CN113234796A - 一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒 - Google Patents
一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒及其检测方法，其包括针对CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述捕获探针为茎环状γPNA‑PNA探针，其从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、P1序列、Linker、P2序列；所述信号放大系统包括标记探针SP1和标记探针SP2；每条标记探针SP1从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列，且P3序列5’端修饰有荧光基团；每条标记探针SP2从5’端到3’端的组成依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列，且P6序列3’端修饰有荧光基团。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确率高、检测时间短等优点。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒。
背景技术
细胞角蛋白18(CK18)是一种Ⅰ型酸性中间丝蛋白，属于细胞骨架蛋白家族，其基因定位于人类染色体12q13.13，含8个外显子。CK18主要在单层或“简单”上皮组织中表达，如肝、肺、肾、胰腺、胃肠道、乳腺等，也在这些组织产生的癌症中表达(WengYR et al.,MolCancer Res,2012,10:485–493)。CK18的已知生物学功能是提供一个灵活的细胞内支架来构建细胞质，抵抗外界施加在细胞上的压力，并维持正常的线粒体结构(WengYR et al.,Mol Cancer Res,10:485–493)。CK18还在细胞凋亡、有丝分裂、细胞周期进程和细胞信号传导等过程中发挥着重要作用。此外，CK18多年来一直被认为是诊断组织病理学的上皮标志物，并且在肿瘤细胞行为中具有重要的功能。
研究表明，CK18表达是多种肿瘤潜在的预后标志物(Weng YR et al.,Mol CancerRes,2012,10:485–493)。例如，在乳腺癌和结直肠癌中，CK18表达降低与肿瘤进展有关(Woelfe U et al.,Clin Cancer Res,2004,10:2670–2674；Knosel T et al.,CellOncol,2006,28:167–175)；在食管鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤、胃癌和非小细胞肺癌中，CK18表达水平升高与肿瘤不良预后相关(Makino T et al.,Br J Cancer,2009,10:1298–1306；Chen N et al.,Melanoma Research,2009,19:87；Saad AA et al.,Ann SurgOncol,2010,17:3059–3067；Zhang B et al.,JCancer Res Clin Oncol,2016,142:2479–2487)。一项针对11952例肿瘤的组织芯片研究显示，源自CK18阳性组织的癌症中CK18表达下调或缺失以及源自CK18阴性组织的癌症中CK18新表达与癌症进展有关，并可能影响肿瘤的去分化(MenzA et al.,Mol Med,2021,27:16)。可见，CK18的功能失调可能在不同癌症的发病机制中起重要作用。另外，在循环肿瘤细胞(CTCs)研究中，CK18被作为上皮型标志物，用于CTCs的分离与鉴定(Wu S et al.,PLoS ONE2015,10:e0123976)。
鉴于CK18表达与肿瘤的密切关系，促使我们开发一种CK18基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于深入研究CK18基因在不同癌症的发病机制中的确切作用及其在肿瘤诊断、预后和治疗方面的临床意义，并将为肿瘤诊断、预后和治疗提供有用的临床辅助信息。
目前CK18表达检测多采用免疫组化和实时定量PCR。免疫组化是在蛋白水平上检测CK18表达；但是，该方法的局限性在于：检测所需组织样本取材受限，检测结果的准确性受抗体的种类、抗原修复方法、染色方法和条件等诸多因素的影响，结果判读的主观性强。实时定量PCR主要是用于检测组织/细胞样本中CK18基因表达水平，具有灵敏度高、序列特异性强等优点；但是，该方法对实验条件要求很高，必须严格避免污染，否则难以保证检测结果的准确性和可靠性。针对上述问题，中国专利CN201410228511.9提供了一种检测基因表达的RNA原位杂交方法，所述方法的检测探针可实现RNA原位检测的荧光信号放大，提高检测的灵敏度，但是进一步的研究发现，上述RNA原位杂交检测方法中捕获探针的杂交选择性以及信号放大系统需要进一步优化，以达到更好的检测效果。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种具有更高杂交亲和力、更好杂交选择性以及更好杂交稳定性的细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒。
具体技术方案如下：
一种CK18基因表达检测试剂盒，包括针对检测CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括标记探针SP1和标记探针SP2；其中，
所述捕获探针为茎环状γPNA-PNA探针，其从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、P1序列、Linker、P2序列；所述茎部序列为可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构的γPNA序列；所述特异性P1序列为能与CK18基因mRNA特异性结合的γPNA序列；所述linker为EG8 Linker；所述P2序列为与P1和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的PNA序列；
所述标记探针SP1连接捕获探针与标记探针SP2，其从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列能与捕获探针的P2序列互补配对并修饰有荧光基团；所述P4序列为与P1、P2、P3和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；
所述标记探针SP2用于连接标记探针SP1，其从5’到3’端的碱基组成依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P5序列为能与标记探针SP1的P4序列互补配对的核酸序列；所述P6与标记探针SP1的P3序列互补配对，与捕获探针的P2序列碱基组成相同，并修饰有与对应标记探针SP1一致的荧光基团。
在其中一些实施例中，上述针对CK18基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10的完全互补序列中的任意至少3条，茎部结构序列为SEQ ID NO.21或其互补序列，P2序列为SEQ ID NO.23或其互补序列；
和/或，上述针对CK18基因mRNA的标记探针SP1中，P3序列为SEQ ID NO.25或其互补序列，P4序列为SEQ ID NO.27或其互补序列；
和/或，上述针对CK18基因mRNA的标记探针SP2中，P5序列为SEQ ID NO.29或其互补序列，P6序列为SEQ ID NO.23或其互补序列。
在其中一些实施例中，上述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；上述针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针修饰的荧光基团不同。
在其中一些实施例中，上述内参基因为ACTB。
在其中一些实施例中，上述CK18基因表达检测试剂盒，其针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.20的完全互补序列中的任意至少3条，茎部结构序列为SEQ ID NO.22或其互补序列，P2序列为SEQ ID NO.24或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针SP1中，P3序列为SEQ IDNO.26或其互补序列，P4序列为SEQ ID NO.28或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针SP2中，P5序列为SEQ ID NO.30或其互补序列，P6序列为SEQ ID NO.24或其互补序列。
在其中一些实施例中，上述捕获探针中的茎部序列长度为4～8bp，特异性P1序列长度为10～22bp。
在其中一些实施例中，上述标记探针的间隔臂序列长度为5～10个碱基；优选为5～10个胸腺嘧啶。
在其中一些实施例中，上述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和AlexaFluor 750。
本发明的目的之一还在于提供一种非疾病诊断目的的CK18基因表达检测方法。
上述目的的具体实施方案如下：
一种非疾病诊断目的的CK18基因表达检测方法，包括以下步骤：
(1)预处理待测样本，使其mRNA暴露；
(2)配置同时包含捕获探针、标记探针SP1和标记探针SP2的探针工作液；
(3)探针工作液与待测样本孵育杂交；
(4)通过荧光显微镜观察待测样本的CK18基因是否表达。
在其中一些实施例中，上述探针工作液中捕获探针、标记探针SP1和标记探针SP2的摩尔比为0.75：0.66：0.66。
在其中一些实施例中，上述待测样本为血液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的人或动物细胞。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人通过构建茎环状γPNA-PNA探针作为捕获探针，将捕获探针中的茎部结构序列和特异性P1序列设计为γPNA序列，将P2序列设计为PNA序列，并在特异性P1序列和P2序列之间引入EG8 Linker，发现这种捕获探针可有效识别CK18基因的mRNA，并具有更高的杂交亲和力、更好的杂交选择性以及更好的杂交稳定性，从而有效提高杂交效率，该捕获探针能很好地应用于本发明多探针检测体系中，提高检测的灵敏度和准确性。
并且本发明还对多探针检测体系中的信号放大系统进行了改进，改进后的信号放大系统包括末端修饰有荧光基团的标记探针SP1和末端修饰有荧光基团的标记探针SP2，可通过超级三明治杂交形成稳定的带有荧光基团的DNA长链，从而更好地实现CK18基因mRNA的在带上荧光信号的同时荧光信号得以累加，实现CK18基因mRNA的信号放大。改进后的信号放大系统具有更高效的信号放大功能，还能确保信号放大杂交与捕获探针杂交同步进行。在保证检测信号强度的同时更进一步简化杂交步骤，缩短扩增杂交的时间，从而改善了检测效果，提高了检测效率。
此外，本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合，所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高，从而使得包括本方案中探针组合的检测试剂盒与检测方法形成一个效果优异的检测体系。
本发明所述试剂盒进一步地还通过优化多探针检测体系捕获探针中γPNA序列和/或PNA序列引入的位置、碱基组成和长度，捕获探针的结构，捕获探针杂交时间，捕获探针的数量，以及信号放大系统中标记探针的结构、碱基组成和长度，可在提高检测灵敏度和特异性的同时进一步缩短检测时间，提高检测效果，从而更好地进行CK18基因表达检测。
附图说明
图1为本发明各探针相应结构及工作原理示意图；其中A为各探针相应结构示意图，B为工作原理示意图。
图2为本发明CK18基因阴性和阳性检测结果示意图。
图3为实施例3中本发明捕获探针(茎环状γPNA-PNA探针)与传统茎环状寡核苷酸探针、线性γPNA-PNA探针的检测结果比较示意图。
图4为实施例4中本发明捕获探针(P1序列为SEQ ID NO.1-20)与P1序列具有1-5个替换碱基的捕获探针(P1序列为SEQ ID NO.31-50)的检测结果比较示意图。
图5为实施例5中本发明捕获探针(茎环状γPNA-PNA探针)与茎环状γPNA-γPNA探针、茎环状PNA-PNA探针的检测结果比较示意图。
图6为实施例10中本发明信号放大系统与常规信号放大系统的检测结果比较示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。实施例中所涉及到的所有探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
术语“PNA”是指肽核酸，其中骨架是由通过肽键连接的重复的N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元而成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过羰基甲基连接到骨架。
探针：探针是限定的核酸，可以是由天然存在的核苷酸制成，或者可以由自然界中未知的核苷酸制成，或它们的任何混合物(包括但不限于DNA、RNA等)，用于识别具有互补序列的特异的目标多核苷酸，所述目标多核苷酸可以是由天然存在的核苷酸制成，或者可以由自然界中未知的核苷酸制成，或它们的任何混合物，如DNA或RNA分子。在一个优选的实施方式中，探针被定义为单链DNA、RNA、LNA、PNA分子，用于在有其他单链多核苷酸的混合物中探测互补序列的存在，所述单链多核苷酸可以是由天然存在的核苷酸制成，或者可以由自然界中未知的核苷酸制成，或它们的任何混合物，如DNA和/或RNA分子。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒
本实施例所述的一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒，主要包括有：
1.捕获探针
所述捕获探针从5’端到3’端依次是茎部结构序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、连接器(Linker)、P2序列。同一目标mRNA其捕获探针中的P2序列相同。所述茎部序列为碱基长度为4～8bp、可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构的γ-修饰的肽核酸(γPNA)序列；所述特异性P1序列为碱基长度为10～22bp的γPNA序列；所述Linker为EG8Linker；所述P2序列为碱基长度为8～20bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和目标mRNA之间均不存在特异性结合的PNA序列。所述Linker可将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，减少空间位阻，提高杂交性能。针对每个mRNA分别设计10条捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每个目标基因，选择3条或3条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA捕获探针的特异性P1序列的碱基序列见表1，不同类型的目标mRNA的捕获探针的茎部结构序列的碱基序列见表2，P2序列的碱基序列见表3。
表1目标mRNA捕获探针P1序列的碱基序列
表2捕获探针茎部结构序列的碱基序列
| mRNA | 捕获探针茎部结构序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CK18 | TGTAAG | 21 |
| ACTB | TCTGAT | 22 |
表3捕获探针P2序列的碱基序列
2.标记探针SP1
所述标记探针SP1是连接捕获探针与标记探针SP2之间的序列，标记探针SP1由三部分组成，从5’端到3’端依次是能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列。所述P3序列的5’端修饰有荧光基团，所述荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、AlexaFluor 488和Alexa Fluor 750，不同目标mRNA的标记探针选自的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便区分不同类型的目标mRNA。所述间隔臂为用于将扩增探针的P4序列与捕获探针的P3序列间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明标记探针SP1的间隔臂优选5～10个T，本实施例优选为5个T。所述P4序列为碱基长度8～24bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和目标mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列。针对相应目标mRNA的标记探针SP1的P3序列见表4，P4序列见表5。
表4标记探针SP1的P3序列
| mRNA | 标记探针SP1的P3序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CK18 | AlexaFluor488-TGTAAGGTCGATAG | 25 |
| ACTB | Cy3-TCTGATGATAGAAC | 26 |
表5标记探针SP1的P4序列
| mRNA | 标记探针SP1的P4序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CK18 | CTCAATTACACGTC | 27 |
| ACTB | CTTCAAGACTCATC | 28 |
3.标记探针SP2
所述标记探针SP2用于连接标记探针SP1，使荧光基团得以叠加，实现信号放大。标记探针SP2由三部分组成，从5’到3’端的碱基组成依次是能与标记探针SP1的P4序列互补配对的P5序列、5个T的间隔臂序列(本发明的标记探针SP2间隔臂碱基优选5～10个T，本实施例优选为5个T)、能与标记探针SP1的P3序列互补配对的P6序列。所述P6为与捕获探针的P2序列碱基组成相同的核酸序列，P6序列的3’端修饰有与相应标记探针SP1相同的荧光基团，所述荧光基团可以选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且同一目标mRNA的标记探针SP2选择的荧光基团与其对应标记探针SP1选择的荧光基团相同，以便荧光基团叠加实现信号放大；不同目标mRNA的标记探针选择的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便区分不同类型的目标mRNA。本实施例针对CK18基因mRNA的标记探针SP2的P6序列3’端修饰有AlexaFluor 488(绿色荧光信号)，针对ACTB基因mRNA的标记探针SP2的P6序列3’端修饰有Cy3(红色荧光信号)。针对相应的目标mRNA的标记探针SP2的P5序列见表6，P6序列的碱基序列见表3。
表6标记探针SP2的P5序列
| mRNA | 标记探针SP2的P5序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CK18 | GACGTGTAATTGAG | 29 |
| ACTB | GATGAGTCTTGAAG | 30 |
本实施例还提供了一种CK18基因表达检测方法，主要包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用上述试剂盒检测CK18基因是否表达。
所述步骤(1)中的生物样本包括但并不局限于以下来源：人或动物的外周循环血、胸腔积液、腹水、脐带血、羊水、骨髓或培养的人或动物细胞。
所述步骤(4)中的使用上述试剂盒检测CK18基因是否表达，包括以下步骤：
a)探针杂交，捕获探针特异性P1序列与目标基因mRNA序列特异性结合，捕获探针的P2序列与标记探针SP1的P3序列特异性结合，标记探针SP1的P4序列与标记探针SP2的P5序列特异性结合，标记探针SP2的P6序列与标记探针SP1的P3序列特异性结合，如此循环，荧光标记目标基因mRNA序列的同时荧光基团不断叠加实现目标信号放大；
b)通过荧光检测仪检测。
本实施例各探针相应结构及工作原理见图1，探针杂交时，捕获探针特异性P1序列与目标mRNA完全配对，捕获探针P2序列与标记探针SP1完全配对，捕获探针的茎环结构即可打开，形成目标mRNA-捕获探针-标记探针SP1复合体，该复合体中标记探针SP1的P4序列再与标记探针SP2的P5序列互补结合形成目标mRNA-捕获探针-标记探针SP1-标记探针SP2复合体，该复合体中标记探针SP2的P6序列又可与标记探针SP1的P3序列互补结合，形成目标mRNA-捕获探针-标记探针SP1-标记探针SP2-标记探针SP1复合体，该复合体又可结合标记探针SP2的P5序列，形成目标mRNA-捕获探针-标记探针SP1-标记探针SP2-标记探针SP1-标记探针SP2复合体，如此循环，从而有效实现了检测荧光信号放大。
实施例2运用实施例1所述试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如表7：
表7各种溶液的配方
本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞CK18基因表达水平进行检测，其中捕获混合液、显色混合液SP1、显色混合液SP2均使用实施例1所述相应列表中的全部探针。
1.抽取患者静脉中血液5ml于真空采血管中，得到血液样本。
2.样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上。
(1)收集待检测细胞悬液，600×g水平离心5分钟，弃上清；(2)加入4ml PBS和1ml固定剂，涡旋混匀，室温静置8分钟；(3)样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4ml PBS，洗涤管壁后抽滤液体；(4)将滤膜转移至24孔板中，加入400μl的4％甲醛溶液，室温固定1小时；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
3.透化处理。
(1)在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体，室温孵育5分钟；(2)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤2次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
4.消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交。
(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75μl的PBS、1.25μl的消化酶，总体积50μl；(2)按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在，室温静置1小时；(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
5.探针杂交，探针特异性P1序列与目标mRNA序列结合的同时荧光标记目标信号并不断叠加实现目标信号放大。
(1)捕获缓冲液和显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟，整个探针杂交操作过程需避光操作；(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获工作液组成为8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按实验需要配制一定体积的捕获工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成为2μl显色混合液SP1、2μl显色混合液SP2、46μl显色缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(4)将滤膜取出，倒扣至24孔板中由50μl捕获工作液和50μl显色工作液组成的探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(5)盖上24孔板盖，40±1℃避光孵育2小时(探针杂交时间优选为2小时，可参考实施例7)；(6)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
6.荧光显微镜观察CK18基因的表达。
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发生蓝色荧光信号。
(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于－20℃保存；(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量；(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果；(4)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表8荧光基团的激发波长和发射波长
| 荧光基团 | 激发波长(Excitationfilter) | 发射波长(Emissionfilter) |
| DAPI | 330～385nm | 420nm |
| AlexaFluor488 | 460～495nm | 510～550nm |
| Cy3 | 545～580nm | 610nm |
7.检测结果判断及分析
(1)CK18基因表达判定标准(即本试剂盒阳性表达判定标准，参见图2)。
a)样本中有1个或1个以上细胞表达CK18基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。
b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本发明所述试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对CK18基因mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否表达CK18。
(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15，其中编号1～5的样本来自非小细胞肺癌患者，编号6～8的样本来自乳腺癌患者，编号10～12的样本来自结直肠癌患者，编号13～15的样本来自胃癌患者)进行检测，同时选用市售CK18阳性肺癌细胞株NCl-H1975和阴性表达细胞株CCRF-HSB-2淋巴母细胞分别作为阳性对照和阴性对照。分别各取1000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表9所示：
表9样本检测结果
检测发现，针对不同肿瘤患者样本，其临床检测结果与本发明试剂盒检测结果均一致；针对不同细胞待检样本，其每次检测结果均相同，且从上述检测结果可知，本发明所述CK18基因表达检测试剂盒具有良好特异性和灵敏度，能实现临床样本检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中CK18基因的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3不同类型捕获探针对试剂盒检测效果的影响
1.试剂盒制备的设计(捕获探针设计)
为了评估不同类型捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-3，各组除了捕获探针类型不同之外，其它组分均相同。具体设计如表10所示。
表10试剂盒捕获探针的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取3000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见图3和表11。
表11试剂盒选用不同捕获探针的检测结果比较
注：为便于结果统计及后续结果处理及判读，计算得到的每个细胞平均荧光数均为四舍五入至整数而得到，下同。
检测结果显示，当使用本发明捕获探针时，杂交效率较好，荧光信号点明亮清晰，信号点丰度较高(见图3实验组1)，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数很多(见表11实验组1)，信号很强很稳定，其检测灵敏度和检测特异性都很好，能实现高效准确检测。传统茎环状寡核苷酸探针虽然特异性很高，但其对靶mRNA的亲和性远不如本发明捕获探针，在实施例2所述杂交时间内(2h)难以避免探针分子未能与靶mRNA完全结合而造成特异性荧光信号丢失，因此其荧光信号丰度较低(见图3实验组2)，检测到的荧光信号点数明显较少，甚至导致个别阳性细胞未能被检出(见表11实验组2)。线性γPNA-PNA探针检测到的荧光信号点数与本发明捕获探针相当，其检测灵敏度很好，但是由于其高亲和性易于脱靶结合含错配序列，因此其杂交选择性不如本发明捕获探针，存在一些非特异性杂交(见图3和表11实验组3)，甚至导致一些假阳性结果的产生(如26、27、29号样本)。以上说明本发明设计的捕获探针兼具传统茎环状探针的高特异性和γPNA/PNA探针的高亲和性，因此具有很好的杂交亲和性、杂交选择性和杂交稳定性，能准确高效地检测样本中CK18基因的表达情况。
实施例4捕获探针的特异性
1.试剂盒制备的设计(捕获探针设计)
本发明试剂盒提供一种茎环状γPNA-PNA捕获探针，其通过在线性γPNA/PNA探针中引入茎环结构以解决线性γPNA/PNA探针易于脱靶结合含错配序列的问题，提高捕获探针的特异性，从而提高捕获探针的杂交选择性。
为了评估本发明捕获探针的特异性，设计实验组1-2，其中实验组1采用实施例1试剂盒相应列表中的全部探针，实验组2采用P1序列具有1-5个替换碱基的捕获探针，具体设计如表12所示，其它检测组分均与实验组1完全一致。
表12捕获探针P1序列
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见图4和表13。
表13试剂盒选用不同P1序列捕获探针的检测结果比较
从检测结果可知，当捕获探针特异性P1序列与目标mRNA不能完全互补配对时，在所有细胞中均检测不到荧光信号，不能实现检测(见图4和表13实验组2)。本发明提供的茎环状γPNA-PNA捕获探针具有很高的特异性，当捕获探针P2序列与标记探针SP1的P3序列完全匹配，但特异性P1序列不能与mRNA完全匹配时，捕获探针保持茎环状，导致mRNA不能通过捕获探针与信号放大系统相连，从而不产生荧光信号，无法实现检测。同理，当实验组1的捕获探针遇上非目的基因的mRNA时，亦不会产生非特异性杂交，即只要序列与目标mRNA存在1个或1个以上碱基的差异，都不能使茎环状γPNA-PNA捕获探针打开，不会产生荧光信号，因此，本发明的茎环状γPNA-PNA捕获探针具有很高的特异性，保证了检测结果的准确性。
实施例5捕获探针茎环结构类型的选择
1.试剂盒制备的设计(捕获探针茎环结构设计)
为了评估捕获探针茎环结构类型的选择对捕获探针使用效果及试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-3，各组除了捕获探针的茎环结构不同之外，其它均相同。具体设计如表14所示。
表14试剂盒捕获探针茎环结构类型的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取3000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为15份，依次编号1～15和16～30。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见图5和表15。
表15试剂盒选用不同茎环结构捕获探针的检测结果比较
从检测结果可知，当使用本发明捕获探针时，杂交效率较好，荧光信号点明亮清晰，信号点丰度较高(见图5实验组1)，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数很多(见表15实验组1)，信号很强很稳定，捕获探针使用效果和试剂盒检测效果都很好，能实现准确检测。茎环状γPNA-γPNA探针因其茎环结构比本发明捕获探针的茎环结构更稳定，在实施例2所述杂交条件下更难打开，因此其杂交效果不如本发明捕获探针，造成特异性荧光信号丢失，因此其荧光信号丰度较低(见图5实验组2)，检测到的荧光信号点数明显减少(见表15实验组2)，甚至导致个别阳性细胞未能被检出(如7号和10号样本)。茎环状PNA-PNA探针不仅茎环结构比本发明捕获探针的茎环结构更稳定，而且其对靶mRNA的亲和性和细胞穿透性不如本发明捕获探针，因此其杂交效果更差，荧光信号丰度更低(见图5实验组3)，检测到的荧光信号点数更少(见表15实验组3)，也导致个别阳性细胞未能被检出(如11号、12号和14号样本)。因此，本发明捕获探针茎环结构设计为γPNA-PNA。
实施例6捕获探针EG8 Linker的运用对试剂盒检测效果的影响
1.试剂盒制备的设计(EG8 Linker的运用)
EG8英文全称为octaethylene glycol，中文名为八乙二醇，其将PNA序列与γPNA序列分隔开来从而使两个序列之间的相互作用最小化。为了考察捕获探针EG8 Linker的运用对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-5，五组除了捕获探针引入的Linker不同之外，其它组份均相同，对比其检测效果。具体设计如表16所示。
表16试剂盒捕获探针Linker/间隔臂的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取5000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为25份，依次编号1～25和26～50。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～50进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表17试剂盒选用不同Linker/间隔臂的捕获探针的检测结果比较
从检测结果可知，当捕获探针中引入EG8 Linker时(实验组2)，由于EG8 Linker更为线性和更为刚性的构象，不仅使得捕获探针更容易被细胞吸收，增加了捕获探针对靶序列的可及性，而且能在杂交时有效地将捕获探针P2序列与目标mRNA之间间隔开来，有效地减少了捕获探针P2序列与标记探针SP1的P3序列互补结合的空间位阻，从而保障了捕获探针与目标mRNA、标记探针SP1的杂交效率，因此可实现准确检测，检测到的荧光信号点数很多，信号很强很稳定，特异性和稳定性都很好，试剂盒的检测效果很好。
当捕获探针不引入Linker或间隔臂时(实验组1)，由于捕获探针被细胞吸收的容易度下降，捕获探针对靶序列的可及性下降，同时，由于捕获探针P2序列与目标mRNA之间没有间隔，导致空间位阻过大，因此降低了杂交反应的效率以及荧光信号强度，使检测效果不稳定，大量阳性细胞不能被有效检出，且检测到的荧光信号大大减少，不能实现准确检测。
当捕获探针中引入EG18 Linker时(实验组3)，由于EG18 Linker构象的线性和刚性不如EG8 Linker，使得捕获探针被细胞吸收的容易度下降，捕获探针对靶序列的可及性下降，同时，使得其在捕获探针P2序列与目标mRNA之间未能发挥合适的、有效的空间间隔作用，导致空间位阻过大，因此降低了降低了杂交反应的效率以及荧光信号强度，使检测效果不稳定，大量阳性细胞不能被有效检出，且检测到的荧光信号大大减少，不能实现准确检测。
当捕获探针中引入5个T的间隔臂序列或O-Linker时(实验组4和实验组5)，其检测效果也不如本发明引入EG8 Linker的捕获探针，检测到的荧光信号点数明显低于本发明引入EG8 Linker的捕获探针，甚至存在个别阳性细胞不能有效被检出，推测造成其检测效果稍差的原因可能在于：①其未能有效地提高捕获探针被细胞吸收的可能性，未能有效地提高捕获探针对靶序列的可及性；②其空间间隔效果不如EG8 Linker。因此，选用本发明引入EG8Linker的捕获探针时，试剂盒检测效果达到最佳；而选用不引入Linker/间隔臂的捕获探针或选用引入EG18 Linker、5个T的间隔臂序列或O-Linker等Linker/间隔臂的捕获探针会降低试剂盒检测性能，甚至导致无法准确检测。
实施例7捕获探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响
1.试剂盒制备的设计(捕获探针杂交时间的设计)
为了评估捕获探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-3和对照组1-3，杂交时间依次设置为1小时、2小时和3小时，实验组1-3选用本发明试剂盒中的捕获探针，对照组选用如实施例3所述的传统茎环状寡核苷酸探针，其它均与实验组试剂盒相同，使用实施例1所述试剂盒和对照组试剂盒进行检测，对比其检测效果。具体设计如表18所示。
表18试剂盒捕获探针杂交时间的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计的试剂盒捕获探针杂交时间，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组/对照组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表19不同捕获探针不同杂交时间的检测结果比较
从以上检测结果可知，三组实验组捕获探针杂交时间为1小时、2小时和3小时均可完成检测，其特异性和稳定性都很好，同时，与本发明捕获探针杂交1小时相比，当本发明捕获探针杂交时间为2小时或3小时时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；而对照组捕获探针杂交1小时或2小时分别存在大量或个别阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，且检出的荧光信号点数也都明显少于三组实验组，只有杂交3小时才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组2、实验组3相差不大；说明本发明捕获探针相较于传统茎环状寡核苷酸探针检测效果更佳，可提高杂交速度。为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省时间成本，本发明的捕获探针杂交时间优选为2小时。
实施例8捕获探针茎部结构序列长度的选择
1.试剂盒制备的设计(茎部结构序列长度设计)
为考察捕获探针茎部结构序列长度的选择对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-5，五组捕获探针茎部结构序列长度分别选用2～10bp，其它组分均相同，对比其检测效果，具体设计参见表20。
表20捕获探针茎部结构序列碱基长度的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取5000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为25份，依次编号1～25和26～50。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～50进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表21试剂盒选用不同碱基长度茎部结构序列的捕获探针的检测结果比较
通过五组实验对比可知，捕获探针茎部结构序列长度选用4bp～8bp时可实现准确检测，其中，当捕获探针茎部结构序列长度为4bp～6bp时，检测到的荧光信号点数很多，信号很强很稳定，特异性和稳定性都很好。当捕获探针茎部结构序列长度选用2bp时，由于其序列长度过短无法与捕获探针P2序列3’端形成稳定的茎环结构，达不到通过茎环结构提高捕获探针特异性的目的，导致捕获探针与非靶mRNA的非特异性结合几率增加，从而影响检测结果的准确性，故存在个别阴性样本被检测为阳性，导致假阳性结果的产生(如28号和30号样本)。当捕获探针茎部结构序列长度选用10bp时，由于其序列长度较长而与捕获探针P2序列3’端形成过于稳定的茎环结构，致使杂交时捕获探针的茎环结构难以打开，导致捕获探针与靶mRNA特异性结合几率下降，进而导致杂交效率下降，因此存在大量阳性细胞漏检的现象，且检测到的荧光信号点数明显减少。因此，本发明捕获探针的茎部结构序列设计为其长度为4bp～8bp的γPNA序列，优选茎部结构序列设计为6bp的γPNA序列。
针对本发明捕获探针特异性P1序列长度的选择实验设计与上述实验设计类似，具体设计和实验数据省略，其结果显示，捕获探针特异性P1序列长度选用10bp～22bp时可实现准确检测，其检测到的荧光信号点数很多，信号很强很稳定，特异性和稳定性都很好。因此，本发明捕获探针的特异性P1序列设计为长度是10bp～22bp的γPNA序列，优选特异性P1序列设计为16bp的γPNA序列。
实施例9捕获探针数量的选择
1.试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-4，分别选取1条、3条、5条及10条能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列，组成捕获探针，对比其检测效果，试剂盒具体设计参见表22。
表22捕获探针数量的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取4000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表23试剂盒选用不同数量捕获探针的检测结果比较
通过四组实验对比可知，使用1条、3条、5条和10条的捕获探针均可完成检测，但当捕获探针使用3条或以上时，其特异性和稳定性才都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
实施例10信号放大系统组成对试剂盒检测效果的影响
为了评估不同组成信号放大系统的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，其中实验组1选用本发明试剂盒中的信号放大系统，其组成包括末端修饰有荧光基团的标记探针SP1和末端修饰有荧光基团的标记探针SP2；实验组2选用CN201410228511.9文件中所述信号放大系统(常规信号放大系统)，其组成包括末端不带荧光基团的扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针。两个实验组除了信号放大系统组成不同外，其它组份均相同。具体设计如表24所示。
表24试剂盒信号放大系统组成的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见图6和表25。
表25不同组成信号放大系统的检测结果比较
从以上检测结果可知，当使用本发明设计的信号放大系统时，杂交效率较好，荧光信号点明亮清晰，信号点丰度较高(见图6实验组1)，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数很多(见表25实验组1)，信号很强很稳定，检测效果很好；而当使用常规信号放大系统时，荧光信号点丰度相对较低(见图6实验组2)，检测到的荧光信号点数明显减少(见表25实验组2)，存在个别阳性细胞未能被检出的现象(如6号和9号样本)。可见，与常规信号放大系统相比，本发明设计的信号放大系统的信号放大效果更佳，检测效果更佳；说明本发明设计的信号放大系统具有更高的灵敏度、稳定性和准确率。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种细胞角蛋白18基因表达检测试剂盒
<160> 50
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtggagcgag tggtga 16
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gcctgcatag acgctg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggctttgcat ggtctc 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ttgctctcca gcctcc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atggctccag tctctg 16
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cattgtcaat ctgcag 16
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cagctgcagt cgtgtg 16
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atctacctcc acggtc 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cagactgtgt ggtgac 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gctgctccat ctgtag 16
<210> 11
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gttgtcgacg acgagc 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aatccttctg acccat 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ccagttggtg acgatg 16
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
cacacgcagc tcattg 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gtgttgaagg tctcaa 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
catcacgatg ccagtg 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gtggccatct cttgct 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ctcattgcca atggtg 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ctgtcggcaa tgccag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
tgatccacat ctgctg 16
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<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
ctatcgacct taca 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gttctatcat caga 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tgtaaggtcg atag 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
tctgatgata gaac 14
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<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
ctcaattaca cgtc 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cttcaagact catc 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gatgagtctt gaag 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtggatcgag tggtga 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcatgcacag atgctg 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
tgctctgcat gatcag 16
<210> 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
ttgctctcga gcctct 16
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
atggcatcag tctctg 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
catcgtcgat ctacag 16
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<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
cagctgtagt cgtgtg 16
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<212> DNA
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<400> 38
ctctacgtcg acgatc 16
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
cagtatgtgt gctgac 16
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tctcctcgat ctgttg 16
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gttgtcgatg acgagc 16
<210> 42
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<212> DNA
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tatcgttctg acgcat 16
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<213> Artificial Sequence
<400> 43
gcagttgctg atgac 15
<210> 44
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
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gtgttgatcg tctcaa 16
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catgtcgatg tcagtg 16
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ctcatcgcta gtgatg 16
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<400> 58
tctgatgata 10
Claims (10)
1.一种CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括标记探针SP1和标记探针SP2；其中，
所述捕获探针为茎环状γPNA-PNA探针，其从5’端到3’端的组成依次为：茎部结构序列、P1序列、Linker、P2序列；所述茎部序列为可与P2序列3’端的碱基互补形成茎环结构的γPNA序列；所述特异性P1序列为能与CK18基因mRNA特异性结合的γPNA序列；所述linker为EG8 Linker；所述P2序列为与P1和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的PNA序列；
所述标记探针SP1连接捕获探针与标记探针SP2，其从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P3序列能与捕获探针的P2序列互补配对并修饰有荧光基团；所述P4序列为与P1、P2、P3和CK18基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；
所述标记探针SP2用于连接标记探针SP1，其从5’到3’端的碱基组成依次为：P5序列、间隔臂序列、P6序列；所述P5序列为能与标记探针SP1的P4序列互补配对的核酸序列；所述P6与标记探针SP1的P3序列互补配对，与捕获探针的P2序列碱基组成相同，并修饰有与对应标记探针SP1一致的荧光基团。
2.根据权利要求1所述的CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，针对CK18基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10的完全互补序列中的任意至少3条，茎部结构序列为SEQ ID NO.21或其互补序列，P2序列为SEQ ID NO.23或其互补序列；
和/或，针对CK18基因mRNA的标记探针SP1中，P3序列为SEQ ID NO.25或其互补序列，P4序列为SEQ ID NO.27或其互补序列；
和/或，针对CK18基因mRNA的标记探针SP2中，P5序列为SEQ ID NO.29或其互补序列，P6序列为SEQ ID NO.23或其互补序列。
3.根据权利要求1所述CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对CK18基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针修饰的荧光基团不同。
4.根据权利要求3所述CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB。
5.根据权利要求4所述CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.11～SEQ IDNO.20的完全互补序列中的任意至少3条，茎部结构序列为SEQ ID NO.22或其互补序列，P2序列为SEQ ID NO.24或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针SP1中，P3序列为SEQ IDNO.26或其互补序列，P4序列为SEQ ID NO.28或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针SP2中，P5序列为SEQ ID NO.30或其互补序列，P6序列为SEQ ID NO.24或其互补序列。
6.根据权利要求1～5任一项所述CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针中的茎部序列长度为4～8bp，特异性P1序列长度为10～22bp。
7.根据权利要求1～5任一项所述CK18基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述标记探针的间隔臂序列长度为5～10个碱基；优选地，所述间隔臂序列的碱基为5～10个胸腺嘧啶。
8.一种非疾病诊断目的的CK18基因表达检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)预处理待测样本，使其mRNA暴露；
(2)配置同时包含捕获探针、标记探针SP1和标记探针SP2的探针工作液；
(3)探针工作液与待测样本孵育杂交；
(4)通过荧光显微镜观察待测样本的CK18基因是否表达。
9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于，所述探针工作液中捕获探针、标记探针SP1和标记探针SP2的摩尔比为0.75：0.66：0.66。
10.根据权利要求8～9任一项所述检测方法，其特征在于，所述待测样本为血液、胸腔积液、腹水、羊水、骨髓或培养的人或动物细胞。
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