CN105506122B - 用于检测il28b基因多态性的探针、基因芯片和试剂盒 - Google Patents

用于检测il28b基因多态性的探针、基因芯片和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的涉及用于IL28B基因多态性检测的探针、基因芯片和试剂盒。一组用于IL28B基因多态性检测的探针，包括rs12979860和rs8099917位点的探针；所述探针序列为：rs12979860‑C探针：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT SEQ ID NO.1；rs12979860‑T探针：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT SEQ ID NO.2；rs8099917‑T探针：CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT SEQ ID NO.3；rs8099917‑G探针：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT SEQ ID NO.4。本发明通过特异性的引物和探针的选择，结合基因芯片技术，不仅提高了检测效率和准确度。

Description

用于检测IL28B基因多态性的探针、基因芯片和试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的涉及用于IL28B基因多态性检测的探针、基因芯片和试剂盒。
背景技术
丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)引起的一种传染病。HCV感染是引起全球慢性肝病的主要原因之一，我国HCV感染率约为3.2％，每年新发丙肝病例约3.5万例。目前，丙型肝炎尚无有效疫苗预防感染。
人IL28B基因位于染色体19q13.13的ACO11445.6基因群上，属于III型干扰素家族，编码IFN-λ3。IL28B基因由6个外显子和5个内显子组成，含有由
22个氨基酸组成的信号肽。研究发现丙型肝炎的治疗与宿主的IL28B基因多态性高度相关。IL28B基因的两个多态性位点rs12979860和rs8099917与丙型肝炎病毒患者的病毒清除有显著的相关性，即与丙肝患者标准化治疗方案(聚乙二醇干扰素联合利巴韦林)的抗病毒治疗效果密切相关。
随着IL28B基因多态性临床诊断价值的出现，市场上有各种检测试剂盒诞生。如基因测序、高分辨率溶解曲线法(high-resolution melting analysis，HRM)、杂交探针法(hybridization probe，HP)、TaqMan探针法、PCR等。其中，基因测序法操作繁琐，工作量大成本高；HRM法操作繁琐，需用测序法对所得结果进一步确认且必须用特殊的仪器设备；HP法成本较高；TaqMan探针法成本高，结果受Taq酶活性影响较大，只能用于少量SNP位点分析，需要特殊的仪器设备，不能发现未知SNP位点；PCR每次只能检测一种突变要多管体系相对应，存在操作不便的缺点。
本发明采用的基因芯片进行检测，其检测通量大，在一张芯片上一次性完成两个位点多态性的检测，结果更准确，具有检测灵敏度高、特异性好，所需样本量少等优点。传统的基因芯片技术的检测，是基于荧光标记探针的荧光发光来进行检测的。其信号弱，必须经过激发，才能发光，需要昂贵的激光扫描设备。在临床检测应用过程中，由于检测单位需要投资购置激光扫描设备，一方面，显著增加了进行相关检测的投资成本，另一方面，也直接增加了应用成本，限制了该技术的市场应用与推广。本发明可通过生物芯片的可见光光学放大，做到了信号分辨率高，信号可以用普通数码相机拍照或肉眼直接判读。相对传统荧光标记具有良好的效果。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术不足，提供一种快速准确、结果直观的IL28B基因多态性检测的基因芯片和试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一组用于IL28B基因多态性检测的探针，包括rs12979860和rs8099917位点的探针；所述探针序列为：
rs12979860-C探针：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT；
rs12979860-T探针：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT；
rs8099917-T探针：CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT；
rs8099917-G探针：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT。
进一步地，本发明的内容还包括用于IL28B基因多态性检测的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片包括固体相和权利要求1所述探针。
进一步地，本发明的内容还包括用于IL28B基因多态性检测的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述探针或权利要求2所述基因芯片。
进一步地，所述基因芯片试剂盒还包括以下引物对：
rs12979860引物对：
上游通用引物FP1:5’-CGCGATGCCCCGGGCCACG-3’；
下游通用引物RP1:5’-Bio GGTCACCGCCCAGCCCCTGTG-3’；
rs8099917引物对：
上游通用引物FP2:5’-CACCATCCTCCTCTCATCCCTC-3’；
下游通用引物RP2:5’-Bio GCCAGCTACCAAACTGTATAC-3’。
进一步地，所述引物上含有有生物素标记。
进一步地，所述基因芯片试剂盒还包括PCR反应体系、阴性对照品、阳性对照品、杂交缓冲液、洗涤液、BW反应液和TMB显色液。
进一步地，所述阳性对照品为9860-T，9917-T型样本浓度106-109copies/ml，所述阴性对照品为生理盐水。
进一步地，所述杂交缓冲液为柠檬酸三钠0.3M、氯化钠3M、十二烷基硫酸钠0.3M、Triton X–1000.1％水溶液。
进一步地，所述洗涤液分为洗涤液A和洗涤液B，所述洗涤液A为0.01-0.1N NaOH溶液，所述洗涤液B为0.1×SSC溶液。
进一步地，所述BW反应液为用20×SSC缓冲液将HRP标记的亲合素稀释到1:5000～1:10000。
为了更好地理解和实施，下面详细说明本发明。
本发明通过特异性的引物和探针的选择，结合基因芯片技术，不仅提高了检测效率和准确度。
本发明通过PCR技术对病原体DNA进行扩增，扩增产物与生物芯片上的寡核苷酸探针进行杂交，通过通过生物素标记，显色液进行显色后，直观的表现检测结果。
本发明的基因芯片试剂盒，通过生物芯片的可见光光学放大，做到了信号分辨率高，信号可以用普通数码相机拍照或肉眼直接判读。相对传统荧光标记具有良好的效果。为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1是本发明采用基因芯片对人工合成的核酸链对应包含有待检测的特异性基因序列的9860CC质粒，9860TT质粒，9917TT质粒，9917GG质粒进行扩增和检测结果。
图2A、B、C、D、E分别对不同浓度9860CC质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
图3A、B、C、D、E分别对不同浓度9860TT质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
图4A、B、C、D、E分别对不同浓度9917TT质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
图5A、B、C、D、E分别对不同浓度9917GG质粒扩增和阴性样品杂交检测结果。
图6为9860CC、9860TT、9917TT和9917GG四种样本提取DNA后杂交检测结果。
图7A、B、C、D、E、F为6组基因型为9860CC的标本提取DNA后杂交检测结果。
图8A、B、C、D、E、F为6组基因型为9860TT的标本提取DNA后杂交检测结果。
图9A、B、C、D、E、F为6组基因型为9917TT的标本提取DNA后杂交检测结果。
图10A、B、C、D、E、F为6组基因型为9917GG的标本提取DNA后杂交检测结果。
具体实施方式
【实施例1】芯片和检测试剂盒的制备
基因芯片：按真空气相沉淀法镀膜，使用旋转真空镀膜机在厚度约为2.5mm，直径20cm硅片(SiO2)上镀上475埃的氮化硅及135埃的TSPS的薄膜，制备出相应的生物传感器，并覆盖150埃的多聚苯丙氨酸-赖氨酸涂层，最后经过1-10uM盐酸琥珀酸酰亚胺基烟酸盐处理20分钟，清水洗净供芯片制作。将氨基修饰的探针，按照表1排列分别将探针点样到处理好的芯片上，探针序列如表2所示；每组设两个平行点样点：室温下反应，制备出包含探针的基因芯片。
表1基因芯片探针点样排列
表2点样的探针序列
rs12979860-C探针 TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT
rs12979860-T探针 TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT
rs8099917-T探针 CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT
rs8099917-G探针 TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT
试剂盒：本实施例中试剂盒的组成如表3：
表3试剂盒组成
【实施例2】杂交反应过程
本实施例中基目标因片段rs12979860(C/T)和rs8099917(T/G)如序列表SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。含有目标片段的质粒9860CC质粒，9860TT质粒，9917TT质粒，9917GG质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。Hot-Taq酶、dUTP、反转录扩增试剂、UNG酶购自深圳菲鹏生物股份有限公司。基因芯片为珠海赛乐奇生物技术有限公司提供，引物、探针为英潍捷基(上海)贸易有限公司合成质粒均为2ug，将质粒用1ml TE缓冲液溶解，质粒浓度为2ug/ml即2000ng/ml。本实施例中，反应体系组成如表4，本实施例中引物序列如表5所示。
表4PCR反应体系
物料名称 浓度 加入量
5×Buffer 5 5ul
dUTP mix 25μM 0.2ul
F-引物 200μM 0.025
R-引物 200μM 0.025
Hotaq 5U/ul 0.25ul
UNG酶 1U/ul 0.2ul
ddH<sub>2</sub>O 加水补到23ul
表5反应引物
s12979860F-引物 5’-CGCGATGCCCCGGGCCACG-3’
s12979860R-引物 5’-BioGGTCACCGCCCAGCCCCTGTG-3’
rs8099917F-引物 5’-CACCATCCTCCTCTCATCCCTC-3’
rs8099917R-引物 5’-Bio GCCAGCTACCAAACTGTATAC-3’
将待检测临床样本(进行DNA提取0或人工合成的质粒模板加入对应体系进行扩增，加入量为2ul，体系总体积为25ul；反应体系中加入UNG酶能够去除扩增产物污染，减少假阳性结果。
将上述加入引物PCR反应混合液放入PCR仪进行PCR扩增。
PCR过程：95℃反应10min；94℃变性30s、56℃复性30s、72℃延伸30s，重复40个循环；72℃延伸5min。
将PCR扩增产物95℃加热3分钟,迅速置于冰上；
取10ul PCR扩增产物至所制备生物芯片上；
取100ul杂交缓冲液于芯片上，在55℃反应60分钟；
用预热的0.01-0.1N NaOH溶液洗涤3次，每次5-10s；
将芯片置于50℃0.1×SSC中洗涤1min，空气吹干芯片表面；
取BW反应液100ul于芯片上，室温反应10分钟；
用0.1×SSC溶液清洗3次，每次1分钟，空气吹干芯片表面；
取100ul TMB显色液于芯片表面，反应5分钟；
用0.1×SSC溶液清洗3次，每次1分钟，空气吹干芯片表面，照相机拍照或肉眼阅读信 号。
结果：利用实施例1制备的芯片分别对9860CC质粒，9860TT质粒，9917TT质粒，9917GG质粒进行扩增和检测，其结果如图1所示，实施例1制备的基因芯片可以准确地对s12979860和rs8099917的突变进行检测。
【实施例3】基因芯片灵敏度检测结果
1.样品制备
取含有目标片段的质粒9860CC质粒，9860TT质粒，9917TT质粒，9917GG质粒，将各种高浓度质粒按照10倍进行梯度稀释，稀释得到质粒浓度如表6：
表6带检测质粒浓度梯度
2.检测
按照实施例2的方法，利用制备的基因芯片分别对上述样品进行检测。
3.结果
9860体系加入9860CC质粒扩增杂交结果如图2所示：其中，图A、B、C、D、E分别对应9860CC-4、9860CC-5、9860CC-6、9860CC-7和阴性样品。
9860体系加入9860TT质粒扩增杂交结果如图3所示：其中，图A、B、C、D、E分别对应9860TT-4、9860TT-5、9860TT-6、9860TT-7和阴性样品。
9917体系加入9917TT质粒扩增杂交结果如图4所示：其中，图A、B、C、D、E分别对应9917TT-4、9917TT-5、9917TT-6、9917TT-7、阴性样品。
9917体系加入9917GG质粒扩增杂交结果如图5所示：其中，图A、B、C、D、E分别对应9917GG-4、9917GG-5、9917GG-6、9917GG-7、阴性样品。
结合以上检测结果可以看出，该检测方法，检测灵敏度高，能够检测出2×10-6ng/ul的模板，即检测限为2×10-4ng/ul。
【实施例4】基因芯片特异性检测结果
将四种样本提取DNA后采用实施例2方法进行检测，杂交得到结果如图6，可以看出，除了上文中对单独病原体能准确检出外，四种样本混合存在情况下，也能准确检出。
【实施例5】基因芯片检出率
从临床收集EDTA抗凝全血样本，经测序确认样本基因型为9860CC、9860TT、9917TT和9917GG各6组。采用QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit(Cat.No.51104)提取全血DNA，每个全血标本提取洗脱核酸各50μl。通过PCR扩增后进行杂交得到结果如图7、8、9和10所示，结果发现，本发明的基因芯片可以对不同人样本的s12979860和rs8099917的突变进行正确检验和区分。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (6)

1.用于IL28B基因多态性检测的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括探针，所述探针序列为：
rs12979860-C探针：TATTTGTTGGGGTAATCAACTGTT；
rs12979860-T探针：TATTTGCTGGGGAAACCACTTGTT；
rs8099917-T探针：CATTTGTTGGGGTAACCAACTATT；
rs8099917-G探针：TGTTTGCTGGCATAATCAATTATT；
还包括以下引物对：
rs12979860引物对：
上游通用引物FP1:5’-CGCGATGCCCCGGGCCACG-3’；
下游通用引物RP1:5’-Bio GGTCACCGCCCAGCCCCTGTG-3’；
rs8099917引物对：
上游通用引物FP2:5’-CACCATCCTCCTCTCATCCCTC-3’；
下游通用引物RP2:5’-Bio GCCAGCTACCAAACTGTATAC-3’。
2.根据权利要求1所述的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述基因芯片试剂盒还包括PCR反应体系、阴性对照品、阳性对照品、杂交缓冲液、洗涤液、BW反应液和TMB显色液。
3.根据权利要求2所述的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为9860-T，9917-T型样本,其浓度106-109copies/ml，所述阴性对照品为生理盐水。
4.根据权利要求2所述的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述杂交缓冲液为0.3M柠檬酸三钠、3M氯化钠、0.3M十二烷基硫酸钠、0.1％Triton X–100水溶液。
5.根据权利要求2所述的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述洗涤液分为洗涤液A和洗涤液B，所述洗涤液A为0.01-0.1N NaOH溶液，所述洗涤液B为0.1×SSC溶液。
6.据权利要求2所述的基因芯片试剂盒，其特征在于，所述BW反应液为用20×SSC缓冲液将HRP标记的亲合素稀释到1:5000～1:10000。
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