CN104357584A - 一种丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的制备和用途 - Google Patents

一种丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的制备和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片，其制备方法包括制备通用引物，制备HCV亚型核酸分型探针和人IL-28B rs12979860多态性检测探针，制备寡核苷酸芯片，建立多重RT-PCR体系，建立杂交体系。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别HCV的5个亚型，包括1b、2a、3a、3b和6a，并可检测人rs12979860的CC、TT、CT 3种基因多态性。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为HCV临床诊断及个体化治疗提供指导。

Description

一种丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的制备和用途
技术领域
本发明涉及丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的制备和用途，属于基因芯片检测技术领域。
背景技术
丙型肝炎病毒(hepatitis c virus，HCV)感染危害严重，全球有1.7亿患者感染HCV，且每年新发300万人。50-80％的HCV感染者可发展为慢性状态，其中20-30％发展为肝硬化或者肝癌。慢性丙型肝炎不同基因型或亚型感染的地理分布、抗病毒治疗的效果及疾病严重程度等均存在差异，人IL-28B的基因多态性与抗病毒治疗的病毒应答率有密切关系，是丙肝患者治疗成功与否的一项重要的预测因子。HCV感染的个体化治疗可显著提高病毒应答率，提高抗病毒治疗效果。目前HCV基因分型已列为丙肝抗病毒治疗必须检测项目之一；另外，人IL28B多态性检测已被美国肝脏病学会列入丙肝治疗的重点检查项目。
在基因分型技术方面，HCV分型检测目前有以下几种方法：
1)血清学方法：目前常用于HCV分型检测的为多肽ELISA、重组抗原ELISA等，它们的敏感性、准确性较高，经过对HCV RNA的C区、NS4区、NS5区等区段进行检测，已经能区分HCV1-6型。血清学方法快捷简便，成本低，临床应用广泛，但当出现病毒混合感染或病毒变异时难以区分。
2)直接测序法：使用PCR产物直接测序，是分型的金标准，但敏感度不足，受测序仪器限制，不易在基层推广。
3)实时荧光定量PCR法：敏感性、特异性、重复性和便捷性等方面均优于直接测序法。但该方法需要专门的荧光定量PCR仪及配套试剂。
4)巢式PCR法：使用两对PCR引物扩增片段，第一对PCR引物扩增片段与普通PCR相似，第二对引物为巢式引物，结合在第一次PCR产物内，经历两个PCR程序，扩增特异性增强，灵敏度与可靠性优于普通PCR，常用于低浓度的核酸扩增，其缺点是易污染。RFLP法：通过提取及扩增靶基因，利用限制性酶切位点间的插入、缺失、重排、突变等原因而造成的基因型间限制性片段长度的变异，进行适当的酶切后从特异性的电泳图谱观察其多态性，借以区分不同基因型。RFLP法敏感性较高，能同时鉴别出多个型别，减轻了工作量，适合于大规模的筛查，但该方法稳定性较差，重复性较低。
5)基因芯片法：基因芯片上可以排列大量不同类别的探针以满足不同需要，例如联合HCV的5′UTR区和C区可提高分辨力，扩大分型范围。该法具有灵敏、高通量、集约化、规模化、结果准确等优点，但因其技术要求高、常需要特殊检测仪器，在推广上还受到一些限制。
发明内容
本发明的目的在于针对HCV分型及耐药检测领域存在的一些不足，研制一种高通量、特异、敏感、快速的HCV基因分型及人IL-28B rs12979860基因多态性检测的基因芯片，能同时检测HCV常见的5种亚型(1b，2a，3a，3b，6a)和人rs12979860的CC、TT、CT 3种基因多态性，为HCV感染个体化治疗方案的制定提供指导。
为了达到上述目的，本发明开发了丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片，其制备方法如下：
1.步骤一：制备通用引物
选择HCV的5’UTR和NS5B基因作为检测靶基因，可以通过一次反应实现5种HCV亚型(1b，2a，3a，3b，6a)的通用扩增；同时包括1对人IL-28B基因引物，扩增包含rs12979860的基因片段。另有1对外源性荧光素酶基因片段引物，用来监测核酸提取、PCR扩增及杂交反应。优选4对引物序列及其对应的，如表1所示：
表1 引物序列及对应的扩增靶标
2.步骤二：制备亚型核酸分型探针及rs12979860多态性检测探针
根据5个亚型HCV基因序列间的比对及每亚型HCV内的序列比对，在上下游引物范围内的序列相对特异区进行分型探针的设计。为避免漏检，每2条核酸分型寡核苷酸探针对应一种亚型的HCV。人IL-28B基因上rs12979860多态性由C突变为T，以突变碱基为中心设计探针，野生、突变探针各一条。HCV亚型核酸分型探针、通用探针序列、rs12979860多态性检测探针序列以及对应的靶标，如表2所示：
表2 寡核苷酸探针序列及对应的靶标
3.步骤三：制备寡核苷酸芯片
一个优选的实施方案，步骤二中的各个寡核苷酸探针在点样时，用2×点样液(6×SSC，0.1％SDS)稀释至终浓度50μM。用市售的基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，探针的点样量均为3nl。寡核苷酸芯片制备完毕后，使用前至少在室温放置干燥18小时。该芯片特征在于寡核苷酸探针阵列中同时包括HCV亚型核酸分型探针和rs12979860多态性检测探针，其探针阵列如表3所示。其中片基质控探针为20T序列，5’端bio标记、3’端NH2修饰，用来监测醛基片片基质量；阴性探针为与病毒无关的植物基因序列，用来指示特异性；通用序列为HCV保守序列；阳性探针分别为引物UR、NR、R和GR的反向互补序列，每条序列3’端NH2修饰，所有探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥18小时；
表3 寡核苷酸探针阵列
片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 阳性探针 阳性探针 阳性探针 阳性探针
N1b1 N1b2 N2a1 N2a2 U3a1 U3a2 U3b1 U3b2
N1b1 N1b2 N2a1 N2a2 U3a1 U3a2 U3b1 U3b2
N1b1 N1b2 N2a1 N2a2 U3a1 U3a2 U3b1 U3b2
U6a1 U6a2 CC TT GP1 GP2 HCV1 HCV2
U6a1 U6a2 CC TT GP1 GP2 HCV1 HCV2
U6a1 U6a2 CC TT GP1 GP2 HCV1 HCV2
空白探针 空白探针 空白探针 空白探针 阴性探针 阴性探针 阴性探针 阴性探针
4.步骤四：建立RT-PCR体系
本发明基因芯片中RT-PCR体系的特征为四重不对称RT-PCR反应体系。合适的RT-PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化，优选的多重RT-PCR体系，如表4所示：
表4 RT-PCR体系配方
优选的RT-PCR扩增条件为：42℃逆转录5min，94℃变性2min；扩增45个循环，94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸20s；72℃延伸2min。
5.步骤五：建立杂交体系
合适的杂交体系对芯片的特异性及灵敏度改善也有很大作用。通过优化得到了同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中RT-PCR产物与杂交液等体积混合，优选的杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，16μM20T-NH2。优选的杂交条件为45℃水浴杂交1小时。优选的洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。
6.步骤六：化学发光显色
1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。
以上制备的丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片，包括寡核苷酸芯片、RT-PCR体系、杂交液、洗液A、洗液B、洗液C、标记液、显色液A、显色液B。
一个优选的实施方案使用市售的RNA提取试剂盒提取HCV病毒RNA，如Qiagen公司的QIAamp viral RNAmini kit，提取参照相应的试剂盒说明书进行。使用市售的血液基因组DNA提取试剂盒提取人基因组DNA，如天根公司的TIANamp Blood DNA Kit，、提取参照相应的试剂盒说明书进行。将提取的病毒RNA和人基因组DNA混合成为总核酸溶液。总核酸溶液使用多重RT-PCR体系按照步骤四中的扩增条件进行进行扩增。PCR产物与杂交液等体积混合，加入寡核苷酸芯片中，按照步骤五和步骤六的条件进行杂交和显色。
洗涤后的芯片使用便携式化学发光生物芯片成像仪进行扫描，并运用分析软件判读结果。选择HIV、HBV、梅毒等病毒作为样本，利用上述制备的基因芯片进行检测，考察芯片的特异性。选择2个亚型的HCV为模板制备体外转录RNA灵敏度参考品，考察芯片的最低检测限。结果：芯片对每个亚型HCV均能够检测到103copie/体系的体外转录RNA。
使用本发明制备的基因芯片，共检测了经荧光PCR确认HCV阳性的病人全血共100例，芯片检测1b型78例、2a型19例、3a型2例和3b型1例；rs12979860CC型84例、CT型15例、TT型1例。HCV样本经5’UTR和NS5B片段测序，通过在Los Alamos HCV sequencedatabase BLAST的分型结果与芯片结果完全一致。人rs12979860基因型经测序验证与芯片结果完全一致。
本发明建立了一种基于化学发光成像法的基因芯片，可同时甄别HCV的5个亚型，包括1b、2a、3a、3b和6a，并可检测人rs12979860的CC、TT、CT 3种基因多态性。该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为HCV临床诊断及个体化治疗提供指导。性能考察表明，本发明的基因芯片以对5种不同亚型的HCV和rs12979860进行准确分型，特异性良好。本发明芯片对5个亚型HCV均能够检测到103copie/体系的体外转录RNA。通过HCV阳性病人全血的检测，本发明的方法与金标准测序法具有较高的一致率。
附图说明
图1：为本发明丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的阵列示意图，每张芯片上分布有10个相同阵列。
图2：包括rs12979860的IL28B基因片段扩增产物琼脂糖电泳图。图中M为分子量标准(从上到下条带大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)；1-10为10例全血标本提取的人基因组DNA；NC为阴性对照
图3：丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片上每个阵列上具体排列布局。图中一个原点代表探针的一次点样，垂直方向的3个圆点为一条探针的3次重复点样。1b区域对应的是HCV 1b亚型的特异性探针，2a区域对应的是HCV 2a亚型的特异性探针，3a区域对应的是HCV 3a亚型的特异性探针，3b区域对应的是HCV 3b亚型的特异性探针，6a区域对应的是HCV 6a亚型的特异性探针；L28B区域对应的是rs12979860的分型探针，其中左起为CC型探针，右起为TT型探针；is区域对应的是2条内标对照探针；HCV区域对应的是HCV通用型的探针；CL区域4个圆点代表片基质控探针，横向重复4次；PC区域4个圆点代表阳性质控探针，4个圆点分别为引物UR、NR、GR和R的反向互补序列；NC区域4个圆点代表阴性探针，为与病毒无关的植物基因序列；。
图4：典型的5个亚型的HCV和3种rs12979860多态性的芯片检测图。其中1表示1b型HCV，CT型rs12979860；2表示表示2a型HCV，CT型rs12979860；3表示3a型HCV，CT型rs12979860；4表示3b型HCV，CT型rs12979860；5表示6a型HCV，CT型rs12979860。
图5：基因芯片特异性检测结果(阴性标本的芯片检测图)。其中1表示HIV阳性血清；2表示HBV阳性血清；3表示梅毒阳性血清；4表示腺病毒阳性血清；5表示献血员1血清；6表示献血员2血清。
图6：2a型HCV芯片灵敏度检测结果。其中1表示106copies/体系；2表示105copies/体系103copie/体系；3表示表示104copies/体系；4表示103copies/体系；5表示阴性对照。
图7：HCV阳性全血样本中部分芯片检测结果图。其中数字代表样品编号，其中1-15为HCV 1b型，rs12979860 CC型；16-20为HCV 2a型，rs12979860 CC型。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例1：丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的研制
一、引物探针设计和筛选
首先从NCBI基因数据库中下载HCV基因序列和人IL28B基因序列，序列下载完成后，使用Vector NTI Advance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、通用型引物。rs12979860基因片段扩增产物的琼脂糖电泳结果见附图2。经过筛选最终确定共8条上下游引物，将反相引物进行5’端bio标记，作为芯片使用的引物；确定16条特异性检测探针，3’端NH2修饰。
二、寡核苷酸芯片制备及探针阵列
完成探针筛选后，确定了最终的探针阵列，见附图1和附图3。1b区域对应的是HCV 1b亚型的特异性探针，2a区域对应的是HCV 2a亚型的特异性探针，3a区域对应的是HCV 3a亚型的特异性探针，3b区域对应的是HCV 3b亚型的特异性探针，6a区域对应的是HCV 6a亚型的特异性探针；L28B区域对应的是rs12979860的分型探针，其中左起为CC型探针，右起为TT型探针；is区域对应的是2条内标对照探针；HCV区域对应的是HCV通用型的探针；CL区域4个圆点代表片基质控探针，横向重复4次；PC区域4个圆点代表阳性质控探针，4个圆点分别为引物UR、NR、GR和R的反向互补序列；NC区域4个圆点代表阴性探针，为与病毒无关的植物基因序列。。
三、多重RT-PCR体系
本发明中RT-PCR体系的特征为四重不对称RT-PCR体系。合适的RT-PCR体系可以进一步提高芯片检测的灵敏度。对标记引物和非标记引物的绝对浓度和相对比例、Taq酶的用量等因素进行了优化。当上下游引物终浓度为0.1μM：0.5μM，Taq酶用量为2.5U/体系时，参考品的探针信号值较强，且低拷贝模板103copie/μl仍然可以检出。优选的RT-PCR扩增条件为：42℃逆转录5min，94℃变性2min；扩增45个循环，94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸20s；72℃延伸2min。
四、建立并优化杂交体系
通过优化得到同时可以保证特异性及灵敏度的杂交液成分、杂交条件和杂交后洗涤条件。在杂交体系中RT-PCR产物与杂交液等体积混合，杂交液各成分终浓度为4×SSC，0.3％SDS，5％甲酰胺，16μM 20T-NH2。杂交条件为45℃水浴杂交1小时。洗涤条件为常温下洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中各洗涤20s。
五、化学发光显色
1)在芯片反应区加入10μl标记液——辣根过氧化物酶标记链酶亲和素(streptavidin-HRP)，37℃水浴放置30min；取出后用PBST洗液(1×PBS+0.05％Tween20)清洗20s，重复3次，置室温晾干。
2)将显色试剂A液和B液等体积混合，每个芯片反应区立即避光加入20μl的A、B混合液，将基因芯片放入便携式化学发光生物芯片成像仪中成像，收集的芯片杂交信号使用ArrayVision7.0软件分析结果。
实施例2：丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片阳性判定标准的确定
Cutoff值是判断基因芯片信号值是否为阳性的标准。每条分型探针分别选取非HCV病毒(即阴性毒株)、空白对照进行基因芯片杂交，通过反复的实验和数据统计，将阴性毒株和空白对照的背景统计平均值+2SD作为每条探针的Cutoff值。将各突变检测探针的区分能力在2.5倍以上作为位点是否出现突变的判断标准。
实施例3：丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片特异性评价
特异性是诊断方法最重要的考核指标，本发明的基因芯片使用优化好的体系和条件，检测了HIV阳性、HBV阳性、梅毒阳性、腺病毒阳性血清及正常献血员血清，由附图4可以看出，HIV阳性、HBV阳性、梅毒阳性、腺病毒阳性血清及正常献血员血清都呈HCV阴性，且内标探针出现正常信号，说明体系工作正常，特异性良好。本发明检测5种亚型的HCV，由附图3可以看出，5种亚型均可以明显区分，说明本发明特异性良好。
实施例4：丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片灵敏度评价
将5种亚型HCV体外转录的RNA作为检测参考品，从109copies/μl梯度稀释至103copies/μl，其中2a型HCV选择106copies/μl、105copies/μl、104copies/μl、103copies/μl的体外转录RNA进行芯片检测，结果见附图6。由附图6可以看出，本发明的检测限为103copies/体系的体外转录RNA。
实施例5：丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片临床样本检测
使用本发明制备的基因芯片，共检测了经荧光PCR确认HCV阳性的病人全血共100例，芯片检测1b型78例、2a型19例、3a型2例和3b型1例；rs12979860 CC型84例、CT型15例、TT型1例。HCV样本经5’UTR和NS5B片段测序，通过在Los Alamos HCV sequencedatabase BLAST的分型结果与芯片结果完全一致。人rs12979860基因型经测序验证与芯片结果完全一致。部分检测结果见附图7。
除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡是采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均在本发明要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测丙型肝炎病毒亚型和人IL-28B rs12979860多态性的基因芯片，本发明的基因芯片可以用于同时甄别HCV的5个亚型，包括1b、2a、3a、3b和6a，并可检测人rs12979860的CC、TT、CT 3种基因多态性检。其特征是包含检测HCV病毒的4条通用引物和12条特异性寡核苷酸探针；检测rs12979860的2条特异性引物和2条特异性寡核苷酸探针；2条内标探针和载体。上述探针分别分布在载体上。
表1  HCV靶基因通用引物
表2  rs12979860片段扩增引物
表3  内标荧光素酶片段扩增引物
表4  HCV病毒分型检测的特异性寡核苷酸探针序列
表5  检测rs12979860多态性的特异性寡核苷酸探针序列
表6  内标荧光素酶基因片段特异性寡核苷酸探针序列
2.根据权利1所述的丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片，其特征是所述的载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片。
3.一种丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，探针的设计：首先从NCBI基因数据库中下载HCV基因序列和人IL28B基因序列，序列下载完成后，使用Vector NTI Advance 10(invitrogen)软件包中的AlignX程序按照默认的参数设置对各病原体基因序列进行全局比对。根据比对结果在基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针、特异性引物。
步骤二，探针的合成，每条探针的3’端加入12个碱基T且3’末端T氨基修饰作为连接臂，以使其能固定在醛基化修饰玻璃基片上；质控探针除3’末端T进行氨基修饰外，5’端同时标记生物素标记；
步骤三，芯片的制备：将合成后的探针用去离子水稀释成100μM，分别取10μL探针溶液，和10μL体积芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μM，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用pixsys 5000芯片制备仪(Cartesian Technologies)，采用接触式点样方式，将探针点制在载体上，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，使探针和芯片表面醛基脱去1分子水后共价结合，点制好的芯片常温干燥保存。
4.根据权利要求3所述的丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的制备方法，其特征是步骤一中16条特异性寡核苷酸探针及8条引物，探针长度在18-28m，引物长度在19-23nt。
5..根据权利要求3所述的丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的制备方法，其特征是步骤三种所述的载体为醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龙基片。
6.丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步骤：
1)步骤一，HCV RNA和人基因组DNA的提取，使用市售商品化病毒基因组RNA提取试剂盒和人基因组DNA提取试剂盒提取HCV RNA和人基因组DNA；
2)步骤二，RT-PCR/PCR扩增：扩增使用TaKaRa的一步法RT-PCR试剂，以1管多重RT-PCR扩增体系同时扩增HCV的2种靶基因、人rs12979860靶基因和内标荧光素酶基因，使用引物见表1-3；扩增按以下循环参数进行扩增：42℃逆转录5min，94℃变性2min；扩增45个循环，94℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸20s；72℃延伸2min，4℃保存或进行下一步实验；
3)步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％ SDS和去离子水中分别清洗30S，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在95℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的产物5μL与5μL杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；
4)步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1×SSC+0.2％SDS、0.2×SSC和0.1×SSC中各清洗30S，最后将基因芯片表明液体离心干燥；
5)步骤五，样品标记：向芯片加入15μl标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应30min，取出芯片以PBST清洗10s，离心干燥；
6)步骤六，扫描：向芯片反应区加入刚刚1∶1混合的发光液A和B的混合溶液，用移液器涂匀后立即置化学发光成像仪中扫描，成像模式为触发模式，曝光参数511，增益参数300，曝光时间10s，触发次数1次；
7)步骤六，数据分析：成像结束后使用化学发光分析软件进行芯片探针信号分析。每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针Cutoff值，探针信号值＞该探针Cutoff值的判读为该探针信号阳性。本发明使用方法的步骤二中RT-PCR使用的反向引物修饰分子为生物素。本发明使用方法步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。
7.根据权利要求6所述的丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的使用方法，其特征是步骤二中使用的用于扩增HCV的2种靶基因、人rs12979860靶基因和内标荧光素酶基因的反向引物5’端进行修饰。
8.根据权利要求7所述的反向引物5’端修饰分子可以是CY3、CY5、生物素。
9.根据权利要求6所述的丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的使用方法，其特征是步骤三中使用的杂交液组分为8×SSC，0.6％SDS，10％甲酰胺，10×Denhardt。
10.根据权利要求6所述的丙型肝炎病毒感染个体化治疗指导基因芯片的使用方法，其特征是步骤六中使用的扫描方法，根据权利要求8中反向引物修饰分子的不同，扫描方法包括荧光扫描，可视化扫描，化学发光成像。
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