することもできるが、前述したように、特定塩基配列に特異的に結合する、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブを使用する方法が好ましい。また、このプローブは前記ＲＮＡ増幅反応を阻害しないため、その存在下で前記特定塩基配列の増幅を実施して、特定塩基配列の増幅の様子をモニタリングする方法が特に好ましい。なお、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で特定塩基配列の増幅を行なう場合には、そのプローブ部分が伸長反応のプライマーとして機能しないように、例えばその３’末端にグリコール酸やビオチンを付加するなどするのが好ましい。そして増幅反応中にこのインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが特定塩基配列と結合して発する蛍光信号を蛍光検出器によって測定し、そのプロファイルから得られる情報（例えば蛍光色素が発する蛍光の強度が一定の強度に達するまでに要した反応時間等）を既知量の標準ＲＮＡに関するプロファイルから得られる情報と比較することにより、特定塩基配列の存在の有無の確認、または増幅された特定塩基配列の量（ＲＮＡコピー数）から試料中に存在した特定核酸配列の量（対象となったＲＮＡコピー数）を推定することができる。
　また、前記測定試薬に含まれる全ての試料を単一の容器に封入可能な点は特筆すべきである。即ち、一定量の試料をかかる単一容器に分注するという操作さえ実施すれば、その後は自動的にＣＫ１９　ｍＲＮＡを測定することができる。この容器は、例えば蛍光色素が発する信号を外部から測定可能なように、少なくともその一部分が透明な材料で構成されてさえいればよく、試料を分注した後に密閉することが可能なものはコンタミネーションを防止する上で特に好ましい。
　前記態様のＲＮＡ増幅・測定方法は、一段階、一定温度で実施可能であるため、ＲＴ−ＰＣＲに比べて簡便で自動化に適した方法であるといえる。本発明によりＣＫ１９　ｍＲＮＡの高特異性、高感度、迅速、簡便、一定温度かつ一段階の直接的増幅・検出が可能となった。
　本発明では、試料中の標的ＲＮＡ（ＣＫ１９遺伝子のｍＲＮＡ）をもとにして、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター領域を５’末端を有する２本鎖ＤＮＡが合成され、前記ＤＮＡを鋳型に多量の１本鎖ＲＮＡが生成され、さらに生成された１本鎖ＲＮＡ量は飛躍的に増大し、インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブが、生成した１本鎖ＲＮＡと相補結合することにより蛍光増加を測定する工程において、蛍光強度が増加する過程を解析することにより、簡便、かつ迅速に初期ＲＮＡ量を決定することが可能である。本発明のＣＫ１９　ｍＲＮＡ測定方法は、核酸増幅および測定の時間が３０分以内であり、これは既存のＲＴ−ＰＣＲ法（通常２時間以上）、ＮＡＳＢＡ法（９０分以上）、ＴＭＡ法（９０分以上）、ＲＴ−ＬＡＭＰ法（通常３０から６０分程度）による測定よりも同等以上の迅速性を有する。
　さらに、１段階操作でＣＫ１９遺伝子のｍＲＮＡを増幅・検出するためのオリゴヌクレオチドを提供すること、すなわちＣＫ１９　ｍＲＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチド、およびＣＫ１９　ｍＲＮＡを検出するためのオリゴヌクレオチドを提供することで、それを利用した簡便、迅速かつ高感度なＣＫ１９　ｍＲＮＡ発現細胞の測定方法、ならびに定量試薬を生化学・分子生物学・医療分野などに提供することができる。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、これらは一例であり、本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
　実施例１　標準ＲＮＡの調製
　後述の実施例で使用したＣＫ１９　ＲＮＡ（以降、標準ＲＮＡと表記）は（１）から（２）に示す方法で行なった。
（１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＫ１９の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿００２２７６、１４９０塩基）のうち、１６０から１３５３番目の塩基（１１９４塩基）の２本鎖ＤＮＡをクローニングした。
（２）（１）で調製した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写を実施した。引き続きＤＮａｓｅ　Ｉ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。当該ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
　実施例２　インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブの調製
　インターカレーター性蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを作製した。配列番号３９に記載の配列の５’末端から９番目のＴ、配列番号４０に記載の配列の５’末端から１２番目のＴ、配列番号４１に記載の配列の５’末端から１３番目のＡ、配列番号４２に記載の配列の５’末端から１３番目のＣ、配列番号４３に記載の配列の５’末端から７番目のＴ、配列番号４４に記載の配列の５’末端から１１番目のＧ、配列番号４５に記載の配列の５’末端から１０番目のＣ、配列番号４６に記載の配列の５’末端から９番目のＧの位置にＬａｂｅｌ−ＯＮ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いてアミノ基を導入し、さらに３’末端をビオチンで修飾した。前記アミノ基にインターカレーター性蛍光色素であるオキサゾールイエローを標識し、オキサゾールイエロー標識オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号３９から４６）を調製した（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２４，４９９２−４９９７（１９９６）．（非特許文献１２）参照）。
　実施例３　ＣＫ１９　ＲＮＡの測定（その１）
　表１に示す組み合わせのうち［１］から［２８］に示す、切断用オリゴヌクレオチド、第一のプライマー、第二のプライマー、インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ（以降ＩＮＡＦプローブと表記）を用いて、（１）から（４）に示す方法で、標準ＲＮＡの測定を行なった。なお表１のうち、配列番号１９から２２は配列番号１の部分配列、配列番号２３および２４は配列番号２の部分配列、配列番号２５および２６は配列番号３の部分配列、配列番号２７および２８は配列番号４の部分配列、配列番号２９から３２は配列番号５の部分配列、配列番号３３および３４は配列番号６の部分配列、配列番号３５および３６は配列番号７の部分配列、配列番号３７および３８は配列番号８の部分配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 （１）実施例１で調製した標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ　リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ　ＤＴＴ）を用い、１０３コピー／５μＬになるように希釈し、これをＲＮＡ試料として使用した。
（２）以下の組成の反応液２０．０μＬを０．５ｍＬ容ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ＰＣＲ　ｔｕｂｅ　ｗｉｔｈ　ｄｏｍｅ　ｃａｐ、ＳＳＩ製）に分注し、これに前記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
　反応液の組成（濃度は酵素溶液添加後（３０μＬ中）の最終濃度）
　　６０．０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）
　　１８．０ｍＭ　塩化マグネシウム
　　１００ｍＭ　塩化カリウム
　　１．０ｍＭ　ＤＴＴ
　　各０．２５ｍＭ　ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ
　　各３．０ｍＭ　ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ
　　３．６ｍＭ　ＩＴＰ
　　１．０μＭ　第一のプライマー（当該プライマーには、各配列番号記載の塩基配列の５’末端にＴ７プロモーター配列（配列番号４７）が付加されている。）
　　１．０μＭ　第二のプライマー
　　０．１６μＭ　切断用オリゴヌクレオチド（当該オリゴヌクレオチドの３’末端の水酸基はアミノ化されている。）
　　２０．０ｎＭ　ＩＮＡＦプローブ
　　６．０Ｕ　リボヌクレアーゼ　インヒビター（タカラバイオ社製）
　　１３．０％　ＤＭＳＯ
　　容量調整用蒸留水
（３）上記の反応液を、４３℃で５分間保温後、以下の組成で、予め４３℃で２分間保温した酵素液５．０μＬを添加した。
　酵素液の組成（反応時（３０μＬ中）の最終濃度）
　　２．０％　ソルビトール
　　６．４Ｕ　ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス社製）
　　１４２Ｕ　Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン社製）
　　３．６μｇ　牛血清アルブミン（タカラバイオ社製）
　　容量調整用蒸留水
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４３℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍ）を経時的に３０分間測定した。
　酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、その時の時間を検出時間とした結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表１の組み合わせのうち、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号５の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［１］から［８］）、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号６の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［９］から［１６］）、
（ｉｉｉ）第一のプライマーが配列番号３の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号７の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［１７］から［２４］）、
および、
（ｉｖ）第一のプライマーが配列番号４の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号８の部分配列からなる組み合わせ（組み合わせ［２５］から［２８］）、
いずれも１０３コピー／５μＬの標準ＲＮＡを２０分以内に検出した。なお、コントロール試験区（標準ＲＮＡの代わりにＲＮＡ希釈液を反応液に添加して測定）では、反応開始から３０分後においても蛍光強度比１．２を超えることはなかった。
当該結果より、
（ｉ）第一のプライマーが配列番号１に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号５に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
（ｉｉ）第一のプライマーが配列番号２に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号６に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
（ｉｉｉ）第一のプライマーが配列番号３に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号７に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
または、
（ｉｖ）第一のプライマーが配列番号４に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、第二のプライマーが配列番号８に示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである組み合わせ、
のいずれかを用いてＲＮＡ増幅反応を行なうことにより、従来技術で最も汎用されるＲＴ−ＰＣＲ法によるＣＫ１９　ｍＲＮＡの検出方法（通常２時間以上）と比較してＣＫ１９　ＲＮＡを迅速に検出することが示された。
　実施例４　ＣＫ１９　ＲＮＡの測定（その２）
　本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、実施例３よりも低濃度の標準ＲＮＡを測定した。
　（１）実験方法
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で実施した。
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
　　表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［５］から［８］、［１０］、［１２］、［１４］、［１６］、［２０］から［２２］、［２４］、［２７］から［３０］を使用。
　ＲＮＡ試料：
　　実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、５０コピー／５μＬ、１０２コピー／５μＬ、および１０３コピー／５μＬに希釈したものを使用。
　（２）実験結果
　酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、５０コピー／５μＬの標準ＲＮＡを２０分以内に検出した。以上より、本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いてＣＫ１９　ＲＮＡを増幅させることで、５０コピー／５μＬといった低濃度のＣＫ１９　ＲＮＡであっても迅速に検出できることが示された。
　実施例５　特異性評価
　本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＣＫ１９　ＲＮＡの増幅検出系における、他のサイトケラチンＲＮＡに対する交差反応性について検討した。
　（１）サイトケラチン１８（以降「ＣＫ１８」と表記）ＲＮＡ、およびサイトケラチン２０（以降「ＣＫ２０」と表記）ＲＮＡの調製
（１−１）ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＫ１８の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０００２２４、１４８５塩基）のうち１１０から１４３４番目の塩基（１３２５塩基）、およびＧｅｎＢａｎｋに登録されているＣＫ２０の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１９０１０、１８１７塩基）のうち、４０から１７１０番目の塩基（１６７１塩基）の２本鎖ＤＮＡをクローニングした。
（１−２）（１−１）で調製した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、インビトロ転写を実施した。引き続きＤＮａｓｅ　Ｉ処理によりその２本鎖ＤＮＡを完全消化した後、ＲＮＡを精製して調製した。当該ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量した。
（１−３）（１−２）で調製した標準ＲＮＡをＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ　リボヌクレアーゼインヒビター、５．０ｍＭ　ＤＴＴ）を用い、１０１０コピー／５μＬになるように希釈した。
　（２）実験方法
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ、およびＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で実施した。
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
　　表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［８］、［１０］、［２１］、［２８］を使用。
　　なお、組み合わせ［８］は、第一のプライマーが配列番号１の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号５の部分配列からなる組み合わせ、
　　組み合わせ［１０］は、第一のプライマーが配列番号２の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号６の部分配列からなる組み合わせ、
　　組み合わせ［２１］は、第一のプライマーが配列番号３の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号７の部分配列からなる組み合わせ、
　　組み合わせ［２８］は、第一のプライマーが配列番号４の部分配列からなり、第二のプライマーが配列番号８の部分配列からなる組み合わせ、
　　にそれぞれ相当。
　ＲＮＡ試料：
　　ＲＮＡ試料のうち、ＣＫ１９は実施例３で使用した試料、ＣＫ１８およびＣＫ２０は本実施例の（１）で調製した試料を使用。
　（３）実験結果
　酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグラウンドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表４に示す。なお、表４においてＮ．Ｄ．とは酵素を添加して３０分後の蛍光強度比が１．２未満（陰性判定）であった試料を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　今回検討したオリゴヌクレオチドの組み合わせはいずれも、ＣＫ１９　ＲＮＡのみを検出し、一方、ＣＫ１８およびＣＫ２０は１０１０コピー／５μＬという非常に多量のＲＮＡ試料であっても検出しなかった。以上の結果より、本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いたＣＫ１９　ＲＮＡの増幅検出系は、サイトケラチンのうちＣＫ１９を特異的に検出することが示された。
　実施例６　ＣＫ１９　ＲＮＡの測定（その３）
　本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、様々な濃度の標準ＲＮＡを測定し、検出時間と初期標準ＲＮＡとの関係を確認した。
　（１）実験方法
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３と同様の方法で測定した。
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
　　表１に示す組み合わせのうち、［８］、［１０］、および［３０］を使用。
　ＲＮＡ試料：
　　実施例１で調製した標準ＲＮＡを、実施例３（１）で使用のＲＮＡ希釈液を用い、１０２コピー／５μＬ、１０３コピー／５μＬ、１０４コピー／５μＬ、および１０５コピー／５μＬに希釈したものを使用。
　（２）実験結果
　酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表５に、表５の結果を基に検量線を作成した結果を図１に示す。また、１０２コピー／５μＬのＲＮＡ試料を測定したときの反応開始後２０分後における蛍光強度比も合わせて表５に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　今回検討した全てのオリゴヌクレオチドの組み合わせにおいて、酵素添加後１５分以内に測定した全ての濃度の標準ＲＮＡを検出した。また、検出時間を縦軸に、初期の標準ＲＮＡ濃度量（コピー数をｌｏｇで表したもの）を横軸にしてプロットしたところ、今回検討した全ての組み合わせにおいて、１０２コピーの低コピー領域から検出時間は初期ＲＮＡ量依存的であり、検量線は線形一次曲線で近似することができた。すなわち、未知試料について、本発明のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定を行ない、得られた検出時間を図１に示す検量線に当てはめることで、未知試料に含まれるＣＫ１９　ｍＲＮＡの量を推測可能であることが示された。
　実施例７　ＣＫ１９　ＲＮＡの測定（その４）
　本発明のオリゴヌクレオチドの組み合わせを用いて、ヒトの肺腺癌由来の培養細胞抽出物中のＣＫ１９　ｍＲＮＡの定量を行なった。
　（１）培養細胞の入手
　ヒト肺腺癌由来培養細胞（ＰＣ−３）は、Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　Ｂａｎｋ（ＨＳＲＲＢ）より入手した（ＨＳＲＲＢ　Ｎｏ．ＪＣＲＢ００７７）。
　（２）培養細胞の培養
　ＰＣ−３細胞の培養は、ＨＳＲＲＢのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｂｉｏ．ｇｏ．ｊｐ／ｃｅｌｌｄａｔａ／ｊｃｒｂ００７７．ｈｔｍ）に記載の培地、培養条件に従い培養した。
　（３）リンパ球の単離
　健常人の血液（全血）を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ　ＰＬＵＳ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を用いて、付属のマニュアルに従いリンパ球の単離を行なった。
　（４）ＲＮＡの抽出
　培養したＰＣ−３細胞は、細胞数を計測し、５ｃｅｌｌｓ、５０ｃｅｌｌｓ、５×１０２ｃｅｌｌｓ、５×１０３ｃｅｌｌｓになるように調製し、前記細胞のみ、あるいは前記細胞を５×１０６Ｃｅｌｌｓのリンパ球と混合した試料を作製し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて、キット付属のマニュアルに従い、ＲＮＡの抽出を行なった。なお、ＲＮＡ抽出試料の量は５０μＬである。
　（５）ＣＫ１９　ＲＮＡの測定
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ、ＲＮＡ試料を下記内容に変更した他は、実施例３を同様の方法で測定した。
　オリゴヌクレオチドの組み合わせ：
　　表１に示す組み合わせのうち、組み合わせ［１０］を使用。
　ＲＮＡ試料：
　　本実施例の（４）に記載のＲＮＡ抽出試料を、実施例３（１）記載のＲＮＡ希釈液を用いて１０倍希釈後、そのうちの５μＬを使用。
　（６）実験結果
　酵素添加時の時刻を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時刻の蛍光強度値÷バックグランドの蛍光強度値）が１．２を超えた場合を陽性判定とし、そのときの時間を検出時間とした結果を表６（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）および７（ＰＣ−３細胞とリンパ球との混合物からのＲＮＡ抽出試料）に、また表６および７の検出時間と、実施例６で得られた検量線（図１（ｂ））を基に各ＲＮＡ試料中に含まれるＣＫ１９　ＲＮＡ量を計算した結果を表８（ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料）および９（ＰＣ−３細胞とリンパ球との混合物からのＲＮＡ抽出試料）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　培養ＰＣ−３細胞からのＲＮＡ抽出試料、および前記細胞とリンパ球との混合物からのＲＮＡ抽出試料、いずれの試料も、検量線から求められた各ＲＮＡ試料中のＣＫ１９　ｍＲＮＡ量は、使用した培養ＰＣ−３細胞の細胞数にほぼ比例しており、本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＣＫ１９　ＲＮＡの増幅検出法が濃度依存的であることが示された。
　実施例８　ＣＫ１９　ＲＮＡ増幅産物の塩基配列解析
　実施例７で得られた核酸増幅反応後の試料に含まれる２本鎖ＤＮＡの塩基配列解析を実施した。塩基配列解析の結果、全ての試料において、使用したオリゴヌクレオチドの組み合わせによってＣＫ１９　ｍＲＮＡの増幅が起きたときに相当する塩基配列を確認した。
　つまり、本発明において増幅検出しているのはＣＫ１９　ＲＮＡであり、他の非特異的なＲＮＡは増幅検出していないことを示している。実施例７に示したＲＮＡ抽出物には、ＣＫ１９　ＲＮＡの他に雑多なＲＮＡが混入しているが、本発明の測定方法はＣＫ１９　ＲＮＡのみを増幅検出しており、非常に特異性が高いといえる。また、多量の夾雑物（ＣＫ１９　ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ）存在下でも、使用した培養細胞の数に依存的、かつ非常に少量の培養細胞（５Ｃｅｌｌｓ）からの抽出物でも測定可能であり、非常に高感度、かつ正確性に優れた測定方法といえる。
　以上より、本発明のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法は、未知試料中に含まれるＣＫ１９　ｍＲＮＡを特異的に、かつ迅速、高感度に測定可能であり、さらには、検量線を用いることで、定量を行なうことも可能であることが示された。
　本発明によれば、比較的低温かつ一定温度（４０から６０℃、好ましくは４３℃）条件下で、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）ＲＮＡを１段階の操作で特異的で、かつ迅速・高感度に増幅し、また増幅産物を直接的に検出することができる。

Claims (9)

  1. 試料中のサイトケラチン１９（以降「ＣＫ１９」と表記）ｍＲＮＡの測定方法において、
    前記測定方法が、ＣＫ１９　ｍＲＮＡ内の特定塩基配列の一部と相同的な配列を有する第一のプライマー、および特定塩基配列の一部と相補的な配列を有する第二のプライマーを用いた、下記の工程からなる測定方法であり、ここで第一または第二のプライマーのいずれか一方はその５’末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列が付加されたプライマーである：
    （１）ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程、
    （２）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ　Ｈ）活性を有する酵素による、前記（１）の反応で得られるＲＮＡ−ＤＮＡ２本鎖のＲＮＡを分解する工程（１本鎖ＤＮＡの生成）、
    （３）１本鎖ＤＮＡを鋳型とする、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による、前記特定塩基配列、または前記特定塩基配列に相補的な配列のＲＮＡを転写可能なプロモーター配列を有する２本鎖ＤＮＡを生成する工程、
    （４）ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素による前記２本鎖ＤＮＡを鋳型とするＲＮＡ転写産物を生成する工程、
    （５）該ＲＮＡ転写産物が、前記（１）の反応におけるｃＤＮＡ合成の鋳型となることで、連鎖的にＲＮＡ転写産物を生成する工程、
    （６）前記ＲＮＡ転写産物量を測定する工程、
    かつ、前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、前記測定方法：
    （ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号５で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチド、
    （ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
    （ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号３で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号７で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
    （ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
  2. 前記第一および第二のプライマーが、以下のいずれかであることを特徴とする、請求項１に記載のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法：
    （ｉ）前記第一のプライマーが配列番号１９から２２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号２９から３２で示されたいずれかの塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
    （ｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２３あるいは２４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３３あるいは３４で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
    （ｉｉｉ）前記第一のプライマーが配列番号２５あるいは２６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３５あるいは３６で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである、
    （ｉｖ）前記第一のプライマーが配列番号２７あるいは２８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、前記第二のプライマーが配列番号３７あるいは３８で示された塩基配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドである。
  3. 前記（６）の工程（ＲＮＡ転写産物量を測定する工程）が、標的ＲＮＡと相補的な２本鎖を形成すると蛍光特性が変化するように設計された蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブ共存下で前記蛍光特性の変化を測定することによってなされることを特徴とする、請求項１あるいは２に記載のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法。
  4. 前記蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが、インターカレーター性蛍光色素をリンカーを介して結合させたインターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブであることを特徴とする、請求項３に記載の測定方法。
  5. 前記インターカレーター性蛍光色素標識オリゴヌクレオチドプローブが配列番号３９から４６に示されるいずれかの塩基配列中、あるいは当該相補配列中の少なくとも連続した１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項４に記載の測定方法。
  6. 前記（１）の工程（ＲＮＡを鋳型とする、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素によって特定塩基配列に相補的なｃＤＮＡを合成する工程）の前に、ＣＫ１９　ｍＲＮＡ中の特定塩基配列を鋳型とし、
    （ｉ）前記特定塩基配列中の、第一のプライマーとの相同領域の５’末端部位と重複した領域、および当該部位から５’側に隣接する領域に対し相補的な配列を有する、切断用オリゴヌクレオチド、
    および、
    （ｉｉ）リボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ　Ｈ）活性を有する酵素、
    を用いて、前記特定塩基配列の５’末端部位で前記ＲＮＡを切断する工程を行なうことを特徴とする、請求項１から５に記載のＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定方法。
  7. 前記切断用オリゴヌクレオチドが配列番号９から１８で示されたいずれかの塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項６に記載の測定方法。
  8. ＣＫ１９　ｍＲＮＡを特異的に増幅または検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号１から８、または配列番号３９から４６に示されたいずれかの塩基配列中または当該相補配列中の、少なくとも連続する１５塩基からなるオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記オリゴヌクレオチド。
  9. 請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも一つ含むことを特徴とする、ＣＫ１９　ｍＲＮＡの測定試薬。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5782704B2 (ja) * 2010-11-11 2015-09-24 東ソー株式会社 ＧＡＰＤＨｍＲＮＡの測定方法
CN113234796A (zh) * 2021-05-14 2021-08-10 益善生物技术股份有限公司 一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000014400A (ja) * 1998-07-01 2000-01-18 Tosoh Corp 標的核酸の定量方法
JP2001333783A (ja) * 2000-05-29 2001-12-04 Tosoh Corp メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド
JP2002320481A (ja) * 2001-04-26 2002-11-05 Tosoh Corp Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法
JP2003033182A (ja) * 2001-07-25 2003-02-04 Tosoh Corp 結核菌検出のためのオリゴヌクレオチド
WO2003026584A2 (en) * 2001-09-26 2003-04-03 The General Hospital Corporation Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
JP2003289869A (ja) * 2002-04-02 2003-10-14 Tosoh Corp 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法
JP2007275016A (ja) * 2006-04-11 2007-10-25 F Hoffmann La Roche Ag サイトケラチン１９（ＣＫ１９）ｍＲＮＡの迅速測定法、並びにそのためのプライマー及びプローブ
JP2008000112A (ja) * 2006-06-26 2008-01-10 Sysmex Corp 核酸増幅方法、核酸増幅用試薬、及び試薬キット
JP2008194028A (ja) * 2007-01-15 2008-08-28 Sysmex Corp 胃がんのリンパ節転移判定方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665545A (en) * 1994-11-28 1997-09-09 Akzo Nobel N.V. Terminal repeat amplification method
JP3968810B2 (ja) * 1997-01-24 2007-08-29 東ソー株式会社 核酸配列分析方法
US6504010B1 (en) * 1999-06-30 2003-01-07 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6866843B2 (en) * 1999-12-06 2005-03-15 Viacell, Inc. Method of transplanting in a mammal and treating diabetes mellitus by administering a pseudo-islet like aggregate differentiated from a nestin-positive pancreatic stem cell
US20020072503A1 (en) * 2000-03-28 2002-06-13 Jiangchun Xu Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
TWI340168B (en) * 2003-05-07 2011-04-11 Tosoh Corp Method of detecting micrometastasis
US20080108059A1 (en) * 2004-07-30 2008-05-08 Tosoh Corporation Method Of Measuring Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein B1 (Hnrnp B1) Mrna
JP2007116999A (ja) * 2005-10-28 2007-05-17 Tosoh Corp ＲｅｇＩＶｍＲＮＡの測定方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000014400A (ja) * 1998-07-01 2000-01-18 Tosoh Corp 標的核酸の定量方法
JP2001333783A (ja) * 2000-05-29 2001-12-04 Tosoh Corp メシチリン耐性黄色ブドウ球菌検出のためのオリゴヌクレオチド
JP2002320481A (ja) * 2001-04-26 2002-11-05 Tosoh Corp Ｈｉｖ−１ｒｎａの増幅および検出法
JP2003033182A (ja) * 2001-07-25 2003-02-04 Tosoh Corp 結核菌検出のためのオリゴヌクレオチド
WO2003026584A2 (en) * 2001-09-26 2003-04-03 The General Hospital Corporation Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
JP2003289869A (ja) * 2002-04-02 2003-10-14 Tosoh Corp 非定型抗酸菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ検出のためのオリゴヌクレオチドおよび検出法
JP2007275016A (ja) * 2006-04-11 2007-10-25 F Hoffmann La Roche Ag サイトケラチン１９（ＣＫ１９）ｍＲＮＡの迅速測定法、並びにそのためのプライマー及びプローブ
JP2008000112A (ja) * 2006-06-26 2008-01-10 Sysmex Corp 核酸増幅方法、核酸増幅用試薬、及び試薬キット
JP2008194028A (ja) * 2007-01-15 2008-08-28 Sysmex Corp 胃がんのリンパ節転移判定方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHIGURO, T. ET AL.: "Intercalation activating fluorescence DNA probe and its application to homogeneous quantification of a target sequence by isothermal sequence amplification in a closed vessel.", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 314, 2003, pages 77 - 86, XP001165733 *
OMOTO, D. ET AL.: "Nyugan Sentinel Lymph-setsu Seiken ni Okeru TRC CK19 mRNA Sokutei no Yuyosei", DAI 56 KAI JAPANESE SOCIETY OF LABORATORY MEDICINE GAKUJUTSU SHUKAI, 28 July 2009 (2009-07-28), pages 296, XP008148249 *
OMOTO, D. ET AL.: "TRC-ho ni yoru Nyugan Sentinel Lymph-setsu Ten'i no Shindan no Yuyosei", THE JAPAN SOCIETY FOR CLINICAL LABORATORY AUTOMATION DAI 41 KAI TAIKAI SHOROKUSHU, 1 September 2009 (2009-09-01), pages 578, XP008147159 *
See also references of EP2351851A4 *

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