CN107475357A - 结直肠癌早期筛查试剂盒 - Google Patents

结直肠癌早期筛查试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及结直肠癌早期筛查试剂盒，其包括针对检测目标基因mRNA的捕获探针、扩增探针和标记探针，所述目标基因包括有结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因，所述结直肠癌筛查基因选自CK20、ZEB1、CEA、CD24中的至少两种；所述非血源细胞相关基因选自EGFR、CDX2、MACC1、LGR5中的至少两种。通过发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析筛选，所选择的结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因，除了能实现单个目标基因的检测外，更与其它目标基因一起使用，从而能够最全面地检测出筛查细胞，区分筛查细胞和血液中的白细胞、造血干细胞和内皮细胞，避免了假阴性和假阳性结果的出现，提高检测的准确性。

Description

结直肠癌早期筛查试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种结直肠癌早期筛查试剂盒。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer)是结肠或直肠内的细胞异常生长所形成的癌症，为胃肠道中常见的恶性肿瘤，是世界第三高发恶性肿瘤，死亡率位居恶性肿瘤第四位，其早期症状不明显，一般会经历7～10年的从正常粘膜组织、腺瘤、再到恶性肿瘤的演变过程。结直肠癌近年在全球发病率直线上升，近些年来每年超过百万人死于结直肠癌。结直肠癌多发生于中年以上的男性，男女两性发病比例约为2:1，大多数患者年龄在40岁以上。早期结直肠癌缺少特异症状，当患者因临床症状明显而就诊时往往已处于中晚期，大约25％的患者首诊时就已出现转移。目前，结直肠癌的根治性治疗方法迄今仍首推外科治疗，早期发现结直肠癌患者的五年存活率高达90％，一旦转移，结直肠癌患者存活率不足10％。因此，治疗的关键在于早期发现、及时诊断和手术根治。但是，目前结直肠癌早期诊断率不足40％，且据有关资料统计，结直肠癌的误诊率为30％，严重影响了治疗的效果及预后。
研究已经确定了大量存在于结肠组织、粪便或血清中的生物标记物，如癌胚抗原(CEA)等，来用于结直肠癌的早期诊断和预测，但是目前大多数推荐的筛查方法的灵敏度和特异性都在50％以下。结直肠癌传统的筛查方法包括粪便潜血试验、粪便免疫试验、结肠钡剂灌肠检查、乙状结肠镜检查及结肠镜检查等，这些检测方法都属于肿瘤形成后诊断，且有可能误诊为痔、肠炎等，以致长期延误治疗。内窥镜检查是目前结直肠癌筛查的最好方法，但由于这种方法侵入性、费用高、风险大、易产生并发症等缺陷限制了其在普查筛选中的应用。临床研究早已证实，肿瘤团块一旦形成，癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长。虽然也有针对结直肠癌相关肿瘤基因水平的早期筛查技术，如标志基因甲基化位点检测、microRNA检测等，但目前的检测主要基于PCR反应原理，具有易污染、假阳性率高等缺陷。此外，缺乏特异性的早期诊断分子标志物也是限制结直肠癌早期诊断的重要因素。因此，急需一种针对结直肠癌早期诊断的分子标志物，以及特异性强、灵敏度高的检测方法，能在基因的一级转录功能产物(mRNA水平)上做更精确的早期筛查和诊断。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的结直肠癌早期筛查试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下。
一种结直肠癌早期筛查试剂盒，包括针对检测目标基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述目标基因包括有结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因，所述结直肠癌筛查基因选自CK20、ZEB1、CEA、CD24中的至少两种；所述非血源细胞相关基因选自EGFR、CDX2、MACC1、LGR5中的至少两种；所述信号放大系统包括有末端修饰有荧光基团的扩增探针，或包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，不同种类目标基因的荧光基团互不相同；；其中，
所述捕获探针用于连接目标基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与待检测的目标基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和目标基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别目标基因mRNA的捕获探针的P2序列相同；
所述扩增探针连接捕获探针与荧光基团，或连接捕获探针与标记探针，每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
所述标记探针连接扩增探针与荧光基团，每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同种类目标基因的荧光基团互不相同。
在其中一个实施例中，所述目标基因还包括排除基因，所述排除基因选自CD45、CD34、CD105、CD146、VWF中至少两种。
在其中一个实施例中，所述结直肠癌筛查基因的捕获探针中：针对CK20基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的2条或2条以上，针对ZEB1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的2条或2条以上，针对CEA基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的2条或2条以上，针对CD24基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的2条或2条以上；针对结直肠癌筛查基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.131；所述结直肠癌筛查基因的扩增探针中，P3序列为SEQ IDNO.134，P4序列为SEQ ID NO.137。
在其中一个实施例中，所述非血源细胞相关基因的捕获探针中：针对EGFR基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50中的2条或2条以上，针对CDX2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60中的2条或2条以上，针对MACC1基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70中的2条或2条以上，针对LGR5基因特异性序列P1的选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上；针对非血源细胞相关基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.132；所述非血源细胞相关基因的扩增探针中，P3序列为SEQ IDNO.135，P4序列为SEQ ID NO.138。
在其中一个实施例中，所述排除基因的捕获探针中：针对CD45基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上，针对CD34基因特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上，针对CD105基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.110中的2条或2条以上，针对CD146基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.111～SEQ ID NO.120中的2条或2条以上，针对VWF基因的特异性序列P1选自SEQID NO.121～SEQ ID NO.130中的2条或2条以上；针对排除基因的捕获探针的P2序列为SEQID NO.133；所述排除基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.136，P4序列为SEQ IDNO.139。
在其中一个实施例中，所述间隔臂序列为5－10个T。
在其中一个实施例中，所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同种类目标基因的荧光基团互不相同。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明提供了分子标志物：结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因对结直肠癌进行早期筛查，解决了不同个体和不同类型结直肠癌相关基因表达差异造成的假阴性结果，以增加结直肠癌早期筛查的可靠性。此外，本发明还包括排除基因，以排除了其他一些非肿瘤疾病中某些相关基因表达增强造成的假阳性结果，进一步提高了检测结果的特异性和准确性，避免造成误诊。同时本发明试剂盒能在基因和细胞水平上对结直肠癌做更精确的早期筛查和诊断，远远早于肿瘤团块形成后的诊断，对结直肠癌患者的早期治疗、提高治愈率和存活率具有重要的意义。
(2)本发明所选择的结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因，是发明人经过大量试验进行综合评估、统计分析筛选得出的在筛查细胞上特异表达的基因。本发明目标基因的选取，除了能实现单个目标基因的检测外，更与其它目标基因一起使用，从而能够最全面地检测出筛查细胞，区分筛查细胞和血液中的白细胞、造血干细胞和内皮细胞，避免了假阴性和假阳性结果的出现，进一步提高检测的准确性。
(3)本发明所述鉴定方法采用针对目标mRNA的多重捕获探针，能够同时标记多种结直肠癌筛查基因及非血源细胞相关基因，并区分筛查细胞和正常细胞，进一步提高了检测结果的准确性。本发明所设计的各种探针，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种探针之间基本不存在非特异性结合；所设计的探针在检测中特异性好、信噪比高。同时，多种探针的组合使用使鉴定试剂盒和检测方法形成一个检测效果完好的系统。本发明使用的是探针的多位点特异配对、级联放大的方式来实现信号的放大，而不是PCR扩增的方法，提高了检测信号，实现了检测的特异性，避免了逆转录PCR和实时荧光定量PCR技术的假阳性。
(4)RNA原位杂交方法本身具有荧光信号灵敏度低的缺点，但是本发明采用新型的RNA原位杂交方法，通过信号放大体系提高荧光信号强度。本发明检测流程能够在8h内完成，单一拷贝的mRNA杂交探针通过信号放大系统，与相应的荧光探针结合，显著提高RNA原位杂交的检测灵敏度。
附图说明
图1是本发明阳性筛查细胞鉴定结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语―和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，有两种类型，分别为具有标记探针与不具有标记探针。
其中，具有标记探针的结直肠癌早期筛查试剂盒A，主要包括有：
一、捕获探针
捕获探针由三部分组成，5’端至3’端依次是能与对应的目标基因的mRNA互补配对的P1序列，间隔臂序列，与对应的扩增探针P3序列互补配对的P2序列，同一类别的目标基因其捕获探针中的P2序列相同。所述间隔臂为用于将捕获探针P2序列与目标mRNA间隔开来，通过在探针内部设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。本发明捕获探针的间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T。每个目标基因分别设计10条捕获探针，以提高检测的特异性。(具体使用时，针对每种目标基因，选择2条或2条以上捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都很好，可参考实施例5)，本实施例优选为使用10条捕获探针，以使特异性达到最好。针对相应的目标基因捕获探针的特异性P1序列见表1，不同类型的目标基因的捕获探针的P2序列见表2。
表1目标基因捕获探针的P1序列
表2捕获探针的P2序列
二、扩增探针
扩增探针是连接捕获探针与信号检测组分之间的序列，扩增探针由三部分组成，5’端是能与捕获探针P2序列互补配对的P3序列，间隔臂序列，3’端是能与标记探针互补配对的序列P4(如不运用标记探针检测时，则P4序列的3’端修饰有荧光基团，如试剂盒B)，中间是5个寡聚核苷酸T的间隔臂序列(本发明的扩增延伸探针间隔臂优选为5－10个T，本实施例优选为5个T)。所述目标基因的扩增探针的P4序列内部不存在发夹结构，探针内部和探针间都不形成二聚体、不存在错配，与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在非特异性结合的序列。
表3扩增探针的P3序列
表4目标基因的扩增探针的P4序列
三、标记探针
标记探针由两部分组成，其5’端是能与扩增探针序列P4互补结合的P5序列，3’端带有荧光基团标记，通过与扩增探针P4序列的结合实现目标mRNA信号的级联放大。(当检测体系中使用标记探针时，扩增探针的P4序列3’端不带有荧光基团标记，而由标记探针的3’端带有荧光基团标记，如试剂盒A)标记探针的荧光基团可以选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，标记探针的FL1、FL2和FL3选择的荧光基团互不相同，且所选择的荧光基团的颜色互不相同或发射波长互不相同，以便于区分不同类型的目标基因。
表5标记探针
本实施例所述不具有标记探针的结直肠癌早期筛查试剂盒B，主要包括有：
一、捕获探针：与上述具有标记探针的结直肠癌早期筛查试剂盒A中的捕获探针相同。
二、扩增探针：与上述具有标记探针的结直肠癌早期筛查试剂盒A中的扩增探针的序列相同，但P4序列的3’端修饰有荧光基团。所述扩增探针P4序列的3’端优选的荧光基团标记中：针对结直肠癌筛查基因CK20、ZEB1、CEA和CD24的荧光基团为Cy3(红色荧光信号)，针对非血源细胞相关基因EGFR、CDX2、MACC1和LGR5的荧光基团为Alexa Fluor488(绿色荧光信号)，针对排除基因CD146、CD105、VWF、CD45和CD34的荧光基团为Alexa Fluor 750(白色荧光信号)。
实施例2运用实施例1中的试剂盒A对结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞进行检测
所述各种溶液的配方如下：
本实施例中的探针混合液、扩增混合液、显色混合液均使用实施例1具有标记探针的结直肠癌早期筛查试剂盒A相应基因列表中的全部探针。
一、样本预处理，将筛查细胞过滤至滤膜上
1.在样本保存管中使用保存液保存血液样本，600×g水平离心5min，弃上清，去除红细胞。
2.加入4mL PBS和1mL固定剂，涡旋混匀，室温静置8min。
3.样本过滤：将样本保存管中的液体转移至过滤器中，打开真空抽滤泵抽尽液体；在本保存管中加入4mL PBS，洗涤管壁后抽滤液体。
4.将滤膜转移至24孔板中，加入400μl 4％甲醛溶液，室温固定1h。
5.去除液体，每孔加入1mL PBS洗涤三次，每次浸泡2min。
二、透化处理
1.在新的24孔板中每孔加入50μl透化剂，将滤膜从PBS中取出，滤膜片边缘接触吸水纸，去除多余的液体，将滤膜倒扣在透化剂上，即滤膜铁圈刻有编码的一面向下贴近液体。室温孵育5min。
2.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤两次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS中至下一步实验操作。
三、消化细胞，暴露mRNA，使其与探针杂交
1.配制相应浓度的消化酶工作液：对于每个样本，消化酶工作液组成如下：48.75ul的PBS、1.25ul的消化酶，总体积50ul。
2.按实验需要配制一定体积的消化酶工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中消化酶工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。室温静置1h。
4.去除液体，每孔加入1ml PBS洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在PBS缓冲液中至下一步实验操作。
四、探针杂交，探针特异性序列与目标mRNA序列结合
1.探针缓冲液、扩增缓冲液和显色缓冲液使用前需40℃水浴预热20min。
2.配制探针工作液：对于每个样本，探针工作液组成如下：8ul探针混合液、42ul探针缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的探针工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
3.将滤膜取出，倒扣至24孔板中探针工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
4.盖上24孔板盖，40±1℃孵育3小时。
5.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
五、扩增杂交，目标mRNA序列信号放大
1.配制扩增工作液：对于每个样本，扩增工作液组成如下：2ul扩增混合液、48ul扩增缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的扩增工作液，涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中扩增工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
六、显色，荧光标记目标信号
1.配制显色工作液：对于每个样本，显色工作液组成如下：2ul显色混合液、48ul显色缓冲液(40℃预热)，总体积50ul。按实验需要配制一定体积的显色工作液，避光涡旋混匀，分装至24孔板中，每孔50μl。
2.将滤膜取出，倒扣至24孔板中显色工作液上，保证滤膜向下一面与液体充分接触，不能有气泡存在。
3.盖上24孔板盖，40±1℃孵育30min。
4.去除液体，每孔加入1ml洗涤液洗涤三次，每次浸泡2min。将滤膜保持在洗涤液中至下一步实验操作，样本在洗涤液中浸泡时间不能超过30min。
七、荧光显微镜观察筛查细胞
本发明的对照品使用DAPI作为细胞核荧光基团，其发射蓝色荧光信号。
1.将滤膜细胞面朝上置于载玻片上，沿铁圈内环将滤膜割下，加10μl含DAPI的抗淬灭剂，盖上18mm×18mm的盖玻片，直接镜检或置于-20℃保存。
2.通过20倍物镜计数筛查细胞异性核数量。
3.根据10倍物镜定位异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果，并拍照记录结果。
4.然后再根据10倍物镜定位下一个异性核位置，滴油，用油镜观察实验结果并视野拍照记录结果。
5.重复操作至拍完所有的异性核，数量与20倍物镜计数结果一致。
显微镜使用通道如下：
表6荧光基团的激发波长和发射波长
八、检测结果判断及分析
1.阳性筛查细胞鉴定标准
在滤膜上，富集有少量的筛查细胞以及残留的白细胞、造血干细胞和内皮细胞，本试剂盒阳性的判定标准为(参见图1)：
1)表达结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因，在本试剂盒中表现为在Cy3通道和/或Alexa Fluor 488通道下能够显示红色荧光信号点和/或绿色荧光信号点。
2)不具有排除细胞特异性标识物，在本试剂盒中表现为在Alexa Fluor 750通道下不显示荧光信号点。
3)细胞核DAPI染色阳性。
4)细胞核形状不规则，直径大于10μm，明显大于滤膜孔径，滤膜孔径为7μm。白细胞大小与滤膜孔大小相近。
本试剂盒采用针对目标mRNA的多重捕获探针，分别针对结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因，通过不同颜色荧光信号，判断检测的细胞是否为结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因阳性。
2.使用上述检测方法，对15例结直肠癌患者外周血样本(编号1-15)进行检测。同时，选用结直肠癌细胞株DLD-1作为阳性对照、淋巴母细胞CCRF-HSB-2、造血细胞株KG-1a和人肝窦内皮细胞HHSEC作为阴性对照，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个DLD-1、CCRF-HSB-2、KG-1a和HHSEC细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，编号16-20、21-25、26-30和31-35，读取每个细胞株样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，统计其表达红色/绿色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在红色阳性、绿色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果为：
表6样本检测结果
通过分析检测结果可知，本发明试剂盒能实现结直肠癌患者外周血中结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因的检测，具体很好的特异性和灵敏度。同时本发明试剂盒能将样本中50个结直肠癌细胞DLD-1和淋巴母细胞CCRF-HSB-2、造血细胞株KG-1a以及人肝窦内皮细胞HHSEC全部检出。其中，结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因仅在结直肠癌细胞株中检测到mRNA表达，而在淋巴母细胞、造血干细胞和内皮细胞中均没有表达，由此可见，本发明试剂盒能够检出结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因mRNA表达情况，同时，本发明试剂盒采用的结直肠癌筛查基因，其检出具有癌种特异性，也就是说，结直肠癌筛查基因的检出，能有效区分样本中的癌细胞的种类，在检测到非血源细胞相关基因的前提下，进一步确定早期癌症的种类，提高了检测结果的准确度和可信度。
实施例3目标检测基因数量和种类的选择
一、试剂盒制备的设计(目标检测基因数量和种类的选择)
本发明试剂盒结直肠癌筛查基因选自：CK20、ZEB1、CEA、CD24，根据实验组做相应的选择，非血源细胞相关基因使用：EGFR、CDX2、MACC1和LGR5；排除基因使用：CD146、CD105、VWF、CD45和CD34。
结直肠癌筛查基因的选择参见实验组1-4，分别选取一种、两种、三种及四种的目标基因，对比其检测效果，而非血源细胞相关基因和排除基因使用全部的目标基因，具体设计如表7所示。
本实施例每组相应目标基因的所述捕获探针、扩增探针与标记探针的组成和数量、检测方法等如实施例1试剂盒A和实施例2所述。
表7结直肠癌筛查基因基因的选择
二、样本检测
本实施例选用结直肠癌细胞株DLD-1、SW480和LoVo进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个DLD-1、SW480和LoVo细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号36-40、41-45和46-50。采用表7目标基因制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本36-50进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个结直肠癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数。具体检测结果如下(表8中数据为细胞数目，表9中数据为平均荧光点数)：
表8使用不同数量结直肠癌筛查基因检测效果的比较
表9使用不同数量结直肠癌筛查基因平均荧光信号点数检测效果的比较
对比实验组1-4的实验结果可知，当结直肠癌筛查基因分别选取一种、两种、三种及四种，非血源细胞相关基因和排除基因使用全部基因时，非血源细胞相关基因和排除基因检测结果稳定，而结直肠癌筛查基因检测结果有差异：由于不同结直肠癌细胞标记基因表达的差异，只选用一种目标基因进行检测时，会造成一定程度的漏检，使用2种或2种以上时，检测效果达到稳定，且红色荧光信号点从实验组1到实验组4随着结直肠癌筛查基因数量的增加而逐渐增加，检测效果更优，其中，选用全部的结直肠癌筛查基因时，检测信号最强最稳定，效果最优。同时，结直肠癌筛查基因的增加并不影响非血源细胞相关基因和排除基因的检测结果，由此可知，本发明试剂盒所设计的各种类型探针之间基本不存在非特异性结合，特异性好。非血源细胞相关基因和排除基因基因数量的选择实验结果与结直肠癌筛查基因一致。其它针对使用不同数量和种类的结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例4：标记探针的运用
一、试剂盒制备的设计(信号检测组分)
本发明试剂盒信号检测组分有两种选择，1)扩增探针P4序列的3’端修饰有荧光基团；2)扩增探针3’端P4序列与标记探针的P5序列通过碱基互补配对结合，同时标记探针的3’端带有荧光基团。这两种信号检测组分均能实现信号放大，检测到正常信号。其中，使用荧光基团修饰的标记探针，检测信号更加稳定，效果较优。
以所述试剂盒的检测结直肠癌筛查基因的两种信号检测组分为例，具体设计如表10所示。即所述试剂盒的组成为：
实验组5：相应捕获探针和扩增探针组成和数量同实施例1试剂盒A，但扩增探针3’端修饰有荧光基团Cy3；没有标记探针；
实验组6：相应捕获探针、扩增探针和标记探针组成和数量同实施例1试剂盒A，扩增探针不具有荧光基团，但配置有标记探针，标记探针的P5序列3’端修饰有荧光基团Cy3。
表10信号检测组分
二、样本检测
本实施例选用结直肠癌细胞株DLD-1、SW480和LoVo进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个DLD-1、SW480和LoVo细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号51-55、56-60和61-65。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本51-65进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个结直肠癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数，具体实验结果如下：
2个实验组中使用不同信号组分的试剂盒均能将三种细胞株样本中含有的50个细胞全部检出，对细胞数目的检测结果没有差异，因此，这两种信号检测组分对信号的检测是等效的。但是使用标记探针的试剂盒(实验组6)检测到的结直肠癌筛查基因平均荧光点数更多，信号更加稳定，效果较优，具体荧光点数检测结果见表11：
表11结直肠癌筛查基因使用不同信号检测探针平均荧光点数检测结果比较
其他针对非血源细胞相关基因和排除基因标记探针的运用检测结果与结直肠癌筛查基因检测结果一致，具体数据省略。
实施例5目标基因的捕获探针的数量选择
一、试剂盒制备的设计(捕获探针数量的选择)
本发明结直肠癌早期筛查试剂盒，针对不同种类的每个目标基因分别设计了10条捕获探针，且同一细胞种类的目标基因的捕获探针中的P2序列相同。在实际使用时，可以针对每种目标基因，选择对应的至少2条捕获探针即可完成检测，特异性和稳定性都能达到需求。
为考察捕获探针数量的选择对试剂盒检测效果的影响，以结直肠癌筛查基因MUC1的捕获探针数量选择为例，参见实验组7-9，分别选取1条、2条及10条的捕获探针，对比其检测效果。在该对比实验中，结直肠癌筛查基因仅使用CK20(参见表12)，而非血源细胞相关基因和排除基因使用如实施例1实验组A所列出的全部的基因和探针。
表12结直肠癌筛查基因CK20的捕获探针的选择
二、样本检测
本实施例选用结直肠癌细胞株DLD-1、SW480和LoVo进行实验，本领域技术人员只要知道细胞株的名称即可通过购买得到。分别各取约1000个DLD-1、SW480和LoVo细胞(通过细胞计数器确定)，混合均匀后将样本各均分为5份，依次编号66-70、71-75和76-80。采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本66-80进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的50个细胞，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取，针对目标检测标志物的荧光信号强度，分别读取这50个结直肠癌细胞的相应颜色的荧光点数量，并计算平均点数。具体检测结果如下(表13中数据为细胞数目，表14中数据为平均荧光点数)：
表13结直肠癌筛查基因CK20使用不同数量捕获探针的检测结果比较
表14结直肠癌筛查基因CK20使用不同数量捕获探针平均荧光点数检测结果比较
通过三组实验对比可知，当仅选用结直肠癌筛查基因CK20，使用1条、2条和10条的捕获探针均可完成检测，将当捕获探针使用2条或以上时，其特异性和稳定性都很好。其中，当使用全部10条的捕获探针时，结直肠癌筛查基因检测到的荧光信号点数更多，信号更强更稳定，检测效果最佳。
其它针对结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因的使用不同数量捕获探针的试剂盒，其结果依然稳定可靠，具体数据省略。
实施例6目标检测基因类型的选择
一、试剂盒制备的设计(目标检测基因类型的选择)
本发明试剂盒提供3种类型的目标检测基因，包括结直肠癌筛查基因(CK20、ZEB1、CEA、CD24)、非血源细胞相关基因(EGFR、CDX2、MACC1、LGR5)和排除基因(CD146、CD105、VWF、CD45、CD34)。
本发明提供的结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因，即可与排除基因联合三者一起使用，也可两者联合使用实现结直肠癌的早期诊断。设计实验组10-11，其中实验组10选用全部类型的标志基因，实验组11只选用结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因，对比其检测效果，具体设计如表15所示。
表15目标检测基因类型的选择
二、样本检测
采用上述设计制备的试剂盒，按实施例2所述检测过程和方法对样本81-90进行检测，读取每个样本中有DAPI蓝色荧光信号的细胞，统计其表达红色/绿色荧光的细胞数量，同时表达两种荧光的细胞分别在红色阳性、绿色阳性细胞数量中列出，其中，样本中的细胞数通过荧光显微镜自动扫描来选取。具体结果为：
表16试剂盒选择不同类型检测基因的检测结果比较
通过上述检测结果可知，本发明试剂盒提供的结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因，既可两者联合使用，也可与排除基因一起三者联合使用，均能实现结直肠癌的早期筛查和诊断，说明试剂盒所选用的结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因具有很好的特异性。结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因与排除基因三者联合使用，有利于排除白细胞、内皮细胞和造血干细胞的对结果判断的干扰(实验组10)，但仅使用结直肠癌筛查基因和非血源细胞相关基因也可完成检测(实验组11)，实现结直肠癌的早期诊断，且两者检测结果没有显著差异。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，包括针对检测目标基因mRNA的捕获探针以及信号放大系统；所述目标基因包括有结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因，所述结直肠癌筛查基因选自CK20、ZEB1、CEA、CD24中的至少两种；所述非血源细胞相关基因选自EGFR、CDX2、MACC1、LGR5中的至少两种；所述信号放大系统包括有末端修饰有荧光基团的扩增探针，或包括有扩增探针和末端修饰有荧光基团的标记探针，不同种类目标基因的荧光基团互不相同；其中，
所述捕获探针用于连接目标基因mRNA与扩增探针，每条捕获探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与待检测的目标基因mRNA结合的特异性序列P1、间隔臂序列、P2序列，所述P2序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配，与P1、P4和目标基因mRNA之间均不存在特异性结合的序列，针对同一类别目标基因的捕获探针的P2序列相同；
每条扩增探针从5’端到3’端的碱基组成依次为：能与相应捕获探针的P2序列互补配对的P3序列、间隔臂序列、P4序列；所述P4序列为不存在发夹结构，探针内部和探针间不形成二聚体、不存在错配、与P1、P2、P3和总mRNA之间均不存在特异性结合的序列；
每条标记探针具有与相应扩增探针P4序列互补配对的P5序列，且末端修饰有荧光基团，不同种类目标基因的荧光基团互不相同。
2.根据权利要求1所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，所述目标基因还包括排除基因，所述排除基因选自CD45、CD34、CD105、CD146、VWF中至少两种。
3.根据权利要求1所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，所述结直肠癌筛查基因的捕获探针中：针对CK20基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10中的2条或2条以上，针对ZEB1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20中的2条或2条以上，针对CEA基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的2条或2条以上，针对CD24基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40中的2条或2条以上。
4.根据权利要求1所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，针对结直肠癌筛查基因的捕获探针的特异性序列P2为SEQ ID NO.131；所述结直肠癌筛查基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.134，P4序列为SEQ ID NO.137。
5.根据权利要求1所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，所述非血源细胞相关基因的捕获探针中：针对EGFR基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.41～SEQ ID NO.50中的2条或2条以上，针对CDX2基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60中的2条或2条以上，针对MACC1基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70中的2条或2条以上，针对LGR5基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80中的2条或2条以上。
6.根据权利要求1所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，针对非血源细胞相关基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.132；所述非血源细胞相关基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.135，P4序列为SEQ ID NO.138。
7.根据权利要求2所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，所述排除基因的捕获探针中：针对CD45基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.81～SEQ ID NO.90中的2条或2条以上，针对CD34基因特异性序列P1选自SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100中的2条或2条以上，针对CD105基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.110中的2条或2条以上，针对CD146基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.111～SEQ ID NO.120中的2条或2条以上，针对VWF基因的特异性序列P1选自SEQ ID NO.121～SEQ ID NO.130中的2条或2条以上。
8.根据权利要求7所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，针对排除基因的捕获探针的P2序列为SEQ ID NO.133；所述排除基因的扩增探针中，P3序列为SEQ ID NO.136，P4序列为SEQ ID NO.139。
9.根据权利要求1-8任一项所述的结直肠癌早期筛查试剂盒，其特征在于，所述目标基因包括有结直肠癌筛查基因、非血源细胞相关基因和排除基因，所述结直肠癌筛查基因有CK20、ZEB1、CEA、CD24；所述非血源细胞相关基因有EGFR、CDX2、MACC1、LGR5；所述排除基因有CD45、CD34、CD105、CD146、VWF；其中，
所述结直肠癌筛查基因的捕获探针中：针对CK20基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10，针对ZEB1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.11～SEQ ID NO.20，针对CEA基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30，针对CD24基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.31～SEQ ID NO.40；
所述非血源细胞相关基因的捕获探针中：针对EGFR基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.41～SEQ ID NO.50，针对CDX2基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.51～SEQ ID NO.60，针对MACC1基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.61～SEQ ID NO.70，针对LGR5基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.71～SEQ ID NO.80；
所述排除基因的捕获探针中：针对CD45基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.81～SEQ IDNO.90，针对CD34基因特异性序列P1有SEQ ID NO.91～SEQ ID NO.100，针对CD105基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.101～SEQ ID NO.110，针对CD146基因的特异性序列P1有SEQ IDNO.111～SEQ ID NO.120，针对VWF基因的特异性序列P1有SEQ ID NO.121～SEQ IDNO.130。
10.根据权利要求1-8任一项所述的结直肠癌早期诊断试剂盒，其特征在于，所述间隔臂序列为5－10个T；所述荧光基团选自：FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、LCRED640、Cy5、LC RED705、Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 750，且针对不同种类目标基因的荧光基团互不相同。
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