CN109097488A - 用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的核酸、方法及试剂盒 - Google Patents
用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的核酸、方法及试剂盒 Download PDFInfo
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明提供一组用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的基因芯片的核酸，包括犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒五种犬腹泻病毒的上、下游引物和杂交探针。本发明还提供上述五种犬腹泻病毒多重基因芯片高通量分子生物学检测方法。该方法通过提取待检样品中的犬腹泻病毒核酸，进行多重基因芯片检测，实现同步准确检测鉴别待测样品中上述五种犬腹泻，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、操作简便，并具有高通量快速检测的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于同步检测鉴别犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒五种犬腹泻病毒的核酸、检测方法及检测试剂盒。
背景技术
犬腺病毒病(Canine adeno，CA)是由犬腺病毒感染引起犬的一种急性传染病，犬腺病毒属于腺病毒科哺乳动物病毒属，是无囊膜dsDNA病毒；犬腺病毒包括犬腺病毒1型(Canine adenovirus type 1，CAV-1)和犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2，CAV-2)，CAV-1主要引起犬传染性肝炎，也可感染熊、狐狸引起脑炎病变，主要感染幼犬；CAV-2主要引起犬传染性喉气管炎，其传播速度快，病程急，对犬类造成了严重的危害。犬冠状病毒病是由犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCV)感染主要引起犬腹泻的一种急性接触性传染病，在世界范围内广泛分布，属于冠状病毒科冠状病毒属，其病死率较高且宿主范围在不断扩大，如熊猫、水貂等。犬瘟热(Canine distemper,CD)主要以犬的呼吸系统、消化系统、神经系统等病变为临床症状，由犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)引起，属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，其基因组为单股负链RNA病毒。由于该病毒极易变异的特性其自然感染宿主也在不断扩大，具相关报道人也有感染CDV并致死的病例。犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)主要引起犬的临床症状包括急性肠胃炎和非化脓性心肌炎两种类型，属于细小病毒科，细小病毒属，其基因组为无囊膜、单股负链DNA病毒。该病毒自1978年被发现后病毒基因基因组一直在不断发生着变异，目前，CPV主要包括4个基因亚型，主要包括CPV-2a，CPV 2b，CPV 2c(a)以及CPV-2c(b)。
以上所述关于犬的5种腹泻病毒，如果采用传统的检测技术如胶体金、PCR等在特异度和灵敏度方面均存在着弊端，胶体金不能同时检测五种病毒，常规PCR方法主要为二重和三重方法，但上述已发表的多重方法的实际检测效果均不理想。目前多重常规PCR或多重实时荧光PCR遇到的主要问题是多重反应带来的检测灵敏度和特异性下降，这由于在多重体系中存在有多条引物、探针、相互之间竞争模板、dNTP、酶等资源以及交叉反应问题。但对于能否对五种病毒同时实现检测，目前，鲜有报道，主要是由于要实现多种病毒要同时检测，必须保证检测这几种病原所采用的引物、探针及扩增产物，相互之间不能出现交叉反应，否则，容易出现假阳性结果，尤其是检测病毒因子越多，设计引物、探针的难度越大。
发明内容
本发明的目的是提供同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的核酸及其方法和试剂盒，一种同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的方法，具有高通量、快速、特异、灵敏、并且操作简便、稳定性好、成本低等特点。同时开发出可用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的检测试剂。
为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：
一组同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的核酸，包括犬腺病毒1型(CAV1)、犬腺病毒2型(CAV2)、犬冠状病毒(CCV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)五种犬腹泻病毒的上游引物、下游引物，其中，
所述CAV1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，该上游引物序列5’端标记生物素，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
所述CAV2的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示；
所述CCV的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；
所述CDV的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示；
所述CPV的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示。
如上所述的核酸，还包括用于基因芯片检测时，五种犬腹泻病毒的探针，所述五种犬腹泻病毒的探针包括CAV1的探针、犬CAV2的探针、CCV的探针、CDV的探针和CPV探针，其中，所述CAV1的探针如SEQ ID No.11-13所示；
所述CAV2的探针如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示；
所述CCV的探针如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示；
所述CDV的探针如SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示；
所述CPV的探针如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示；
各下游引物5’端尾序列进行荧光标记。
进一步，所述荧光标记为CY3、FAM标记。
一种用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种犬腹泻病毒上游引物和下游引物。
一种用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的基因芯片的试剂盒，所述试剂盒包括上述CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种犬腹泻病毒上游引物、下游引物和探针。
如上所述的试剂盒还包括2×ES Taq Master Mix。
一种同步检测鉴别CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种犬腹泻病毒的基因芯片检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)、提取待检样品的核酸；
(2)、利用如上所述检测鉴别CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种犬腹泻病毒的的上游引物、下游引物对上述步骤(1)提取的待检样品的核酸进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)、利用如上所述CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV的探针点制在醛基化玻璃基片上，同时还设有点样质控探针、阳性质控探针和阴性质控探针；
(4)、利用如上所述CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV的探针，与步骤(2)获得的扩增产物进行杂交反应；
(5)、用微阵列芯片扫描仪检测步骤(4)杂交反应后的结果，根据检测的本底值，判定检测结果。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤(2)中，所述PCR扩增的程序为:94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min 15s，共35个循环；72℃延伸10min。
如上所述的检测方法，优选地，在步骤(3)中，同时还设有点样质控探针、阳性质控探针和阴性质控。
本发明的有益效果在于：
本发明提供了一种能够同步快速检测鉴别五种犬腹泻病毒的新型高通量基因芯片的核酸及检测方法。其检测方法具有高通量、样品用量少，操作简便，反应快速、灵敏度高、特异性强、重复性、稳定性好等特点。
本发明方法可准确检测鉴别犬腺病毒1型、犬腺病毒2型、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒五种犬腹泻病毒，五种病毒相互之间、以及对其它常见犬腺病毒均没有交叉反应，能够准确识别多重感染的情况。
附图说明
图1为CAV1、CAV2、CCV、CDV、CPV的PCR扩增结果，其中，M：D2000；1：CAV1；2：CAV2；3：CCV；4：CDV；5：CPV。
图2为CAV1、CAV2、CCV、CDV、CPV基因芯片检测结果。
图3为芯片特异性试验检测结果，其中，(1)为CAV1、CAV2、CCV、CDV、CPV的质粒DNA模板等体积混合；(2)为CPIV质粒DNA模板；(3)为CIV质粒DNA模板。
图4为基因芯片敏感性实验结果，其中，1：CAV1DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释；2：CAV2 DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释；3：CCV DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释；4：CDV DNA模板浓度从左到右依次为102-103倍稀释；5：CPV DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释。
图5为琼脂糖凝胶电泳敏感性实验结果，其中，1：CAV1DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释；2：CAV2 DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释；3：CCV的DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释；4：CDV的DNA模板浓度从左到右依次为100-102倍稀释；5：CPV的DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释。
具体实施方式
下面结合实施例详细介绍本发明，应理解，本发明要求保护的范围不受所述具体实施方案的限制，本发明提供的具体实施例仅作为进一步说明本发明的例子，本领域技术人员参照本案说明书的描述可以很容易对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换，这些无需创造性劳动的改进和替换也应落入本发明权利要求书的保护范围之内。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。其中，下面实施例中所用的DNA提取试剂盒、RNA提取试剂盒、质粒小题试剂盒均可购自天根生化科技有限公司，GoldScript cDNA合成试剂盒可购自invitrogen公司，醛基化玻璃基片、芯片点样液可购自博奥生物有限公司；PCR仪、凝胶成像仪可购自BioRad公司，芯片点样仪可采用博奥生物有限公司的Personal Arrayer 16，芯片杂交仪可采用博奥生物有限公司的Bio MixerⅡ，芯片洗干仪可采用博奥生物有限公司的Slide Washer 8，微阵列芯片扫描仪可采用博奥生物有限公司的Lux Scan 10K-A。
实施例1引物、探针的设计与合成
从NCBI网站上下载收录的CAV1、CAV2、CCV、CDV、CPV标准毒株基因组序列，通过DNAStar软件选取各病毒标准毒株的保守区域，并通过Primer5软件进行引物设计，共设计优化出5对引物，且对下游引物5’端尾序列进行CY3标记。根据设计好的引物区间范围选取各代表毒株高度变异区间进行探针的设计，为了改善探针空间位阻的影响，可在5’端加入15各以内T碱基，并对设计好的探针进行BLAST以检查其特异性。其引物、探针见表1、表2。
表1特异性引物序列
表2特异性探针序列
实施例2 PCR扩增
(1)PCR扩增
CAV1、CAV2、CCV参考NCBI网站上登录的各病毒基因序列并由上海生工有限公司合成质粒，CDV、CPV由临床阳性病料提取获得，并通过天根生化科技有限公司生产的质粒小提试剂盒提取制备质粒。以提取好的DNA、cDNA为模板，经PCR扩增，PCR体系为25μl：2×ES TaqMaster Mix12.5μl，上游引物(10pmol/L)1.0μl，下游引物(10pmol/L)1.5μl，模板1.0μl，用RNase-Free Wate补足体积至25μl。PCR程序为:94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 15s，共35个循环；72℃延伸10min。
PCR扩增结果如图1所示。
(2)质粒的构建
将PCR产物与pEASY-T5载体连接，并将连接产物转化至Trans1-T1感受态细胞中，挑取阳性克隆菌落进行扩大培养，使用天根生化科技有限公司生产的质粒小提试剂盒提取质粒，并做质粒PCR鉴定。
实施例3基因芯片的检测方法的建立
(1)提取待检样品的核酸并进行逆转录；
(2)按照如实施例2所述方法进行扩增
(3)制备芯片
将上海生工生物工程有限公司合成的寡聚核苷酸探针用蒸馏水稀释至40μmol/L，各取5μL加入至A384板中，并取5μL芯片点样液进行稀释，使用Personal Arrayer 16芯片点样仪将探针点制在醛基化玻璃基片上(见表3)，每条探针重复点样3次，其微阵列布局共包含点样质控探针HEX、阳性质控探针P、阴性质控探针的点样液N以及11条特异性探针。点样结束后将芯片放置37℃12h以上，之后用0.2％SDS洗涤，用清水洗干净后进行封闭，最后用蒸馏水进行清洗并离心甩干放置4℃保存。
表3寡聚核苷酸探针微阵列
备注：H为芯片点样质控，P为芯片杂交阳性质控，N为芯片杂交阴性质控，其中A1T1是指CAV1的ST1探针，A1T2是指CAV1的ST2探针，A1T4是指CAV1的ST4探针，A2T1是指CAV2的ST1探针，A2T2是指CAV2的ST2探针，CT2是指CCV的ST2探针，CT3是指CCV的ST3探针，DT4是指CDV的ST4探针，DT7是指CDV的ST7探针，PT3是指CPV的ST3探针，PT4是指CPV的ST4探针。
(4)杂交
取按实施例2中7μl扩增好的PCR产物与8μl现配好的杂交液混匀，放置于PCR仪上95℃变性5min，立即置于冰上至少5min，小心取出15μl杂交样品加入到十样品围栏里，注意避免气泡的产生，然后将芯片放入杂交盒中，为了保证杂交盒的湿度，需要在杂交盒的底部放置滤纸并滴加少量的蒸馏水，封闭杂交盒放于杂交仪里，设置温度为40℃，时间为1.5h。
(5)基因芯片的洗涤及结果扫描分析
将杂交好的芯片放入清洗仪中进行清洗，设置清洗仪具体步骤：42℃清洗液I(2×SSC，0.2％SDS)洗涤2分钟，重复2次；42℃清洗液II(0.2×SSC)洗涤2分钟，重复3次，取出芯片放入离心机中离心甩干。最后将芯片放入微阵列芯片扫描仪Lux Scan 10K-A中，设定参数，扫描记录结果并进行分析。将实施例2中制备好的CAV1、CAV2、CCV、CDV、CPV质粒为模板进行PCR扩增，之后PCR产物与杂交液与杂交并转入十围栏芯片中，基因芯片所检测的病毒均在各自病毒的探针所在位置发生特异性杂交，而与其它病毒的探针无特异性杂交，结果如图2所示。
实施例4特异性试验
以犬副流病毒(CPIV)、犬流感病毒(CIV)2种犬常见病毒提取的基因组为模板按照相同的实验方法进行PCR扩增，再按照实施例3操作进行芯片杂交试验，以验证所建立的芯片检测方法对CAV1、CAV2、CCV、CDV、CPV的特异性。将实验室保存的犬副流病毒(CPIV)、犬流感病毒(CIV)提取基因组并进行PCR扩增，其PCR产物与建立好的芯片检测方法进行杂交，结果如图3所示，除HEX和阳性探针P为阳性外，其余均为阴性，说明所建立的芯片检测方法具有很好的特异性。
实施例5灵敏性试验
以实施例2制备好CAV1、CAV2、CCV、CDV、CPV质粒(浓度为20ng/μl)进行梯度稀释，再以每个梯度质粒为模板进行PCR扩增并检测，同时将PCR产物进行如实施例3所述的基因芯片杂交。结果如图4所示。1：CAV1DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释；2：CAV2 DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释；3：CCV DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释；4：CDV DNA模板浓度从左到右依次为102-103倍稀释；5：CPV DNA模板浓度从左到右依次为102-109倍稀释。
实施例6临床样品检测
将从北京、山东、湖南地区收集的犬粪便临床样品进行基因组的提取，同时进行普通PCR和基因芯片检测，以此来对两种检测方法进行比较。
将北京、山东、湖南地区收集的犬粪便临床样品按照DNA提取试剂盒说明进行稀释并进行DNA、RNA提取，以提取的基因组为模板进行如实施例2所述的PCR扩增，其中下游引物为带有CY-3标记的荧光引物。最后将PCR产物进行杂交并用建立好的芯片检测方法如实施例3中方法进行检测。
2在45份临床样品中，根据临床症状抽检14份样品进行后续试验，结果如表4所示，结果表明，本试验所建立的基因芯片检测方法可以用于临床粪便样品的检测，并且其灵敏性要高于PCR检测方法。
表4芯片临床样品试验检测结果
实施例7琼脂糖凝胶电泳敏感性实验结果
采用实施例2建立的PCR方法，对单一的各病毒的模板进行10倍比梯度稀释，之后进行扩增，其扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示，其中，1：CAV1的DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释；2：CAV2的DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释；3：CCV的DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释；4：CDV的DNA模板浓度从左到右依次为100-102倍稀释；5：CPV的DNA模板浓度从左到右依次为100-107倍稀释。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的核酸、方法及试剂盒
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccacacacc ttgccttc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agctgtctca gtcataat 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acattgtgac ttgctgcg 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tccagaaagg cgggatagaa 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggtgctaat aatgaatcca a 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gtcacatcac ctttacctgc 20
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aactaaggat ccaggatcct t 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcactgatc tcatttctgt 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acaccttggt cattggttga 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tctggatctg taccatggta t 21
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttttttttta gggagtccat caaactggtc catgggac 38
<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tttttttttt ttttttgtac aacagaatac cctttct 37
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttttcctca ttcccatggt gcatgggact aatgccgg 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tttttttttt ctgcaaactt ttctgaggat ggcctgta 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tttttttttt ttcaacgaga tgcctcttcc cagcgtaa 38
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tttttttttt ttaattccag cttgaagtga acc 33
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tttttttttt ttctggaaga gaactgcagg taa 33
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ttttttttca cgtacccgtt cgtgacatct ctctgagg 38
<210> 19
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttttttgcaa aggactgcgt ggcagtaagg tctccttc 38
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tttttaatac catgccattt actccagcag ctatgaga 38
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttccatggaa accaaccata ccaactccat ggagatat 38
Claims (8)
1.一组同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的核酸，其特征在于，其包括犬腺病毒1型(CAV1)、犬腺病毒2型(CAV2)、犬冠状病毒(CCV)、犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)五种犬腹泻病毒的上游引物、下游引物，其中，
所述CAV1的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，该上游引物序列5’端标记生物素，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
所述CAV2的上游引物序列如SEQ ID No.3所示，下游引物序列如SEQ ID No.4所示；
所述CCV的上游引物序列如SEQ ID No.5所示，下游引物序列如SEQ ID No.6所示；
所述CDV的上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示；
所述CPV的上游引物序列如SEQ ID No.9所示，下游引物序列如SEQ ID No.10所示。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，还包括用于基因芯片检测时，五种犬腹泻病毒的探针，所述五种犬腹泻病毒的探针包括CAV1的探针、犬CAV2的探针、CCV的探针、CDV的探针和CPV探针，其中，所述CAV1的探针如SEQ ID No.11-13所示；
所述CAV2的探针如SEQ ID No.14和SEQ ID No.15所示；
所述CCV的探针如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示；
所述CDV的探针如SEQ ID No.18和SEQ ID No.19所示；
所述CPV的探针如SEQ ID No.20和SEQ ID No.21所示；
各下游引物5’端尾序列进行荧光标记。
3.一种用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种病毒上游引物和下游引物。
4.一种用于同步检测鉴别五种犬腹泻病毒的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种病毒上游引物、下游引物和探针。
5.根据权利要求3所述的PCR试剂盒，其特征在于还包括2×ES Taq Master Mix。
6.一种同步检测鉴别CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种犬腹泻病毒的基因芯片检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)、提取待检样品的核酸并进行逆转录；
(2)、利用如权利要求1中所述检测鉴别CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV五种犬腹泻病毒的的上游引物、下游引物对上述步骤(1)提取的待检样品的核酸进行PCR扩增，获得扩增产物；
(3)、利用如上所述CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV的探针点制在醛基化玻璃基片上；
(4)、利用如上所述CAV1、CAV2、CCV、CDV和CPV的探针，与步骤(2)获得的扩增产物进行杂交反应；
(5)、用微阵列芯片扫描仪检测步骤(4)杂交反应后的结果，根据检测的本底值，判定检测结果。
7.根据权利要求6所述的基因芯片检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述PCR扩增的程序为:94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min 15s，共35个循环；72℃延伸10min。
8.根据权利要求6所述的基因芯片检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，同时还设有点样质控探针、阳性质控探针和阴性质控。
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