CN113604611B - 一种检测b1组腺病毒的数字pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测B1组腺病毒的引物，及包括所述引物的探针引物组合、试剂、试剂盒。本发明中使用前述产品检测方法的准确高，具有较一般PCR更高的灵敏度，并且可以定量检测。

Description

一种检测B1组腺病毒的数字PCR方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测B1组腺病毒的数字PCR方法。

背景技术

目前，数字PCR包括液滴式PCR检测方法和芯片式检测方法。芯片式检测方法中单个芯片上的有效反应腔数量一般只有数千个，远少于液滴式。所以，芯片式数字PCR的动态范围相对于液滴式较窄。液滴式PCR检测方法将样本分散成油包水的反应单元，之后对每个反应单元进行实时或终点荧光分析。

数字式PCR(digitalPCR，dPCR)是新近发展起来的第三代PCR技术，主要包括大规模集成微流控芯片数字PCR(chamberbaseddigitalPCR，cdPCR)和微滴数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)，这两种方法都是在PCR扩增前将待测DNA样本随机分配形成微反应液滴，每个微反应液滴中或者不含待测的核酸靶分子，或者至少含有一个待测的核酸靶分子，且每个微反应液滴都是一个独立的PCR反应器。经过PCR扩增后，检测器对每个微反应液滴进行检测，有荧光信号的就判定为“1”，没有荧光信号的就判定为“0”，最终根据泊松分布原理和阳性微滴的比例，直接计算出待测样本中靶序列的拷贝数或浓度。

人类腺病毒(human adenovirus，HAdV)是包含60多种血清型的病毒科，这些血清型进一步归为从A到G的7个亚组。其有一个约35kb的双链DNA基因组，该基因组被无包膜二十面体包绕，而二十面体的12个顶角均有一条纤突。纤突蛋白通过一个叫做五邻体基底的五聚多肽以非共价键形式连接在二十面体上。

根据既往报道，国内呼吸道腺病毒感染中主要以B1组和B2组呼吸道腺病毒多见。病原学监测数据显示，B亚属HAdV-7和HAdV-3是引起我国呼吸道感染性疾病主要的腺病毒型别。群体性呼吸道腺病毒感染在军队中发生率较高，影响军人工作和训练。报道显示B组腺病毒是我军最为常见的呼吸道腺病毒。腺病毒科病毒还是幼儿发热性疾病的重要病因，最常引起上呼吸道综合征，例如咽炎或鼻卡他，但也可致肺炎。较少情况下，腺病毒可致消化系统、眼、泌尿生殖系统及神经系统疾病。

因此课题组对上述腺病毒的H基因进行了序列比对，发现B1组和B2组腺病毒的H基因具有较大差异，因此分别针对两组腺病毒H基因设计了2种引物探针，并分别设计了3组和4组引物探针组合用于进一步筛选。

发明内容

本发明提供了一种检测B1组腺病毒的引物，及包括所述引物的探针引物组合、试剂、试剂盒。本发明中使用前述产品检测方法的准确高，具有较一般PCR更高的灵敏度，并且可以定量检测。

方法

一方面，本发明提供了一种检测B1组腺病毒的方法，所述方法包括使用序列如SEQID NO:1所示的advh_f3上游引物和序列如SEQ ID NO:2所示的advh_r3下游引物进行PCR。

优选地，所述检测包括鉴定、筛选、分型等含义。

优选地，所述B1组腺病毒包括但不限于3型腺病毒、7型腺病毒。

优选地，所述方法是非诊断目的的。

优选地，所述方法还包括使用序列如SEQ ID NO:3所示的advh_p3探针体现PCR结果。

优选地，所述advh_p3探针的两端连接有淬灭基团和/或荧光基团。

优选地，所述advh_p3探针5’端连接第一荧光基团。

优选地，所述advh_p3探针3’端连接第一淬灭基团。

优选地，本文所述的荧光基团(第一荧光基团、第二荧光基团)包括但不限于VIC、Texas Red、NED、PET、FAM(羧基荧光素，Carboxy fluorescein，绿色荧光)、FITC(异硫氰酸荧光素，Fluorescein isothiocyanate)、TET(四氯-6-羧基荧光素，Tetrachlorofluorescein)、HEX(六氯-6-甲基荧光素，Hexachloro fluorescein)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)、罗丹明类(Rhodamine染料如R110，TAMRA、Texas Red等)、ROX、AlexaFluor染料、ATTO染料、DyLight染料、cyanine染料(如Cy2，Cy3，Cy3.5，Cy3b，Cy5，Cy5.5，Cy7，Cy7.5)、FluoProbes染料、SulfoCy染料、Seta染料、IRIS染料、SeTau染料、SRfluor染料、Square染料。

优选地，本文所述淬灭基团((第一淬灭基团、第二淬灭基团))包括但不限于TamraNHS、Dabcyl Quencher-3’、Atto 540Q、Atto 575Q、Atto 612Q、BHQ-0(Black HoleQuencher 0，3’)、BHQ-1(Black Hole Quencher 1，3’)、BHQ-2(Black Hole Quencher 2，3’)、BHQ-3(Black Hole Quencher 3，3’)、BHQ-1(Black Hole Quencher-1，5’)、BHQ-2(Black Hole Quencher-2，5’)、BHQ-3(Black Hole Quencher-3，5’)、BBQ-650NHS(BlackBerry Quencher 650NHS)、3’-BBQ-650(Black Berry Quencher 650)、BBQ-650-dT(BlackBerry Quencher 650dT)、BHQ-1-NHS(Black Hole Quencher 1NHS)、BHQ-1-dT(Black HoleQuencher 1dT)、BHQ-2-dT(Black Hole Quencher 2dT)、Dabcyl Quencherdeoxythymidine dT、MGB 3’CDPI3、MGB-5’CDPI3、TAMRA-3’(Carboxytetramethylrhodamine)、Dabcyl-5’、Tamra-dT Carboxytetramethyl rhodamine-dT)。

优选地，所述advh_p3探针5’端连接FAM荧光基团。

优选地，所述advh_p3探针3’端连接BHQ1淬灭基团。

优选地，所述方法还包括对内参基因进行PCR的步骤。

优选地，所述内参基因包括RPP30。

优选地，所述内参基因是RPP30。

优选地，所述对内参基因进行PCR包括使用序列如SEQ ID NO:4所示的hadvh55_f4上游引物和序列如SEQ ID NO:5所示的hadvh55_r4下游引物进行PCR。

优选地，所述对内参基因进行PCR包括使用序列如SEQ ID NO:6所示的hadvh55_p4探针体现PCR结果。

优选地，所述hadvh55_p4探针的两端连接有淬灭基团和/或荧光基团。

优选地，所述hadvh55_p4探针5’端连接第二荧光基团。

优选地，所述hadvh55_p4探针3’端连接第二淬灭基团。

优选地，所述第二荧光基团与第一荧光基团相同或不相同。

优选地，所述第二荧光基团与第一荧光基团不相同。

优选地，所述第二淬灭基团与第一淬灭基团相同或不相同。

优选地，所述第二淬灭基团与第一淬灭基团相同。

优选地，所述hadvh55_p4探针5’端连接VIC荧光基团。

优选地，所述hadvh55_p4探针3’端连接BHQ1淬灭基团。

优选地，所述PCR包括基于PCR原理的扩增反应。

优选地，所述PCR是数字PCR(dPCR)。

优选地，所述数字PCR包括液滴式数字PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)和芯片式数字PCR(chamberbaseddigitalPCR，cdPCR)。

优选地，所述数字PCR是ddPCR。

优选地，所述方法还包括提取和/或处理样品的步骤。

优选地，所述样品包括采集来自人体的样品或来自环境的样品。

优选地，所述采集来自人体的样品包括血清、全血、粪便、咽拭子、鼻涕、唾液、汗液、毛发、口腔细胞、脓液、脑脊髓液、精液。

优选地，所述来自环境的样品包括细菌培养物、细菌菌落、病毒悬液、环境浓缩物、粮食、原料、水样或水浓缩物。

优选地，所述方法还包括读取结果(数值、图像)和/或定量计算的步骤。

优选地，本发明所述的引物或探针中可以包括修饰的核苷酸。

优选地，所述修饰包括磷酸骨架修饰、碱基修饰、核糖修饰。

优选地，所述磷酸骨架修饰可以是硫代修饰，硫代修饰是指核苷酸片段中磷酸二酯键中的非桥氧原子被硫原子取代。

优选地，所述磷酸骨架的修饰还可以是通过形成其它类型的磷酸酯键实现，这些磷酸酯键包括但不限于甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、甲硼基磷酸酯和双硫代磷酸酯。

优选地，所述核糖修饰可以是对戊糖的2’位进行修饰。戊糖的2’位修饰包括但不限于甲氧基、甲氧乙氧基、丙烯氧基和氟代修饰。

优选地，所述碱基修饰主要指单链脱氧核苷酸中包含稀有碱基，稀有碱基是指除A、G、C、U外的一些碱基，包括双氢尿嘧啶(DHU)、假尿嘧啶和甲基化的嘌呤(mG，mA)。

优选地，所述试剂盒中还可以包括检测其他靶核酸的试剂和/或仪器；

优选地，所述其他靶核酸包括动物基因组、植物基因组和微生物；

优选地，所述微生物包括朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体和病毒；

优选地，所述病毒包括腺病毒、肝炎病毒、流感病毒、水痘病毒、Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅰ)、Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-Ⅱ)、牛瘟病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、海胆病毒、虫媒病毒、汉坦病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒、Ⅰ型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、Ⅱ型人类免疫缺陷病毒(HIV-2)、任何披盖病毒属病毒(例如登革病毒)、甲病毒属病毒、黄病毒属病毒、冠形病毒属病毒、狂犬病毒、绿猴病毒、伊波拉病毒、副流感病毒、正粘病毒、沙粒病毒、Ⅰ型人T细胞白血病病毒、Ⅱ型人T细胞白血病病毒、猿猴免疫缺陷病毒、慢病毒、埃巴病毒、人疱疹病毒、弥猴疱疹病毒、痘病毒等；

产品

另一方面，本发明提供了一对检测B1组腺病毒的引物，所述引物包括如SEQ IDNO:1所示的advh_f3上游引物和SEQ ID NO:2所示的advh_r3下游引物。

优选地，所述引物是如SEQ ID NO:1所示的advh_f3上游引物和SEQ ID NO:2所示的advh_r3下游引物组成。

另一方面，本发明提供了一组检测B1组腺病毒的引物探针组合，所述引物包括前述advh_f3上游引物和前述advh_r3下游引物，所述探针是前述advh_p3探针。

另一方面，本发明提供了一种检测B1组腺病毒的试剂盒，所述试剂盒包括前述检测B1组腺病毒的引物或检测B1组腺病毒的引物探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括前述对内参基因进行PCR所使用的引物、引物探针组合。

优选地，所述试剂盒还包括DNA聚合酶。

优选地，所述试剂盒还包括配制前述PCR反应体系所使用的试剂。

优选地，所述试剂盒还包括可以进行前述PCR反应所需要的仪器。

应用

另一方面，本发明提供了前述引物、引物探针组合或试剂盒在检测B1组腺病毒中的应用。

另一方面，本发明提供了前述引物、引物探针组合或试剂盒在制备检测B1组腺病毒的产品中的应用。

附图说明

图1为内参基因检测第1组引物探针组合的数字PCR检测可视化结果图。

图2为内参基因检测第2组引物探针组合的数字PCR检测可视化结果图。

图3为内参基因检测第3组引物探针组合的数字PCR检测可视化结果图。

图4为采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测3型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字PCR检测可视化结果图。

图5为采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测7型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字PCR检测可视化结果图。

图6为采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测11型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字PCR检测可视化结果图。

图7为采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测14型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字PCR检测可视化结果图。

图8为采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测55型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字PCR检测可视化结果图。

图9为采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测3型和55型混合样品的数字PCR检测可视化结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

实施例1、筛选PCR位点并设计引物和探针

课题组对B1组腺病毒的H基因进行了序列比对，发现B1组腺病毒H基因的特异性较高，进而选取H基因上不同的位置为靶点设计三组引物探针，引物探针序列如表1所示：

表1.检测B1组腺病毒的引物和探针序列

采用腺病毒3型为模版，使用以上三组引物进行qPCR检测，检测使用takara的OneStep PrimeScript^TMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)(Code No.RR064)试剂盒，反应体系共25μl，其中2X one Step RT-PCR Buffer 12.5μl，TaKaRa Ex TaqHs 0.5μl，RoxReference DyeⅡ0.5μl，引物探针混合液3μl，Rnase Free dH₂O 6.5μl，DNA2μl。

反应条件为95℃10s，95℃5s，60℃34s，40个循环(收集荧光信号)。实验在ABI7500仪器上进行。

根据数据，Ct值结果展示为：

第1组：>40

第2组：25.4

第3组：17.4

使用上述同样的引物探针组合及实验方法，对腺病毒7型进行检测，Ct值结果展示为：

第1组：17.5

第2组：22.8

第3组：12.2

结合上述结果，第3组的ct值最低，继而将第3组引物与美宁康城销售的引物探针组合(厂商：南京美宁康城生物科技有限公司；产品：呼吸道腺病毒DNA检测试剂盒；货号：BP0211-32)进行比较：

对3型腺病毒的检测结果对比：本发明引物的ct值为17.46，美宁康城销售的腺病毒检测试剂的ct值为18.64；

对7型腺病毒的检测结果对比：本发明引物的ct值为12.2，美宁康城销售的腺病毒检测的ct值为11.9。

以上实验说明，本发明的引物、探针可以快速检测到样品中是否存在B1组(3型、7型等)组腺病毒。

实施例2、筛选内参基因及其引物探针

课题组采用呼吸道细胞管家基因RPP30作为内参基因，设置3组引物对照，如表2所示：

表2.检测RPP30内参基因的引物和探针序列

选择课题组保有的患者的咽拭子样本进行数字PCR检测，仪器采用TARGETING ONE系统包括微滴生成器和微滴读取仪(新羿生物)A300 Fast Thermal Cycler快速梯度PCR仪(LongGene朗基)。

反应体系：预混液15μl【引物探针混合液：adv7型引物500nM、探针200nM、RPP30引物600nM、探针300nM(浓度为PCR体系终浓度)】、3μl ADV7+3μl RPP30、7μl H₂O、2μl模板。

扩增条件为：95℃600s，94℃30s，55℃60s，42个循环，12℃300s，变温速度设置为1.5度/秒。

数字PCR检测的样本拷贝数结果如表3所示：

表3.3组引物探针组合进行检测的拷贝数

样品编号	1	2	3
				样本备注信息	z2，rpp30-1	z2，rpp30-2	z2，rpp30-3
拷贝数(VIC)	357.3	467.6	374.6

同时数字PCR检测可视化图如图1-3所示，图中绿色(浅色，右侧)数据点为阳性点，第三组引物探针组合RPP30-3的数据点最为密集、与对照的黑色数据点区分最明显，检测效果最好。

以上数据说明，对于内参基因筛选的探针引物可以稳定的检测到内参RPP30，可以起到指示检测效果的作用，所以继续使用本实施例筛选到的引物探针组合进行下一步实验。

实施例3、B1引物探针分别检测AdV3、AdV7、AdV11、AdV14、AdV55型腺病毒的结果

对实施例1筛选到的B1组腺病毒检测引物探针和实施例2筛选到的内参基因引物探针在数字PCR检测中的检测效果进行验证。其中健康人咽拭子提取物主要为待测样本提供内参基因。

仪器：新羿TD-1微滴式数字PCR系统、A300 Fast Thermal Cycler快速梯度PCR仪(LongGene朗基)。

反应体系：预混液15μl【引物探针混合液：adv7型引物500nM、探针200nM、RPP30引物600nM、探针300nM(浓度为PCR体系终浓度)】、3μl ADV7+3μl RPP30、7μl H₂O、2μl模板。

扩增条件：95℃600s，94℃30s，55℃60s，42个循环，12℃300s注意：变温速度设置为1.5度/秒。结果如下：

结果如下：

图4显示采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测3型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字PCR检测结果，图为3次重复实验结果。三次检测的3型腺病毒检测拷贝数分别为：33153.4，30616.5和34048.7；而三次检测的内参基因拷贝数分别为：286.8，250.7和286.1。

图5为采用B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测7型腺病毒与健康人咽拭子混合物的数字PCR检测结果，图为3次重复实验结果。其中7型腺病毒拷贝数分别为：3874.8、3725.6和3410.9；而内参基因拷贝数为：281.8、308和295。

以上结果显示，相关引物和探针在数字PCR检测中具有良好稳定的检测效果。

图6为B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测11型腺病毒与健康人咽拭子提取物混合样本的数字PCR检测结果图。其中腺病毒检测拷贝数均为0，内参基因检测拷贝数为312.2、292.8和285.5。

图7为B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测14型腺病毒与健康人咽拭子提取物混合样本的数字PCR检测结果图，图为3次重复实验结果。其中腺病毒检测拷贝数均为0，内参基因检测拷贝数为274.1、312.1和231.2。

图8为B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物检测55型腺病毒与健康人咽拭子提取物混合样本的数字PCR检测结果图，图为3次重复实验结果。其中腺病毒检测拷贝数均为0，内参基因检测拷贝数为235.3、273.9和267.7。

上述结果显示B1组腺病毒引物探针和内参基因引物探针混合物具有良好的检测特异性。

图9是对B1组(3型)和B2组(55型)混合样品进行的检测，由结果图可知只会检测到3型腺病毒，而不会检测到55型腺病毒；说明本发明引物探针特异性良好。

实施例4、通过qPCR验证本发明设计B1组腺病毒引物探针与美宁康城销售腺病毒 检测试剂盒在患者检测中的优势

采用5例腺病毒7型感染者咽拭子样本，分别采用本发明设计B1组腺病毒引物探针以及美宁康城销售腺病毒检测试剂盒进行qPCR检测，结果如下表4所示：

表4.样品名称和检测结果

本实施例的结果发现，本发明设计引物探针在本次临床样本的qPCR检测中略好与美宁康城销售的腺病毒引物探针相比。其中在SAMPLE2和SAMPLE4的检测中，美宁康城试剂检测的ct值可判定为灰区检测值或接近灰区检测值，而本发明设计的引物探针组合为33左右，可直接判定为阳性，显示本发明中的引物探针组合在处于临界值的样本检测中具有一定的优势。

实施例5、最低检测限的确定

采用B1组引物探针+本研究组另外一项发明的引物探针组合(B2组引物探针，序列依次如SEQ ID NO:7-9所示)+内参基因引物探针组合检测60例健康人的咽拭子样本，结果如表5。

经计算最低检测限位5copies/test(计算方法如表6所示，参考文献(Milbury etal.2014))。B1组引物探针单独使用时的最低检测限不会高于混合以后的最低检测限。因此B1组/内参基因引物探针组合/B2组的引物探针组合分别的最低检测限为5copies/test，或者低于5copies/test。

本发明所提供的B1组引物探针在检测上具有良好的特异性，并不会受内参探针引物或B2组引物探针的影响。

表5. 60例健康人的数字PCR检测数据

表6.最低检测限计算方法

序列表

<110> 中国人民解放军总医院第五医学中心

<120> 一种检测B1组腺病毒的数字PCR方法

<141> 2021-08-11

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgagggata caaggatc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggctttgtag tcagtgta 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcaaccacc tgcctgctca ta 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcttttgaa cttgtctata 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcagatttgc atcaaattg 19

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagactccac aatgagaagg tatacaa 27

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagaaggat acaaagatc 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gccttgaagt ctttgtaa 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcaaccacc tgcctgctca 20

Claims (18)

1.一种非诊断目的的在腺病毒中鉴定B1组腺病毒的方法，所述方法包括使用序列如SEQ ID NO:1所示的advh_f3上游引物、序列如SEQ ID NO:2所示的advh_r3下游引物和序列如SEQ ID NO:3所示的advh_p3探针进行数字PCR，

所述B1组腺病毒是3型腺病毒和7型腺病毒。

2.如权利要求1所述的方法，所述advh_p3探针的两端连接有淬灭基团和荧光基团。

3.如权利要求2所述的方法，所述advh_p3探针5’端连接FAM荧光基团。

4.如权利要求2所述的方法，所述advh_p3探针3’端连接BHQ1淬灭基团。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对内参基因进行数字PCR的步骤，所述内参基因包括RPP30。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，对内参基因进行PCR包括使用序列如SEQ IDNO:4所示的 hadvh55_f4上游引物、序列如SEQ ID NO:5所示的hadvh55_r4下游引物和序列如SEQ ID NO:6所示的hadvh55_p4探针进行数字PCR。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述hadvh55_p4探针的两端连接有淬灭基团和荧光基团。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述hadvh55_p4探针5’端连接VIC荧光基团。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述hadvh55_p4探针3’端连接BHQ1淬灭基团。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述数字PCR是微滴式数字PCR。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提取样品的步骤。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述样品包括来自环境的样品。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述来自环境的样品包括细菌培养物、病毒悬液、环境浓缩物、粮食、水样或水浓缩物。

14.一组检测B1组腺病毒的引物探针组合，所述引物包括序列如SEQ ID NO:1所示的advh_f3上游引物、序列如SEQ ID NO:2所示的advh_r3下游引物和序列如SEQ ID NO:3所示的advh_p3探针，

所述B1组腺病毒是3型腺病毒和7型腺病毒。

15.一种检测B1组腺病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括权利要求14所述的检测B1组腺病毒的引物探针组合，

所述B1组腺病毒是3型腺病毒和7型腺病毒。

16.如权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括序列如SEQ ID NO:4所示的hadvh55_f4上游引物和序列如SEQ ID NO:5所示的hadvh55_r4下游引物。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括序列如SEQ ID NO:6所示的hadvh55_p4探针。

18.权利要求14所述的检测B1组腺病毒的引物探针组合或权利要求15所述的检测B1组腺病毒的试剂盒在制备鉴定B1组腺病毒的产品中的应用，

所述B1组腺病毒是3型腺病毒和7型腺病毒。

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