CN106939359A - 一种lamp法检测hpv常见亚型的引物组及检测体系 - Google Patents

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CN106939359A CN201710348588.3A CN201710348588A CN106939359A CN 106939359 A CN106939359 A CN 106939359A CN 201710348588 A CN201710348588 A CN 201710348588A CN 106939359 A CN106939359 A CN 106939359A
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Abstract

本发明涉及一种LAMP法检测HPV常见亚型的引物组及检测体系，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44，所述引物组由核苷酸序列为SEQ NO.1‑24的引物序列组成。本发明针对尖锐湿疣及常见皮肤疣体感染的HPV的6种亚型设计并验证了各自的LAMP引物，使用上述反应体系可以有效扩增模板中的特定HPV亚型DNA。通过验证该体系的特异性及灵敏度，并与现有的方法比较，本发明的LAMP体系灵敏度均优于目前临床使用的检测方法，因此本发明可为临床提供一种简单，快速，判读方便，特异性高，灵敏度高的HPV分型检测方法。

Description

一种LAMP法检测HPV常见亚型的引物组及检测体系
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体地说，是一种LAMP法检测HPV常见亚型的引物组及检测体。
背景技术
人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)是一种双链环状DNA病毒，可特异性感染人类生殖器官的皮肤及黏膜，导致尖锐湿疣(Condylomaacuminatum,CA)及鳞状上皮内损伤(SILs)。鳞状上皮内损伤可以进一步病变为宫颈癌。目前已发现HPV病毒有100余种病毒亚型，按照其是否能够导致宫颈癌，将其分为两大类型。与宫颈癌及其他外生殖器癌密切相关的，能够用引起宫颈上皮内高度病变的为高危型(High risk Types)，主要包括HPV16、18、33、35、39、45等。主要与尖锐湿疣相关，引起其他宫颈上皮内低度病变的为低危型(LowriskTypes)，主要包括HPV6、11、40、42、43、44等。HPV基因分型检测对于尖锐湿疣患者的治疗及HPV感染人群的宫颈癌筛查和癌前病变的早期筛查，具有重要的临床意义。
针对HPV检测有很多种方法，主要包括HPV-DNA检测，HPV-RNA检测，HPV抗体检测，HPV相关蛋白检测等等。其中针对HPV–DNA的检测是目前临床应用最为广泛的，根据其方法不同可以分为多种亚型混合检测和各种亚型独立检测，以荧光定量PCR法为代表，因其能同时检测多种HPV亚型，特异性及灵敏度都较高，可以同时对多种亚型进行定性及定量测试。环介导等温核酸扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是针对目的基因的6个特异性部位设计4条引物，利用同时具有链置换活性和DNA聚合酶活性的BstDNA聚合酶，在恒定温度条件下，高效扩增目的基因的核酸扩增技术。
中国专利201610333820.1公开了一种非诊断、治疗目的的快速筛查多种HPV亚型的引物和方法，引物为F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4或与上述引物对的核苷酸互补序列，该方法不需要探针和饱和荧光染料即可通过熔解曲线分析方法鉴定多种HPV亚型，降低了人工和试剂成本。中国专利200810025867.7公开了一种DNA微阵列芯片，特别是涉及人乳头瘤病毒(HPV)高危和低危亚型分型DNA微阵列芯片，该芯片采用固相载体基片，配合HPV各亚型的寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以高灵敏度、高特异性的一次性同时检测多个样本的HPV高危和低危型亚型，可以广泛应用于HPV病毒感染定性和分型检测。然而现有技术中，关于本发明检测HPV常见亚型的引物组及检测体系，目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测HPV常见亚型的引物组。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供如上所述引物组的用途。
本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于检测HPV常见亚型的试剂盒。
本发明的第四个目的是针对现有技术中的不足，提供一种LAMP法检测HPV常见亚型的检测体系。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于检测HPV常见亚型的引物组，所述引物组由下列核苷酸序列对组成：
进一步，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的引物组在制备HPV常见亚型检测试剂中的应用，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
如上所述的引物组在制备HPV常见亚型检测试剂盒中的应用，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种用于检测HPV常见亚型的试剂盒，所述的试剂盒包含如上所述的引物组，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
进一步，所述的试剂盒包含以下检测组分：
进一步，所述试剂盒还包括记载有如下方法的载体：反应条件：65℃60min，95℃10min。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
一种LAMP法检测HPV常见亚型的检测体系，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44；所述检测体系包括如上所述的引物组及检测组分。
本发明优点在于：
1、本发明针对尖锐湿疣患者常见的6种亚型，设计得到了多套合适的LAMP引物组，并通过实验筛选获得了SEQ NO.1-24所述的引物序列，该引物序列特异性十分优异，且灵敏度高，显著优于其它引物，可用于HPV常见亚型的分型检测。
2、本发明的检测体系中，所述引物浓度经过实验对比，最终确认为FIP，BIP引物浓度为40umol/L，F3，B3引物浓度为5umol/L，该条件下具有扩增效率高的优点。
3、本发明的检测体系中，所述dNTPs选用10mM浓度，该浓度下可显著提高扩增效率。
4、本发明针对尖锐湿疣及常见皮肤疣体感染的HPV的6种亚型(6.11.16.42.43.44型)设计并验证了各自的LAMP引物及反应体系。使用上述反应体系可以有效扩增模板中的特定HPV亚型DNA，通过验证该体系的特异性及灵敏度，与现有的方法比较，本发明的LAMP体系灵敏度均优于目前临床使用的方法。本发明的检测体系可为临床提供一种简单，快速，判读方便，特异性高，灵敏度高的HPV分型检测方法。
附图说明
附图1为HPV6型LAMP引物设计示意图。
附图2为LAMP反应后反应管指示剂颜色示意图。
附图3为Loopamp实时浊度测定仪结果画面。
附图4为LAMP产物电泳结果示意图。
附图5为LAMP特异性实验显色剂及电泳结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1样本相关资料
从上海市第十人民医院和上海市第十人民医院分院2014年7月至2016年10月间门诊及住院病人中选取627份均确认为生殖器疣体症状的病史。年龄，性别无统计学差异，排除各类其他皮肤炎症性感染。选取病人样本均在手术或药物治疗之前。病人手术切除的疣体，皮肤表面取得的脱落皮屑或是生殖道拭子等进行洗脱并保存于3ml HPV样本保存液中。
1.1.2 HPV分型样本收集
以上624份样本均使用透景流式荧光杂交法检测样本中HPV感染及分型情况。挑选出单一HPV-6，HPV-11，HPV-16，HPV-42，HPV-43，HPV-44的样本。根据其最终荧光读数挑选出模板浓度较高的样本。筛选后获得HPV-6型30例，HPV-11阳性30例，HPV-16阳性22例，HPV-42阳性20例，HPV-43阳性30例，HPV-44阳性20例，总计152例。以上样本取保存液，使用QIAGENBlood&tissue kit进行再次抽提DNA，并使用朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒(环介导等温扩增法)进行LAMP扩增，确认实验设计的引物效率及LAMP体系是否工作。
1.1.3尖锐湿疣石蜡包埋块样本收集
取40例(n＝1-40)明确病理诊断为尖锐湿疣的组织石蜡包埋块，除外其他类型的疣体及各类良恶性皮肤病变。经由TIANGEN石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒抽提取得DNA作为模板。
1.2.1 LAMP相关设备
ABI-7500荧光定量PCR仪(赛默飞世尔科技)；
VORTEX-2漩涡混合器；
BIOER MB-102震荡型恒温金属浴；
EFFENDORF Centrifuge 5424R高速冷冻离心机。
1.2.2 PCR对照方法相关设备
Luminnex 200流式点阵仪(透景生物)
Loopamp实时浊度测定仪(荣研生物)
1.2.3核酸电泳相关设备
Tanon EPS300电泳仪(天能)
Tanon 1600凝胶成像分析仪(天能)
JA2103电子分析天平
1.3试剂与试剂盒
试剂盒
人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒流式荧光法(透景生物)
Loopamp朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒环介导等温扩增法(荣研生物)
DNA提取相关
TIANGEN石蜡包埋组织快速提取试剂盒(天根)
D Neasy Blood&tissue kit(QIAGEN)
LAMP反应体系
Bst DNA聚合酶8000U/ml(BioLabs)
dNTPs Mixture溶液10mM(上海生工生物科技)
羟基萘酚蓝(HNB)3mol/L(荣研生物)
1:1000稀释，最终使用HNB浓度为3mmol/L
核酸电泳相关试剂
Agarose Regular(TAKARA)
10xLoading Buffer(TAKARA)
50xTAE concentrate Solution(上海生工生物科技)
SYBR Green核苷酸染料(上海生工生物科技)
DNAMarker-D 2000BBI(上海生工生物科技)
实验用纯水
Milli-Q超纯水仪
1.4基因模板提取
1.4.1透景试剂盒提取
(1)轻微振荡悬浮起保存液中的脱落细胞，取50ul样品于1.5ml离心管中，如果有颗粒状物体(疣体)用枪头捣碎，确保有一部分取入离心管。
(2)12000pm离心3分钟，小心取上清并丢弃。
(3)加入200核酸提取缓冲液，振荡混匀，将离心管放入金属衡温浴100℃10min。
(4)12000rpm离心5分钟，移取上清至一新的离心管内备用。
1.4.2QIAGEN试剂盒抽提DNA
(1)轻微振荡悬浮起保存液中的脱落细胞，取50ul样品于1.5ml离心管中，如果有颗粒状物体(疣体)用枪头捣碎。
(2)加入180ul BufferATL，20ul proteinase K,振荡混匀后置于56℃水浴10分钟。
(3)加入200ul BufferAL漩涡仪振荡混匀后置于56℃水浴10分钟。
(4)加入200ul无水乙醇并振荡混匀后，加入滤过柱，高速离心8000rpm 1分钟，弃去收集管中液体。
(5)滤过柱中加入500ul BufferAW1，高速离心8000rpm 1分钟，弃去收集管中液体。
(6)滤过柱中加入500ul BufferAW2，高速离心14000rpm 3分钟，弃去收集管中液体。
(7)更换新的无菌收集管后，加入200ul BufferAE室温(15-25℃)静置一分钟，高速离心8000rpm 1分钟。并重复该步骤一次。取得DNA模板溶液保存于-20℃备用。
1.4.3石蜡包埋组织DNA模板抽提
(1)取石蜡切片(5-10um厚，1CM2面积)5-8张，置于无菌离心管中。
(2)加入500ul裂解液GL，50ul裂解液GP剧烈涡旋10秒。98℃金属浴30分钟以上，直至样本完全溶解。
(3)12000rpm高速离心5分钟。吸取中间层水相清液，再加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后静置3分钟。混合液加入滤过柱CR2，高速离心8000rpm2分钟，弃去收集管中液体。
(4)在滤过柱中加入500ul缓冲液GD，高速离心8000rpm 1分钟，弃去收集管中液体。
(5)在滤过柱中加入600ul漂洗液PW，高速离心8000rpm 1分钟，弃去收集管中液体。并重复此步骤一次。
(6)滤过柱高速离心12000rpm 2分钟，弃去收集管中液体，开盖置于室温2-5分钟。
(7)更换新的无菌收集管后，加入100ulddH2O，室温静置2-5分钟。高速离心12000rpm2分钟。取得DNA模板溶液保存于-20℃备用。
1.5 LMAP引物设计与合成
首先根据Genebank中已知的HPV6,11,16,42,43,44六种亚型的已知序列，进行对比和同源性分析，并查阅相关文献确定其保守序列。本实验引物主要针对的保守区域处于HPV的E6，E7，L1这三个区域。实验中HPV-6和HPV-11型目的基因位于各自的E6区域，HPV-16型目的基因位于E7区域，HPV-42型，HPV-43型，HPV-44型位于各自的L1区域。
使用目的基因序列如下HPV-6(HG793938.1)；HPV-11(KU298879.1)；HPV-16(KP313775.1)；HPV-42(KU298897.1)；HPV-43(HE962401.1)；HPV-44(HE963128.1)。设计F3，B3，FIP，BIP四个一组的引物数套。如图1所示，设计的HPV6型引物设计位点及四条引物的区域。
LAMP因其环状引物特征，其F1C段和B1C段的TM值要比其他几条引物高5℃左右，这样的引物组F1C和B1C更容易匹配形成环状结构。环状结构的引物对于引物间隔也有最优反应条件，要求F2的5’端至B2的5’端距离为120-180bp，F2的5’端至F1c的3’端，也就是末端的茎环结构长度为40-60bp。F2的5’端至F3的3’端长度为0-20bp。另外，引物中GC含量尽量控制在40-60％，并计算3’和5’末端的安定性。再对引物二级结构进行筛选，并进行预实验，筛选扩增效率最高的引物，最终选取六个亚型的环状引物。如表1。
表1 HPV亚型环状引物及设计位点表
按照上表由上海生工生物工程股份有限公司合成引物，获得引物的初始浓度为100umol/L。使用ddH2O进行稀释，本实验使用的FIP，BIP引物浓度为40umol/L，F3，B3引物浓度为5umol/L。
1.6透景流式荧光法操作
按照透景人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒流式荧光法操作，其PCR扩增体系如表2。
表2 流式荧光法PCR体系
以上体系进入ABI 7500荧光定量PCR仪进行扩增，设置循环如下：①95℃，退火5分钟。②95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，5次预循环。③95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，扩增35个循环。④72℃3分钟，终止反应。
取PCR反应产物3ul，加入杂交反应板，每孔加入微球杂交液22ul，振荡混匀。使用封口膜封住反应板。在PCR仪中进行杂交反应，99℃变性5分钟，48℃杂交30分钟。然后每孔加入75ul链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)，48℃孵育15分钟后，进入Luminnex 200流式点阵仪读数。实验使用Humanβ-Globin做为阳性内对照，其读数大于150代表实验有效，低于150代表未获得人类细胞基因模板，或者是试剂仪器出现问题。
1.7 Loopamp朗报环介导等温扩增法主要操作
按照朗报环介导等温扩增法试剂盒说明书建立PCR扩增体系如表3。
表3 朗报环介导等温扩增PCR体系
反应体系加入反应试管后进入Loopamp实时浊度测定仪在65℃下恒温扩增50分钟，95℃下恒温2分钟，使酶灭活以终止反应。实时浊度记录的扩增曲线图可直接读取结果，但终点浊度值与初始模板量之间没有相关性。仅以浊度上升和HNB颜色发生变化来判断LAMP循环有无产生。因LAMP反应容易出现假阳性，每次试验均加入对照反应组，对照反应组使用引物溶液DNA(PM DNA)代替试验设计的4条引物。每次试验均需对照组为阴性，来证明试验结果有效，未发生污染。
1.8自建LAMP体系扩增主要过程
实验使用NEW ENGLAND BioLabs Bst DNA聚合酶，浓度为8000U/ml，恒温反应最佳温度为65℃。Bst酶兼具链置换活性和DNA聚合酶活性，可以介导完成LAMP环状扩增反应。4条环状引物中FIP，BIP引物浓度为40umol/L，F3，B3引物浓度为5umol/L。Bst配套的MgSO4浓度为100mM,dNTPs浓度为10mM。显色剂羟基萘酚蓝(HNB)浓度为3mmol/L。建立反应体系如表4。
表4 实验设计的LAMP扩增体系
因为AMP反应灵敏度很高，混入极其微量的DNA模板就可能导致假阳性的产生。故试剂配置和加样均在超净工作台内进行，在检测反应产物时，在配置世界和加样操作的房间以外的其他房间进行。所有试剂配置均置于冰上进行操作，再经由灭菌传递仓传递至另一房间进行加样。使用过的房间和设备均需进行紫外消毒后再进行后续实验。
反应体系加入PCR反应管后，进入ABI-7500PCR仪进行扩增，设定循环为65℃60min95℃10min。之后可直接根据显色剂HNB颜色判断有无LAMP循环产生。反应产物经传递仓送至另一间实验室内进行核酸电泳。
1.9琼脂糖核酸电泳
LAMP扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压120V，电泳20分钟。LoadingBuffer中添加SYBR Green进行核酸染色，电泳后放入Tanon 1600凝胶成像分析紫外下成像。LAMP反应最终产物中包含循环数不等的目的基因正反衔接序列以及循环数不等的茎环状反应中间产物。因此电泳后会生成一条连续，在末端形成梯状的特异性条带，明显区别于普通PCR产物结果。而未能产生LAMP扩增的样本则因为其引物浓度较高，大多出现明显得引物二聚体。
1.10尖锐湿疣样本HPV分型检测
保存的627例尖锐湿疣患者病变组织DNA模板使用透景人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒流式荧光法试剂盒，经流式荧光法测定标本包含的HPV亚型情况。共包括(HPV6，11,16,18,26,31,33,35,39,40,42,43,44,45,51,52,53,55,56,58,59,61,66,68,81,82和83)27种。结果荧光读数高于150的为阳性，低于150为阴性。实验使用Humanβ-Globin作为阳性内参，其读数低于150则表示PCR体系内无足够人细胞来源DNA，实验无效。
根据实验结果计算尖锐湿疣患者人群中HPV的感染率，在感染HPV的标本中计算各个分型的分布情况，以及单一和混合感染例数及其HPV亚型。将所得的结果使用SPSS12.0进行统计学分析。按照感染情况分组使用二项式分布(95％)计算阴性，阳性的预期值。将样本按照年龄分为≤25岁,26–30岁,31–40岁,41–50岁,51–60岁和≥60岁共计6个组，分析年龄段HPV亚型感染情况，使用P检验分析其是否具有统计学意义。取P<0.05做为判断标准。
1.11 Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒验证
由透景流式荧光杂交法筛选获得的单一阳性样本总数152例。其中包括HPV-6型30例，HPV-11阳性30例，HPV-16阳性22例，HPV-42阳性20例，HPV-43阳性30例，HPV-44阳性20例。按照Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒操作说明分别检测其HPV分型情况。结果判断以Loopamp实时浊度测定仪出现阳性上升峰和HNB颜色转变为蓝色来判读，均符合阳性特征为阳性结果。同时加入阴性对照，以阴性对照正常为实验有效的前提。
1.12自建LAMP体系检测HPV分型情况
以上164例样本DNA使用自建体系进行LAMP扩增，分别检测其HPV分型情况。产物进行琼脂糖核酸电泳，判断标准为HNB转变为蓝色，核酸电泳出现特异性条带为阳性。每批实验均加入阴性对照，以阴性对照正常为实验有效的前提。
1.13自建LAMP体系特异性验证
从实验数据中挑选出确认为单一感染HPV6.11.16.42.43.44型的DNA模板保存液各5支。每支各吸取2ul，混合成7种亚型的阳性模板混合液，放置于-20℃冰箱备用。使用七排八联管，每排第一反应管为阴性对照，其余各组分布加入实验设计的HPV-6,11，16,42,43,44型环状引物及其他LAMP反应组分。然后从第一排起分别加入预混的HPV6.11.16.42.43.44型阳性混合DNA模板。按照实验设计步骤进行LAMP扩增后，由显色剂HNB颜色变化和电泳结果判断6种亚型的特异性。并对反应产物进行琼脂糖核酸电泳，验证其是否产生特异性条带。
1.14自建LAMP体系灵敏度验证
根据透景流式荧光杂交法结果，在保存的样本DNA中选取两组初始DNA模板。选取的样本均为单一型HPV感染。高浓度组选取各个亚型中微球荧光值较高的模板DNA10个，低浓度组选取各个亚型中微球荧光值较低的模板DNA10个。混合后获得高低浓度两组模板DNA各7个，分别含有各自亚型的DNA。
将高浓度组DNA模板进行1:10稀释8次，每组亚型获得10-1至10-8梯度浓度模板8个。低浓度组进行以下稀释，每组获得1:5,1:10,1:20,1:30,1:50,1:80,1:100响应稀释浓度的DNA模板8个。以上DNA模板依次编号后放置于-20℃冰箱备用。
两组模板分别按照实验设计体系进行LAMP扩增和流式荧光杂交法检测HPV分型基因，LAMP产物进行电泳，以是否出现特异性条带判断阴阳性。以结果对比来比较实验设计体系LAMP扩增方法和现临床使用检测方法的灵敏度差异。
1.15尖锐湿疣病理样本LAMP验证
40例(n＝1-40)明确病理诊断为尖锐湿疣的组织石蜡包埋块，排除其他类型的疣体及各类良恶性皮肤病变。经由TIANGEN石蜡包埋组织DNA快速提取试剂盒抽提取得DNA作为模板，放置于-20℃冰箱备用。
40例样本DNA分别进行流式荧光杂交法与LAMP扩增，LAMP产物通过电泳确认是否产生特异性条带，结果进行对比。观察两种方法测得的HPV感染的差异。
2结果与分析
2.1尖锐湿疣样本HPV分型检测
627例尖锐湿疣患者样本中HPV亚型经流式荧光杂交法检测，其中367例为阳性，感染亚型情况见表5。
表5：367例HPV阳性样本中HPV亚型的分布
2.1.1尖锐湿疣中HPV感染率
627例样本中男性为251例(40.35％)，女性为376例(59.95％)，性别分布无统计学意义。总体年龄分布为33.99±10.14岁，经流式荧光杂交法检测，其中367例为阳性，存在HPV感染，年龄分布为32.98±7.29岁。246例为阴性，未测得HPVDNA存在，年龄分布为35.42±10.14岁。HPV阳性率在性别上无统计学差异(P＝0.170)。在所有的阳性结果中，高危型感染率为58.58％，低危型感染率为73.02％。男性感染者中，有124例为HPV低危型感染(124/145＝85.52％),66例为HPV高危型感染(66/145＝45.52％)。女性感染者中，有144例为HPV低危型感染(144/222＝64.86％),149例为HPV高危型感染(149/222＝67.12％)。男性感染者中，有58例为两种以上HPV亚型混合感染(58/145＝40％),在女性群体中则为103例(103/222＝46.4％)。见表6。
表6 按性别分组HPV阳性分布
2.1.2 HPV亚型分布情况
在所有的HPV阳性结果中最多的5种亚型如下，HPV-6型(158/367＝43.05％),HPV-52(48/367＝13.08％),HPV-11(46/367＝12.53％),HPV-16(45/367＝12.26％),HPV-59(29/367＝7.9％)。在单一亚型感染(n＝206)中，最多的五种亚型是HPV-6型(83/206＝40.29％),HPV-11(28/206＝13.59％),HPV-16(14/206＝6.8％),HPV-52(12/206＝5.86％),HPV-51(7/206＝3.40％)。共有161例两种以上HPV亚型混合感染情况，92例属于两种HPV亚型感染(92/367＝25.07％)，69例则是3种或更多亚型混合感染。单一感染的男性和女性群体中，HPV阳性最高的亚型都是HPV-6，分别是30.51％(36/118)和53.41％(47/88)。而在两种亚型混合感染的群体中，男性出现最多的阳性组合是HPV-6，HPV-52(4/62＝6.45％)和HPV-42,HPV-52(4/62＝6.45％)。女性群体最高的阳性组合是HPV-6,HPV-16和HPV-6,HPV-4，百分比均为3.33％(2/30)。三种或更多HPV亚型混合感染在女性组里有40例(40/220＝18.18％)，男性组为29例(29/147＝19.73％)。所有三种以上亚型感染的情况，其感染的亚型组合在本实验中均只出现一次，无统计价值。取95％可信区间，使用二项式分布计算阳性，阴性预期值，所得结果显示本实验所有结果均处于预期值范围内。见表7。
表7 按性别分组的HPV亚型感染分布
2.1.3年龄组HPV阳性分布
将样本按照年龄分为≤25岁,26–30岁,31–40岁,41–50岁,51–60岁和≥60岁共计6个组。大多病人集中于50岁及以下，超过50的病人例数较少。HPV阳性率最高的两组为，≤25组阳性率61.32％(65/106)，26-30岁组阳性率69.01％(118/171)。见表8。
表8 按年龄分组的HPV阳性结果分布
按年龄组别对阳性率进行P检验。取95％可信区间，P<0.05。结果显示年龄组别间有一定的差异。特别是29-30岁组和41-50岁组之间有明显统计学差异，P<0.001。见表9。
表9 按年龄分组的HPV阳性率P检验结果
2.2自建LAMP体系与Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒结果
2.2.1结果判断
按照Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒操作说明由Loopamp实时浊度测定仪实时测定浊度变化，出现明显上升峰为阳性，并可观察到反应管颜色由淡紫色转变为淡蓝色。结果示意如图2和图3所示。图2中左起第一管为阴性对照，第1，2，4，6，7号反应管未变色为阴性结果，第3，5号反应管HNB转变为蓝色，判断为阳性反应。图3中A组A5蓝色，A7黄色，A8棕色，B组B3浅绿色样本浊度线出现明显上升峰，判读为阳性结果，该浊度系统不能设置基线，故其余反应孔中杂波无法去除，但均无明显上升峰段，结果为阴性。
自建LAMP体系中显色剂系统和Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒一致，反应管显色反应和图2一致。再使用琼脂糖核酸电泳来确认产物是否出现LAMP特异性条带，结果见图4。如图所示，LAMP反应最终产物中包含循环数不等的目的基因正反衔接序列以及循环数不等的茎环状反应中间产物，故阳性条带为特异性连续条带，末端可出现明显梯状结构。图4中第一条电泳道为DL2000DNA MARKER，第二条电泳道为阴性对照，第4.6,9,12.13.14条电泳道出现明显连续梯状特异性条带，结果为阳性。阴性对照和其余电泳道因为引物浓度较高故显示出明显的引物二聚体，未见特异性条带，判读为阴性。
2.2.2 Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒与自建LAMP体系结果对比
使用两种LAMP体系检测7种HPV亚型，结果见表10。Loopamp试剂盒体系阳性率最高的亚型为HPV-6型，30例中阳性为27例，阳性率90％，阳性率最低的的亚型为HPV-18型，12例中5例为阳性，阳性率41.6％(18亚型的数据已删除)。两种方法的阳性符合率较高，最高为HPV-18，12例均符合，符合率100％，最低为HPV-42型，20例中3例不符合，符合率85％。结果上看自建LAMP体系的阳性率略低于Loopamp试剂盒体系。6组亚型中仅有42型自建体系阳性率高于Loopamp试剂盒体系。
表10 Loopamp与自建LAMP体系结果对照表
2.3 LAMP体系特异性实验
6组亚型特异性实验所得的结果中，所有的阴性对照孔均显示为蓝色，其电泳结果也均显示无特异性条带，表示实验未发生污染，结果可靠。每组均在引物和模板匹配的反应管位置出现HNB的颜色变化，其核酸电泳结果也出现了明显的特异性条带。当模板加入其它引物组的反应体系中，则经恒温扩增后，显色剂HNB依然为淡紫色，核酸电泳结果只显示引物二聚体，未见梯状连续的特异性条带。见图5。
2.4 LAMP体系灵敏度验证
低浓度组初始的微球荧光读数在200-300左右。稀释后使用流式荧光杂交法检测，HPV-6型，HPV-16型，HPV-42型和HPV43型均在稀释至1:10的浓度无法测出HPV基因，HPV-11型1:5稀释就没有测出HPVDNA，HPV-44则在1:15稀释度上无法测得阳性。而使用LAMP扩增的体系，均至少在1:50稀释度上依然出现阳性。见表11。
表11 低浓度组灵敏度实验结果表
(T表示流式荧光杂交法L表示自建LAMP扩增体系)
高浓度组初始的微球荧光读数在2000左右。稀释后使用流式荧光杂交法检测，HPV-6型，HPV-11型，HPV-42型稀释至10-4浓度无法测出HPV基因，HPV-16，HPV-43型10-5稀释就没有测出HPVDNA，HPV-44和HPV-44型则在10-3浓度上无法测得阳性。而使用LAMP扩增的体系，最低的阳性稀释度是HPV-16型，在10-6稀释度下依然为阳性，而HPV-6，HPV-42，HPV-43，HPV-44型则在10-5稀释度上显示为阳性。HPV-11型最低可测得HPV阳性的稀释度为10-4。见表12。
表12 高浓度组灵敏度实验结果表
(T表示流式荧光杂交法L表示自建LAMP扩增体系)
2.5 LAMP检测尖锐湿疣病理切片结果
40例样本(n＝1-40)经过LAMP检测共测得HPV阳性反应30例，其中HPV6型18例，11型7例，16型1例，42型1例，43型2例，44型2例。其中有一例为43.44型混合阳性。
40例样本(n＝1-40)经普通PCR扩增后，使用透景流式荧光杂交系统检测HPV分型情况，结果有38例与LAMP体系一致，其中No.22号样本LAMP方法为阴性，流式荧光法测得HPV6型阳性，No.30号样本，LAMP法为HPV 6型阳性，流式荧光法为HPV6型，44型混合阳性。总体符合率为(38/40)90％。见表13。
表13 LAMP与流式荧光杂交法检测结果表
3讨论
3.1 LAMP体系的优化
LAMP体系的特异性和灵敏度很大程度上是由设计的环状引物决定的。现有文献报到的LAMP研究使用的引物各不相同。本发明设计的基因位点均事先经过序列对比，选取保留序列，设计得到的F3，B3也回溯至Genebank匹配其目的基因，确保其特异性可以进行后续实验。
本发明在试验初始每种亚型都设计了至少5条引物，经过预试验筛选出特异性最高，扩增效率最高的引物来继续接下去的实验
本发明的检测体系中，引物浓度经过实验对比，最终确认为FIP，BIP引物浓度为40umol/L，F3，B3引物浓度为5umol/L，该条件下扩增具有效率高的优点。
根据预试验，dNTPs选用10mM浓度，会明显提高扩增效率。在60-65℃的温度范围内，Bst酶均能有效完成链置扩增反应。改变Mg2+浓度对于实验影响不大。反应体系中添加甜菜碱可以提高反应的特异性和扩增效率。本实验中发现是否添加甜菜碱对于反应无明显影响。
3.2 LAMP体系与其他方法的对比
本发明通过目前临床使用的流式荧光杂交法方法确认了152例6种HPV亚型单一感染的DNA样本。使用Loopamp脱氧核糖核酸环介导等温扩增法和实验设计的LAMP扩增体系分别进行检测，结果显示符合度最高的为HPV-6型，符合率为90％。其余亚型基本都在80％以上，上述结果表明所设计的LAMP引物可以正确匹配目的基因，并诱导发生链置换扩增反应。LAMP体系可以有效的检测出相应的HPV亚型。而与Loopamp脱氧核糖核酸环介导等温扩增法结果的符合度较高，也说明了实验建立的体系可以在一定程度上达到该试剂盒使用的环介导等温扩增效率。
3.3 LAMP实验的方法学评价
在特异性实验中，本发明的6组引物体系均表现出了较好的特异性结果。未在型别间产生交叉污染，特异性较高。引物也均经过Blast同源比较，确保其匹配序列的正确。特异性实验表明，最后的LAMP反应和实验设计理论相一致，得到了预期的实验效果。
在灵敏度实验中，所有LAMP实验组的灵敏度均高于现在使用的流式荧光杂交法。在低浓度组中有4个亚型在稀释100倍后依然没有达到最低可以检测到的灵敏度，而在高浓度组实验中，LAMP扩增的可检测到的浓度比传统PCR法高10-103不等，其中44型最高，可比传统PCR多稀释1000倍的浓度下测得阳性，43型和11型最低，在多稀释10倍的情况下可以测得阳性。LAMP扩增灵敏度高的同时也给实验带来了更多的干扰，假阳性的出现率也明显高于传统PCR方法。通过优化实验步骤，规范实验操作来降低假阳性的干扰，是LAMP实验的最大课题。相对于传统PCR法，本发明的LAMP扩增更灵敏，方便，直观，特异性也更高。对于各类病原体DNA的检测提供了另一种思路。
3.4尖锐湿疣病理样本LAMP验证
使用自建LAMP体系检测40例病理确诊为尖锐湿疣的石蜡切片，所得结果为6型(18/40)45％，11型(7/40)17.5％，44型.43型为(2/40)5％,42型.16型为(1/40)2.5％。所得结果符合尖锐湿疣患者HPV感染情况的预期。
LAMP结果与R流式荧光杂交法的符合率为(38/40)95％。说明自建体系中引物能够有效结合目的基因位点，Bst酶及其他反应体系能够有效完成LAMP环状扩增反应。显色剂系统和电泳系统高度符合，表明目测体系可以有效工作，简单迅速的显示LMAP反应是否完成。自建体系中的引物经试验表明设计针对的目的基因，可以特异性的代表HPV相应分型，并有效的和目的基因相结合，引发LAMP反应。
4结论
(1)本发明对尖锐湿疣患者病变部位感染的HPV基因型分布进行了调查。分析了不同性别，年龄群组中HPV分型感染的具体情况。综合感染亚型类别，数量等情况，为尖锐湿疣患者HPV感染情况的预估和针对治疗，以及潜在宫颈癌的防治提供了参考依据。
(2)本发明对LAMP反应体系中的影响因素进行了研究。讨论了各个组分的浓度和组成对检测结果的影响。最终得出LAMP反应体系如下：总反应体系为25ul，包括Bst酶1ul，HNB 1ul，浓度为3umol/l，dNTP 3.5ul 10mM，Buffer 2.5ul，MgSO41.5ul，4条引物各1ul，其中F3，B3浓度为5umol/l，FIP，BIP浓度为40umoml/l，ddH2O 9.5ul，DNA模板2ul。反应条件：65℃60min 95℃10min。
(3)本发明针对尖锐湿疣及常见皮肤疣体感染的HPV的6种亚型(6.11.16.42.43.44型)设计并验证了各自的LAMP引物。使用上述反应体系可以有效扩增模板中的特定HPV亚型DNA。验证了该体系的特异性及灵敏度，并和现有方法和商品化环介导等温扩增试剂盒进行了比较，获得了满意的结果。并最后使用病理确诊的石蜡包埋组织提取的DNA进行了验证。
实施例2
使用目的基因序列如下HPV-6(HG793938.1)；HPV-11(KU298879.1)；HPV-16(KP313775.1)；HPV-42(KU298897.1)；HPV-43(HE962401.1)；HPV-44(HE963128.1)。设计F3，B3，FIP，BIP四个一组的引物数套。
由透景流式荧光杂交法筛选获得的单一阳性样本总数164例。其中包括HPV-6型30例，HPV-11阳性30例，HPV-16阳性22例，HPV-42阳性20例，HPV-43阳性30例，HPV-44阳性20例。按照Loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒操作说明分别检测不同引物组HPV分型情况。结果判断以Loopamp实时浊度测定仪出现阳性上升峰和HNB颜色转变为蓝色来判读，均符合阳性特征为阳性结果。同时加入阴性对照，以阴性对照正常为实验有效的前提。统计阳性样本数目，结果如下表所示：
表14 不同引物组阳性扩增样本数
注：表中加粗字体部分对应的引物为最后筛选获得的引物组(即表1中记载的引物序列)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海市第十人民医院
<120> 一种LAMP法检测HPV常见亚型的引物组及检测体系
<130> /
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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<211> 23
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<213> 人工序列
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gcatacgttg caaattaatt gtg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtttcttct tcaacagttg tt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aggaccttta gctgtttata tgcattgttt tgcaagaatg cactg 45
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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tggagataca cccacattg 19
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ggacaagcag aaccggacag agcgtagagt cacacttg 38
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gaaccactag gggtagga 18
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cgcaattggt gaacctgtac caaattatgt ctgccagatg c 41
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atttgttggg gaaatcagtt 20
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<213> 人工序列
<400> 23
actgtgtagt ggcagcacat agttactgtt gtagatacta cccg 44
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
taagcaatac atgcgacatg ttgagcatta cctccgccgt taa 43

Claims (8)

1.一种用于检测HPV常见亚型的引物组，其特征在于，所述引物组由下列核苷酸序列对组成：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
3.权利要求1-2所述的引物组在制备HPV常见亚型检测试剂中的应用，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
4.权利要求1-2所述的引物组在制备HPV常见亚型检测试剂盒中的应用，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
5.一种用于检测HPV常见亚型的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的引物组，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含以下检测组分：
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括记载有如下方法的载体：反应条件：65℃60min，95℃10min。
8.一种LAMP法检测HPV常见亚型的检测体系，其特征在于，所述HPV常见亚型为HPV6、HPV11、HPV16、HPV42、HPV43和HPV44；所述检测体系包括权利要求1所述的引物组，以及权利要求6所述的检测组分。
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