CN109576352A - 单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒。该方法包括针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团。本发明通过半巢式扩增反应引物以及酶切RNA碱基后探针与引物扩增提高检测特异性和灵敏度；利用RNaseH酶切获得带荧光标记的引物，直接对特异性产物进行熔解曲线分析，具有优异的特异性。

Description

单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒。
背景技术
传统实时荧光PCR技术通过在PCR反应体系中加入不同的荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程。具有高度灵敏、高特异性、有效解决PCR污染问题、快速等优点，是目前核酸检测广泛运用的方法。但由于受目前市场上荧光PCR仪通道的限制，单管最多只能检测4-5个靶标，不能满足临床上某一症候群相关的多种病原体或基因同时筛查的需求。
目前临床上常见的病原微生物感染症状有呼吸道感染，胃肠道感染，泌尿生殖道感染等，而引起这些症状的病原微生物较为复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，给疾病诊断和治疗造成极大的困难。若感染所致疾病得不到快速诊断，则只能经由临床医生的经验和现有知识给予治疗，而这些治疗方法常伴随着广谱抗生素的滥用，引起多重耐药菌的出现和医院获得性感染的发生。多种病原体同时检测的策略，以及病原体的快速、准确鉴定在疾病管理中至关重要。
传统的病原微生物检测方法技术复杂、阳性率低，而且耗时耗力，部分病原体培养条件苛刻甚至不能培养或需要专业的技术人员操作等制约条件使得其难以应用于临床早期诊断和指导治疗；免疫荧光技术、血清学试验等敏感度和特异性也很少能满足临床诊断的需要。随着生物学新技术的发展，分子诊断技术逐渐成为临床微生物实验室不可或缺的检验技术。由于临床样品中未知病原体感染以及多病原体混合感染，常规单病原体核酸检测方法往往需要进行多次筛选，相对费时费力。多重靶标检测能够实现多个病原体的快速鉴别和诊断，降低检验成本。多重靶标检测具有高效性、系统性和经济简便性等优点，已广泛应用于病原微生物的检测。常见的多重靶标检测技术有以下几种。
基因芯片技术又称为DNA微阵列(DNA microarray)，是通过微加工技术，将大量DNA探针固定到硅片、玻片等固态支持物上，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，获得样品的基因序列信息。此项技术可对多达上万个基因进行同时检测和分析，具有微型化、高通量等特点。但基因芯片技术仍存在一些问题，如检测灵敏度低，特异性较差，芯片制作成本高，且需要昂贵的检测仪器，这些问题使得基因芯片到目前主要局限于实验室研究而未能广泛应用于临床病原微生物的检测与鉴定。
高通量测序技术是近年来发展迅猛的生物技术，通过对DNA(或cDNA)随机片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中数以万计的克隆进行延伸反应，检测对应的信号，最终获取序列信息。该技术通量大，灵敏度高，尤其在一些新发疾病病原体的检测、未知病原体鉴别和突发疾病的防控中发挥重要作用。但目前该技术仍然存在一些待解决的问题：测序产生的海量数据需要专业的人员进行分析；测序的时间和成本仍然制约着其在临床上的广泛应用。
鉴于目前临床上对简便快速，灵敏度高，特异性好及多靶标检测技术的需求，而现有技术都有其局限性，不能完全满足临床的需求，因此我们亟需开发出一种快速，准确且低成本的多重检测技术。
发明内容
在一种实施方式中，本发明提供单管检测多个待测目标核酸序列的方法，所述方法利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列，所述方法包括以下步骤：
步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述至少1个RNA碱基优选地为至少1个连续的RNA碱基，更优选地为1个RNA碱基；
步骤2：所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；
步骤4：所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物，在核酸聚合酶的作用下延伸生成待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物；和
步骤5：通过不同待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。
当所述至少1个RNA碱基为至少1个连续的RNA碱基时，所述耐热核糖核酸酶RNaseH随机切割与待测核酸序列结合的RNA碱基；当所述至少1个RNA碱基为至少多个不连续的RNA碱基时，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，只要使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而剪切的其它非荧光的探针片段游离出去即可。
在一种实施方式中，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上标记淬灭基团。
在一种实施方式中，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针非末端碱基上标记荧光基团；和/或在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上连接阻断基团，非末端碱基上标记淬灭基团，所述阻断基团优选为双脱氧胞苷基团或磷酸化基团。
在一种实施方式中，所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针中G+C含量为40％-60％，Tm值为45℃-60℃。在本发明中，上述GC含量和Tm值的范围是优选的，在该服务内引物探针结合效率高，扩增效率高。
在一种实施方式中，所述探针上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp；在这个范围内淬灭基团能有效将荧光信号淬灭，使得反应本底信号低。
在一种实施方式中，所述探针与上游引物和/或下游引物之间序列的长度为30bp-120bp，优选地为40bp-70bp；在这个长度范围容易调整产物Tm值，且长度越短，扩增效率越高。
在一种实施方式中，所述步骤4中聚合酶为DNA聚合酶，包括具有5’—3’外切酶活性的Taq酶和不具有5’—3’外切酶活性的Vent酶。
在一种实施方式中，所述耐热核糖核酸酶RNaseH包括RNaseH2；也可以是商品化酶HybridaseTM Thermostable RNase H等。
在一种实施方式中，所述待测目标核酸序列为DNA序列或RNA序列。
在一种实施方式中，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、NED、TET、ROX、CY3和CY5，TAMRA；和/或所述探针淬灭基团包括BHQ、TAMRA和NFQ。
在一种实施方式中，所述同一荧光标记通道内Tm值相邻的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值相差2-20℃，优选为相差3-8℃；在本发明中Tm值相差3℃以上时不同靶标产物的熔解曲线峰能清楚地分开，在上述范围内能够实现靶标产物分开，同时保持反应效率。
在一种实施方式中，本发明提供单管检测多个待测目标核酸序列的中使用的探针，所述探针在利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列的方法中应用，所述探针中间含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述至少1个RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述探针与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链。
在一种实施方式中，本发明提供单管检测多个待测目标核酸序列的试剂盒，所述试剂盒利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列，所述试剂盒包括：
a.针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针中间含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述至少1个RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值，所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；和
c.核酸聚合酶，在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物情况下，所述聚合酶使得待测目标核酸序列生成带荧光标记的PCR产物。
在一种实施方式中，实现单管检测常见性病病原体沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟淋球菌、HPV6型病毒、HPV11型病毒、HSV-1单纯疱疹病毒和HSV-2单纯疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测上述常见性病病原体，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计的特异性上、下游引物和探针和内标人基因组部分DNA序列；所述上、下游引物和探针分别如下：
其中CT代表沙眼衣原体、UU代表解脲脲原体、NG奈瑟淋球菌、HPV6代表HPV6型病毒、HPV11代表HPV11型病毒、HSV-1代表HSV-1单纯疱疹病毒、HSV-2代表HSV-2单纯疱疹病毒和IC代表内标人基因组部分DNA序列；探针序列中小写字母表示RNA碱基，RNA碱基5'端T修饰报告荧光基团，RNA碱基3'端T碱基或3'末端修饰淬灭基团。
在一种实施方式中，本发明提供单管检测呼吸道感染病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒的试剂盒，所述试剂盒利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测上述呼吸道感染病原体，，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计的特异性上、下游引物和探针和内标人基因组序列；所述上、下游引物和探针分别如下：
其中INA代表甲型流感病毒、INB代表乙型流感病毒、PIVs代表副流感病毒、MV代表麻疹病毒、RSV代表呼吸道合胞病毒和IC代表内标人基因组部分DNA序列；探针序列中小写字母表示RNA碱基，RNA碱基5'端T修饰报告荧光基团，RNA碱基3'端T修饰淬灭基团或直接修饰在3'末端。
在本发明中，不同荧光通道由不同的荧光定量PCR仪所决定，现有的实时荧光定量PCR仪一般为2～6个荧光通道，因此，根据待测靶标的数量，检测通道可以是1～6个。
本发明针对检测靶标保守区域设计特异性上、下游引物及含RNA碱基探针，在探针和下游引物设计过程中调整探针和下游引物的位置和/或碱基组成，对每个检测靶标的荧光产物熔点(Tm)进行控制，使得同一荧光通道内不同检测靶标的荧光产物Tm值有所区分。当探针与检测靶标结合后，RNaseH能特异性切割探针序列上的RNA碱基5'端，并在左端相邻的DNA碱基上产生3'端OH基，探针RNA碱基左端带荧光基团序列作为巢式内引物启动延伸，形成带荧光基团的扩增产物，通过对荧光产物Tm进行分析，实现待测靶标的定性检测。本发明是基于RNaseH进行酶切扩增的多靶标核酸检测方法，利用RNaseH特异性切割探针序列上的RNA碱基5'端后，在RNA碱基左端相邻的DNA碱基上产生3'端OH基，启动延伸，同时特异性引物也进行扩增。在扩增完成后，对荧光产物进行熔解曲线分析。本发明灵敏度高，特异性好，成本低廉，快速，可在同一反应体系中实现十几种目标核酸的检测，满足临床医生及患者的需求。
本发明通过调整探针及引物的位置、长度及GC含量，针对不同检测靶标设计形成不同Tm的产物，使得同一通道的荧光产物都具有合适的差值，例如2～20℃，通过调整PCR扩增体系及反应程序，使得不同通道各靶标熔解曲线信号达到最佳，实现一个荧光通道检测2～4种靶标的定性分型检测。
本发明的主要优点如下：
1、利用基于产物的熔解曲线检测多靶标核酸，通过半巢式扩增反应(上游(下游)引物以及酶切RNA碱基后探针与下游(上游)引物扩增提高检测特异性和灵敏度；
2、利于RNaseH酶切获得带荧光标记的引物，扩增形成带荧光基团的产物，直接对特异性产物进行熔解曲线分析，具有优异的特异性；
3、利用荧光定量PCR仪的2～6通道和不同产物的Tm差异二维参数，实现多靶标核酸的多重检测，提高检测准确率，节省时间和成本以及样本量。
4、整个过程闭管操作，避免扩增污染。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是本发明方法的原理图。
图2是表示FAM通道的CT(A1表示)和NG(A2表示)的产物熔解曲线图；
图3是表示CY5通道的HSV1(A1表示)和HSV2(A2表示)的产物熔解曲线图；
图4是表示ROX通道的UU(A1表示)和IC(A2表示)的产物熔解曲线图；
图5表示HEX通道的HPV6(A1表示)和HPV11(A2表示)的产物熔解曲线图；
图6是表示性病八重体系与Taqman体系检测不同浓度的UU质粒对比结果图，其中A1～A4代表性病八重体系检测不同浓度的UU质粒扩增曲线，B1～B4代表Taqman体系检测不同浓度的UU质粒扩增曲线；
图7是表示性病八重体系与Taqman体系检测不同浓度的HSV2质粒对比结果图，其中A1～A4代表性病八重体系检测不同浓度的HSV2质粒扩增曲线，B1～B4代表Taqman体系检测不同浓度的HSV2质粒扩增曲线；
图8是表示FAM通道的RSV(A1表示)、MV(A2表示)、INA(A3)的产物熔解曲线图；
图9是表示HEX通道的PIVs(B1表示)和INB(B2表示)的产物熔解曲线图；
图10是表示ROX通道的IC(C表示)的产物熔解曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。标准质粒的提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。
实施例一本发明方法的基本原理
如图1所示，本发明利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性上游引物F、下游引物R和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针中间含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述至少1个RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值。如果待测目标核酸是DNA，则直接设计相应的引物和探针，如果待测目标核酸是RNA，则反转录成为cDNA，然后进行相应的引物和探针的设计。所述探针上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离根据淬灭基团对荧光基团的淬灭效果进行选择，淬灭效果好，本底背景就低，一般为5-15bp，这时试剂自身荧光背景最低，实验效果最好。在一些情况中，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上连接阻断基团，非末端碱基上标记淬灭基团；在一些情况中，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上直接标记淬灭基团，淬灭基团自身直接作为阻断基团。
由于RNaseH特异性切割DNA-RNA杂交链的RNA碱基，在所切割RNA碱基左侧相邻的碱基上产生3'端OH基，使得探针RNA碱基的左侧片段可作为引物而延伸。为了防止阻碍其延伸，探针RNA碱基的右侧片段须游离出去，因此设计RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧片段熔点Tm值。
步骤2：所述上游引物F、下游引物R及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链。
步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去。
步骤4：所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物，在核酸聚合酶的作用下延伸生成待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物；和。
步骤5：通过不同待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。
实施例2：常见性病病原体的检测
以常见性病病原体沙眼衣原体(CT)、解脲脲原体(UU)、奈瑟淋球菌(NG)、HPV6型、HPV11型、单纯疱疹病毒(HSV-1和HSV-2)及内标人基因组部分DNA序列(IC)检测为例，用本发明的方法对性病病原体DNA进行定性检测，同时以UU和HSV-2为例比较本发明与Taqman探针法的灵敏度。具体方法包括如下步骤：
一、阳性质粒DNA的提取
将各病原体及内标重组质粒菌液进行过夜培养(12-14h)，用天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒DNA。
二、引物、探针的设计
根据各待测核酸序列保守区域设计上下游引物和带一个RNA碱基的探针。具体序列信息详见表1。
表1常见性病病原体检测引物和探针及荧光产物Tm值
注：探针序列中小写字母表示RNA碱基，RNA碱基5'端T修饰报告荧光基团，RNA碱基3'端T碱基或3'末端修饰淬灭基团
为了比较本发明方法的检测灵敏度，选择性病8重中的UU和HSV-2，设计Taqman引物和探针，具体序列见表2。
表2UU和HSV2检测引物和taqman探针
注：Taqman探针的荧光和淬灭基团修饰分别在5'末端和3'末端.
三、PCR反应及熔解曲线分析
单管8重反应体系：1×PCR buffer，0.1mM MgSO4，200μM dNTPs、0.025μM上游引物(或下游引物)，0.1μM下游引物(或上游引物)，0.1μM探针，15mU RNaseH，0.75U聚合酶。30μL反应体系，其中模板DNA加入3μL。
Taqman探针单重体系：1×PCR buffer，200μM dNTPs、0.20μM上下游引物、0.12μM探针，2U聚合酶。
熔解曲线反应条件：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，55℃退火延伸，同时退火时收集荧光，重复40个循环；40-95℃熔解曲线分析，每隔0.03℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟。
Taqman荧光PCR反应条件：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，55℃退火延伸，同时退火时收集荧光，重复40个循环。
四、检测结果
1.单管8重反应体系的结果
性病八重体系各荧光通道的产物熔解曲线结果如图2-5所示，其中，
图2表示FAM通道的CT(A1表示)和NG(A2表示)的产物熔解曲线图；
图3表示CY5通道的HSV1(A1表示)和HSV2(A2表示)的产物熔解曲线图；
图4表示ROX通道的UU(A1表示)和IC(A2表示)的产物熔解曲线图；
图5表示HEX通道的HPV6(A1表示)和HPV11(A2表示)的产物溶解曲线图。
从以上检测结果可看出，该八重体系检测8种目标序列的混合质粒时，每种病原体均有对应的特征熔解峰，说明建立的性病八重体系能够准确检测常见的性病病原体。
2.本发明体系与Taqman反应体系灵敏度比较结果
本发明与taqman探针法比较：将UU和HSV-2的质粒分别按梯度进行稀释至106、105、104、103copies/mL，分别取出3uL加入到本发明的8重反应体系与taqman探针单重体系中。具体结果如图6-7所示，
图6表示性病八重体系与Taqman体系检测107～104copies/ml的UU质粒对比结果，其中A1～A4代表性病八重体系检测107、106、105、104copies/ml的UU质粒扩增曲线，B1～B4代表Taqman体系检测107、106、105、104copies/ml的UU质粒扩增曲线。
图7表示性病八重体系与Taqman体系检测107～104copies/ml的HSV2质粒对比结果，其中A1～A4代表性病八重体系检测107、106、105、104copies/ml的HSV2质粒扩增曲线，B1～B4代表Taqman体系检测107、106、105、104copies/ml的HSV2质粒扩增曲线。
从以上结果可以看出，本发明建立的性病8重体系检测各病原体具有较好的灵敏度，检测Ct值较Taqman体系小0.5-2；荧光信号也提高了近50％。
实施例3呼吸道病原体检测
以5种常见的甲型流感病毒(INA)、乙型流感病毒(INB)、副流感病毒(PIVs)、麻疹病毒(MV)和呼吸道合胞病毒(RSV)及内标人基因组序列(IC)检测为例，用本发明的方法对5种病原体RNA进行定性检测，具体检测方法如下：
一、样本RNA提取
用天根生化科技(北京)有限公司的病毒RNA提取试剂盒按照说明书提取呼吸道咽拭子样本中病毒RNA。
二、引物探针设计
根据各病原体保守区域设计上下游引物和带RNA碱基的探针。具体序列信息详见表3。
表3常见呼吸道感染病原体检测引物和探针及荧光产物Tm值
注：探针序列中小写字母表示RNA碱基，RNA碱基5'端T修饰报告荧光基团，RNA碱基3'端T修饰淬灭基团或直接修饰在3'末端
三、反应体系
(1)逆转录反应
用invitrogen的SuperScript IIITm Reverse Transcriptase进行随机扩增将RNA逆转录为cDNA，逆转录过程如下：50μM随机引物，200ng RNA，10mM dNTPs，补水至13μL，65℃5min，冰上孵育3min；加入下列组分：1×First-Strand Buffer，0.1M DTT，1μL RNaseInhibitor，200U SuperScriptTM III RT，25℃孵育5min，50℃反应50min。
(2)荧光扩增体系
将逆转录后的cDNA和外源内参质粒等比例混合后加入到多重体系中进行扩增，体系如下：1×PCR buffer，0.1mM MgSO4，200μM dNTPs、0.025μM上游引物(或下游引物)，0.1μM下游引物(或上游引物)，0.1μM探针，15mU RNaseH，0.75U聚合酶。
四、检测
将反应管放入ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增，荧光PCR反应程序：95℃预变性10分钟；95℃变性15秒，55℃退火延伸，同时退火时收集荧光，重复40个循环；40-95℃熔解曲线分析，每隔0.03℃检测一次荧光信号，60℃降温1分钟。
五、结果分析
5种呼吸道病原检测结果如图8-10所示。其中：图8表示FAM通道的RSV(A1表示)、MV(A2表示)、INA(A3)的产物熔解曲线图；图9表示HEX通道的PIVs(B1表示)和INB(B2表示)的产物熔解曲线图；和图10表示ROX通道的IC(C表示)的产物熔解曲线图。
从以上检测结果可看出，呼吸道多重检测体系检测甲型流感病毒(INA)、乙型流感病毒(INB)、副流感病毒(PIVs)、麻疹病毒(MV)和呼吸道合胞病毒(RSV)及内标人基因组序列(IC)，各病原体和内参均有对应的特征熔解曲线峰，当5种病原体同时存在时也均能有效检出，说明建立的呼吸道多重检测体系可以准确有效检测各种常见的呼吸道病原体。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 江苏宏微特斯医药科技有限公司
<120> 单管检测多个待测目标核酸序列的方法、探针及其试剂盒
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcgctgcga atagaaaaag t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctattgcttg agcgtataaa gg 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctatagcact atcaagcctt c 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgctatgac tatcaaccct gc 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
agcagaaaat aaccgccgat 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgccgatata cctagcaagc tccaca 26
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggtagatacc acacgcagta ccaacat 27
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cagaattggt gtatgtgga 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
attatgtgca tccgtaacta c 21
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatgatgtag aaaatagtgg tgggta 26
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caccattttg tacagaggta tttga 25
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctatgtatg gtgggctgtg ct 22
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcgccatgc gtgcc 15
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgatacacc gacaagaacc a 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gttgttccca ttatcccatt cc 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
accgtcgccc tatacagctt aa 22
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgagtcctcg gggtcttcc 19
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccccaagccc ccgtacacca g 21
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccacttaaat cctaaggttc caga 24
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcagctgcaa ttgtttggct a 21
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgttgctttt gctgactcac gtattcg 27
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacaaccctg ccctgtgc 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cccagtgctg tagagctgtc c 21
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcagtgactt tctcagcaac atgtcga 27
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccacttaaat cctaaggttc caga 24
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcagctgcaa ttgtttggct a 21
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgttgctttt gctgactcac gtattcg 27
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
accgtcgccc tatacagctt aa 22
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cgagtcctcg gggtcttcc 19
<210> 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccccaagccc ccgtacacca g 21
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tcccattgat gtcttgacga 20
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tctaggttag gaagagaaga c 21
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcatctctg agtattttta tgg 23
<210> 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttccacactg gcatctgaac tc 22
<210> 35
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ctggtcctgt cctcagtagt atgc 24
<210> 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gatgcaaggc ttgtttcaga gatt 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gaccaatcct gtcacctctg ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agggcattct ggacaaagcg tcta 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcagtcctc gctcactggg cacg 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgaaatgaca actccacggt aa 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggaggacac tgtcatgatg ttt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacacacatt aacacaccag caggaagga 29
<210> 43
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cagtcttggc tttgatgtct ctc 23
<210> 44
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggctgargcc attcgattta 20
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccctctgtct gccattgctc ttccta 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aacaaccctg ccctgtgc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccagtgctg tagagctgtc c 21
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gcagtgactt tctcagcaac atgtcga 27

Claims (19)

1.单管检测多个待测目标核酸序列的方法，其特征在于，所述方法利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列，所述方法包括以下步骤：
步骤1：针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述至少1个RNA碱基优选地为至少1个连续的RNA碱基，更优选地为1个RNA碱基；
步骤2：所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
步骤3：在耐热核糖核酸酶RNaseH工作温度下，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RNA碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；
步骤4：所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物，在核酸聚合酶的作用下延伸生成待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物；和
步骤5：通过不同待测目标核酸序列的带荧光标记的PCR产物的Tm差异和/或不同的荧光标记，实现多个待测目标核酸序列的多重检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上标记淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针非末端碱基上标记荧光基团；和/或在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上连接阻断基团，非末端碱基上标记淬灭基团，所述阻断基团优选为双脱氧胞苷基团或磷酸化基团。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针中G+C含量为40％-60％，Tm值为45℃-60℃。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针与上游引物和/或下游引物之间序列的长度为30bp-120bp，优选地为40bp-70bp。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中聚合酶为DNA聚合酶，包括具有5’—3’外切酶活性的Taq酶和不具有5’—3’外切酶活性的Vent酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐热核糖核酸酶RNaseH包括RNaseH2。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测目标核酸序列为DNA序列或RNA序列。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、VIC、HEX、NED、TET、ROX、CY3和CY5，TAMRA；和/或所述探针淬灭基团包括BHQ、TAMRA和NFQ。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述同一荧光标记通道内Tm值相邻的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值相差2-20℃，优选为相差3-8℃。
12.单管检测多个待测目标核酸序列的中使用的探针，其特征在于，所述探针在利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列的方法中应用，所述探针含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述至少1个RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值；所述探针与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链。
13.根据权利要求12所述的探针，其特征在于，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上标记淬灭基团。
14.根据权利要求12所述的探针，其特征在于，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针非末端碱基上标记荧光基团；和/或在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针的末端碱基上连接阻断基团，非末端碱基上标记淬灭基团，所述阻断基团优选为双脱氧胞苷基团或磷酸化基团。
15.根据权利要求12所述的探针，其特征在于，所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针中G+C含量为40％-60％，Tm值为45℃-60℃。
16.根据权利要求12所述的探针，其特征在于，所述探针上标记的荧光基团和淬灭基团的碱基之间的距离为5-15bp。
17.单管检测多个待测目标核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测多个待测目标核酸序列，所述试剂盒包括：
a.针对每个待测目标核酸序列设计特异性上、下游引物和探针，实现对每个待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值的控制，使得同一荧光标记通道内不同的待测目标核酸序列的荧光产物熔点Tm值通过PCR仪能够区分；所述探针中间含至少1个RNA碱基，在所述RNA碱基左侧靠近所述探针5’端一侧的探针碱基上标记荧光基团，在所述RNA碱基靠近所述探针3’端一侧的探针碱基上标记淬灭基团；在所述RNA碱基的左侧所述探针片段熔点Tm值高于在所述至少1个RNA碱基的右侧所述探针片段熔点Tm值，所述上、下游引物及探针分别与各自待测目标核酸序列特异性结合，形成探针-模板杂交双链，且在所述RNA碱基处形成DNA-RNA杂交链；
b.耐热核糖核酸酶RNaseH，所述耐热核糖核酸酶RNaseH切割与待测核酸序列结合的RNA碱基，使得RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链，而在所述RAN碱基右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去；和
c.核酸聚合酶，在所述RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段作为引物情况下，所述聚合酶使得待测目标核酸序列生成带荧光标记的PCR产物。
18.实现单管检测常见性病病原体沙眼衣原体、解脲脲原体、奈瑟淋球菌、HPV6型病毒、HPV11型病毒、HSV-1单纯疱疹病毒和HSV-2单纯疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测上述常见性病病原体，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计的特异性上、下游引物和探针和内标人基因组部分DNA序列；所述上、下游引物和探针分别如下：
其中CT代表沙眼衣原体、UU代表解脲脲原体、NG奈瑟淋球菌、HPV6代表HPV6型病毒、HPV11代表HPV11型病毒、HSV-1代表HSV-1单纯疱疹病毒、HSV-2代表HSV-2单纯疱疹病毒和IC代表内标人基因组部分DNA序列；探针序列中小写字母表示RNA碱基，RNA碱基5'端T修饰报告荧光基团，RNA碱基3'端T碱基或3'末端修饰淬灭基团。
19.单管检测呼吸道感染病原体甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒利用PCR扩增产物的熔点Tm值实现单管检测上述呼吸道感染病原体，所述试剂盒包括针对上述每个所述病原体设计的特异性上、下游引物和探针和内标人基因组序列；所述上、下游引物和探针分别如下：
其中INA代表甲型流感病毒、INB代表乙型流感病毒、PIVs代表副流感病毒、MV代表麻疹病毒、RSV代表呼吸道合胞病毒和IC代表内标人基因组部分DNA序列；探针序列中小写字母表示RNA碱基，RNA碱基5'端T修饰报告荧光基团，RNA碱基3'端T修饰淬灭基团或直接修饰在3'末端。
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