CN111808964B

CN111808964B - 一种EpCAM基因表达检测试剂盒

Info

Publication number: CN111808964B
Application number: CN202010725432.4A
Authority: CN
Inventors: 许嘉森; 吴诗扬; 黄洁芬; 刘志明; 刘芳
Original assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Current assignee: Surexam Bio Tech Co Ltd
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2040-07-24
Also published as: CN111808964A

Abstract

本发明提供了一种EpCAM基因表达检测试剂盒，其包括针对检测EpCAM基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针；其中，所述捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：能与待检测EpCAM基因mRNA结合的特异性P1序列、助溶基团、P2序列，所述特异性P1序列为长度为16～20bp的肽核酸序列；所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。本发明通过检测探针的优化，使得所述试剂盒具有准确率高、检测时间短、省时省力等优点。

Description

一种EpCAM基因表达检测试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种EpCAM基因表达检测试剂盒。

背景技术

上皮细胞黏附分子(EpCAM)，又称为CD326，最初被描述为人类结肠癌的显性表面抗原，是一种介导上皮特异性细胞间黏附的跨膜糖蛋白，其基因定位于人类染色体2p21，包含9个外显子。EpCAM在大多数正常上皮细胞和胃肠道癌等恶性上皮肿瘤细胞中表达，但其在不同细胞类型和器官中的表达水平不同。在全身大多数上皮细胞类型中，EpCAM表达均为强阳性，且主要集中在侧膜和基底膜，但在淋巴源性和骨髓源性细胞、间质型、肌肉或神经内分泌组织等非上皮组织中不表达。在成人中，结肠、小肠、胰腺、肝脏、胆囊和子宫内膜的上皮细胞均高表达EpCAM。在大多数癌组织如结直肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌中，EpCAM经常过度表达，且与正常的上皮细胞不同，EpCAM表达的分布因癌症的类型而异，从基底外侧到均匀的全细胞膜分布；此外，在细胞质和细胞核也能检测到强烈的EpCAM表达。EpCAM参与细胞间黏附、细胞信号转导、细胞增殖、分化、迁移以及上皮-间质转化(EMT)等多种生物学过程，在肿瘤发生和发展中发挥着重要作用。

在癌症诊断中，EpCAM也具有重要的临床价值。EpCAM可作为区分上皮型肿瘤和非上皮型肿瘤的标志物。EpCAM可作为鉴别肺腺癌、卵巢癌等癌症和EpCAM阴性间皮瘤的标志物，但表达EpCAM的上皮样间皮瘤除外。EpCAM还可作为上皮型肿瘤组织学鉴别的标志物，如鉴别以EpCAM阳性为主的胆管癌和以EpCAM阴性为主的肝细胞癌。此外，根据不同的器官，不同的癌症亚型可能有明显不同的EpCAM染色特性和强度。

在循环肿瘤细胞(CTCs)研究中，EpCAM常被作为上皮型标志物，用于CTCs的分离与鉴定。有研究发现，EpCAM⁺CTCs的存在与肝细胞癌患者较短的总生存期有关；治疗前EpCAM^mRNA+CTCs高水平与肝细胞癌根治性切除术、经导管动脉化疗栓塞术和放疗后较高的复发率有关，治疗后EpCAM^mRNA+CTCs水平下降可能反映肿瘤反应，而治疗后EpCAM^mRNA+CTCs水平增加患者出现疾病进展(Guo W et al.,Clinical cancer research,2014,20:4794-4805)。另有研究报道，EpCAM⁺CTCs的显著减少与非小细胞肺癌患者对吉西他滨的显著反应有关，吉西他滨靶向EpCAM⁺CTCs，通过逆转HGF/cMET途径诱导的EMT特征，抑制非小细胞肺癌的转移和侵袭(Liao Z J et al.,International journal of oncology,2014,45:651-658)。由此可见，EpCAM在CTCs中表达具有重要的临床价值。

鉴于EpCAM表达在癌症预后、诊断及CTCs研究中的重要临床价值，促使我们开发一种EpCAM基因表达检测试剂盒，该试剂盒将有助于深入研究EpCAM基因表达在各种癌症发生发展、预后及治疗方面的临床意义，并将为其提供有效的临床辅助信息。

目前EpCAM表达检测多采用免疫组化和实时定量PCR，这两种方法在实际检测中均存在一定的局限性，包括样本的来源受限和影响检测结果准确性的因素较多较难控制等。为此，中国专利CN201410228511.9提供了一种检测基因表达的RNA原位杂交方法，所述方法的检测探针可实现RNA原位检测的荧光信号放大，提高检测的灵敏度，但是进一步的研究发现，上述RNA原位杂交检测方法中检测探针的细胞穿透性、检测探针与目标mRNA特异性结合的稳定性以及杂交时间可进一步优化。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种能快速准确进行EpCAM基因表达检测的试剂盒，通过原位杂交法检测生物样本中EpCAM基因的表达水平，提供临床相关辅助信息。

具体技术方案为：

一种EpCAM基因表达检测试剂盒，包括针对检测EpCAM基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，

所述捕获探针用于连接EpCAM基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：能与待检测EpCAM基因mRNA结合的特异性P1序列、助溶基团、P2序列；所述特异性P1序列为碱基长度为16～20bp的肽核酸序列；所述助溶基团选自O-linker、E-linker、X-linker中的至少一种；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和EpCAM基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；

所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和EpCAM基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；

所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团。

本申请所述助溶基团指能提高肽核酸溶解性，同时起到空间间隔作用的连接器。

在其中一些实施例中，所述助溶基团的数目为2～3个。

在其中一些实施例中，优选所述助溶基团为2～3个O-linkers。

在其中一些实施例中，更优选地，所述助溶基团为2个O-linkers，其可使检测效果更稳定。

在其中一些实施例中，针对EpCAM基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列的碱基序列选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的5条或5条以上，P2序列的碱基序列为SEQ IDNO.21；

和/或，针对EpCAM基因mRNA的扩增探针中，P3序列的碱基序列为SEQ ID NO.23，P4序列的碱基序列为SEQ ID NO.25；

和/或，针对EpCAM基因mRNA的标记探针中，P5序列的碱基序列为SEQ ID NO.27。

在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，

所述捕获探针用于连接内参基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：能与待检测内参基因mRNA结合的特异性P1序列、助溶基团、P2序列，所述特异性P1序列为碱基长度为16～20bp的肽核酸序列；所述助溶基团选自O-linker、E-linker、X-linker中的至少一种；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和EpCAM基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；

所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和内参基因mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；

所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，所述荧光基团与针对EpCAM基因mRNA的标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同。

在其中一些实施例中，所述助溶基团的数目为2～3个。

在其中一些实施例中，所述内参基因为ACTB基因。

在其中一些实施例中，所述ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列的碱基序列选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的5条或5条以上，助溶基团为2～3个O-linkers，P2序列的碱基序列为SEQ ID NO.22；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列的碱基序列为SEQ ID NO.24，P4序列的碱基序列为SEQ ID NO.26；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列的碱基序列为SEQ ID NO.28。

在其中一些实施例中，所述间隔臂序列的碱基长度为5～10个。

在其中一些实施例中，优选所述间隔臂序列的碱基为5～10个T。

在其中一些实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。

本发明还提供了一种非疾病诊断目的的EpCAM基因表达检测方法，包括以下步骤：

(1)得到生物样本；

(2)富集待检测细胞；

(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；

(4)使用上述试剂盒检测EpCAM基因是否表达：a)捕获探针杂交，捕获探针的特异性P1序列与EpCAM基因mRNA序列特异性结合；b)扩增杂交，捕获探针P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合，EpCAM基因mRNA序列信号放大；c)显色，扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d)通过荧光检测仪检测。

在其中一些实施例中，所述步骤(4)中捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育1.5～2小时。

在其中一些实施例中，优选步骤(4)中捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育2小时。本发明通过检测探针的优化，使得所述捕获探针在2h内与目标mRNA完全杂交，并准确检测。

在其中一些实施例中，所述步骤(4)中捕获探针、扩增探针和标记探针的摩尔比为：(2.8～3.2)：(0.6～0.7)：(0.3～0.4)。

在其中一些实施例中，优选所述步骤(4)中捕获探针、扩增探针和标记探针的摩尔比为：3：0.66：0.33。发明人经过研究发现，当使用该比例探针检测时，可以取得更好的检测效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过在捕获探针中引入以中性酰胺键为骨架的寡核苷酸探针模拟物，将捕获探针特异性P1序列设计为肽核酸序列，并在特异性P1序列与P2序列之间加入与本发明所述捕获探针相适应的助溶基团，使得所述捕获探针具有更好的细胞穿透性、更强的单碱基识别能力(甚至不能允许1个碱基的错配)、与目标mRNA特异性结合的高稳定性以及杂交快速性。因此，在杂交时，可以提高捕获探针与生物样本中靶mRNA特异性结合的几率、亲和力和稳定性，提高杂交效率，缩短捕获探针与靶mRNA完全杂交需要的时间，使得所述捕获探针在更短的杂交时间内仍然能保证充分和准确的杂交，并且还可以减少碱基错配的发生，降低非特异性结合几率，从而进一步提高检测的准确性，减少检测时长，提高检测效率。

常规肽核酸探针序列过长时溶解性越差，且容易发生聚集，导致杂交效率降低，而本发明作为一个多探针的检测体系，各类探针是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析筛选后得出的，所述捕获探针更是通过引入的肽核酸序列的位置、长度以及助溶基团种类和数量的优化，从而既可以保障捕获探针与靶mRNA结合的高特异性、亲和力和稳定性，同时又能有效解决因肽核酸探针序列过长而导致的探针溶解性降低和容易聚集等问题，使所述捕获探针可以很好地应用于本发明多探针检测体系中，在提高探针杂交亲和力和稳定性的同时又避免了杂交效率的降低。此外，所述助溶基团还可以起到空间间隔的作用以增加特异性P1序列和P2序列之间的空间减少空间位阻，从而进一步提高杂交性能。

本发明所选择的各种探针，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析、多种参数的优化组合而得出的。本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高，从而多种探针的组合使检测试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。

附图说明

图1为本发明EpCAM基因阴性和阳性检测结果示意图。

具体实施方式

本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。

本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

实施例1 EpCAM基因表达检测试剂盒

本实施例所述的EpCAM基因表达检测试剂盒(原位杂交法)，主要包括有：

1.捕获探针

所述捕获探针从5’端到3’端依次是能与待检测目标mRNA结合的特异性P1序列、助溶基团、能与扩增探针P3序列结合的P2序列，针对同一目标mRNA的捕获探针中的P2序列相同；所述特异性P1序列为碱基长度为16～20bp的肽核酸序列；所述助溶基团选自O-linker、E-linker、X-linker中的至少一种；所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1和EpCAM基因mRNA均不存在特异性结合的序列。所述助溶基团可提高捕获探针的溶解性，同时还可将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，减少空间位阻，提高杂交性能。本实施例针对EpCAM基因mRNA捕获探针的助溶基团优选为2个O-linkers，针对ACTB基因mRNA捕获探针的助溶基团与针对EpCAM基因mRNA的捕获探针的助溶基团相同。针对每个mRNA分别设计10条捕获探针，在保证整个检测系统稳定性的基础上，提高检测特异性，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标mRNA捕获探针的特异性P1序列的碱基序列见表1，P2序列的碱基序列见表2。

表1目标mRNA捕获探针P1序列的碱基序列

表2捕获探针P2序列的碱基序列

mRNA	捕获探针P2序列(5’-3’)	SEQ ID NO.
			EpCAM	TAACGTGGCTGCTATGCATGCATG	21
ACTB	CTTCTAGCTGTACGCTGTACGTCT	22

2.扩增探针

扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，从5’端到3’端依次是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列、5个T的间隔臂序列(本发明的扩增探针间隔臂碱基优选为5～10个T，本实施例优选为5个T)、能与标记探针互补配对的P4序列。所述间隔臂为用于将扩增探针的P4序列与捕获探针的P2序列间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。所述目标mRNA的扩增探针的P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合。针对相应的目标mRNA的扩增探针的P3序列的碱基序列见表3，P4序列的碱基序列见表4。

表3扩增探针P3序列的碱基序列

表4扩增探针P4序列的碱基序列

mRNA	扩增探针P4序列(5’-3’)	SEQ ID NO.
			EpCAM	TGACCTGAGTCCTTCGAATTCGGC	25
ACTB	GACGGTGTGCTAAGCTTCCAACTA	26

3.标记探针

标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针P4序列互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LCRED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，不同目标mRNA的标记探针选择的荧光基团互不相同，且选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标mRNA。标记探针的P5序列的碱基序列见表5。

表5标记探针P5序列的碱基序列

mRNA	标记探针P5序列(5’-3’)	SEQ ID NO.
			EpCAM	GCCGAATTCGAAGGACTCAGGTCA	27
ACTB	TAGTTGGAAGCTTAGCACACCGTC	28

本实施例还提供了一种EpCAM基因表达检测方法，主要包括以下步骤：

(1)得到生物样本；

(2)富集待检测细胞；

(4)使用针对检测目标mRNA的捕获探针以及信号放大系统检测EpCAM基因是否表达。

步骤(4)中所述使用针对检测目标mRNA的捕获探针以及信号放大系统检测EpCAM基因mRNA是否存在，包括以下步骤：

a)捕获探针杂交，捕获探针的特异性P1序列与EpCAM基因mRNA序列特异性结合；

b)扩增杂交，捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合，目标mRNA信号放大；

c)显色，扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；

d)通过荧光检测仪检测。

实施例2运用实施例1所述试剂盒对样本进行检测

所述各种溶液的配方如表6：

表6

本实施例优选肿瘤患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞EpCAM基因表达水平进行检测，其中捕获探针混合液、扩增探针混合液、显色探针混合液均使用实施例1所述试剂盒相应列表中的全部探针。

1、抽取患者静脉中血液5ml于真空采血管中，得到血液样本

2、样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上

(1)5ml血液样本转移至含有10ml红细胞裂解液的离心管中，充分震荡混匀10秒，600×g离心5分钟，弃上清液体保留细胞沉淀，用1ml PBS重悬细胞沉淀；

(2)向细胞悬液中加入1ml使用浓度为10mg/ml的免疫磁珠，在混合器上反应15分钟，再在磁力架上静置5分钟，将上清液转移到新的离心管中；

(3)向上清液中补加PBS至4ml，加入1ml固定剂，涡旋混匀，室温静置8分钟，将其转移至含有滤膜的过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体，再加入4ml PBS，洗涤管壁后抽尽液体；

(4)将滤膜转移至24孔板中，加入400μl 4％甲醛溶液，室温固定1小时，再去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。

3、透化处理

(1)在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余液体，将滤膜倒扣在透化剂上，室温孵育5min。

(2)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤2次，每次浸泡2分钟。

4、消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交

(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75μL的PBS、1.25μL的消化酶，总体积50μL。

(2)按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μL。

(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，室温静置1小时。

(4)去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。

5、捕获探针杂交，探针特异性P1序列与目标mRNA序列结合

(1)捕获缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。

(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获工作液组成如下：8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液。按实验需要配制一定体积的捕获工作液，涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。

(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获工作液上，盖上24孔板盖，40±1℃孵育2小时(本实施例捕获探针的杂交时间优选为2小时，可参考实施例4)。

(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。

6、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大

(1)扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟。

(2)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2μl扩增混合液、48μl扩增缓冲液。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。

(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，盖上24孔板盖，40±1℃孵育30分钟。

(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。

7、显色，荧光标记目标信号

(1)显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；整个显色操作过程需避光操作。

(2)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2μl显色混合液、48μl显色缓冲液。按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀。分装至24孔板中，每孔50μl。

(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，盖上板盖，40±1℃避光孵育30分钟。

(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。

8、荧光显微镜观察EpCAM基因的表达

本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。

(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。

(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量。

(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。

(4)然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察并记录实验结果。

(5)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。

显微镜使用通道如下：

表7荧光基团的激发波长和发射波长

荧光基团	激发波长(Excitation filter)	发射波长(Emission filter)
			DAPI	330～385nm	420nm
Alexa Fluor 488	460～495nm	510～550nm
			Cy3	545～580nm	610nm

9、检测结果判断及分析

(1)EpCAM基因表达判定标准

在滤膜上，富集有待检测细胞，本试剂盒阳性表达判定标准(参见图1)：

a)样本中有1个或1个以上细胞表达EpCAM mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。

b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。

本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对EpCAM mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断待检细胞是否表达EpCAM。

(2)使用上述检测方法，对15例肿瘤患者外周血样本(编号1～15)进行检测，同时选用市售EpCAM阳性肺癌细胞株NCl-H1975和阴性表达细胞株CCRF-HSB-2淋巴母细胞分别作为阳性对照和阴性对照。分别各取约1000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为5份编号16～20和21～25，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表8所示：

表8样本检测结果

从上述检测结果可知，各标本的每次检测结果相同，且本发明试剂盒具有很好的特异性和灵敏度，与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针检测体系能对患者CTCs中EpCAM的表达进行精准检测，具有很高的准确率，还能实现临床样本的检测。

实施例3不同类型捕获探针对试剂盒检测效果的影响

为了评估不同类型捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-2，两组除了捕获探针类型不同之外，其它组分均相同。具体设计如表9所示。

表9试剂盒捕获探针的选择

实验组	捕获探针类型
		实验组1	本发明捕获探针
实验组2	传统的线性寡核苷酸探针

采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对10例肿瘤患者血液样本(依次编号为1～10)进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：

表10试剂盒选用不同捕获探针的检测结果比较

从以上检测结果可知，与常规的线性捕获探针(实验组2)相比，本发明设计的捕获探针(实验组1)具有更高的准确度，检测结果与临床检测结果100％吻合。传统的线性寡核苷酸探针对靶mRNA的亲和性和细胞穿透性均不如本发明所述捕获探针，在实施例2所述杂交时间内(2h)难以避免探针分子未能与靶mRNA完全结合而造成特异性荧光信号丢失，导致一些阳性细胞未能被检出，因此传统的线性寡核苷酸探针的灵敏度低于本发明所述捕获探针，甚至导致一些假阴性结果的产生(如3号和6号样本)。此外，传统的线性寡核苷酸探针由于单碱基识别能力不如本发明捕获探针，故存在一些非特异性杂交，导致一些假阳性结果的产生(如5号和9号样本)。本发明设计的捕获探针细胞穿透性和杂交稳定性更好，且识别单碱基的能力强于RNA和DNA，即使是一个碱基的差异也难以结合，因此在更短的检测时间内即可准确地实现检测，能准确高效地检测样本中EpCAM基因的表达情况。

实施例4捕获探针杂交时间对试剂盒检测效果的影响

为了评估捕获探针杂交时间对试剂盒的检测效果的影响，设计实验组1-3和对照组1-3，杂交时间依次设置为1-3小时，实验组1-3选用本发明试剂盒中的捕获探针，对照组1-3选用传统的线性寡核苷酸探针，两组仅捕获探针类型不同。实验组1～3使用实施例1的试剂盒进行检测，对照组1～3使用与实施例1所述试剂盒中的检测探针碱基序列相同，但是捕获探针特异性P1序列没有采用肽核酸序列，对比其检测效果。具体设计如表11所示。

表11试剂盒捕获探针杂交时间的选择

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本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计的试剂盒捕获探针及其杂交时间，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组/对照组每个杂交时间每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：

表12不同捕获探针不同杂交时间的检测结果比较

通过上述检测结果的对比可知，实验组捕获探针杂交时间分别为1小时、2小时和3小时均可完成检测，其特异性和稳定性都很好，同时，与本发明捕获探针杂交1小时相比，杂交时间为2小时或3小时时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果更佳；而对照组捕获探针杂交1小时或2小时均存在大量阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，检出的荧光信号点数也都明显少于三组实验组，只有杂交3小时才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组2、实验组3相差不大；说明本发明捕获探针相较于传统的线性寡核苷酸探针检测效果更佳，可提高杂交效率，实现快速杂交。为保障试剂盒检测结果的准确性的同时节省时间成本，本发明的捕获探针杂交时间优选为2小时。

实施例5捕获探针肽核酸序列设计位置的选择

为考察捕获探针肽核酸序列设计位置的选择对试剂盒检测效果的影响，以EpCAM基因mRNA的捕获探针的肽核酸序列设计位置为例，设计实验组1-2，两组捕获探针的碱基序列与实施例1所述捕获探针相同，但是捕获探针肽核酸序列设计位置分别选用：特异性P1序列、P2序列，且设计为肽核酸序列的碱基数目相同；实验组使用的扩增探针和标记探针均与实施例1相同，对比其检测效果，试剂盒具体设计参见表13。

表13 EpCAM基因mRNA捕获探针肽核酸序列设计位置的选择

实验组	肽核酸序列设计位置
		实验组1	特异性P1序列
实验组2	P2序列

本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约2000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～10和11～20。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～20进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：

表14 EpCAM使用不同肽核酸序列设计位置的捕获探针的检测结果比较

通过上述实验对比可知，针对EpCAM基因的检测，捕获探针的肽核酸序列设计位置选用特异性P1序列可实现准确检测，其检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，特异性和稳定性都很好。当捕获探针的肽核酸序列设计位置选用P2序列时，由于特异性P1序列为非肽核酸序列，导致捕获探针与靶mRNA特异性结合的几率、亲和力和稳定性有所下降，从而影响杂交效率和检测效果，故存在个别阳性细胞漏检的现象，且检测到的荧光信号点数也有所减少。因此，本发明EpCAM基因mRNA的捕获探针的肽核酸序列设计位置选择特异性P1序列。

针对ACTB基因mRNA捕获探针的肽核酸序列设计位置的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。

实施例6捕获探针肽核酸序列碱基长度的选择

为考察捕获探针肽核酸序列碱基长度的选择对试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-5，五组捕获探针肽核酸序列碱基长度分别选用14bp-22bp，对比其检测效果，具体设计参见表15。

表15 EpCAM基因mRNA捕获探针肽核酸序列碱基长度的选择

本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约5000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为25份，依次编号1～25和26～50。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～30进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：

表16 EpCAM使用不同肽核酸序列碱基长度的捕获探针的检测结果比较

通过五组实验对比可知，针对EpCAM基因的检测，捕获探针的肽核酸序列碱基长度选用16～20bp时可实现准确检测，其检测到的荧光信号点数很多，信号很强很稳定，特异性和稳定性都很好。当捕获探针的肽核酸序列碱基长度选用14bp时，由于碱基长度过短，导致捕获探针与非靶mRNA的非特异性结合几率增加，从而影响检测结果的准确性，故存在个别阴性样本被检测为阳性，导致假阳性结果的产生。当捕获探针的肽核酸序列碱基长度选用22bp时，由于碱基长度较长，导致探针溶解性有所降低、发生聚集的几率升高，从而导致杂交效率下降，因此也存在个别阳性细胞漏检的现象，且检测到的荧光信号点数也有所减少。因此，本发明EpCAM基因mRNA的捕获探针的特异性P1序列设计为碱基长度为16～20bp的肽核酸序列，优选特异性P1序列设计为20bp的肽核酸序列(即实施例1所述试剂盒)。

针对ACTB基因mRNA捕获探针的肽核酸序列碱基长度的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。

实施例7捕获探针助溶基团种类的选择

为考察助溶基团种类的选择对试剂盒检测效果的影响，以EpCAM基因mRNA的捕获探针为例，设计实验组1-6，六组除了捕获探针中加入的助溶基团种类不同之外，其它组分均相同，对比其检测效果。试剂盒具体设计参见表17。

表17捕获探针助溶基团种类的选择

实验组	助溶基团种类的选择	实验组	助溶基团种类的选择
				实验组1	无助溶基团	实验组4	2个X-linkers
实验组2	2个O-linkers	实验组5	2个C6M-linkers
				实验组3	2个E-linkers	实验组6	2个C12M-linkers

本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约6000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：

表18捕获探针使用不同种类助溶基团的检测结果比较

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从上述检测结果可知，当捕获探针中加入的助溶基团为本发明优选的O-linker、E-linker和X-linker时，试剂盒检测效果都较好，能将样本中细胞完全检出，尤其是当捕获探针中加入助溶基团O-linker时，检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最好。当选用不加入助溶基团的捕获探针时，由于捕获探针的水溶解性降低，导致捕获探针不容易被细胞吸收，同时，由于捕获探针P2序列与目标mRNA之间没有间隔，导致空间位阻过大，因此降低了杂交反应的效率以及荧光信号强度，使检测效果不稳定，大量阳性细胞不能有效被检出，且检测到的荧光信号明显减少。当选用加入不是本发明优选的助溶基团(C6M-linkers和C12M-linkers)的捕获探针时，试剂盒检测效果较差，均存在一些阳性细胞不能有效被检出，推测造成其检测效果差的原因可能有两点：①其并未有效地提高捕获探针的水溶性；②其在捕获探针P2序列与目标mRNA之间未能发挥合适的、有效的空间间隔作用。因此，选用加入本发明助溶基团(O-linker、E-linker和X-linker)的捕获探针时，试剂盒检测效果达到较好水平，其中，以加入O-linker的捕获探针的试剂盒检测效果最好，而选用不加入助溶基团的捕获探针或选用加入不是本发明优选的助溶基团的捕获探针会降低试剂盒检测性能，影响检测结果的准确性。

针对ACTB基因mRNA捕获探针的助溶基团的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。

鉴于以上实验结果，本发明捕获探针的助溶基团可选自O-linker、E-linker和X-linker，优选为O-linker。

实施例8捕获探针助溶基团数量的选择

为考察助溶基团数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以EpCAM基因mRNA的捕获探针为例，设计实验组1-4，四组除了捕获探针中加入的助溶基团数量不同之外，其它组分均相同，对比其检测效果。试剂盒具体设计参见表19。

表19捕获探针助溶基团数量的选择

实验组	助溶基团数量的选择
		实验组1	1个O-linkers
实验组2	2个O-linkers
		实验组3	3个O-linkers
实验组4	4个O-linkers

本实施例选用市售细胞株NCl-H1975和CCRF-HSB-2进行实验。分别各取约4000个NCl-H1975和CCRF-HSB-2细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色荧光的细胞数量以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果如下：

表20捕获探针使用不同数量助溶基团的检测结果比较

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从上述检测结果可知，当捕获探针中加入助溶基团数量为2～3个时，试剂盒检测效果最好，能将样本中细胞完全检出。当捕获探针中加入助溶基团数量为1个或4个时，试剂盒检测效果较差，均存在一些阳性细胞不能有效被检出，且检测到的荧光信号明显减少，推测造成其检测效果变差的原因可能在于：加入的助溶基团数量过少则不能将捕获探针P2序列与目标mRNA有效间隔开来，导致空间位阻过大，降低了杂交反应的效率，使检测效果不稳定；加入的助溶基团数量过多则导致捕获探针P1序列与P2序列之间间隔过大，也会造成过大的空间位阻，导致杂交反应的效率降低，使检测效果不稳定。因此，选用助溶基团数量为2～3个的本发明捕获探针时，试剂盒检测效果达到最好，而选用助溶基团数量为1个或4个的捕获探针会降低试剂盒性能，影响检测结果的准确性。

针对ACTB基因mRNA捕获探针的助溶基团数量的选择实验结果与上述结果一致，具体数据省略。

鉴于以上实验结果，本发明捕获探针的助溶基团数量为2～3个，为节约经济成本，本发明捕获探针的助溶基团数量优选为2个。

实施例9捕获探针的特异性

以检测EpCAM的捕获探针为例，设计实验组1-2，其中实验组1采用实施例1试剂盒相应列表中的全部探针，实验组2采用P1序列具有1-5个替换碱基的捕获探针，具体设计如表21所示，其它检测组分均与实验组1完全一致。

表21捕获探针P1序列的碱基序列

表22不同捕获探针P1序列的检测结果比较

从上述检测结果可知，当实验组2的捕获探针特异性P1序列与EpCAM基因mRNA不能完全互补配对时，在EpCAM阳性表达细胞株NCl-H1975中基本检测不到荧光信号，不能实现检测，说明本发明提供的捕获探针具有很高的特异性，当捕获探针P2序列与扩增探针P3序列完全匹配，但肽核酸序列设计的特异性P1序列不能与mRNA完全匹配时，捕获探针因其肽核酸序列较强的单碱基识别能力而与其不能完全匹配的mRNA之间无法成功杂交，导致mRNA不能通过捕获探针与信号放大系统相连，从而不产生荧光信号，无法实现检测。同理，当实验组1的捕获探针遇上非EpCAM基因的mRNA时，亦不会产生非特异性杂交，即只要序列与EpCAM基因的mRNA存在1个或以上碱基的差异，都不能使肽核酸捕获探针与之杂交，不会产生荧光信号。因此，本发明提供的捕获探针具有很高的特异性，保证了检测结果的准确性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 益善生物技术股份有限公司

<120> 一种EpCAM基因表达检测试剂盒

<130> 2020-07-13

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

gacacattct tcctgagctg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tgcaccaact gaagtacact 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

agcccatcat tgttctggag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gtgttcacac accagcacat 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tagttcaatg atgatccagt 20

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<212> DNA

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<400> 6

ttggatccag ttgataacgc 20

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<400> 7

atcagctatg tccacatcat 20

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caggatccag atccagttgt 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

accacaacca caataacagc 20

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<213> Artificial Sequence

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tgcattgagt tccctatgca 20

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<213> Artificial Sequence

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ggtgaggatg cctctcttgc 20

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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gtagaaggtg tggtgccaga 20

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catgatctgg gtcatcttct 20

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gtacagggat agcacagcct 20

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attgccaatg gtgatgacct 20

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<213> Artificial Sequence

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tgatctcctt ctgcatcctg 20

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gagcaatgat cttgatcttc 20

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taacgtggct gctatgcatg catg 24

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<213> Artificial Sequence

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cttctagctg tacgctgtac gtct 24

<210> 23

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<213> Artificial Sequence

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catgcatgca tagcagccac gtta 24

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<213> Artificial Sequence

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<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

tagttggaag cttagcacac cgtc 24

Claims

1.一种EpCAM基因表达检测试剂盒，其特征在于，包括针对检测EpCAM基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，所述捕获探针用于连接EpCAM基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：能与待检测EpCAM基因mRNA结合的特异性P1序列、助溶基团、P2序列；所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；

所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团；

针对EpCAM 基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列的碱基序列为SEQ ID NO.1～SEQID NO.10，P2序列的碱基序列为SEQ ID NO.21；

针对EpCAM基因mRNA的扩增探针中，P3序列的碱基序列为SEQ ID NO.23，P4序列的碱基序列为SEQ ID NO.25；

针对EpCAM基因mRNA的标记探针中，P5序列的碱基序列为SEQ ID NO.27；

所述助溶基团为2~3个O-linkers。

2.根据权利要求1所述的EpCAM基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述信号放大系统包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针；其中，所述捕获探针用于连接内参基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的组成依次为：能与待检测内参基因mRNA结合的特异性P1序列、助溶基团、P2序列；所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的组成依次为：能与捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；

所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，所述荧光基团与针对EpCAM基因mRNA的标记探针的末端修饰的荧光基团互不相同；

所述内参基因为ACTB基因；所述ACTB基因mRNA的捕获探针中，特异性P1序列的碱基序列为SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20，助溶基团为2～3个O-linkers，P2序列的碱基序列为SEQ ID NO.22；针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P3序列的碱基序列为SEQ ID NO.24，P4序列的碱基序列为SEQ ID NO.26；针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P5序列的碱基序列为SEQID NO.28。

3.根据权利要求1~2任一项所述的EpCAM基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的碱基长度为5～10个。

4.根据权利要求3所述的EpCAM基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列的碱基为5～10个T。

5.根据权利要求1~2任一项所述的EpCAM基因表达检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750。

6.一种非疾病诊断目的的EpCAM基因表达检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）得到生物样本；

（2）富集待检测细胞；

（3）对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；

（4）使用权利要求1~5任一项所述试剂盒检测EpCAM基因是否表达：a）捕获探针杂交，捕获探针的特异性P1序列与EpCAM基因mRNA序列特异性结合；b）扩增杂交，捕获探针的P2序列与扩增探针的P3序列特异性结合，EpCAM基因mRNA序列信号放大；c）显色，扩增探针的P4序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P5序列特异性结合，荧光标记目标信号；d）通过荧光检测仪检测。

7.根据权利要求6所述的非疾病诊断目的的EpCAM基因表达检测方法，其特征在于，所述步骤（4）中捕获探针杂交的条件为：40±1℃孵育1.5~2小时。