CN105063237A - 用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法 - Google Patents

用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法，用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒。通过标准毒株基因组序列分析设计PCR引物，对目的基因克隆及测序分析，设计特异性探针，可对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒6种病原进行同时鉴定检测。本发明旨在建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片用于鉴别检测猪呼吸道疾病综合征的重要病原。

Description

用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法
技术领域
本发明属于生物芯片领域。具体而言，本发明涉及一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒6种病原鉴别检测的芯片装置及其检测方法。
背景技术
猪支原体肺炎（Mycoplasmapneumoniaeofswine,MPS）、猪传染性胸膜肺炎（porcinecontagiouspleuropneumonia,PCP）、猪多发性浆膜炎与关节炎（Swinepolyserositisandarthrithis）、猪圆环病毒相关疾病（porcinecircovirusassociateddisease,PCVAD）、猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）和猪瘟（classicalswinefever,CSF）分别是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp）、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,APP）、副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,Hps）、猪圆环病毒（porcinecircovirustype2,PCV2）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）和猪瘟病毒（classicalswinefevervirus,CSFV）引起的一类急性、接触性传染病，广泛存在于世界各地，严重影响我国养猪业的发展。临床上，常出现几种病原体混合感染或继发感染的现象，不仅加大对猪群的危害，而且增加了病原诊断难度。九十年代中期，北美提出猪呼吸道疾病综合症（Porcinerespiratorydiseasecomplex,PRDC），该综合症是由病毒、细菌、支原体、寄生虫及不当管理条件等综合因素引起的一种呼吸道疾病，普遍存在于丹麦、中国、美国等多个国家。该病多发于6-10周龄保育猪和13-20周龄育肥猪，发病率为10%-40%，死亡率可达2%-20%。保育猪暴发PRDC，死亡率较高，生长育肥猪发生PRDC，病程较长，生长缓慢，饲料转化率较低，养殖成本增加，为集约化养猪造成巨大的经济损失。流行病学调查发现，PRDC一般为混合感染或继发感染，其中PRRSV、PCV-2、Mhp、APP、HPS和CSFV均为造成PRDC的病原体。快速确定病原体是防治疾病的关键。目前，对呼吸道疾病综合症相关病原的诊断多采用病毒分离鉴定、血清型方法及分子生物学方法，但未建立同时鉴别检测六种病原体的可行方法。在不同国家、不同地区，由于地理环境、饲养管理水平及品种差异，PRDC病原谱也存在差异性。因此，针对我国引起PRDC的主要病原，建立同时检测六种病原的寡聚核苷酸芯片检测方法具有重要的意义。也便于对出入境的肉制品进行快速检测。
基因芯片(Genechip)是由DNA或寡核苷酸探针密集排列在经过共价结合醛基、氨基或多聚赖氨酸的固相支持物所形成的探针阵列，在适当的温度、湿度条件下，利用特异性探针与经过适当方式标记的待检样品DNA通过碱基互补配对杂交，然后通过相应的检测设备，检测杂交信号的位置和强弱，判断样品种类，完成疾病检测和基础研究等方面的工作。该方法具有高通量、平行化、微量化、自动化、低成本的优点。因此，该技术被广泛应用于诊断检测、差异表达分析、测序等诸多领域。目前，基因芯片检测技术已应用于多种疾病的检测，但缺乏六种病原体并行检测的技术。综合寡聚核苷酸芯片的优点，本发明建立一种快速、准确鉴定猪常见病原体的基因芯片检测技术，为控制PRRSV、PCV-2、Mhp、APP、HPS和CSFV的传播及进出境动物的检疫具有重要作用。
发明内容
本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、节时省力并且易于观察结果的微阵列芯片用于检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的基因芯片。
为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒检测的基因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH2O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：
点样位置质控分区P1，包含至少一个点样位置质控探针:SEQIDNO.7；
杂交阳性质控分区P2，包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQIDNO.8；
杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液；
所述待测样品探针区内设置下述至少一个待测样品探针的分区：
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区；副猪嗜血杆菌探针分区；猪肺炎支原体探针分区；猪圆环病毒2型探针分区；猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区；猪瘟病毒探针分区。
各个探针序列如下：
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针：SEQIDNO.1；
副猪嗜血杆菌探针：SEQIDNO.2；
猪支原体肺炎探针：SEQIDNO.3；
猪圆环病毒2型探针：SEQIDNO.4；
猪繁殖与呼吸综合征病毒探针：SEQIDNO.5；
猪瘟病毒探针：SEQIDNO.6。
利用上述基因芯片检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的检测方法，包括如下步骤：
（1）待测样品制备：按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或病毒的细胞增殖液的全基因组DNA/RNA，制备待测样品DNA/cDNA；
（2）PCR扩增：25μLPCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix:2.9μL、待测样品DNA5μL、无核酸酶灭菌水4.6μL；
其中，所述引物Mix含有：
序列为SEQIDNO.9的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌上游引物0.05μL,
序列为SEQIDNO.10的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.11的10μmol/L副猪嗜血杆菌上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.12的10μmol/L副猪嗜血杆菌下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.13的10μmol/L猪肺炎支原体上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.14的10μmol/L猪肺炎支原体下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.15的10μmol/L猪圆环病毒2型上游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.16的10μmol/L猪圆环病毒2型下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.17的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.18的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.19的10μmol/L猪瘟病毒上游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.20的10μmol/L猪瘟病毒下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.21的20μmol/L通用引物上游引物1μL，
序列为SEQIDNO.22的20μmol/L通用引物下游引物1μL.
按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃5min；
（3）杂交：首先配制杂交液，包括杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物8μL、杂交阳性对照0.1μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后用15μL杂交液进行杂交；
（4）结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。
本发明具有如下优点:
（1）成功地构建了APP&HPS&Mhp&PCV2&PRRSV&CSFV鉴别检测基因芯片：本发明所制备的基因芯片采用的各条筛选探针可与对应病原体目的基因进行特异性结合，杂交信号较强且稳定。
（2）制备的检测基因芯片具有良好的方法学特征：本发明建立了一种特异性好、灵敏度高、稳定性强和节时省力的基因芯片检测方法。
（3）检测基因芯片的构建，为混合感染病原的同步检测和鉴别诊断提供快速、高效的手段：为今后出入境动物检疫、肉制品检疫和相应疫病控制提供了技术保障。对满足进出境动物检疫工作的需要，控制猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的传播，保障我国的畜牧业安全、健康发展具有十分重要的意义。
附图说明
图1为芯片探针分布示意图；
图2为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌杂交结果；
图3为副猪嗜血杆菌杂交结果；
图4为猪肺炎支原体杂交结果；
图5为猪圆环病毒2型杂交结果；
图6为猪繁殖与呼吸综合征病毒杂交结果；
图7为猪瘟病毒杂交结果；
图8为六种病原核酸杂交结果；
图中：P1-点样位置质控分区；P2-杂交阳性质控分区；N-杂交阴性质控分区；1-猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区；2-副猪嗜血杆菌探针分区；3-猪肺炎支原体探针分区；4-猪圆环病毒2型探针分区；5-猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区；6-猪瘟病毒探针分区;
杂交说明：
P1：探针固定阳性对照，监控芯片点样过程，芯片杂交前后都应阳性；
P2：杂交阳性对照，监控芯片杂交过程，检测任何样品都应阳性；
N：杂交阴性对照，检测任何样品都应阴性；
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，1号探针亮；
副猪嗜血杆菌基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，2号探针亮；
猪肺炎支原体基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，3号探针亮；
猪圆环病毒2型基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，4号探针亮。
猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，5号探针亮。
猪瘟病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果：除质控探针符合要求外，6号探针亮。
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于以下实施例。
实施例1，本发明是分别对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体进行培养，提取病原体基因组DNA；对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒细胞增殖，提取病毒基因组。对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的特异保守序列进行克隆、测序分析，根据测序结果设计了6条寡核苷酸探针，可与相应病原的PCR产物进行特异性结合，PCR进行基因组扩增时，上游通用引物5′端利用Cy3荧光色素进行标记，探针可与此产物在42℃下进行杂交。根据荧光信号位置、强度判断杂交结果，以此来鉴别检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒。根据Genbank网站上公布的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的全基因序列利用PrimerPremier5.0生物软件设计PCR引物SEQIDNO.9、SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12、SEQIDNO.13、SEQIDNO.14、SEQIDNO.15、SEQIDNO.16、SEQIDNO.17、SEQIDNO.18、SEQIDNO.19、SEQIDNO.20、SEQIDNO.21和SEQIDNO.22。同时，克隆基因序列，并进行测序、比对分析，利用fastPCR生物软件设计所述6条特异性寡核苷酸探针，SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。通过这14条PCR引物和6条特异性的探针，可以特异的、敏感的快速鉴定区别6种病原体。根据国家质量监督检验检疫总局文件（2009.178号）《关于进一步加强进出境猪甲型H1N1流感检验检疫工作的通知——A型流感分型基因芯片检测方法》提供的质控序列合成本发明用质控序列SEQIDNO.7、SEQIDNO.8。
每条探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基，具体核苷酸序列如下：
SEQIDNO.1为：
5'-NH2-T15-GTTCATCGCCTAAACCAAATTCGGAATCTACGCC；
SEQIDNO.2为：
5'-NH2-T15-GAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG；
SEQIDNO.3为：
5'-NH2-T15-AAACTTTTATCAAAGACGGCGATCAAAATATGAC；
SEQIDNO.4为：
5'-NH2-T15-GGTGACAGGGGAGTGGGCTCCAGTGCTGTTATTCTAG；
SEQIDNO.5为：
5'-NH2-T15-GCTGTAGATGGGAGCTGCTGTCGTTGCTGGCGTTG；
SEQIDNO.6为：
5'-NH2-T15-ACTACTGGCTTCTGCTTCACCCACTTATACATCACCT；
SEQIDNO.7为：
5'-NH2-T15-GCTGCCTCGGCAAGGAGT-TAMRA；
SEQIDNO.8为：
5'-NH2-T15-GTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATT。
实施例2，参见图1，用于呼吸道疾病综合征重要病原检测的基因芯片，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成8行×7列的微阵列。微阵列上探针分布从上到下依次为：点样位置质控分区P1：1行×8点，杂交阳性质控分区P2：1行×4点，杂交阴性质控分区N：1行×4点，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌检测探针分区1：1行×4点，副猪嗜血杆菌检测探针分区2：1行×4点，猪肺炎支原体检测探针分区3：1行×4点，猪圆环病毒2型检测探针区分4：1行×4点，猪繁殖与呼吸综合征病毒检测探针分区5：1行×4点，猪瘟病毒检测探针分区6：1行×4点，杂交阴性质控分区N：1行×8点，点样位置质控分区P1：1行×8点。每张芯片上有至少一个上述微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。
杂交阴性质控分区N，包含点样缓冲液，点样缓冲液为市售产品，例如博奥生有限公司生产的。其余各分区包括对应的检测探针和质控探针。
图2～8为本发明的具体实施方式，分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果；副猪嗜血杆菌基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果；猪肺炎支原体基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果；猪圆环病毒2型基因组DNA经PCR扩增产物的杂交结果；猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果；猪瘟病毒cDNA经PCR扩增产物的杂交结果;六种病原核酸经PCR扩增产物的杂交结果；
实施例3、试剂准备
1）芯片洗液
根据需要及实际情况，按如下比例配制洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ。
洗液Ⅰ：SSC终浓度为2×，SDS终浓度为0.2%。如600mL洗液Ⅰ=528mL蒸馏水+60mL20×SSC+12mL10%SDS，或根据需要按比例配制。
洗液Ⅱ：SSC终浓度为0.2×。如600mL洗液Ⅱ=594mL蒸馏水+6mL20×SSC，或根据需要按比例配制。
若10%SDS产生白色絮状沉淀，请置于42℃水浴中溶解混匀后配制洗液。
2）无水乙醇。
3）冰水混合物。
实施例4、病原体基因组的提取
按照相应商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取患病动物的组织或细菌培养液或病毒的细胞增殖液的全基因组，制备样品。
实施例5、PCR扩增病毒基因组DNA/cDNA
1、PCR反应体系：在PCR配液区内，在冰上融化PCRMix及基因组DNA，按如下体系配制反应液。25μLPCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix（混合引物）:2.9μL、待测样品DNA5μL、无核酸酶灭菌水4.6μL；
其中，所述引物Mix含有：
序列为SEQIDNO.9的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌上游引物0.05μL,
序列为SEQIDNO.10的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.11的10μmol/L副猪嗜血杆菌上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.12的10μmol/L副猪嗜血杆菌下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.13的10μmol/L猪肺炎支原体上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.14的10μmol/L猪肺炎支原体下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.15的10μmol/L猪圆环病毒2型上游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.16的10μmol/L猪圆环病毒2型下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.17的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.18的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.19的10μmol/L猪瘟病毒上游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.20的10μmol/L猪瘟病毒下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.21的20μmol/L通用引物上游引物1μL，
序列为SEQIDNO.22的20μmol/L通用引物下游引物1μL.
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌上游引物SEQIDNO.9：
5′-AGGTGACACTATAGAATATAGTGCTTACCGCATGTAGTGG-3′；
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌下游引物SEQIDNO.10：
5′-GTACGACTCACTATAGGGATGGCTGCTCCGCTTTTGG-3′；
副猪嗜血杆菌上游引物SEQIDNO.11:
5′-AGGTGACACTATAGAATAAGCCGCGAGGTGGAGTG-3′；
副猪嗜血杆菌下游引物SEQIDNO.12:
5′-GTACGACTCACTATAGGGAGGTAAACGCCCCCTTTCA-3′；
猪肺炎支原体上游引物SEQIDNO.13:
5′-AGGTGACACTATAGAATAGCCGAACAAGCAATCACCAA-3′；
猪肺炎支原体下游引物SEQIDNO.14:
5′-GTACGACTCACTATAGGGAACCCGAAGAACTTCAACAGCA-3′；
猪圆环病毒2型上游引物IDNO.15：
5′-AGGTGACACTATAGAATAGGGAGGAGTAGTTTACATAGGGG-3′；
猪圆环病毒2型下游引物SEQIDNO.16：
5′-GTACGACTCACTATAGGGAATCAAGCGAACCACAGTCA-3′；
猪繁殖与呼吸综合征病毒上游引物IDNO.17：
5′-AGGTGACACTATAGAATAGCGATTGCTTTCTTTGTGGT-3′；
猪繁殖与呼吸综合征病毒下游引物SEQIDNO.18：
5′-GTACGACTCACTATAGGGATGTCAAGGAAATGGCTGGT-3′；
猪瘟病毒上游引物SEQIDNO.19：
5′-AGGTGACACTATAGAATAGACCGCTGGTGACTTCGT-3′；
猪瘟病毒下游引物SEQIDNO.20：
5′-GTACGACTCACTATAGGGAATCCCATTCCTTCTTTACTTTG-3′；
通用上游引物SEQIDNO.21：5′-cy3-AGGTGACACTATAGAATA-3′;
通用下游引物SEQIDNO.22：5′-GTACGACTCACTATAGGGA-3′。
2、扩增：将配置好的反应液置于PCR扩增仪中，按照表1的PCR反应循环程序进行PCR反应。
表1PCR反应程序
PCR产物要避光放置。短期保存放置4℃冰箱。
实施例6、判读
1、洗片：杂交缓冲液在42℃融化，按下面体系配制杂交液，杂交体系混合液95℃变性8分钟，冰浴5分钟，备用。配制16μL杂交液：杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物8μL、杂交阳性对照0.1μL，取其中的15μL杂交液进行实验。
打开芯片杂交盒，将杂交盒平放在桌面上，在杂交盒底部凹槽内加入约200μL灭菌水。将芯片正面朝上（围栏面朝上，标签朝向操作者）放入杂交盒内两个定位销之间；放上芯片盖片，注意有凸台的一面朝向芯片，上端先接触芯片，再缓缓盖下；然后用移液器通过盖片加样孔缓慢注入15μL变性后的杂交液，杂交液会凭借液体表面张力在盖片下面的凸台和芯片表面之间形成一道液膜。注意不要震动盖片或芯片以避免破坏液膜。盖紧杂交盒盖。放入42℃恒温水浴中，静置，杂交2-3小时均可。
杂交后，取出芯片放在42℃预热好的洗液Ⅰ中，42℃震荡清洗5分钟，再用42℃预热好的洗液Ⅱ，42℃震荡清洗5分钟（冬季洗液Ⅱ可清洗两次，每次两分钟），最后用42℃预热好的清水清洗一次，清洗后的芯片2000rpm离心2分钟以去除芯片表面的液体，此芯片可避光保存，在4小时内扫描都有效。
2、扫描及结果判读
洗净的芯片使用微阵列芯片扫描仪在晶芯LuxScanTM10K-A微阵列芯片扫描仪下进行扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。
实施例7、弃物处理
按照当地或国家的传染性与潜在传染性废弃物处理规范来处理使用或未经使用过的试剂以及污染的废弃物。
SEQUENCELISTING
<110>重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120>用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法
<160>22
<210>1
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.1
NH2-t15-gttcatcgcctaaaccaaattcggaatctacgcc34
<210>2
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.2
NH2-t15-gaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttg38
<210>3
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.3
NH2-t15-aaacttttatcaaagacggcgatcaaaatatgac34
<210>4
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.4
NH2-t15-ggtgacaggggagtgggctccagtgctgttattctag37
<210>5
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.5
NH2-t15-gctgtagatgggagctgctgtcgttgctggcgttg35
<210>6
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.6
NH2-t15-actactggcttctgcttcacccacttatacatcacct37
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.7
NH2-t15-gctgcctcggcaaggagt-TAMRA18
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.8
NH2-t15-gtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagatt38
<210>9
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.9
aggtgacactatagaatatagtgcttaccgcatgtagtgg40
<210>10
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.10
gtacgactcactatagggatggctgctccgcttttgg37
<210>11
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.11
aggtgacactatagaataagccgcgaggtggagtg35
<210>12
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.12
gtacgactcactatagggaggtaaacgccccctttca37
<210>13
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.13
aggtgacactatagaatagccgaacaagcaatcaccaa38
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.14
gtacgactcactatagggaacccgaagaacttcaacagca40
<210>15
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.15
aggtgacactatagaatagggaggagtagtttacatagggg41
<210>16
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.16
gtacgactcactatagggaatcaagcgaaccacagtca38
<210>17
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.17
aggtgacactatagaatagcgattgctttctttgtggt38
<210>18
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.18
gtacgactcactatagggatgtcaaggaaatggctggt38
<210>19
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.19
aggtgacactatagaatagaccgctggtgacttcgt36
<210>20
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.20
gtacgactcactatagggaatcccattccttctttactttg41
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.21
cy3-aggtgacactatagaata18
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>SEQIDNO.22
gtacgactcactataggga19

Claims (5)

1.用于六种猪病病原鉴别的基因芯片，包括：PCR反应混合液、Taq聚合酶、PCR阳性对照、PCR阴性对照、ddH2O、检测芯片、芯片探针的点样分布、芯片盖片、杂交液、杂交阳性对照、杂交盒，采用基因芯片微量点样技术，将待测样品探针与各种质控探针固定在经过化学修饰的基片上，形成的微阵列，其特征是：所述微阵列包括质控探针区和待测样品探针区，其中所述质控探针区内设置下述分区：
点样位置质控分区（P1），包含至少一个点样位置质控探针:SEQIDNO.7；
杂交阳性质控分区（P2），包含至少一个杂交阳性质控探针:SEQIDNO.8；
杂交阴性质控分区（N），包含点样缓冲液；
所述待测样品探针区内设置下述至少一个待测样品探针的分区：
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针分区（1）；
副猪嗜血杆菌探针分区（2）；
猪肺炎支原体探针分区（3）；
猪圆环病毒2型探针分区（4）；
猪繁殖与呼吸综合征病毒探针分区（5）；
猪瘟病毒探针分区（6）；
各个探针序列如下：
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针：SEQIDNO.1；
副猪嗜血杆菌探针：SEQIDNO.2；
猪支原体肺炎探针：SEQIDNO.3；
猪圆环病毒2型探针：SEQIDNO.4；
猪繁殖与呼吸综合征病毒探针：SEQIDNO.5；
猪瘟病毒探针：SEQIDNO.6。
2.根据权利要求1所述用于六种猪病病原鉴别的基因芯片，其特征是：每张所述检测芯片上包括至少一个权利要求1所述的微阵列，每个微阵列可以检测一份样品。
3.根据权利要求1所述用于六种猪病病原鉴别的基因芯片，其特征是：所述每条质控探针和待测样品探针的5′端均通过15个胸腺嘧啶核苷酸连接有一个氨基。
4.利用权利要求1所述基因芯片检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的非疾病检测目的的检测方法，包括如下步骤：
（1）待测样品制备：按照商品化DNA/RNA提取试剂盒使用说明书提取待测样品全基因组，制备待测样品DNA/cDNA；
（2）PCR扩增：25μLPCR反应液包含:rTaq酶12.5μL、引物Mix:2.9μL、待测样品DNA5μL、无核酸酶灭菌水4.6μL；
其中，所述引物Mix含有：
序列为SEQIDNO.9的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌上游引物0.05μL,
序列为SEQIDNO.10的10μmol/L猪传染性胸膜肺炎放线杆菌下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.11的10μmol/L副猪嗜血杆菌上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.12的10μmol/L副猪嗜血杆菌下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.13的10μmol/L猪肺炎支原体上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.14的10μmol/L猪肺炎支原体下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.15的10μmol/L猪圆环病毒2型上游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.16的10μmol/L猪圆环病毒2型下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.17的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒上游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.18的10μmol/L猪繁殖与呼吸综合征病毒下游引物0.1μL，
序列为SEQIDNO.19的10μmol/L猪瘟病毒上游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.20的10μmol/L猪瘟病毒下游引物0.05μL，
序列为SEQIDNO.21的20μmol/L通用引物上游引物1μL，
序列为SEQIDNO.22的20μmol/L通用引物下游引物1μL.
按如下步骤进行扩增:94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃25sec循环12次；94℃30sec，50℃30sec，72℃25sec循环30次；72℃5min；
（3）杂交:首先配制杂交液，包括杂交缓冲液7.9μL、PCR扩增产物8μL、杂交阳性对照0.1μL，混匀后95℃变性8min,冰上放置5min，然后取其中的15μL杂交液进行杂交；
（4）结果判读：用微阵列芯片扫描仪扫描分析，去除阴性对照背景，与芯片杂交说明对照，判定结果。
5.根据权利要求4所述检测方法，其特征是：所述杂交缓冲液每1000μL包括20×SSC500μL、10%SDS10μL及DEPCH2O490μL。
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