CN113234797A - 一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒 - Google Patents

一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒及检测方法，其包括针对CK19基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；P2序列、间隔臂序列、P1序列、间隔臂序列、P2序列，所述P1序列为能与CK19基因mRNA特异性结合的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸序列；所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针；每条扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4’序列，所述P4’序列为n组P4序列顺次连接，且相邻的两组P4序列之间包含有间隔臂序列；每条标记探针具有与相应扩增探针P4’序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。该试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确率高等优点，从而能更好地应用于CK19基因表达检测中。

Description

一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒。
背景技术
细胞角蛋白19(CK19)是相对分子质量最小且呈酸性的Ⅰ型角蛋白，是构成细胞骨架的成分之一，其基因定位于人类染色体17q21.2，含6个外显子。CK19表达于胰腺、胆囊、肾脏和消化系统的周皮和上皮细胞，其在信号转导途径、应激反应、凋亡、保持上皮细胞真实性和细胞增殖方面发挥着重要作用(Mehrpouya M et al.,J Cell Physiol,2019,234:21425-21435)。研究表明，CK19在肺癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、甲状腺癌、宫颈癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达，并与肿瘤的发生发展、侵袭、转移和预后有关，在肿瘤的预后、诊断和治疗方面是一个有用的标志物(Mehrpouya M et al.,J Cell Physiol,2019,234:21425-21435)。
在循环肿瘤细胞(CTCs)研究中，CK19被作为上皮型标志物，用于CTCs的分离与鉴定(Wu S et al.,PLoS ONE 2015,10:e0123976)。有研究通过实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测了ER阴性、三阴性和HER阳性早期乳腺癌患者血液中的CK19 mRNA阳性CTCs，结果发现，辅助化疗前CK19 mRNA阳性CTCs的检出预示着较差的临床预后(Ignatiadis Met al.,J Clin Oncol,2007,25:5194-52020)。另一项针对早期乳腺癌患者血液中CK19mRNA阳性CTCs的研究则显示，辅助化疗后血液中CK19 mRNA阳性CTCs的检测是提示化疗耐药残留病灶存在的独立危险因素(Xenidis N et al.,J Clin Oncol,2009,27:2177-2184)。以上研究表明，CK19 mRNA阳性CTCs可作为早期乳腺癌辅助治疗疗效的预测标志物。一项针对可手术乳腺癌患者血液中CK19 mRNA阳性CTCs的研究发现，最初五年的随访中持续检测到CK19 mRNA阳性CTCs与患者晚期复发、死亡风险有关，并预示存在化疗和激素治疗耐药的残留病灶(Saloustros E et al.,Breast Cancer Res,2011,13:R60)。另有研究采用EpCAM、CK19和hMAM三种标志物通过RT-PCR法来检测转移性乳腺癌患者的CTCs，结果发现，外周血三标记物阳性CTCs的存在是转移性乳腺癌患者无进展生存率和总生存率降低的独立危险因素，化疗前CTCs的存在预示着转移性乳腺癌患者无进展生存率和总生存率降低(Zhao S et al.,Cell Biochem Biophys,2013,65:263-273)。此外，一项针对食管鳞状细胞癌患者的研究采用CEA、CK19和survivin三种标志物通过RT-PCR法检测了患者外周血中的CTCs，结果显示，放疗后CTC阳性与患者不良预后独立相关，表明放疗后CTCs阳性可能是食管鳞状细胞癌放疗效果和预后评估的一个潜在生物标志物(Yin XD et al.,DisEsophagus,2012,25:750-756)。可见，CK19在CTCs中的表达具有重要的临床价值。
鉴于CK19表达与肿瘤的密切关系及其在CTCs研究中的重要意义，促使我们开发一种CK19基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于深入研究CK19基因在不同肿瘤发生发展中的重要作用及其在肿瘤诊断、预后和治疗方面的临床意义，并将为肿瘤诊断、预后和治疗提供有用的临床辅助信息。
目前检测CK19表达的方法主要包括免疫组化和RT-PCR。但是，上述两种方法在实际检测中均存在一定的局限性，包括样本取材受限和影响检测结果准确性的因素较多较难控制等。为此，中国专利CN201410228511.9提供了一种检测基因表达的RNA原位杂交方法，所述方法的检测探针可实现RNA原位检测的荧光信号放大，提高检测的灵敏度，但是进一步的研究发现，上述RNA原位杂交检测方法中检测探针可进一步优化，以达到更好的检测效果。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种检测效果优异的细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒。
具体技术方案如下：
一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒，包括针对检测CK19基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统，所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针；其中，
上述捕获探针用于连接CK19基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：P2序列、间隔臂序列、P1序列、间隔臂序列、P2序列；P1序列为能与CK19基因mRNA特异性结合的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸序列；P2序列与P1和CK19基因mRNA之间均不存在特异性结合；
上述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4’序列；P3序列能与捕获探针的P2序列互补配对，所述P4’序列为n组P4序列顺次连接，n为0-20的整数，且相邻的两组P4序列之间包含有间隔臂序列；P4序列与P1、P2、P3和CK19基因mRNA之间均不存在特异性结合。
上述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4’序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。
在其中一些实施例中，上述扩增探针中P4’序列的P4序列组数n为3～10的整数；
在其中一些实施例中，上述扩增探针中P4’序列的P4序列组数n为4～7的整数，进一步优选为5。
在其中一些实施例中，上述针对CK19基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10的完全互补序列中的任意至少5条，P2序列为SEQ ID NO.21或其互补序列；
和/或，针对CK19基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.23或其互补序列，P4’序列中的P4序列为SEQ ID NO.25或其互补序列；
和/或，针对CK19基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.27或其互补序列。
在其中一些实施例中，上述间隔臂序列的碱基长度为5～10个碱基；优选地，所述间隔臂序列的碱基为5～10个胸腺嘧啶。
在其中一些实施例中，上述捕获探针中的特异性P1序列长度为15～25bp，P2序列长度为18～24bp；所述扩增探针的P4序列长度为18～24bp。
在其中一些实施例中，上述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对CK19基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同。
在其中一些实施例中，上述内参基因为ACTB。
在其中一些实施例中，上述针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20的完全互补序列中的任意至少5条，P2序列为SEQ ID NO.22或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.24或其互补序列，P4’序列中的P4序列为SEQ ID NO.26或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.28或其互补序列。
本发明的目的之一还在于提供一种CK19基因表达检测方法。
实现上述目的的技术方案如下
一种非疾病诊断目的的CK19基因表达检测方法，包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用上述试剂盒检测CK19基因是否表达：a)捕获探针杂交，捕获探针特异性P1序列与目标基因mRNA序列特异性结合；b)扩增杂交，捕获探针P2序列与扩增探针P3序列特异性结合，目标mRNA序列信号放大；c)显色，扩增探针的P4’序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d)通过荧光检测仪检测。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人研制了一种用于细胞角蛋白19基因mRNA原位检测体系，其包括针对CK19基因特异性设计的捕获探针、扩增探针以及标记探针等多种探针。通过发明人对CK19基因的深入研究发现，在其捕获探针中引入吗啉环结构，将捕获探针特异性P1序列设计为PMO序列，可使得所述捕获探针具有更高的稳定性、更好的水溶性、更好的细胞渗透性、更强的与靶序列结合能力以及更好的特异性；捕获探针5’端和3’端同时包含P2序列，可以有效地提高扩增杂交过程中捕获探针P2序列与扩增探针P3序列特异性结合的几率，提高扩增杂交效率，从而提高检测效率。并且，还将其扩增探针中通过引入多组P4序列(形成P4’序列)的优化，使扩增探针与标记探针组成的信号放大系统具有更高效的信号放大功能，更好地实现CK19基因mRNA的信号放大，提高检测的信噪比和准确率。
此外，本发明发明人所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合，所设计的探针在检测中灵敏度高、特异性好、信噪比高，从而使探针组合与CK19基因表达检测方法形成一个检测效果完好的体系。
本发明形成的试剂盒进一步优化多探针检测体系中捕获探针PMO序列引入的位置和长度，捕获探针杂交时间，捕获探针的数量，以及信号放大系统中标记探针的结构、碱基组成和长度，从而有效保障检测体系可提高检测灵敏度和特异性，提高检测效果，更好地进行CK19基因表达检测。
附图说明
图1为本发明各探针相应结构及工作原理示意图，其中A为各探针相应结构示意图，B为工作原理示意图。
图2为本发明CK19基因阴性和阳性检测结果示意图。
图3为实施例4中本发明捕获探针(P1序列为PMO序列)与P2序列为PMO序列的捕获探针的检测结果比较示意图。
图4为实施例5中本发明扩增探针与常规扩增探针的检测结果比较示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。实施例中所涉及到的所有探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒
本实施例所述的一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒，主要包括有：
1.捕获探针
所述捕获探针由五部分组成，从5’端到3’端依次是P2序列、间隔臂序列、能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、间隔臂序列、P2序列。同一目标mRNA其捕获探针中的P2序列相同。所述特异性P1序列为碱基长度为15～25bp的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(PMO)序列；所述P2序列为碱基长度为18～24bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和CK19基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5～10个T，本实施例优选为5个T。针对每个mRNA分别设计10条捕获探针，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每个目标基因，选择5条或5条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA捕获探针的特异性P1序列的碱基序列见表1，P2序列的碱基序列见表2。
表1目标mRNA捕获探针P1序列的碱基序列
Figure BDA0003066785620000061
表2捕获探针P2序列的碱基序列
mRNA 捕获探针P2序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CK19 GGGATGAGTGTAATGAGGAT 21
ACTB AGGGTGTTGGTAGTGAGATA 22
2.扩增探针
所述扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，每条扩增探针从5’端到3’端依次是能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、n组P4序列。所述P4序列为碱基长度18～24bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和CK19基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；所述n组P4序列中，相邻的两组P4序列之间包含有间隔臂序列，其结构模式为P4序列、间隔臂序列、P4序列……间隔臂序列、P4序列。本发明扩增探针的间隔臂优选5～10个T，本实施例优选为5个T。本发明扩增探针中P4序列的组数优选3～20组，本实施例扩增探针中P4序列的组数优选为5组。本实施例优选的5组P4序列的结构模式为P4序列、间隔臂序列、P4序列、间隔臂序列、P4序列、间隔臂序列、P4序列、间隔臂序列、P4序列。针对相应目标mRNA的扩增探针的P3序列见表3，P4序列见表4。
表3扩增探针的P3序列
mRNA 扩增探针的P3序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CK19 ATCCTCATTACACTCATCCC 23
ACTB TATCTCACTACCAACACCCT 24
表4扩增探针的P4序列
mRNA 扩增探针的P4序列(5’-3’) SEQ ID NO.
CK19 ACACTTTCACCTTCCCATTA 25
ACTB TCCTCCTATTCCCTAACAAC 26
3.标记探针
所述标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针P4序列互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，不同目标mRNA的标记探针选择的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便区分不同类型的目标mRNA。针对相应目标mRNA的标记探针的P5序列见表5。
表5标记探针的P5序列
mRNA 标记探针的P5序列(5’-3’) SEQ ID NO. 荧光基团
CK19 TAATGGGAAGGTGAAAGTGT 27 Alexa Fluor 488(绿色荧光信号)
ACTB GTTGTTAGGGAATAGGAGGA 28 Cy3(红色荧光信号)
本实施例还提供了一种CK19基因表达检测方法，主要包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用上述试剂盒检测CK19基因是否表达。
所述步骤(1)中的生物样本包括但并不局限于以下来源：人或动物的外周循环血、胸腔积液、腹水、脐带血、羊水、骨髓或培养的人或动物细胞。
所述步骤(4)中的使用上述试剂盒检测CK19基因是否表达，包括以下步骤：a)捕获探针杂交，捕获探针特异性P1序列与目标基因mRNA序列特异性结合；b)扩增杂交，捕获探针P2序列与扩增探针P3序列特异性结合，目标mRNA序列信号放大；c)显色，扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d)通过荧光检测仪检测。
本实施例各探针相应结构及工作原理见图1。
实施例2运用实施例1所述试剂盒对样本进行检测
所述各种溶液的配方如表6：
表6各种溶液的配方
Figure BDA0003066785620000071
Figure BDA0003066785620000081
本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞CK19基因表达水平进行检测，其中捕获混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1所述相应列表中的全部探针。检测主要步骤如下，参考文件CN201410228511.9：
1.抽取患者静脉中血液5ml于真空采血管中，得到血液样本。
2.样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上。
3.透化处理。
4.消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交。
5.捕获探针杂交，探针特异性P1序列与目标mRNA序列结合
(1)捕获缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获工作液组成为8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按实验需要配制一定体积的捕获工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(4)盖上24孔板盖，40±1℃孵育2小时(具体操作时，捕获探针杂交1～3小时均可完成检测，准确性和稳定性都很好，本实施例捕获探针杂交时间优选为2小时，以确保检测准确性的同时节省时间成本)；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
6.扩增杂交，目标mRNA序列信号放大。
(1)扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；(2)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成为2μl扩增混合液、48μl扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(4)盖上24孔板盖，40±1℃孵育15分钟(具体操作时，扩增杂交10～30分钟均可完成检测，准确性和稳定性都很好，本实施例扩增杂交时间优选为15分钟，以确保检测准确性的同时节省时间成本)；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
7.显色，荧光标记目标信号。
(1)显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟，整个显色操作过程需避光操作；(2)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成为2μl显色混合液、48μl显色缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(4)盖上24孔板盖，40±1℃避光孵育15分钟(本实施例显色杂交时间优选为15分钟，可参考实施例7)；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
8.荧光显微镜观察CK19基因的表达。
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发生蓝色荧光信号。
(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于－20℃保存；(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量；(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果；(4)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表7荧光基团的激发波长和发射波长
荧光基团 激发波长(Excitation filter) 发射波长(Emission filter)
DAPI 330～385nm 420nm
Alexa Fluor 488 460～495nm 510～550nm
Cy3 545～580nm 610nm
9.检测结果判断及分析
(1)CK19基因表达判定标准(即本试剂盒阳性表达判定标准，参见图2)。
a)样本中有1个或1个以上细胞表达CK19基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。
b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本发明所述试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对CK19基因mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否表达CK19。
(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15，其中编号1～4的样本来自结直肠癌患者，编号5～10的样本来自乳腺癌患者，编号11～15的样本来自非小细胞肺癌患者)进行检测，同时选用市售CK19阳性肺癌细胞株NCl-H1975和阴性表达细胞株CCRF-HSB-2淋巴母细胞分别作为阳性对照和阴性对照。分别各取1000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表8所示：
表8样本检测结果
Figure BDA0003066785620000101
检测发现，针对不同肿瘤患者样本，其临床检测结果与本发明试剂盒检测结果均一致；针对不同细胞待检样本，其每次检测结果均相同，且从上述检测结果可知，本发明所述CK19基因表达检测试剂盒具有良好特异性和灵敏度，能实现临床样本检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对患者循环肿瘤细胞中CK19基因的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3不同类型捕获探针对试剂盒检测效果的影响
1.试剂盒制备的设计(不同类型捕获探针设计)
本发明针对CK19基因mRNA检测，在捕获探针中引入吗啉环结构，将捕获探针特异性P1序列设计为PMO序列，使得所述捕获探针具有更高的稳定性、更好的水溶性、更好的细胞渗透性、更强的与靶序列结合能力以及更好的特异性。同时，本发明捕获探针5’端和3’端均包含P2序列，因此，扩增杂交时捕获探针P2序列与扩增探针P3序列特异性结合的几率增加，从而有效地提高了扩增杂交效率。因此，与现有的线性寡核苷酸探针相比，上述本发明捕获探针可在更短的时间内实现充分和准确的杂交，具有更高的灵敏度、特异性和准确率。
为了评估不同类型捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-4，各组除了捕获探针类型不同之外，其它组分均相同。具体设计如表9所示。
表9试剂盒捕获探针的选择
Figure BDA0003066785620000102
Figure BDA0003066785620000111
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取4000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表10试剂盒选用不同捕获探针的检测结果比较
Figure BDA0003066785620000112
注：为便于结果统计及后续结果处理及判读，计算得到的每个细胞平均荧光数均为四舍五入至整数而得到，下同。
从以上检测结果可知，当使用本发明设计的捕获探针(实验组1)时，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数很多，信号很强很稳定，其检测灵敏度和特异性都很好，能实现准确检测。优化型捕获探针1由于其只有3’端包含P2序列，使得其在扩增杂交时杂交效率变差，造成特异性荧光信号丢失，导致检测到的荧光信号点数明显减少，甚至导致个别阳性细胞未能被检出(实验组2)，试剂盒检测灵敏度相对较差。优化型捕获探针2由于其特异性P1序列为常规核酸序列而非PMO序列，其细胞渗透性、与靶核酸结合的能力和稳定性及其特异性不如本发明捕获探针，使得其在捕获杂交时杂交性能变差，造成特异性荧光信号丢失，导致检测到的荧光信号点数明显减少，甚至导致个别阳性细胞未能被检出(实验组3)，并且产生一些非特异性杂交信号，导致假阳性结果(如35号样本)，试剂盒检测灵敏度和特异性均较差。现有的线性寡核苷酸探针的细胞渗透性、与靶核酸结合的能力和稳定性、特异性及其与扩增探针P3序列结合的能力均不如本发明所述捕获探针，在实施例2所述检测过程和方法中无法实现准确检测，其检测到的荧光信号点数更少，大量阳性细胞未能被检出(实验组4)，并且存在一些非特异性杂交，导致假阳性结果的产生(如38号样本)，试剂盒检测效果最差。因此，本发明所述捕获探针具有更好杂交性能和稳定性，在较短的杂交时间内即可准确完成检测，检测灵敏度、特异性和准确率更高。
实施例4捕获探针PMO序列设计位置的选择
1.试剂盒制备的设计(PMO序列设计位置选择)
为了考察捕获探针PMO序列设计位置的选择对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-2，两组捕获探针的碱基序列与实施例1所述捕获探针相同，但是捕获探针PMO序列设计位置分别选用：特异性P1序列、P2序列，且设计为PMO序列的碱基数目相同；实验组使用的扩增探针和标记探针均与实施例1相同，对比其检测效果。具体设计如表11所示。
表11试剂盒捕获探针PMO序列设计位置的选择
实验组 PMO序列设计位置
实验组1 特异性P1序列
实验组2 P2序列
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见图3和表12。
表12试剂盒选用不同PMO序列设计位置的捕获探针的检测结果比较
Figure BDA0003066785620000131
从以上检测结果可知，针对CK19基因表达的检测，捕获探针的PMO序列设计位置选用特异性P1序列时，杂交效率较好，荧光信号点明亮清晰，信号点丰度较高(见图3实验组1)，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数很多(见表12实验组1)，信号很强很稳定，特异性和稳定性都很好，可实现准确检测。当捕获探针的PMO序列设计位置选用P2序列时，由于特异性P1序列为非PMO序列，导致捕获探针与靶mRNA特异性结合能力和稳定性有所下降，从而影响杂交效率和检测效果，故检测到的荧光信号点丰度有所降低(见图3实验组2)，荧光信号点数也有所减少，存在个别阳性细胞漏检的现象(见表12实验组2)。因此，本发明捕获探针的PMO序列设计位置选择特异性P1序列。
实施例5不同类型扩增探针对试剂盒检测效果的影响
1.试剂盒制备的设计(扩增探针设计)
为了评估不同类型扩增探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，实验组1选用本发明实施例1所述试剂盒中的扩增探针，实验组2选用常规扩增探针，两组除了扩增探针不同外，其它组份均相同。具体设计如表13所示。
表13试剂盒扩增探针的选择
实验组 扩增探针类型 序列组成
实验组1 本发明扩增探针 如实施例1所述
实验组2 常规扩增探针 从5’端到3’端依次是P3序列、间隔臂序列、P4序列
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见图4和表14。
表14试剂盒选用不同扩增探针的检测结果比较
Figure BDA0003066785620000141
从以上检测结果可知，当使用本发明扩增探针时，杂交效率较好，荧光信号点明亮清晰，信号点丰度较高(见图4实验组1)，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数很多(见表14实验组1)，信号很强很稳定，其检测效果很好，能实现高效准确检测。常规扩增探针与标记探针组成的信号放大系统的信号放大能力不如本发明扩增探针与标记探针组成的信号放大系统，在实施例2所述检测过程和方法中难以避免扩增探针未能与标记探针完全结合造成特异性荧光信号丢失，因此其检测到的荧光信号点丰度较低(见图4实验组2)，荧光信号点数明显减少，甚至导致一些阳性细胞未能被检出(见表14实验组2)。以上说明本发明设计的扩增探针能很好地应用于本发明信号放大系统中，可以有效地提高信号放大系统的信号放大能力，更好地实现CK19基因mRNA的信号放大。
实施例6扩增探针P4序列组数的选择
1.试剂盒制备的设计(P4序列组数的设计)
为了考察扩增探针P4序列组数的选择对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-6，扩增探针P4序列组数依次设计为2组、3组、5组、10组、20组和21组，各实验组除了扩增探针P4序列组数不同之外，其它组分均相同，对比其检测效果，具体设计如表15所示。
表15扩增探针P4序列组数的选择
实验组 实验组1 实验组2 实验组3 实验组4 实验组5 实验组6
P4序列组数 2组 3组 5组 10组 20组 21组
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表16不同组数P4序列组成的扩增探针的检测结果比较
Figure BDA0003066785620000151
从以上检测结果可知，使用P4序列组数为3～20组的扩增探针均可实现准确检测，其检测到的荧光信号点数很多，信号很强很稳定，试剂盒检测效果很好，其中，当使用P4序列组数为5～10组的扩增探针时，其检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，试剂盒检测效果最佳；当扩增探针P4序列的组数为2组时，由于P4序列组数过少，其与标记探针组成的信号放大系统的信号放大能力有限，导致荧光信号放大效果变差，使试剂盒检测效果不稳定，一些阳性细胞不能有效被检出；当扩增探针P4序列的组数为21组时，由于P4序列组数过多致使整个扩增探针分子序列过长，导致扩增探针的杂交效率以及荧光信号放大效果有所下降，使试剂盒检测效果不稳定，一些阳性细胞不能有效被检出。因此，本发明所述扩增探针中P4序列的组数优选为3～20组；为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省经济成本(探针合成成本)，本发明所述扩增探针中P4序列的组数优选为5组。
实施例7显色杂交时间的选择
1.试剂盒制备的设计(显色杂交时间设计)
本发明所述信号放大系统由扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针组成。其中，所述扩增探针包含多组P4序列，本发明实施例1所述扩增探针包含5组P4序列。由于本发明实施例1所述扩增探针包含5组P4序列，其在显色杂交时理论上可与5条末端修饰有荧光基团的标记探针特异性结合，因此，可以提高扩增探针与标记探针特异性结合几率，提高显色杂交效率，在保证检测信号强度的同时缩短显色杂交时间。
为了评估显色杂交时间对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-3和对照组1-3，各组除了信号放大系统和/或显色杂交时间不同外，其它组份和/或其它检测步骤均相同。具体设计如表17所示。
表17试剂盒显色杂交时间的选择
Figure BDA0003066785620000161
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计制备的试剂盒及显色杂交时间，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组/对照组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：
表18不同信号放大系统不同显色杂交时间的检测结果比较
Figure BDA0003066785620000162
Figure BDA0003066785620000171
从以上检测结果可知，三组实验组信号放大系统显色杂交时间为10分钟、15分钟和30分钟均可完成检测，其特异性和稳定性都很好，同时，与本发明信号放大系统显色杂交10分钟相比，当本发明信号放大系统显色杂交时间为15分钟或30分钟时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；而对照组常规信号放大系统显色杂交10分钟或15分钟分别存在大量或一些阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，且检出的荧光信号点数也都明显少于三组实验组，只有显色杂交30分钟才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组2、实验组3相差不大；说明本发明信号放大系统相较于常规信号放大系统检测效果更佳，可提高显色杂交速度。为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省时间成本，本发明所述信号放大系统的显色杂交时间优选为15分钟。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gatagctgta ggaagtcatg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgaggttctg catggttagc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gatcttcacc tctagctcgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
agaatcttgt cccgcaggtc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaagtcatct gcagccagac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
catggttctt cttcaggtag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tcgcatgtca ctcaggatct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gctggtgaac caggcttcag 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
ctgcagctca atctcaagac 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tcatcatcca tggtgagctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
gaatccttct gacccatgcc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
tgacgatgcc gtgctcgatg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
ccacacgcag ctcattgtag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
catcacgatg ccagtggtac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gatctccttc tgcatcctgt 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gactcgtcat actcctgctt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
gggatgagtg taatgaggat 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
atcctcatta cactcatccc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
tatctcacta ccaacaccct 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
acactttcac cttcccatta 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
tcctcctatt ccctaacaac 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
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<400> 27
taatgggaag gtgaaagtgt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gttgttaggg aataggagga 20

Claims (10)

1.一种细胞角蛋白19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括针对检测CK19基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统，所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针；其中，
所述捕获探针用于连接CK19基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：P2序列、间隔臂序列、P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述P1序列为能与CK19基因mRNA特异性结合的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸序列；所述P2序列与P1和CK19基因mRNA之间均不存在特异性结合；
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4’序列；所述P3序列能与捕获探针的P2序列互补配对，所述P4’序列为n组P4序列顺次连接，n为0-20的整数，且相邻的两组P4序列之间包含有间隔臂序列；所述P4序列与P1、P2、P3和CK19基因mRNA之间均不存在特异性结合。
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4’序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。
2.根据权利要求1所述的CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述扩增探针中P4’序列的P4序列组数n为3～10的整数；
3.根据权利要求2所述的CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述扩增探针中P4’序列的P4序列组数n为4～7的整数。
4.根据权利要求3所述的CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，针对CK19基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10以及SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.10的完全互补序列中的任意至少5条，P2序列为SEQ ID NO.21或其互补序列；
和/或，针对CK19基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.23或其互补序列，P4’序列中的P4序列为SEQ ID NO.25或其互补序列；
和/或，针对CK19基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.27或其互补序列。
5.根据权利要求1～4任一项所述的CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的碱基长度为5～10个碱基；优选地，所述间隔臂序列的碱基为5～10个胸腺嘧啶。
6.根据权利要求1～4任一项所述CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针中的特异性P1序列长度为15～25bp，P2序列长度为18～24bp；所述扩增探针的P4序列长度为18～24bp。
7.根据权利要求1所述的CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统与针对CK19基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统的结构相同，但标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同。
8.根据权利要求7所述的CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB。
9.根据权利要求8所述的CK19基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述针对ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20以及SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20的完全互补序列中的任意至少5条，P2序列为SEQ ID NO.22或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.24或其互补序列，P4’序列中的P4序列为SEQ ID NO.26或其互补序列；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列为SEQ ID NO.28或其互补序列。
10.一种非疾病诊断目的的CK19基因表达检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用权利要求1～9任一项所述试剂盒检测CK19基因是否表达：a)捕获探针杂交，捕获探针特异性P1序列与目标基因mRNA序列特异性结合；b)扩增杂交，捕获探针P2序列与扩增探针P3序列特异性结合，目标mRNA序列信号放大；c)显色，扩增探针的P4’序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d)通过荧光检测仪检测。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107475358A (zh) * 2016-06-08 2017-12-15 益善生物技术股份有限公司 结直肠癌组织溯源ctc分型鉴定试剂盒
WO2019104294A1 (en) * 2017-11-27 2019-05-31 Western University Of Health Sciences Fluorophore-labeled phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides and uses thereof
CN111808964A (zh) * 2020-07-24 2020-10-23 益善生物技术股份有限公司 一种EpCAM基因表达检测试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475358A (zh) * 2016-06-08 2017-12-15 益善生物技术股份有限公司 结直肠癌组织溯源ctc分型鉴定试剂盒
WO2019104294A1 (en) * 2017-11-27 2019-05-31 Western University Of Health Sciences Fluorophore-labeled phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides and uses thereof
CN111808964A (zh) * 2020-07-24 2020-10-23 益善生物技术股份有限公司 一种EpCAM基因表达检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
付洁等: "反义寡核苷酸药动学研究进展", 中国新药杂志, vol. 27, no. 21, pages 2534 - 2543 *

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