CN115992227A - 一种Hepatocyte检测试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，包括针对CPS1基因mRNA的捕获探针和信号放大系统，通过对捕获探针组成结构的设计，将捕获探针设计为双探针体系并引入HNA序列修饰，从而保障了捕获探针杂交的高灵敏度、高特异性、高效率和高稳定性，使得本发明试剂盒中的捕获探针可很好地应用于本发明探针检测体系中，在提高检测灵敏度、特异性和稳定性的同时缩短检测时长；通过在信号放大系统中的扩增探针5’端和3’端引入多组P5序列的优化以及在标记探针中引入PNA序列修饰，使得本发明试剂盒中的信号放大系统具有更高效的信号放大功能，在提高检测的信噪比和准确率的同时还可进一步缩短检测时长。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种Hepatocyte检测试剂盒及其制备方法与应用。
背景技术
Hepatocyte，即肝细胞特异性抗原(hepatocyte-specific antigen)，其抗体名为肝细胞石蜡1(Hepatocyte paraffin 1，HepPar 1)，是1993年Wennerberg等从常规福尔马林固定石蜡包埋的肝移植失败的肝组织中获得的一种能与正常肝细胞和肿瘤性肝细胞反应的单克隆抗体。2008年Butler等证明了HepPar 1的抗原是肝细胞线粒体中一种名为氨甲酰磷酸合成酶1(CPS1)的尿素循环限速酶。由此可见，Hepatocyte实际上为CPS1。
Hepatocyte是肝细胞癌(HCC)诊断和预后的一个重要标志物。研究发现，在正常肝组织细胞和大部分HCC中，HepPar 1抗体均为阳性，但在其他正常成人组织(如皮肤、平滑肌、骨骼肌、间皮膜、淋巴结、脾脏、肺、乳房、食道、胃、肠、胰腺、肾脏等)和其他多种成人恶性肿瘤(如胆系肿瘤、乳腺癌、结肠癌、食管癌、肺癌、卵巢癌等)中，HepPar 1抗体多为阴性(WennerbergAE et al.,Am J Pathol,1993,143,1050-1054)。该研究表明，Hepatocyte在正常肝组织和大多数HCC中表达，在其他正常成人组织和恶性肿瘤中不表达或较少表达，提示Hepatocyte或可用于肝细胞源性肿瘤的鉴别诊断。在文献中，Hepatocyte在HCC的鉴别诊断中的敏感性为54.7％～96％，特异性为98.1％～100％；其中，Hepatocyte鉴别HCC与转移性腺癌的敏感性和特异性分别为95.6％和98.1％(KaraborkA et al.,Pathol Res Pract,2010,206:572-577)。此外，有研究报道，HepPar 1表达与HCC TNM分期负相关，HepPar 1高表达与HCC患者较好的总生存率、较好的无复发生存率相关(Jin Y et al.,J InvestSurg.2018,31:412-419)。该研究表明，Hepatocyte高表达预示着HCC患者预后较好。
在循环肿瘤细胞(CTCs)的研究中，Hepatocyte常被作为HCC CTCs标志物，用于HCCCTCs的鉴定。研究发现，联合HepPar 1抗体或CPS1抗体的免疫荧光染色法可提高检测HCCCTCs的敏感性和特异性(Liu HY et al.,World J Gastroenterol,2015,21:2918-2925)，该方法检出的CTCs阳性率和数量与HCC肿瘤大小、门静脉癌栓、分化程度及根据TNM分期和Milan分级划分的疾病程度显著相关(XuW et al.,Clin Cancer Res,2011,17:3783-3793)。
目前文献报道的用于Hepatocyte检测的方法主要包括免疫组化和免疫荧光染色。上述两种方法均是通过HepPar 1抗体或CPS1抗体以实现在蛋白水平上检测Hepatocyte的表达，但是上述方法在实际应用中存在一定的不足，如：检测过程不涉及信号放大过程，在一定程度上限制了检测的灵敏度和准确性；结果判读的主观性太强。此外，实时定量PCR是通过检测CPS1基因mRNA表达水平以实现在基因水平上检测Hepatocyte的表达，该方法具有灵敏度高、序列特异性强等优点；但是，实时定量PCR过程对环境和操作要求高，且必须严防污染，否则难以保证检测结果的准确性和可靠性。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种检测特异性高的Hepatocyte检测试剂盒。
包括如下技术方案：
一种Hepatocyte检测试剂盒，其包括针对CPS1基因mRNA的捕获探针和信号放大系统，其中，所述捕获探针采用双探针捕获系统，包括捕获探针CP1和捕获探针CP2，所述捕获探针CP1从5’端到3’端的组成依次为：P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述捕获探针CP2从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P1、P4序列长度为10～14bp；所述P2、P3序列为长度16～20bp，且与目标mRNA特异性结合；
所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针，所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，其从5’端到3’端的组成依次为：P5’序列、间隔臂序列、P6序列、间隔臂序列、P7序列、间隔臂序列、P5”序列；所述P5’序列为n1组P5序列顺次连接，n1为0-10的整数，所述P5序列为长度为18～22bp，所述P5”序列为n2组P5序列顺次连接，n2为0-10的整数，所述P5序列为长度为18～22bp；所述P6序列与P4序列互补配对；所述P7序列与P1序列互补配对；所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，其从5’端到3’端的组成依次为：P8序列、荧光基团；所述P8序列与P5序列互补配对；
所述捕获探针和/或标记探针采用己糖醇核酸修饰。
本发明的目的之一还在于提供上述Hepatocyte检测试剂盒在检测、分类、预测、治疗监测、预后或其它评价肝细胞癌中的应用。
本发明的目的之一还在于提供一种非疾病诊断目的Hepatocyte检测方法。
包括如下技术方案：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用上述试剂盒检测待检测细胞中CPS1基因mRNA是否存在。
本发明的发明人基于对荧光原位杂交技术和Hepatocyte(肝细胞特异性抗原，hepatocyte-specific antigen)的深入研究，研制了一种用于CPS1基因mRNA原位检测试剂盒，其包括针对CPS1基因特异性设计的捕获探针、扩增探针以及标记探针等多种探针。发明人发现，通过对捕获探针组成结构的设计，将捕获探针设计为双探针体系并引入HNA序列修饰，从而保障了捕获探针杂交的高灵敏度、高特异性、高效率和高稳定性，使得本发明试剂盒中的捕获探针可很好地应用于本发明探针检测体系中，在提高检测灵敏度、特异性和稳定性的同时缩短检测时长；通过在信号放大系统中的扩增探针5’端和3’端引入多组P5序列的优化以及在标记探针中引入PNA序列修饰，使得本发明试剂盒中的信号放大系统具有更高效的信号放大功能，在提高检测的信噪比和准确率的同时还可进一步缩短检测时长。
发明人在本发明中设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合，所设计的探针在检测中灵敏度高、特异性好、信噪比高，从而使得包括本发明探针组合的检测试剂盒和检测方法形成一个效果完备的检测体系，从而实现针对Hepatocyte的灵敏、特异、准确检测，将有助于深入研究Hepatocyte表达在HCC发生发展中的重要作用及其在HCC诊断、预后和治疗方面的临床意义，并将为HCC诊断、预后和治疗提供有用的临床辅助信息。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测Hepatocyte的示意图，其中A为本发明目标mRNA-捕获探针-扩增探针-标记探针杂交复合物示意图，B为本发明Hepatocyte阴性和Hepatocyte阳性检测结果示意图；
图2为实施例3中本发明捕获探针(双探针系统)与常规组成结构的捕获探针(单探针系统1、2和单探针系统组合)的检测结果比较示意图；
图3为本发明试剂盒检测肝细胞癌的ROC曲线图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。实施例中所涉及到的所有探针均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
本发明的一些实施例提供了一种Hepatocyte检测试剂盒，其包括针对CPS1基因mRNA的捕获探针和信号放大系统，其中，所述捕获探针采用双探针捕获系统，包括捕获探针CP1和捕获探针CP2，所述捕获探针CP1从5’端到3’端的组成依次为：P1序列、间隔臂序列、P2序列；所述捕获探针CP2从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；
所述P1序列和所述P4序列均为长度为10～14bp，不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P2序列、P3序列和目标mRNA之间均不存在特异性结合；所述P2、P3序列为长度16～20bp，且与目标mRNA特异性结合；
所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针，所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，其从5’端到3’端的组成依次为：P5’序列、间隔臂序列、P6序列、间隔臂序列、P7序列、间隔臂序列、P5”序列；所述P5’序列为n1组P5序列顺次连接，n1为0-10的整数，所述P5”序列为n2组P5序列顺次连接，n2为0-10的整数，所述P5序列为长度为18～22bp，所述P5序列为长度为18～22bp，且不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3、P4和目标mRNA之间均不存在特异性结合的核酸序列；所述P6序列与P4序列互补配对；所述P7序列与P1序列互补配对；所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，其从5’端到3’端的组成依次为：P8序列、荧光基团；所述P8序列与P5序列互补配对；所述捕获探针和/或标记探针采用己糖醇核酸修饰。
在其中的一些实施例中，上述捕获探针进行杂交反应时，只有当捕获探针CP1特异性P2序列、捕获探针CP2特异性P3序列同时特异性结合目标基因mRNA序列时，才能与信号放大系统特异地、稳定地结合，使目标mRNA带上荧光，实现检测；若捕获探针CP1和CP2中有一探针结合上非特异性序列，随后结合上的扩增探针因无法与该捕获探针稳定结合而容易在洗涤步骤被洗掉，后续也就无法结合标记探针，不能形成荧光信号。因此，捕获探针的双探针系统的设计极大地降低了非特异性荧光信号的产生，降低了背景信号，荧光信号特异性更高，信噪比更高。
在其中的一些实施例中，上述捕获探针和标记探针采用己糖醇核酸修饰，所述捕获探针P1、P2、P3、P4序列和标记探针P8序列均为己糖醇核酸序列。将捕获探针各序列设计为HNA序列，使得所述捕获探针具有更高的杂交亲和力、杂交稳定性和单碱基错配识别能力。因此，在杂交时，不仅可提高捕获探针与目标mRNA、扩增探针特异性结合的亲和力和稳定性，提高杂交效率和检测灵敏度，缩短捕获探针与目标mRNA、扩增探针完全杂交所需时间，使得所述捕获探针能在更短的杂交时间内仍然能保证充分和准确的杂交，而且还可减少单碱基错配的发生，降低非特异性结合几率，提高检测特异性，从而进一步提高检测的准确性。同时将标记探针的P8序列设计为HNA序列，从而具有核酸酶抗性(例如，RNA酶H、DNA酶、5’-3’核酸外切酶或3’-5’核酸外切酶抗性)，相对于等同的未修饰P8序列可以对其mRNA靶具有提高的结合亲和力，使得所述标记探针具有更高的杂交亲和力、杂交稳定性和单碱基错配识别能力。
在其中的一些实施例中，上述扩增探针中P5’序列中的P5序列组数n1为3～10的整数；上述扩增探针中P5”序列中的P5序列组数n1为3～10的整数。从而使得扩增探针5’端和3’端均包含多组P5序列，在显色杂交时所述扩增探针5’端和3’端均可与多条带有荧光基团的标记探针特异性结合，使得所述扩增探针与标记探针结合几率更高、信号放大能力更佳。
在其中的一些实施例中，上述扩增探针中P5’序列中的P5序列组数n1为3～7的整数，进一步优选为，n1为5。
在其中的一些实施例中，上述扩增探针中P5”序列中的P5序列组数n2为3～7的整数，进一步优选为，n2为5。
在其中的一些实施例中，上述所述捕获探针CP1和CP2中，P2序列和P3序列分别靶向CPS1基因mRNA的两个相邻的检测靶区，两个相邻的检测靶区之间存在2～5个碱基的间隔。
在其中的一些实施例中，上述捕获探针CP1中，P1序列为SEQ ID NO.1或其完全互补序列，P2序列选自SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.12以及SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.12的完全互补序列中的任意至少3条；所述捕获探针CP2中，P4序列为SEQ ID NO.43或其完全互补序列，P3序列选自SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32以及SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32的完全互补序列中的任意至少3条。
在其中的一些实施例中，上述捕获探针CP1中，P2序列选自SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.12以及SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.12的完全互补序列中的任意至少5条；所述捕获探针CP2中，P3序列选自SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32以及SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32的完全互补序列中的任意至少5条。
在其中的一些实施例中，上述捕获探针CP1中，P2序列选自SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.12以及SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.12的完全互补序列中的任意至少7条；所述捕获探针CP2中，P3序列选自SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32以及SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32的完全互补序列中的任意至少7条。
在其中的一些实施例中，上述捕获探针CP1中，P2序列为SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.12或SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.12的完全互补序列；所述捕获探针CP2中，P3序列为SEQID NO.23～SEQ ID NO.32或SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32的完全互补序列。
在其中的一些实施例中，上述扩增探针中，P5序列为SEQ ID NO.45或其完全互补序列，P6序列为SEQ ID NO.47或其完全互补序列，P7序列为SEQ ID NO.49或其完全互补序列；所述标记探针中，P8序列为SEQ ID NO.51或其完全互补序列，荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、AlexaFluor488和AlexaFluor 750。
在其中的一些实施例中，上述间隔臂序列的碱基长度为5～10个；优选地，所述间隔臂序列的碱基为5～10个T，进一步优选为5个T。通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，具体为采用间隔臂序列将P1序列/P4序列与目标mRNA间隔开来，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。
在其中的一些实施例中，上述Hepatocyte检测试剂盒还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统。
在其中的一些实施例中，上述内参基因为ACTB。
在其中的一些实施例中，上述针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP1中，P1序列为SEQID NO.2或其完全互补序列，P2序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22的完全互补序列中的任意至少3条；针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP2中，P3序列选自SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.42以及SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.42的完全互补序列中的任意至少3条，P4序列为SEQ ID NO.44或其完全互补序列。
在其中的一些实施例中，上述针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP1中，P2序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22的完全互补序列中的任意至少5条；针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP2中，P3序列选自SEQ ID NO.33～SEQ IDNO.42以及SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.42的完全互补序列中的任意至少5条。
在其中的一些实施例中，上述针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP1中，P2序列为SEQID NO.13～SEQ ID NO.22或SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22的完全互补序列；针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP2中，P3序列为SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.42或SEQ ID NO.33～SEQ IDNO.42的完全互补序列。
在其中的一些实施例中，上述针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQ IDNO.46或其完全互补序列，P6序列为SEQ ID NO.48或其完全互补序列，P7序列为SEQ IDNO.50或其完全互补序列。
在其中的一些实施例中，上述针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P8序列为SEQ IDNO.52或其完全互补序列，荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LCRED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和AlexaFluor 750，且与CPS1基因标记探针所带荧光基团不同。
本发明的一些实施例提供了上述Hepatocyte检测试剂盒在检测、分类、预测、治疗监测、预后或其它评价肝细胞癌中的应用。
本发明的一些实施例还提供了一种非疾病诊断目的Hepatocyte检测方法。
包括如下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用上述试剂盒检测待检测细胞中CPS1基因mRNA是否存在。
在其中的一些实施例中，上述步骤(1)的生物样本包括但并不局限于以下来源：人或动物的外周循环血、脐带血、活检样本、骨髓、培养的人或动物细胞等。
在其中一些实施例中，上述检测方法中步骤(4)包括如下：
a)捕获探针杂交，捕获探针CP1特异性P2序列、捕获探针CP2特异性P3序列同时与目标基因mRNA序列特异性结合；
b)扩增杂交，捕获探针CP1的P1序列和捕获探针CP2的P4序列分别与扩增探针P7序列、P6序列特异性结合，目标mRNA序列信号放大；
c)显色，扩增探针的P5序列与带有荧光基团修饰的标记探针的P8序列特异性结合，荧光标记目标信号；
d)通过荧光检测仪检测。
在其中一些实施例中，上述检测方法中步骤(4)所述捕获探针杂交时间为2小时。
在其中一些实施例中，上述检测方法中步骤(4)所述扩增杂交时间为15分钟。
在其中一些实施例中，上述检测方法中步骤(4)所述显色杂交时间为15分钟。
实施例1 Hepatocyte检测试剂盒的组成
本发明Hepatocyte检测试剂盒，包括针对检测Hepatocyte目标mRNA的捕获探针以及信号放大系统；其中，Hepatocyte目标mRNA为CPS1基因mRNA，信号放大系统包括扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，具体如下：
1.捕获探针
针对每个mRNA分别设计10条捕获探针CP1和CP2，在保证整个检测系统的稳定性的基础上，再提高检测的特异性(具体使用时，针对每个目标基因，选择3条或3条以上捕获探针CP1和CP2即可完成检测，特异性和稳定性都很好)；本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应目标mRNA的捕获探针CP1的P1序列见表1，特异性P2序列及对应捕获探针CP2的特异性P3序列见表2，P4序列见表3。Hepatocyte目标mRNA为CPS1基因mRNA。
表1捕获探针CP1的P1序列
| mRNA | P1序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CPS1 | CTTAACTGATCG | 1 |
| ACTB | ACGACTGGTCAA | 2 |
表2捕获探针CP1特异性P2序列和捕获探针CP2特异性P3序列
表3捕获探针CP2的P4序列
| mRNA | P4序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CPS1 | GCTTAGCAAAGC | 43 |
| ACTB | AACTGATCGTAC | 44 |
2.扩增探针
针对相应的目标mRNA的扩增探针的P5序列见表4，P6序列见表5，P7序列见表6。
表4扩增探针的P5序列
| mRNA | P5序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CPS1 | CACTCAATGCAATCCTGCCT | 45 |
| ACTB | GAAGTGTACAATTCTACGGC | 46 |
表5扩增探针的P6序列
| mRNA | P6序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CPS1 | GCTTTGCTAAGC | 47 |
| ACTB | GTACGATCAGTT | 48 |
表6扩增探针的P7序列
| mRNA | P7序列(5’-3’) | SEQ ID NO. |
| CPS1 | CGATCAGTTAAG | 49 |
| ACTB | TTGACCAGTCGT | 50 |
3.标记探针
针对相应的目标mRNA的标记探针的P8序列见表7。
表7标记探针的P8序列
| mRNA | P8序列(5’-3’) | SEQ ID NO. | 荧光基团 |
| CPS1 | AGGATTGCATTGAGTG | 51 | Alexa Fluor 488(绿色荧光信号) |
| ACTB | TAGAATTGTACACTTC | 52 | Cy3(红色荧光信号) |
实施例2 Hepatocyte检测试剂盒的检测
本发明Hepatocyte检测试剂盒在检测时涉及到的各种溶液的配方如下表8所示：
表8各种溶液的配方
本实施例优选肝细胞癌患者血液样本，对样本中循环肿瘤细胞Hepatocyte进行检测，其中捕获混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1所述相应列表中的全部探针。
1.抽取患者静脉中血液5ml于真空采血管中，得到血液样本。
2.样本前处理，待检测细胞过滤至滤膜上。
(1)收集待检测细胞悬液，600×g水平离心5分钟，弃上清；(2)加入4ml PBS和1ml固定剂，涡旋混匀，室温静置8分钟；(3)样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4ml PBS，洗涤管壁后抽滤液体；(4)将滤膜转移至24孔板中，加入400μl的4％甲醛溶液，室温固定1小时；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
3.透化处理。
(1)在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体，室温孵育5分钟；(2)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤2次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
4.消化细胞，暴露mRNA，使其便于与探针杂交。
(1)配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成为48.75μlPBS、1.25μl消化酶，总体积50μl；(2)按实验需要配制适量消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在，室温静置1小时；(4)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
5.捕获探针杂交，探针特异性P2序列、特异性P3序列与目标mRNA序列结合。
(1)捕获缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；(2)配制捕获工作液：对于每个样本，捕获工作液组成为8μl捕获混合液、42μl捕获缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按实验需要配制适量捕获工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中捕获工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(4)盖上24孔板盖，40±1℃孵育2小时(本实施例捕获杂交时间优选2小时，可参考实施例4)；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
6.扩增杂交，目标mRNA序列信号放大。
(1)扩增缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟；(2)配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成为2μl扩增混合液、48μl扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按需配制适量扩增工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(4)盖上24孔板盖，40±1℃孵育15分钟(本实施例扩增杂交时间优选15分钟，可参考实施例4)；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
7.显色，荧光标记目标信号。
(1)显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20分钟，整个显色操作过程需避光操作；(2)配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成为2μl显色混合液、48μl显色缓冲液(40℃预热)，总体积50μl，按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl；(3)将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在；(4)盖上24孔板盖，40±1℃避光孵育15分钟(本实施例显色杂交时间优选为15分钟，可参考实施例5)；(5)去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤3次，每次浸泡2分钟。
8.荧光显微镜观察Hepatocyte表达情况。
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发生蓝色荧光信号。
(1)将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于－20℃保存；(2)通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量；(3)根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果；(4)重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表9荧光基团的激发波长和发射波长
| 荧光基团 | 激发波长(Excitation filter) | 发射波长(Emission filter) |
| DAPI | 330～385nm | 420nm |
| Alexa Fluor 488 | 460～495nm | 510～550nm |
| Cy3 | 545～580nm | 610nm |
9.检测结果判断及分析
(1)Hepatocyte表达判定标准(即本试剂盒阳性表达判定标准，参见图1B)。
a)样本中有1个或1个以上细胞表达Hepatocyte目标mRNA，在本试剂盒中表现为样本中有1个或1个以上细胞在Alexa Fluor 488通道下能够显示绿色荧光信号点。
b)样本中所有细胞均表达内参基因mRNA，在本试剂盒中表现为样本中所有细胞在Cy3通道下均显示红色荧光信号点。
本发明所述试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对Hepatocyte目标mRNA和内参基因mRNA，通过荧光信号的表达，判断检测的细胞是否表达Hepatocyte。
(2)使用上述检测方法，对10例肝细胞癌患者外周血样本(编号1～10，样本来源：广州益善医学检验所)进行检测，同时选用市售Hepatocyte阳性肝癌细胞株HepG2和阴性表达的结肠癌细胞株SW480分别作为阳性对照和阴性对照。分别各取1000个HepG2和SW480细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份编号10～15和16～20，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在绿色阳性、红色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。每个标本重复检测三次。具体结果如表10所示：
表10样本检测结果
注：为便于结果统计及后续结果处理及判读，计算得到的每个细胞平均荧光数均为四舍五入至整数而得到，下同。
检测发现，针对不同患者样本，其临床检测结果与本发明试剂盒检测结果均一致；针对不同细胞待检样本，其每次检测结果均相同，且从上述检测结果可知，本发明所述肝细胞Hepatocyte检测试剂盒具有良好特异性和灵敏度，能实现临床样本检测。本发明试剂盒与临床检测结果具有100％的吻合率，说明本发明试剂盒设计的探针组成的检测体系能对肝癌患者循环肿瘤细胞中Hepatocyte的表达进行精准检测，具有很高的准确率。
实施例3捕获探针组成结构对试剂盒检测效果的影响
1.试剂盒制备的设计(不同组成结构捕获探针设计)
为了评估不同组成结构捕获探针组成的试剂盒的检测效果，设计实验组1-4，两组除了捕获探针组成结构不同之外，其它组分均相同。具体设计如表11所示。
表11试剂盒捕获探针的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株HepG2和SW480进行实验。分别各取4000个HepG2和SW480细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为10份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见图2和表12。
表12试剂盒选用不同组成结构的捕获探针的检测结果比较
检测结果显示，当使用组成结构为双探针系统的本发明捕获探针时，杂交效率较好，荧光信号明亮清晰，信号点丰度较高(见图2实验组1)，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数很多(见上表实验组1)，信号很强很稳定，其检测灵敏度和特异性都很好，能实现准确检测；而单探针系统1或2的常规组成结构的捕获探针检测到的荧光信号点数相比本发明捕获探针有所减少(见图2和上表实验组2、3)，且其特异性不如本发明捕获探针，故存在一些背景信号和非特异性荧光信号(见图2实验组2、3)，甚至导致个别假阳性结果(如29、32号样本)；单探针系统1和2组合而成的常规组成结构的捕获探针检测到的荧光信号点数虽然与本发明捕获探针相当，但其特异性也不如本发明捕获探针(见图2实验组4)，也存在一些背景信号和非特异性荧光信号(见图2实验组4)，导致假阳性结果(如38、40号样本)。以上说明本发明捕获探针能更好地应用于本发明探针检测体系中，更具检测特异性，可有效降低非特异性荧光信号，降低背景信号，荧光信号特异性更高，信噪比更高，更能保障检测结果的准确性。
实施例4 HNA序列的引入对捕获探针使用效果的影响
1.试剂盒制备的设计(捕获探针序列类型和杂交时间的设计)
为了评估HNA序列的引入对捕获探针使用效果及试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-4和对照组1-4，各组除了捕获探针序列类型、捕获和/或扩增杂交时间不同之外，其它组分均相同，其它检测过程和方法均相同。具体设计如表13所示。
表13捕获探针序列类型和杂交时间的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株HepG2和SW480进行实验。分别各取8000个HepG2和SW480细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为40份，依次编号1～40和41～80。采用上述设计制备的试剂盒及其捕获、扩增杂交时间，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～80进行检测，每个分组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见表14。
表14不同序列类型捕获探针不同杂交时间的检测结果比较
从以上检测结果可知，实验组本发明捕获探针在捕获杂交2小时或3小时、扩增杂交15分钟或30分钟的条件下均可实现准确检测，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数都很多，信号很强很稳定，其特异性和稳定性都很好，检测效果很好，而对照组不引入HNA序列的常规核酸序列捕获探针在捕获杂交2小时和/或扩增杂交15分钟的条件下均存在一些阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，且检出的荧光信号点数也都明显减少，只有捕获杂交3小时再扩增杂交30分钟才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组相差不大；说明HNA序列的引入使得本发明捕获探针相较于常规核酸序列捕获探针检测效果更佳，可在保障检测特异性的同时提高杂交效率和检测灵敏度，缩短杂交时间。基于上述实验结果，本发明试剂盒捕获杂交时间优选为2小时，扩增杂交时间优选为15分钟。
针对Hepatocyte检测的捕获探针的HNA序列引入位置的选择(如：本发明捕获探针vs.仅P1序列为HNA序列、本发明捕获探针vs.仅P2序列为HNA序列，等)实验结果与上述实验结果一致，具体数据省略。
实施例5 HNA序列的引入对标记探针使用效果的影响
1.试剂盒制备的设计(标记探针序列类型和杂交时间的设计)
为了评估HNA序列的引入对标记探针使用效果及试剂盒检测效果的影响，设计实验组1-2和对照组1-2，各组除了标记探针序列类型、显色杂交时间不同之外，其它组分均相同，其它检测过程和方法均相同。具体设计如表15所示。
表15标记探针序列类型和显色杂交时间的选择
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株HepG2和SW480进行实验。分别各取4000个HepG2和SW480细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为20份，依次编号1～20和21～40。采用上述设计制备的试剂盒及其显色杂交时间，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～40进行检测，每个分组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见表16。
表16不同序列类型标记探针不同显色杂交时间的检测结果比较
从以上检测结果可知，实验组本发明标记探针显色杂交15分钟或或30分钟均可实现准确检测，所有阳性细胞都能被检出，检测到的荧光信号点数都很多，信号很强很稳定，其特异性和稳定性都很好，检测效果很好，而对照组不引入HNA序列的常规核酸序列标记探针显色杂交15分钟时均存在个别阳性细胞漏检的现象，无法完成准确检测，且检出的荧光信号点数也相对较低，只有显色杂交30分钟才能实现准确检测，其检出的细胞数和荧光信号点数与实验组相当；说明HNA序列的引入使得本发明标记探针相较于常规核酸序列标记探针检测效果更佳，可提高显色杂交效率，缩短显色杂交时间。基于上述实验结果，本发明试剂盒显色杂交时间优选为15分钟。
实施例6扩增探针P5序列组数的选择
1.试剂盒制备的设计(P5序列组数的选择)
为了考察扩增探针P5序列组数的选择对试剂盒检测效果的影响，以扩增探针5’端(5’序列)的P5序列为例，设计实验组1-6，各组除了扩增探针5’端(5’序列)的P5序列组数不同之外，扩增探针3’端(5”序列)的P5序列组数均相同，其它组分也均相同。具体设计如表17所示。
表17扩增探针5’端的P5序列组数的选择
| 实验组 | 实验组1 | 实验组2 | 实验组3 | 实验组4 | 实验组5 | 实验组6 |
| 5’端P5序列组数 | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 10 |
| 3’端P5序列组数 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
2.样本检测
本实施例选用市售细胞株HepG2和SW480进行实验。分别各取6000个HepG2和SW480细胞(通过细胞计数器确定)，混匀后将样本各均分为30份，依次编号1～30和31～60。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本1～60进行检测，每个实验组每种细胞株的样本各检5份，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达绿色/红色荧光的细胞数以及平均荧光点数，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果见表18。
表18 5’端不同组数P5序列组成的扩增探针的检测结果比较
从以上检测结果可知，使用5’端P5序列组数为1～10组的扩增探针均可实现准确检测，其检测到的荧光信号点数很多，信号很强很稳定，试剂盒检测效果很好，其中，当使用5’端(5’序列)P5序列组数为3～7组的扩增探针时，其检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，试剂盒检测效果更佳；当扩增探针5’端P5序列组数为0时，由于扩增探针仅3’端含有P5序列，其信号放大能力有限，导致荧光信号放大效果变差，使试剂盒检测效果不稳定，个别阳性细胞不能有效被检出。因此，本发明扩增探针中5’端P5序列组数优选为3～7组。
针对Hepatocyte检测的扩增探针3’端(5”序列)的P5序列组数的选择实验结果与上述实验结果一致，具体数据省略。
鉴于以上实验结果，本发明扩增探针中5’端和3’端P5序列组数优选为3～7组；为保障试剂盒检测结果的准确性同时节省探针合成成本，本发明扩增探针中5’端(5’序列)和3’端(5”序列)P5序列的组数优选为5组。
实施例7本发明试剂盒检测肝细胞癌的灵敏度和特异性
1.试剂盒制备的设计
为了考察本发明试剂盒检测肝细胞癌的灵敏度和特异性，按照实施例1设计制备本发明试剂盒，以用于临床样本检测。
2.样本检测
本实施例选用100例外周血临床样本(样本来源：广州益善医学检验所)进行实验，其中，5例来自健康者，7例来自肺癌患者，8例来自乳腺癌患者，9例来自结肠癌患者，9例来自胃癌患者，11例来自胆管癌患者(肝内胆管癌)，51例来自肝细胞癌患者。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对上述100例样本进行检测，以临床病理诊断结果为参照，计算本发明试剂盒检测肝细胞癌的灵敏度、特异性和符合率。具体结果见图3和表19。
表19 100例外周血临床样本检测结果汇总
从上表检测结果可知，本发明试剂盒在健康者和非肝细胞癌患者临床样本中共检出48例Hepatocyte阴性结果和1例Hepatocyte阳性结果，在肝细胞患者临床样本中共检出8例Hepatocyte阴性结果和43例Hepatocyte阳性结果，其检测肝细胞癌的灵敏度为84.3％，特异性为98.0％，符合率为91％；从图3可知，本发明试剂盒检测肝细胞癌的曲线下面积为0.911。以上说明本发明试剂盒在检测肝细胞癌方面具有一定诊断价值，对比肝癌患者中胆管癌患者和肝小细胞癌患者的检测数据可知，本发明试剂盒还可进一步地为区分肝癌中的肝细胞癌提供辅助信息。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 一种Hepatocyte检测试剂盒及其制备方法与应用
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
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<213> Artificial Sequence
<400> 1
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Claims (10)
1.一种Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，包括针对CPS1基因mRNA的捕获探针和信号放大系统，其中，
所述捕获探针采用双探针捕获系统，包括捕获探针CP1和捕获探针CP2，
所述捕获探针CP1从5’端到3’端的组成依次为：P1序列、间隔臂序列、P2序列；
所述捕获探针CP2从5’端到3’端的组成依次为：P3序列、间隔臂序列、P4序列；
所述P1、P4序列长度为10～14bp；
所述P2、P3序列为长度16～20bp，且与目标mRNA特异性结合；
所述信号放大系统包括扩增探针和标记探针，
所述扩增探针连接捕获探针与标记探针，其从5’端到3’端的组成依次为：P5’序列、间隔臂序列、P6序列、间隔臂序列、P7序列、间隔臂序列、P5”序列；
所述P5’序列为n1组P5序列顺次连接，n1为0-10的整数，所述P5序列为长度为18～22bp；
所述P5”序列为n2组P5序列顺次连接，n2为0-10的整数，所述P5序列为长度为18～22bp；
所述P6序列与P4序列互补配对；所述P7序列与P1序列互补配对；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，其从5’端到3’端的组成依次为：P8序列、荧光基团；所述P8序列与P5序列互补配对；
所述捕获探针和/或标记探针采用己糖醇核酸修饰。
2.根据权利要求1所述Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针和标记探针采用己糖醇核酸修饰，所述捕获探针P1、P2、P3、P4序列和标记探针P8序列均为己糖醇核酸序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，所述扩增探针中P5’序列中的P5序列组数n1为3～10的整数；
P5”序列中的P5序列组数n2为3～10的整数。
4.根据权利要求1-3任一项所述Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，所述所述捕获探针CP1和CP2中，P2序列和P3序列分别靶向CPS1基因mRNA的两个相邻的检测靶区，两个相邻的检测靶区之间存在2～5个碱基的间隔。
5.根据权利要求4所述Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，所述捕获探针CP1中，P1序列为SEQ ID NO.1或其完全互补序列，P2序列选自SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.12以及SEQ IDNO.3～SEQ ID NO.12的完全互补序列中的任意至少3条；
所述捕获探针CP2中，P4序列为SEQ ID NO.43或其完全互补序列，P3序列选自SEQ IDNO.23～SEQ ID NO.32以及SEQ ID NO.23～SEQ ID NO.32的完全互补序列中的任意至少3条。
6.根据权利要求4-5任一项所述Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，所述扩增探针中，P5序列为SEQ ID NO.45或其完全互补序列，P6序列为SEQ ID NO.47或其完全互补序列，P7序列为SEQ ID NO.49或其完全互补序列；
所述标记探针中，P8序列为SEQ ID NO.51或其完全互补序列，荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和AlexaFluor 750。
7.根据权利要求1-6任一项所述Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，还包括针对内参基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统。
8.根据权利要求7所述Hepatocyte检测试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTB；
针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP1中，P1序列为SEQ ID NO.2或其完全互补序列，P2序列选自SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22以及SEQ ID NO.13～SEQ ID NO.22的完全互补序列中的任意至少3条；
针对ACTB基因mRNA的捕获探针CP2中，P3序列选自SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.42以及SEQ ID NO.33～SEQ ID NO.42的完全互补序列中的任意至少3条，P4序列为SEQ ID NO.44或其完全互补序列；
针对ACTB基因mRNA的扩增探针中，P5序列为SEQ ID NO.46或其完全互补序列，P6序列为SEQ ID NO.48或其完全互补序列，P7序列为SEQ ID NO.50或其完全互补序列；
针对ACTB基因mRNA的标记探针中，P8序列为SEQ ID NO.52或其完全互补序列，荧光基团选自FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas、Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、AlexaFluor 488和Alexa Fluor 750，且与CPS1基因标记探针所带荧光基团不同。
9.权利要求1～8任一项所述Hepatocyte检测试剂盒在检测、分类、预测、治疗监测、预后或其它评价肝细胞癌中的应用。
10.一种非疾病诊断目的Hepatocyte检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)得到生物样本；
(2)富集待检测细胞；
(3)对富集的待检测细胞进行前处理，使待检测细胞的mRNA暴露；
(4)使用权利要求1～8任一项所述试剂盒检测待检测细胞中CPS1基因mRNA是否存在。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111222814.6A CN115992227A (zh) | 2021-10-20 | 2021-10-20 | 一种Hepatocyte检测试剂盒及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN202111222814.6A CN115992227A (zh) | 2021-10-20 | 2021-10-20 | 一种Hepatocyte检测试剂盒及其制备方法与应用 |
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| CN115992227A true CN115992227A (zh) | 2023-04-21 |
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| CN (1) | CN115992227A (zh) |
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2021
- 2021-10-20 CN CN202111222814.6A patent/CN115992227A/zh active Pending
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