CN105671212A - 腺病毒分型基因芯片的制备和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可分型检测腺病毒的基因芯片的制备和用途，其制备方法包括制备不同型别腺病毒的特异性引物和探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可甄别腺病毒的不同型别，包括3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为不同型别腺病毒感染的临床诊断和流行病学调查提供一种新的检测手段。

Description

腺病毒分型基因芯片的制备和用途

技术领域

本发明涉及腺病毒分型基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。

背景技术

腺病毒是引起人类呼吸道和消化道感染的重要病原之一。它是双螺旋DNA基因组病毒，无囊膜，具有众多的血清型。目前鉴定的有57个血清型，分为7个亚属(A-G)，不同的血清型引起不同的疾病，其中，C、E和B亚属主要引起呼吸道疾病，其它B亚属主要引起尿路感染，A、F和G主要引起消化道感染，D亚属主要引起角膜炎和结膜炎。在人类腺病毒感染中约50％引起相关症状，如流行性角膜炎以及婴儿肠炎也可引起肺炎的流行。因此，准确的判断其型别对腺病毒的早期诊断和治疗具有重要意义。

腺病毒致病的潜伏期为3-8天，在潜伏期末和急性感染期传染性最强。我国不同地区先后发生多起腺病毒引起的呼吸道感染传染病疫情，全球也多次暴发腺病毒在新兵中流行，疫情传染性强，传播速度快，严重者会导致死亡。临床上婴幼儿急性上呼吸道感染有5％是腺病毒引起的，在小于5岁的儿童急性呼吸系统疾病中腺病毒一起的肺炎较为严重，在大规模流行时，其病死率较高。若能在感染早期做出正确诊断，进行正确的治疗，可有效地避免其快速传播，可有效控制疫情的发展。因此快速、准确的早期诊断是是控制其快速传播的关键。

目前腺病毒检测方法主要有免疫学方法(病毒分离实验、血清中和实验、抗原抗体检测等)，此方法耗时长，操作复杂，不能准确地确定型别；PCR法只能检测一种或几种病原体，不能检测众多的血清型；基因测序主要用于病毒新型别的确定。基因芯片技术具有快速、准确、低成本、高通量的特点，能够快速完成腺病毒不同血清型的分型。

发明内容

本发明的目的在于针对腺病毒分型领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的腺病毒分型基因芯片，能同时甄别5种腺病毒的型别，包括3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒，为腺病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。

为了达到上述目的，本发明腺病毒分型基因芯片，其制备方法如下：

1.步骤一：制备腹泻病毒特异性引物

选择腺病毒的hexon基因作为检测靶基因，可以实现腺病毒靶基因片段的扩增。优选4对引物序列及其对应的扩增靶标，其中11型和55型共用1对引物，如表1所示：

表1引物序列及对应的扩增靶标

2.步骤二：制备特异性寡核苷酸探针

根据这五型腺病毒基因序列间的比对及每型腺病毒型内的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。腺病毒特异性探针序列以及对应的靶标，如表2所示：

表2寡核苷酸探针序列及对应的靶标

3.步骤三：制备寡核苷酸芯片

一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3μl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥48小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括腺病毒5条特异性探针，其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH₂修饰，用来监测醛基片片基质量；阴性探针为与腺病毒无关的植物基因序列，用来指示特异性；所有探针的点样量均为3μl，使用前至少在室温放置干燥48小时。

表3寡核苷酸探针阵

片基质控	片基质控	片基质控	阳性探针	阳性探针	阳性探针
						ADV3	ADV7	ADV14	ADV11	ADV55	内标
ADV3	ADV7	ADV14	ADV11	ADV55	内标
						ADV3	ADV7	ADV14	ADV11	ADV55	内标
空白对照	空白对照	空白对照	阴性探针	阴性探针	阴性探针

4.步骤四：建立多重不对称PCR体系

本发明基因芯片中PCR体系的特征为1管多重不对称PCR反应体系。合适的多重不对称PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的多重PCR体系，如表4所示：

表4多重不对称PCR体系配方

优选的PCR扩增条件为：；95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环；72℃延伸5min。

5.步骤五：建立杂交体系

合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物(5μl)与杂交液(5μl)等体积混合，优选的杂交液各成分为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，10×Denhardt。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

6.步骤六：化学发光显色1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。

以上制备的腺病毒分型基因芯片，包括寡核苷酸芯片、PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B。

一个优选的实施方案使用市售的DNA提取试剂盒(磁珠法)提取腺病毒核酸，提取参照相应的试剂盒说明书进行。提取的DNA溶液使用多重PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行扩增。PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五和步骤六的条件进行杂交和显色。

洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行成像，并运用分析软件判读结果。选择流感病毒、麻疹病毒、40型腺病毒、41型腺病毒和风疹病毒作为样本，利用上述制备的基因芯片进行检测，考察芯片的特异性。制备质粒DNA灵敏度参考品，考察芯片的最低检测限。结果：腺病毒的检测限均为3×1000copies/反应。

使用本发明制备的基因芯片分型3、7、14、11、55型腺病毒样本(全血)。本芯片法分型五种腺病毒样本，直接从全血样本中提取腺病毒核酸，与测序结果一致，经多重不对称RT-PCR扩增后与基因芯片杂交，结果显示，样本基因芯片检测符合率达到100％。表明本实验所建立的基因芯片方法可以对样本中的腺病毒进行准确分型。

本发明建立了一种基于化学发光成像法的基因芯片，可同时甄别五种常见腺病毒的型别，包括3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为腺病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段。性能考察表明，本发明的基因芯片以对五种腺病毒的型别进行准确甄别，特异性良好。本发明芯片对七种腹泻病毒的检测灵敏度为3000copies/反应。

附图说明

图1：为本发明腺病分型毒基因芯片的阵列示意图，每张芯片上分布有10个相同阵列。

图2：腺病毒分型基因芯片上每个阵列上具体排列布局。图中一个原点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。1号对应的是片基质控探针；2号对应的是阳性对照探针；3号对应的是3型腺病毒特异性探针；4号对应的是7型腺病毒特异性探针；5号对应的是14型腺病毒特异性探针；6号对应的是11型腺病毒特异性探针；7号对应的是55型腺病毒特异性探针；8号对应的是内标探针；9号对应的是空白对照：10号对应的是阴性对照探针。

图3：腺病毒分型芯片检测图。其中1-5依次为3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒，腺病毒分型芯片检测结果。

图4：基因芯片特异性检测结果图。其中1-5依次为流感病毒、麻疹病毒、40型腺病毒、41型腺病毒和风疹病毒的检测结果图。

图5：腺病毒质粒DNA参考品的灵敏度检测结果图。其中1-6依次为3型腺病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；7-12依次为7型腺病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；13-18依次为14型腺病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；19-24依次为11型腺病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果；25-30依次为55型腺病毒3×10⁵copies、3×10⁴copies、3×10³copies、3×10²copies、3×10¹copies质粒DNA参考品和阴性对照检测结果。

图6：腺病毒分型基因芯片样本检测结果图。1为3型腺病毒样本检测结果；2为7型腺病毒样本检测结果；3为14型腺病毒样本检测结果；4为11型腺病毒样本检测结果；5为55型腺病毒样本检测结果。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：五种腺病毒分型基因芯片的研制

一、引物探针设计和筛选

首先从NCBI基因数据库中下载腺病毒靶基因序列，序列下载完成后，使用VectorNTIAdvance10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各型别基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、通用及特异性引物。经过筛选最终确定共8条上下游引物，将反向引物进行5’端bio标记，作为芯片使用的引物；确定5条特异性检测探针，3’端NH₂修饰。

二、寡核苷酸芯片制备及探针阵列

完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见附图1和附图2。1号对应的是片基质控探针；2号对应的是阳性对照探针；3号对应的是3型腺病毒特异性探针；4号对应的是7型腺病毒特异性探针；5号对应的是14型腺病毒特异性探针；6号对应的是11型腺病毒特异性探针；7号对应的是55型腺病毒特异性探针；8号对应的是内标探针；9号对应的是空白对照：10号对应的是阴性对照探针。

三、多重不对称PCR体系

本发明中PCR体系的特征为一管五重不对称PCR体系。合适的PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。当上下游引物终浓度为0.08μM：0.4μM，Taq酶的用量2.5U/体系，参考品的探针信号值较强，且低拷贝模板10³copie/μl仍然可以检出。优选的PCR扩增条件为：95℃预变性10min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，共40个循环；72℃延伸5min。

四、建立并优化杂交体系

通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，10×Denhardt。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。

五、化学发光显色

1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。

2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。

实施例2：腺病毒分型基因芯片的特异性评价

特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明的基因芯片使用优化好的体系和条件，检测了流感病毒、麻疹病毒40型腺病毒、41型腺病毒和风疹病毒，由附图4可以看出，上述病毒检测结果都呈五种腺病毒阴性，特异性良好。本发明分型检测五个型别腺病毒，由附图3可以看出，五个型别腺病毒均可以明显区分，说明本发明特异性良好。

实施例3：腺病毒分型基因芯片灵敏度评价

构建腺病毒质粒DNA作为检测参考品，从10⁵copies/μl梯度稀释至10¹copies/μl，进行芯片检测，结果见附图5。由附图5可以看出，本发明的检测限：腺病毒分型检测限均为3×1000copies/反应。

实施例4：腺病毒分型基因芯片样本检测

使用本发明制备的基因芯片，检测分型临床样本中的腺病毒。样本中腺病毒核酸的提取，使用病毒DNA核酸提取试剂盒(磁珠法)提取样本中的腺病毒核酸，与测序结果一致。样本核酸检测，按照说明书中的操作方法进行检测，检测结果阳性率为100％，部分检测结果见附图6。

除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种可以分型检测腺病毒的基因芯片，本发明的基因芯片可以用于同时分型检测3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒和55型腺病毒。其特征是包含分型检测腺病毒的4对特异性引物和1对内源性内标引物，其中11型和55型腺病毒共用1对引物；5条腺病毒特异性寡核苷酸探针；1条片基质控探针，1条阳性对照探针，1条空白对照探针，1条阴性对照探针，1条内源性内标探针和载体。上述探针分别分布在载体上。

表13型腺病毒扩增引物

表27型腺病毒扩增引物

表314型腺病毒扩增引物

表411和55型腺病毒扩增引物

表5内标扩增引物

表6腺病毒特异性寡核苷酸探针序列

2.根据权利1所述的腺病毒分型检测基因芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。

3.腺病毒分型检测基因芯片的制备方法，包括以下步骤：

步骤一，探针和引物的设计：首先从NCBI基因数据库中下载以上五型腺病毒基因序列，使用VectorNTIAdvance10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各型别腺病毒基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、特异性引物。

步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个碱基T且3’末端T氨基修饰作为连接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’末端T进行氨基修饰外，5’端同时标记生物素标记；

步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM，分别取10μl探针溶液，和10μl芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μM，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用PersonalArrayer^TM16个人点样仪(博奥生物有限公司)，将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，点制好的芯片常温干燥保存。

4.根据权利要求3所述的腺病毒分型检测基因芯片的制备方法，其特征是步骤一中5条特异性寡核苷酸探针及4对引物，探针长度在17-20nt，引物长度在20-24nt。

5.根据权利要求3所述的腺病毒分型基因芯片的制备方法，其特征是步骤三种所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。

6.腺病毒分型基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：

1)步骤一，腺病毒核酸的提取，使用市售商品化病毒基因组DNA提取试剂盒提取腺病毒核酸；

2)步骤二，多重不对称PCR扩增：扩增使用康为公司的PCR试剂，扩增整个体系。包括3型腺病毒、7型腺病毒、14型腺病毒、11型腺病毒、55型腺病毒和内标。扩增按以下循环参数进行扩增：95℃预变性10min，95℃30s、55℃30s、72℃30s共40个循环，72℃延伸5min，4℃保存或进行下一步实验；

3)步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％SDS和去离子水中分别清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性产物5μl与5μl杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；

4)步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1×SSC+0.2％SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30s，最后将基因芯片表面液体离心干燥；

5)步骤五，样品标记：向芯片加入10μl标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥；

6)步骤六，成像：向芯片反应区加入刚刚1∶1混合的发光液A和B的混合溶液，用移液器涂匀后立即置于化学发光成像仪中成像，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数300，曝光时间10s，触发次数1次；

7)步骤七，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析。每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值＞该探针Cutoff值的判读为该探针信号阳性。本发明使用方法的步骤二中PCR使用的反向引物修饰分子为生物素。本发明使用方法步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。

7.根据权利要求6所述的腺病毒分型基因芯片的使用方法，其特征是步骤二中使用的用于扩增腺病毒各特异性基因的反向引物5’端进行修饰。

8.根据权利要求7所述的反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素。

9.根据权利要求6所述的腺病毒分型基因芯片的使用方法，其特征是步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。

10.根据权利要求6所述的腺病毒分型基因芯片的使用方法，其特征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求8中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包括荧光扫描，可见光扫描，化学发光成像。