JP2003529376A - Pnaプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング - Google Patents
Pnaプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピングInfo
- Publication number
- JP2003529376A JP2003529376A JP2001573046A JP2001573046A JP2003529376A JP 2003529376 A JP2003529376 A JP 2003529376A JP 2001573046 A JP2001573046 A JP 2001573046A JP 2001573046 A JP2001573046 A JP 2001573046A JP 2003529376 A JP2003529376 A JP 2003529376A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- type
- probe
- hpv
- pna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
,304号、および2000年8月15日に出願された同第60/225,52
4号に基づく。
助成金番号1R43CA80401−01によって支援された。政府は、本発明
において一定の権利を有する。
よび癌の主要な原因として関連づけてきた。それにも関わらず、頸部の新形成お
よび癌の病因におけるHPVの原因的役割を裏づけるための証拠の大半が生じて
きたのは、わずかここ10年に過ぎない。70種類を超える型のHPVが同定さ
れている。しかしながら、全てのHPV型が子宮頸癌に関連しているわけではな
い。いくつかの型(16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型
、51型、53型、52型、56型、58型、59型、66型、68型、および
70型を含む)が頸部の疾患についての高危険度(high risk)に関係
していた。HPVのこれらの高危険度型の検出は、HPV関連疾患の正確かつ時
宜を得た診断に重要である。
これらの多くは、HPVゲノムにおける固有の配列の検出に基づく。例えば、特
定の高危険度HPV株の遺伝子の一部分に相補的なDNAまたはRNAプローブ
は、患者サンプル中の高危険度HPVの特定の株の存在をスクリーニングするの
に有用であるとして、Lorinczの米国特許第4,849,332号(本明
細書中において参考として援用される)中に報告されている。Manosの米国
特許第5,705,627号(本明細書中において参考として援用される)は、
縮重または混合されたコンセンサスプライマーを使用してHPV DNAを増幅
および検出するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、その後の遺伝子型特異
的DNAプローブの混合物を用いるタイピングの使用を報告する。PCR増幅は
、HPV DNAを検出するさらに高感度な方法を提供する。しかし、既存のP
CRコンセンサスプライマーは、HPVの高危険度型および低危険度型の両方に
ハイブリダイズするので、引き続きタイピングする必要がなお存在する。一方で
、種々の高危険度遺伝子型に対して特異的なプローブのカクテルを使用する場合
、コストが高く、時間を費やし、そして多くの量の試薬およびサンプルDNAを
必要とする。それゆえ、関心がある全ての高危険度HPV型を検出するさらに経
済的な方法についての必要性が存在する。
を包含する。好ましい実施形態において、これらの方法は、HPVに関連する核
酸を検出するために使用され、これは次いで、医学的な診断および処置のための
基礎を提供する。本発明の方法は、2つのアプローチを通じて当該分野の問題を
解決する:第1のアプローチは、関心がある全ての改変体(例えば、病原生物の
全ての高危険度株)をスクリーニングするために必要とされるプローブの量を最
少にする。第2のアプローチは、増幅ベース(例えば、PCRベース)の検出方
法によって、増幅される株を限定する。
生物学的サンプル中の特定のHPV標的核酸の存在を検出するための方法が提供
される。好ましい方法は、溶液中にサンプル細胞を懸濁する工程;このサンプル
細胞から、1つ以上のHPV標的核酸を単離する工程;この標的核酸を、少なく
とも1つのPNAプローブ(これは、検出が所望される核酸の少なくとも一部分
に実質的に相補的である)と接触させる工程;およびPNAプローブと標的核酸
との間のハイブリダイゼーションを検出する工程、を包含する。好ましくは、サ
ンプル細胞を懸濁するための溶液は、アルコール(凝集することなくサンプル細
胞を固定するために十分な量で)、抗集塊剤、および溶液を約4〜7の範囲内の
pHで維持する緩衝剤を含む。
を診断し、癌の危険(例えば、子宮頸管内の癌腫、子宮頸癌および新形成に関連
する危険)を示し得る。
を示す。より好ましい実施形態において、標的核酸配列は、16型、18型、3
1型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、5
9型、68型、および70型より選択されるHPV株の存在を示す。
作用を用いて、標的核酸を固体支持体上に捕捉する工程を包含する。
るための方法を含み、この方法は以下の工程を包含する:少なくとも1つのPN
Aプローブ(これは、1つ以上のHPV型の核酸の少なくとも一部分に実質的に
相補的である)を使用して候補核酸を固体支持体上に捕捉する工程、次いでPN
Aプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程。他の実
施形態は、懸濁されたサンプル細胞を均一に表面上に移すことによって、サンプ
ル中のHPVの標的核酸をインサイチュで検出するための方法に関し、この方法
は、以下の工程を包含する;細胞中に含まれるHPVの標的核酸を、少なくとも
1つのPNAプローブ(これは、1つ以上のHPV型の核酸の部分に実質的に相
補的である)とインサイチュでハイブリダイズさせる工程;およびPNAプロー
ブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出する工程。
の核酸の増幅をブロックする工程、を包含する標的核酸を検出する方法を提供す
る。このような方法は、一般的に、生物の少なくとも1つの選択された株由来の
核酸、およびこの生物の少なくとも1つの選択されていない株由来の核酸を含み
得るサンプルを提供する工程を包含する。この生物の選択された株および選択さ
れていない株の両方に由来する核酸の部分に実質的に相補的である複数のプライ
マーもまた、提供される。このサンプルを、少なくとも1つの核酸アナログプロ
ーブ(これは、複数のプライマー間の全長増幅をブロックするに十分に少なくと
も1つの選択されていない株由来の核酸の一部分に相補的である)に曝露する。
少なくとも1つの選択された株由来の核酸は、この複数のプライマー間で増幅さ
れ、このような増幅産物の検出は、このサンプル中における少なくとも1つの選
択された株の存在を示す。
生物の株または種に対するスクリーニングアッセイにバイアスをかけるために使
用される。従って、本発明の方法は、生物学的サンプルを病原生物の選択された
株または改変体に由来する核酸の増幅のためのプライマー対に曝露する工程、お
よびその生物の選択されていない株または改変体に由来する核酸の増幅をブロッ
クする工程、を包含する。好ましくは、本発明の方法において使用されるプライ
マー対は、病原生物の全ての株の核酸を普遍的(universally)に増
幅する。増幅は、生物の選択されていない株または改変体においてのみ、ブロッ
クされ、その結果選択された株または改変体由来の核酸のみが増幅される。
を選択的に増幅するために使用される。このような方法において、感染性生物の
ゲノムの予め選択された領域の増幅のためのコンセンサスプライマーが使用され
る。単独で、これらのプライマーは、病原生物の株または改変体のほとんどまた
は全てに由来する核酸を増幅し得る。しかしながら、本発明の方法において、選
択されていない株または改変体の増幅はブロックされ、その結果、生成されるア
ンプリコンはいずれも、ブロックされなかった株または改変体のみを表す。
HPVコンセンサスプライマー、およびHPVの選択されていない低危険度株に
おけるプライマーの領域またはプライマー間の領域にのみハイブリダイズする、
1つ以上のペプチド核酸(PNA)ブロッキングプローブ(blocking
probe)の存在下で増幅反応を行う。PNAブロッキングプローブは、低危
険度株由来の核酸の増幅を阻止し(すなわち、プライマー間の全長増幅を阻止し
)、一方このPNAブロッキングプローブがハイブリダイズしない高危険度株由
来の核酸は、増幅される。
R)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ローリングサークル複製系、分枝鎖増幅、
核酸に基づく配列増幅(NASBA)、Cleavase断片長多型(Clea
vase Fragment Length Polymorphism)(例
えば、本明細書中において参考として援用される米国特許第5,719,028
号を参照のこと)および核酸のキメラプライマー開始型等温増幅(Isothe
rmal and Chimeric Primer−initiated A
mplification of Nucleic Acid)(ICAN)お
よび分枝伸長増幅方法(Ramification−extension Am
plification Method)(RAM)(例えば、本明細書中にお
いて参考として援用される米国特許第5,719,028号、同第5,942,
391号を参照のこと)。本発明の方法は、生物学的サンプル中の任意の病原生
物(ウイルスおよび細菌(例えば、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、淋菌、ス
トレプトバシラス属菌、HPV、HIVなどを含む)の存在を検出するのに有用
である。
考察に基づいて理解される。
用して、高危険度HPV改変体の存在について、患者サンプルをスクリーニング
する工程を包含する。好ましい実施形態において、複数のHPV型の核酸の部分
にハイブリダイズするPNAプローブが使用される。従って、本発明はHPVの
複数の株または型の同時検出を可能にする。
ズすることが示された。従って、いくつかの例において、単一のプローブまたは
プローブ混合物が使用され、単一のサンプルにおける複数の株の存在がスクリー
ニングされ得る。また本発明に従って、単一のHPV株の核酸にのみハイブリダ
イズするPNAプローブが使用され、サンプル中の株を特異的に同定および/ま
たはタイピングし得る。このように高い特異性のプローブは、例えばプローブに
統合された識別可能なマーカーを利用することによって、連続してかまたは並行
して使用され得る。このような高い特異性のプローブの混合物、またはこのよう
な高い特異性のプローブおよび交差ハイブリダイズするプローブの混合物が使用
され、HPVの複数の株(好ましくは、全ての高危険度な株であり、かつ高危険
度な株のみ)が同定され得る。
溶液(例えば、PreservCyt(登録商標))の中で行われ、そうするこ
とにより患者サンプル(例えば、パパニコラウスミア)の細胞学的スクリーニン
グとHPVスクリーニングとを組み合わせ得る。PreservCyt(登録商
標)溶液は、本明細書中において参考として援用される、共有に係る米国特許第
5,256,571号において記載される。
に実質的に相補的であるように設計される。HPV DNA配列は、多数の公的
データベース(例えば、GENBANK)において見出され得る。本発明の使用
のためのPNAプローブは、1つ以上のHPV株の相同領域にハイブリダイズす
るように設計された。好ましい実施形態において、高危険度HPV株の間では共
通するが低危険度HPV株の間では共通しない株の相同性が選択され、HPV
DNAの高危険度型のみに対するPNAプローブの特異性を確実にする。
は、HPVの主要なカプシドタンパク質をコードし、細胞内でウイルスの組み込
みが起こる場合に常に、保持される。ウイルスゲノム内の他の領域(例えば、E
6オープンリーディングフレーム、本明細書中において参考として援用されるS
ilversteinらの米国特許第5,888,724号に記載される)もま
た、相同性を生じるよう使用され得る。
した。次いで、高危険度HPV型のL1領域を、Vector NTIソフトウ
ェア(Informax Inc.,North Bethesda,MD)を
用いて比較し、相同性領域を確立した。その後、既知の高危険度型のHPVの間
で共通しているが、低危険度型のHPVの間では共通していない相同性領域を選
択した。これは、このように構築されたPNAプローブはいずれも、高危険度型
のHPVに対して最大の特異性を示すが、低危険度型のHPVに対しては最小の
特異性を示すかまたは全く特異性を示さないことを裏付けた。次いで、選択され
た配列を、Vector NTIプログラムを用いて分析して、顕著な2次構造
(例えば、ヘアピン)を形成する任意の配列を切り捨てた。
ブを作製した。作製したこれらのプローブの例を、配列番号1〜5に示す。代表
的に、これらのプローブは、溶液中にそのまま存在するために十分に短くあるべ
きである(すなわち、18塩基または19塩基未満)。これらのプローブを構築
することにおいて、好ましくは、配列において10塩基の任意のストレッチにつ
いて、プリンが6つ以下で存在すべきである。また、列を成す4〜5つのプリン
、特に列を成す3つのグアニンは、好ましくは避けられるべきである。PNAプ
ローブの好ましい長さは、8以上のユニットである。本発明はまた、目的の複数
の株を検出するためのプローブとして、PNAと他の核酸(例えば、DNAおよ
びRNA)との間のハイブリッドの使用を企図する。Uhlmannの“Pep
tide Nuclic Acids (PNA) and PNA−DNA
Chimeras:From High Binding Affinity
Towards Biological Function”,Biol.Ch
em.1998,379(8−9):1045−52(この開示を、本明細書中
で参考として援用する)に記載されるように、PNA−DNAキメラは、本発明
の方法において有用であり得る。
法に従って、合成し、精製し、そして標識し得る。例えば、このような方法は、
PCT公開WO92/20702、Neilsen等による米国特許第5,53
9,082号、およびGarnerによる米国特許第5,731,416号に開
示されており、これらの全ては、本明細書中で参考として援用される。PNAプ
ローブのこのような合成、標識化(例えば、ビオチンを用いて)および精製はま
た、販売業者(例えば、PerSeptive Biosystems Inc
.(Framingham,MA))から手配し得る。
の方法において、プローブと標的テンプレートとの間のハイブリダイゼーション
の直接的な可視化のために用いてもよい。分子標識プローブは、Tyagi等の
PCT出願番号WO95/13399およびTyagi等のPCT出願番号WO
97/39008に記載されており、これら両方ともが、本明細書中で参考とし
て援用される。分子標識は、ステムループ(stem−and−loop)構造
を保有する一本鎖の核酸プローブである。ここで、この分子のループの部分は、
標的核酸配列に相補的なプローブ配列である。このステムは、このプローブの配
列のいずれかの末端にそれぞれ位置する、2つの相補的なアーム配列のアニーリ
ングによって生じる。これらのアーム配列は、標的配列に関連せず(すなわち、
相補的でない)、そして、各アームは、その末端で標識される。一方のアームに
対して、蛍光部分が結合し(すなわち、5’末端のリン酸塩にて)、そして、他
方に対して、非蛍光性消光化分子(すなわち、3’末端のヒドロキシル基にて)
が結合する。その発生期において、この分子標識は、蛍光を発しない。これは、
蛍光団(fluorophore)によって得られたエネルギーが、その消光剤
に移動し、そして熱として分散する(蛍光共鳴エネルギー移動(fluores
cence resonance energy transfer)(FRE
T)という出来事)ように、蛍光消光剤の対が選択されるからである。Tmをわ
ずかに超える温度で、分子標識のステム部分が展開され、そして標的鎖に対する
この分子のプローブ部分を露出する。一旦露出されると、この標識と標的とがハ
イブリダイズする。
ション変化を起こし、これによって、この標識のアーム配列が強制的に離れ、そ
の結果、蛍光団と消光剤とが、お互いにかつそれぞれのもとの位置から物理的に
離れる。蛍光団が消光化分子の近くにもはや存在しない限り、FRETは、もは
や不可能であり、次いで、蛍光団は、励起された場合、適切な波長の検出可能な
光を放つ。本発明に従うPNAプローブが、分子標識分子(標的核酸に相補的な
PNAのループ部分を有する)として構築される場合、このプローブと標的テン
プレートとの間のハイブリダイゼーションは、蛍光読み取り装置を用いて、「リ
アルタイム」または「終点」様式のいずれかにおいて、検出され得る。
用であるよう企図される。1つの実施形態において、PreservCyt溶液
中に先に懸濁された頸部標本から単離されたサンプルDNAは、コンセンサスプ
ライマー(MY09およびMY11)の対を用いるPCRを用いて、最初にかつ
必要に応じて、増幅される。これらのプライマーは、HPV DNAのL1領域
の異なるセグメントに結合し、そして高危険度HPV株および低危険度HPV株
の両方のDNAを増幅する。次いで、増幅産物を、高危険度HPV株のDNAに
特異的なビオチン標識化PNAプローブと接触させ、そしてハイブリダイズさせ
る。次いで、ハイブリダイズさせたPNA:DNA二重鎖を含む溶液を、アビジ
ンコートしたマイクロタイタープレートに適用する。適切なインキュベーション
および洗浄の後、他の核酸複合体からPNA:DNA二重鎖を区別し得る標識化
抗体を、任意のハイブリダイゼーションの可視化のために用いる。このような抗
体は、当該分野で公知であり、以下に記載される:例えば、Hansen等:“
Detection of PNA/DNA Hybrid Molecule
s by Antibody Fab Fragments Isolated
from a Phage Display Library”,J Imm
unol Methods,1997 203(2):199−207(本明細
書中で参考として援用される)。この抗体は、以下が挙げられるがこれらに限定
されない検出可能なマーカーを用いて標識され得る:放射性同位体、または熱量
マーカー(例えば、ジゴキシゲニン)、発光マーカー、蛍光マーカーまたは酵素
(例えば、アルカリホスファターゼ)。このようなマーカーは、当該分野で公知
である。さらに、一次抗体は、検出目的のために標識された二次抗体によって次
に認識され得る。
Uプローブ)を最初に用いて、アビジンコートしたマイクロタイタープレート上
に全ての型のHPV DNAをハイブリッドさせて捕捉する(hybrid−c
apture)。適切なインキュベーションおよび洗浄後、PNAプローブを、
ハイブリダイゼーションのためにプレートに添加する。ハイブリダイゼーション
の検出を、先の段落で記載されるように、抗体を用いて実施し得る。
の両方を備えるキットを含み、そして、検出アッセイに必要とされる他の試薬を
含み得る。例えば、キットは、頸部サンプルを取得するため、サンプルを保存す
るため、ならびにサンプルから遺伝物質を単離および精製するために、材料、機
器、およびデバイスを備え得る。インビトロハイブリダイゼーションキットは、
複数のプローブ(例えば、本発明に従って作製されたPNAプローブおよびAL
Uオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにハイブリダイゼーション反応に必要な
他の試薬)を含み得る。これらのプローブのいずれかは、例えば、ビオチンまた
は蛍光団で標識され得る。本発明に従って作製されたキットは、ヌクレオチド増
幅反応のための酵素、プライマー(例えば、MY09/MY11)、緩衝液およ
び他の試薬をさらに備え得る。インサイチュハイブリダイゼーションキットは、
インサイチュハイブリダイゼーションにおいて利用されるスライド調製、シグナ
ル増幅および他の技術に必要とされる、酵素、固定化溶液、緩衝液および他の試
薬を備え得る。キットはまた、標的分子の標識化、検出および可視化のために必
要とされる酵素、抗体、基質および他の試薬を備え得る。このようなキットはま
た、さらなるHPVのタイピングのために必要とされるプローブおよび試薬を備
え得る。
幅をブロックすることによって選択された核酸改変体の1つ以上を同定する生物
学的サンプルの臨床アッセイのために提供される。好ましい実施形態において、
疾患生物体の選択された株または改変体(例えば、細菌、酵母、他の微生物、ま
たはウイルスの、DNAまたはRNA)の1つ以上を検出するための方法が使用
される。これらの方法は、疾患生物体の核酸を、その生物体のいくつかおよび好
ましくは全ての株または改変体由来の核酸を増幅し得るコンセンサスプライマー
(一方、このプライマーは、選択されていない株由来の核酸の増幅をブロックす
る)を用いて増幅する工程を包含する。増幅産物の存在は、選択された株の存在
を示す。標識プローブは必要でない。目的の株に特徴的な配列とハイブリダイズ
するいかなるプローブも必要でない。好ましい実施形態において、PCRを用い
て核酸を増幅し、そしてPNAから作製されたブロッキングプローブを用いる。
度を示すHPVの株についてスクリーニングするために女性被験体から得る。こ
のようなサンプルは、例えば、PreservCyt(登録商標)保存溶液中に
懸濁され得る。このサンプル由来のDNAを、当業者に周知のキットおよび方法
を用いて単離および精製する。
例示されるようにPCR反応のためのプライマーとして選択される。プライマー
MY09およびMY11(配列番号10および配列番号11)は、HPV LI
コンセンサス領域の一部分に結合する。LIコンセンサス領域は、ウイルスの組
込みが細胞内で生じる場合はいつでも保持されるので、好ましい。しかし、HP
Vウイルスゲノムにおける他の領域(例えば、L2、E1、E6およびE7オー
プンリーディングフレーム)はまた、増幅のための候補領域として有用である。
HPV特異的PNAブロッキングプローブは、公開されたHPV DNA配列(
例えば、GENBANK提供)に基づいて構築される。本発明に従って、PNA
を含むブロッキングプローブは、低危険度HPV株のみのL1領域における一部
(プライマーMY09およびMY11に対するハイブリダイゼーション部位間)
に実質的に相補的であるよう設計される。次のPCRは、高危険度株由来のDN
Aのみを選択的に増幅する。なぜなら、低危険度株の指数関数的増幅は、PNA
プローブによってブロックされるからである。低危険度株におけるブロックされ
る領域に至るまでのこれらのプライマーのハイブリダイゼーション部位間のセグ
メントは、指数関数様式よりもむしろ線形様式で複製され、このため、アンプリ
コンの検出可能な量を生じない。好ましい実施形態において、プローブは、プラ
イマーハイブリダイゼーション部位に隣接する領域にハイブリダイズし、短縮さ
れた増幅産物さえ除去する。従って、本発明の方法において、増幅産物(すなわ
ち、ベースラインレベルを超える多くの核酸)は、慣用的なDNA検出方法(例
えば、エチジウムブロマイド染色、CYBR Green染色および他のDNA
染色)によって検出可能である。アンプリコンの存在は、サンプル中に高危険度
株が存在することを示す。このアンプリコンのサイズは、簡単なゲル電気泳動ま
たは他の方法によって決定され得、高危険度株の存在をさらに実証するために用
いられる。逆に、増幅産物が存在しないことは、サンプル中に高危険度株を欠く
ことを示す。
の核酸に対する特異性を用いて構築され得る。これらの複数のブロッキングプロ
ーブが、増幅反応において「カクテル」として用いられる場合、これらのプロー
ブは共に、全ての選択されていない株の増幅をブロックする。従って、特に好ま
しい実施形態において、プローブは、いかなる高危険度株の増幅もブロックせず
、できるだけ多数の低危険度HPV株(例えば、11型、16型、および42〜
44型)をブロックするよう構築される。さらに好ましい実施形態において、少
なくとも1つのプローブは、増幅が企図される領域内で低危険度HPV DNA
とのハイブリダイゼーションによって低危険度HPV株全ての増幅をブロックす
る。増幅産物(これは、プライマーセット間の全長である)の次の検出は、サン
プル中に高危険度株の存在することを示すが、一方、増幅産物が存在しないこと
は、高危険度株を欠くことを示す。
のハイブリダイゼーション部位と部分的にかまたは完全にハイブリダイズするよ
う構築される。好ましい実施形態において、プローブは、PNA分子またはPN
Aと別のヌクレオチド(例えば、DNA)との間のキメラから作製されている。
配列特異的ハイブリダイゼーションを介した増幅をブロックするプローブの他の
型もまた、用いられ得る。そして、このブロッキングプローブは、(図1または
図2のいずれかに従って用いられる)は、先に記載されたように、分子標識とな
るよう構築され得る。分子標識ブロッキングプローブは、このブロッキングプロ
ーブと選択されていない株のテンプレートとの間のハイブリダイゼーションのリ
アルタイムの検出を可能にする。
トに対してより高い親和性を有する。従って、PNAプローブが、DNAプライ
マーまたはRNAプライマーと、ハイブリダイゼーション部位の一部または全て
に対して競合する状況において、PNAプローブと核酸テンプレートとの間のハ
イブリダイゼーションが支持される。結果として、このプライマーセットのハイ
ブリダイゼーション部位間の全長増幅は、阻害される。Buchardtらによ
る米国特許第5,891,625号を参照のこと(この全体の開示は、本明細書
中で参考として援用される)。
または複数(「カクテル」)ブロッキングプローブを含み得る。図1に関連した
実施形態に記載されることに類似して、増幅産物の検出は、選択された株(例え
ば、HPVの高危険度株)の存在を示す。
ついてスクリーニングする。切屑を、綿棒で集めることによって得て、そして1
mlあたり約2.0×105個の細胞の濃度でPreservCyt(登録商標
)溶液を塗布してこの中に置く。細胞を含む溶液をボルテックスによって混合し
、そして、Lapidus等による米国特許第5,143,627号(参考とし
て本明細書中で援用される)に記載されるように、このサンプルのアリコートを
取得して、細胞学的分析のために「ThinPrep」スライドを作製する。特
に、このスライド(ここに、サンプル細胞を均一に移す)を、ThinPrep
Processor 2000(登録商標)(Cytyc Corporat
ion,Boston MA)を用いて調製する。
tre Technologies,Inc.(Madison,Wiscon
sin)のBuccal Swab DNAキットをDNA抽出のために用いる
。MY09/MY11コンセンサスプライマー(Research Genet
ics,Inc,Huntsville,AL)を、PCR増幅のために用いる
。
mMのTris−HCl(pH8.3)、5−mMのKCl、6mMのMgCl2 、22μMのdNTP、50pmoleのプライマー、5pmoleのβ−グ
ロビンプライマーPC04およびGH20、ならびに2.5ユニットのAmpl
itaq DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer Getus,P.
W.Roche Molecular Systems,Inc.,Branc
hburg,NJ)有する総容積50μlにする。β−グロビン遺伝子の増幅を
、コントロールとして実施して、このサンプルがPCRによるHPV検出にふさ
わしいかどうかを決定する。PCRパラメーターを、35サイクル(95℃−6
0秒/55℃−60秒/72℃−60秒)に設定する。増幅産物を、エチジウム
ブロマイドで染色される1%のアガロースゲルでの反応混合物の5分の1の容積
の電気泳動によって検出する。次いで、サンプルDNAをゲルから抽出し、そし
てインサイチュハイブリダイゼーションアッセイ(以下に記載されるように)を
用いてHPV状態を評価する。
ーブを、作製した。PNAプローブ配列は、GENBANKデータベースからの
情報を用いて設定したMY09/MY11縮重プライマーによって増幅されたL
1コンセンサス領域中に見出される相同性領域に基づいた。5つのPNA配列を
、以下の配列番号1〜5として同定する。ビオチン標識化PNA(14〜15塩
基長)を、PerSeptive BioSystems(Framingha
m,MA)による使用説明書に従って合成した。
Cyt(登録商標)溶液(Cytyc Corporation,Boxbor
ough,MA)中で保存した。これらのサンプル由来のDNAを、以下の工程
をともなうEpicenterのBuccal swab DNA抽出キット(
Madison,WI)を用いて単離して精製した:2mlのPreservC
yt(登録商標)懸濁液を、8,000×gにて5分間、遠心分離することによ
ってペレット化した。この上清を除去し、このペレットをEpicenterの
DNA抽出液中に再懸濁し、そして60℃にて30分間、98℃にて10分間イ
ンキュベートし、そして氷上で5分間、冷却した。抽出されたDNAを含む得ら
れた上清を、8,000×gにて5分間の遠心分離によって回収した。
型を、まず、2つの別々の方法によって決定した。第1のタイピング方法は、H
PVコンセンサスプライマー(MY09/MY11)−HPVの増幅されたL1
コンセンサス領域の、ポリメラーゼ連鎖反応−制限断片長多型(Polymer
ase Chain Reaction−Restriction Fragm
ent Length Polymorphism)(PCR−RFLP)分析
であった。PCR−RFLPを、Lungo等,”Typing of HPV
by PCR Amplification with L1 Consen
sus Primers and RFLP Analysis”,Mol.&
Cell Probes,第10巻,l45〜52頁,1992(本明細書中で
参考として援用される)によって記載された方法に従った標本で実施した。特に
、精製したDNAをP−32標識化CTP(および他の適切なNTP)の存在下
で増幅し、次いで、このアンプリコンを、Pst I、Rsa I、およびHa
e IIIを用いて同時に消化した。制限消化産物をポリアクリルアミドゲルで
分析し、そしてHPV型サイズをHPV DNA標準物に基づいて割り当てた。
検出を、X線フィルムに露光することによって達成した。PCR−RFLPに加
えて、各ポジティブ標本を、市販のハイブリダイゼーションHPV DNAタイ
ピングキット(Alphagenics Diaco Biotech,Tri
este,Italy)を製造業者の指示書に従って用いる第2の方法によって
タイピングした。精製したサンプルDNAを、まず、DIG標識化MY09/M
Y11プライマーを用いて増幅した。このアンプリコンを、各型のHPV DN
Aに対して特異的なビオチン標識化DNAプローブを用いて、続けてハイブリダ
イズさせた。ハイブリダイズされた二重鎖を、アビジンコートしたマイクロタイ
タープレートに捕捉し、そしてDIG標識化核酸を認識する酵素結合抗体を用い
て検出した。
タイピングした後、このDNAをMY09/MY11プライマーを用いて増幅し
、その後、構築したPNAプローブとハイブリダイズさせた。種々の型のHPV
のPCR増幅したDNAサンプルを、0.8%アガロースゲルの異なる列にロー
ドし、そしてPAGEを行った。HPV L1コンセンサスアンプリコンのサイ
ズおよび存在を、PAGEサンプルのエチジウムブロマイド染色によって決定し
た。このゲル中のアンプリコンを、脱プリン化し、洗浄し、次いで室温にて変性
させた。次いで、このゲルを、室温にて中和(0.5MのTris−HCl/1
.5MのNaCl)させ、そしてこのDNAを、毛細管拡散(capillar
y diffusion)を介してアガロースゲルからナイロン膜(Biody
ne B membrane,PALL)に一晩転写した。好首尾の転写を、処
理したゲル上にエチジウムブロマイドのバンドが存在しないことから決定した。
その後、このDNAを80℃にて30分間加熱することによって膜に固定した。
この膜を、2×SSC中で再水和させ、そしてブロッキング溶液(100mg/
mlのサケ精子DNA/5×SSC/5×Denhardt溶液/0.1%のS
DS)を用いて68℃にて30分間、予めハイブリダイズさせた。続いてこの膜
を、20nMの変性ビオチン標識化PNAプローブを用いて、65℃にて一晩、
ハイブリダイズさせた。
識したPNA:DNAハイブリッドの存在を、触媒としてホスファターゼ酵素に
依存する化学発光基質アッセイによって確証した(New England B
ioLabs提供のPhototope Star検出キット)。最終的な検出
を、X線フィルム(Kodak)に対するサザンブロットの露光によって得た。
顕著なハイブリダイゼーションが、特定の配列番号(行)に従って構築したPN
Aプローブと特定の型のHPV(列)との間で認められたことを示す。−の表示
は、このような知見が認められなかったことを示す。この表中の空白の欄は、ハ
イブリダイゼーション反応を、規定のようにまだ行っていないことを示す。
通して、HPVの標的核酸の検出もまた試験した。PCR増幅したDNA(1μ
l)を、変化させた希釈のハイブリダイゼーション緩衝液中にビオチン標識した
PNAプローブI(配列番号1)(20pM)と混合した。アンプリコンをPN
Aプローブ存在下で95℃にて10分間変性させ、迅速にアニーリングさせ、そ
してPNA:DNA二重鎖を3%のアガロースゲル上で単離した。DNAの存在
を、エチジウムブロマイド染色することによって決定し得る。この後、このDN
Aを、変性させずに、毛細管拡散を介してナイロン膜に転写した。ナイロンへの
定着を、先に記載したように実施した。DNA:PNA二重鎖を、先に記載した
ように、化学発光基質およびX線フィルムを用いて検出して可視化した。ハイブ
リダイゼーション緩衝液の1:1〜1:1000の範囲の希釈において、顕著な
ハイブリダイゼーションは、プローブIとCaski細胞由来の16型HPV
DNAとの間で認められたが、同じプローブとHela細胞由来の18型HPV
DNAとの間では認められなかった。前もったゲルハイブリダイゼーションは
、ゲル中での変性および緩慢なハイブリダイゼーションならびにストリンジェン
シー洗浄の必要性を排除し、検出アッセイのための作業時間を短縮化し、相対的
に少量のPNAプローブを必要とし、そしてPCR産物に対して良好に作用する
。
、2×SSC中の10μg/mlのプロテイナーゼK 500μl、または0.
05%〜0.15%のペプシンを含有する0.2Nの塩酸溶液 500μl)を
用いて、37℃にて30分間、消化する。次いで、これらのスライドを、2分間
、2×SSCで洗浄し、エタノールで脱水し、そして風乾させた。1〜20nM
のPNAプローブを含有したハイブリダイゼーション混合物の15〜20μlを
各スライドに適用する。次いで、スライドを、ガラス製のカバーガラスでカバー
し、封着する。
ch,Inc.Watertown,MA)内にスライドを置き、そして素早く
移動してサーモサイクラーの温度を3分間80℃に維持することによって、同時
に変性させる。その後、内部の温度を37℃まで急速に低下させ、そして15分
から2時間、このインキュベーションを続行させる。次に、これらのスライドを
サーモサイクラーから取り出し、このカバーガラスをピンセットで取り外し、そ
してスライドを、75℃にて5分間、2×SSCで洗浄する。次いで、スライド
を、0.05%のTween20を含有するリン酸緩衝生理食塩水 40mlを
含むCoplin瓶に2分間、移す。
ctキット(Life Science Product at Boston
,MA)を用いることによって実施し得る。Tyramide Signal
Amplificationシステムは、“In situ hybridiz
ation with biotinylated tryamide amp
lification:Detection of human papill
omavirus DNA in cervical neoplasia”,
Modern Pathol 1998;11:19−23においてSano等
によって記載される(本明細書中で参考として援用される)。基本工程を、以下
の通り実施し得る:先の工程からの各スライドを、100μlのTNBブロッキ
ング緩衝液(0.15MのNaClを含有する0.1MのTris−HCl(p
H7.5)、および0.5%のブロッキング試薬)とともに、湿潤チャンバー(
humid chamber)中で30分間室温にてインキュベートする。プラ
スチック製のカバーガラスを、蒸発を減ずるためにスライドの上に使用する。各
スライドは、100μlのストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ試
薬(TNBブロッキング緩衝液中での1:100の希釈)を受け、そして、その
後、カバーガラスによってカバーしたまま、室温にて30分間、インキュベート
する。次に、スライドを、TNT緩衝液(0.15MのNaClおよび0.05
%のTweenを含有する0.1MのTris−HCl(pH7.5))中で撹
拌しながら、室温にて洗浄し、そして、各スライドに対して300μlのビオチ
ン標識したチラミド(biotinyl−tyramide)を添加する。室温
にて3〜10分間インキュベーション後、これらのスライドをTNT緩衝液でも
う1回洗浄する。
中で1:100の希釈)を、各スライドに添加する。スライドを、5〜10分間
室温にてカバーしたまま、湿潤チャンバー中でインキュベートし、次いで、各ス
ライドをTNT緩衝液で洗浄する。ハイブリダイズしたPNAプローブを、製造
業者の指示書に従って、BCIP−NBT検出システムによって検出する。
ガラスをつけて、マウントした。
るように、懸濁した頸部切屑標本から調製した。
を用いて、第2のアリコートから抽出したDNAテンプレートの増幅の選択的ブ
ロッキングにおいて有用なPNAプローブを作製する。用いたPNAプローブを
、配列番号6〜8に示す。代表的に、これらのプローブは、溶液中に存在するた
めに十分に短くあるべきである(すなわち、19塩基未満)。これらのプローブ
を構築することにおいて、配列における10塩基の任意のストレッチについて、
プリンが約7つ未満で存在することが理想的である。
番号10および配列番号11)またはその改変を用いてプローブの存在下または
非存在下で、以下の条件下で実施する:95℃にて5分間の開始変性工程、次い
で、35サイクルの95℃−30秒/54℃−30秒/72℃−60秒、72℃
にて2分間の最終伸長工程。他の熱サイクリング条件もまた、本願のために使用
し得た(例えば、95℃にて5分間の開始変性工程、次いで35サイクルの95
℃−30秒/4℃−60秒/55℃−30秒/72−60秒、72℃にて2分間
の最終伸長)。さらなる代替工程は、4℃の工程に代わる25℃のPNAアニー
リング温度、ならび4℃の工程を60秒から30秒に短縮することを含み得る。
HPV LI領域を増幅しかつ配列決定するためのMY09およびMY11プラ
イマーの使用は、Bauer等の“Genital Human Papill
omavirus Infection In Female Univers
ity Students As Determined By A PCR−
Based Method”,JAMA 1991;265:472−477に
より詳細に記載される(本明細書中で参考として援用される)。
MのTris−HCl(pH8.3)、25mMのKCl、5mMのMgCl2 、200μMのdNTP、100nmoleの各HPV L1コンセンサスプラ
イマー、1.0ユニットのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ(G
ibco)および100〜750ngの精製した細胞のDNAから構成される。
DNA濃度を、260nmと280nmとの読み取り値の間の比を算出すること
によるUV分光光度法によって決定する。OD260/OD280は、核酸の純
度の評価を提供する。最終PNA濃度を、通常、10μMに定める。増幅産物を
、エチジウムブロマイドで染色される2%のアガロースゲル上での反応混合物の
4分の3の電気泳動によって検出し得る。
試験) 2つのPNAプローブ(VIおよびVII)(配列番号6〜7)を、図1に図
示される実施形態に従って構築した。両方のPNAプローブ(VIおよびVII
)の配列は、低危険度HPV株6および11の相同的な部分に対して実質的に相
補的である。両方のプローブは、プライマーセットMY09/MY11に対する
結合部位の間の部分に結合する。
的ブロッキング能を試験する。図3に示されるように、PCRアンプリコンは、
HPVプローブのVIおよびVIIのいずれを用いた場合でも、HPV株11の
DNAサンプル中で全く認められなかった。予測した長さのPCRアンプリコン
を、プローブVIまたはVIIのいずれかの存在下で、HPV株16または18
のDNAのエチジウムブロマイド染色によって検出した。これらの結果は、プロ
ーブVIおよびVIIが、(それらが設計されたように)HPV株11(16で
も18でもなく)の増幅をブロックし得たことを示した。
試験) 改変されたコンセンサスプライマーMC01(配列番号9)を、MY09との
結合に用いられるように構築し、そして株18を含む複数のHPV株を増幅し得
た。PNAプローブVIII(配列番号8)を、2塩基対の改変を有するプライ
マーMC01の一部を含むよう設計した。このプローブは、HPV株18のDN
Aに対して100%相補的なプローブであり、かついかなる他の株に対しても相
補的ではないプローブとなる。PNAプローブVIIIは、HPV株18のDN
Aに結合するために改変されたコンセンサスプライマーMC01と競合すると予
測された。
VIIIを試験した。種々の濃度のHPVプローブVIIIを用いた場合、PC
Rアンプリコンは全く認められなかった。予測された長さのPCRアンプリコン
を、PNAプローブVIIIの非存在下で、DNAサンプルのエチジウムブロマ
イド染色によって検出した。これらの結果は、プローブIIIがHPV株18の
増幅と競合し、かつブロックし得たことを示した。
することに重点をおき、代わりに概して位置付けられる。
する選択的増幅を示す、エチジウムブロマイド染色ゲルである。
ってブロックされるDNA増幅を示す、別のエチジウムブロマイド染色ゲルであ
る。
Claims (37)
- 【請求項1】 サンプル中の生物の少なくとも1つの選択された株の存在を
検出するための方法であって、以下の工程: 生物の少なくとも1つの選択された株由来の核酸および該生物の少なくとも1
つの選択されていない株由来の核酸を含み得るサンプルを提供する工程; 該生物の少なくとも1つの選択された株由来の該核酸および該生物の少なくと
も1つの選択されていない該株由来の核酸の両方の領域に対して実質的に相補的
な複数のプライマーを提供する工程; 該複数のプライマー間での少なくとも1つの選択されていない株由来の該核酸
の全長増幅をブロックするに十分な程少なくとも1つの選択されていない株由来
の該核酸の一部分に相補的である少なくとも1つのプローブに、該サンプルを曝
露する工程であって、該少なくとも1つのプローブが核酸アナログを含む、工程
; 該複数のプライマー間で、少なくとも1つの選択された株由来の該核酸を増幅
する工程;ならびに 少なくとも1つの選択された株由来の核酸の増幅産物を検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 前記少なくとも1つの選択された株が病原性株を含む、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記サンプルが被験体由来であり、かつ前記病原性株が該被
験体における癌性増殖の危険を示す、請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記生物が、ヒトパピローマウイルス(HPV)を含む、請
求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 前記少なくとも1つのプローブがPNAを含む、請求項1に
記載の方法。 - 【請求項6】 前記少なくとも1つのプローブがさらに、PNAとは異なる
ヌクレオチドを含む、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記少なくとも1つのプローブの各々が、少なくとも8塩基
を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 請求項1に記載の方法であって、前記複数のプライマー間で
、少なくとも1つの選択された株の前記核酸を増幅させる工程が、ポリメラーゼ
連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、ローリングサークル複製、分枝鎖増幅、核酸に基
づく配列増幅(NASBA)、Cleavase断片長多型、ICANおよびR
AMからなる群より選択される反応を行う工程を包含する、方法。 - 【請求項9】 前記核酸の両方の前記領域が、L1、L2、E1、E6およ
びE7領域からなる群より選択される領域の部分である、請求項4に記載の方法
。 - 【請求項10】 前記少なくとも1つの選択されていない株が、既知の低危
険度HPV株のすべてに相当する、請求項4に記載の方法。 - 【請求項11】 前記少なくとも1つの選択されていない株が、HPV株6
、11、42、43、および44からなる群より選択される、請求項4に記載の
方法。 - 【請求項12】 前記少なくとも1つの選択された株が、複数の高危険度H
PV株を含む、請求項4に記載の方法。 - 【請求項13】 前記複数のプライマーが、MY09およびMY11(配列
番号10および11)を含む、請求項4に記載の方法。 - 【請求項14】 前記少なくとも1つのプローブが配列番号6および配列番
号7からなる配列群より選択される、請求項4に記載の方法。 - 【請求項15】 前記サンプルが頸部切屑である、請求項1に記載の方法。
- 【請求項16】 前記増幅産物を検出する工程が、該産物のゲル内電気泳動
工程および該産物をエチジウムブロマイドで染色する工程を包含する、請求項1
に記載の方法。 - 【請求項17】 サンプル細胞中のヒトパピローマウイルス(HPV)の標
的核酸の存在を検出する方法であって、以下の工程: サンプル細胞を溶液中に懸濁する工程; 該サンプル細胞からHPVの標的核酸を単離する工程; 該標的核酸を、ペプチド核酸(PNA)を含む少なくとも1つのプローブと接
触させる工程であって、該少なくとも1つのプローブは、複数のHPV型の核酸
の部分に実質的に相補的である、工程;および 該少なくとも1つのプローブと該標的核酸との間のハイブリダイゼーションを
検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項18】 請求項1に記載の方法であって、前記溶液が、凝集するこ
となくサンプル細胞を固定するための十分な量のアルコール、抗集塊剤、および
該溶液を約4〜約7の範囲内のpHに維持する緩衝剤を含む、方法。 - 【請求項19】 前記サンプル細胞が被験体由来であり、そしてここで、前
記標的核酸配列の存在が該被験体における腫瘍増殖の危険を示す、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項20】 前記腫瘍増殖が子宮頸癌または子宮頸管内癌腫のいずれか
に関連する、請求項4に記載の方法。 - 【請求項21】 前記標的核酸配列の存在がHPVの特定の型の存在を示す
、請求項3に記載の方法。 - 【請求項22】 前記HPVの特定の型が、16型、18型、31型、33
型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、68
型、および70型からなる群より選択される、請求項7に記載の方法。 - 【請求項23】 前記標的核酸配列の非存在が、HPVによる感染の非存在
の診断となる、請求項3に記載の方法。 - 【請求項24】 前記標的核酸配列の非存在が、16型、18型、31型、
33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型、59型、
68型、および70型からなる群より選択されるHPV型による感染の非存在の
診断となる、請求項3に記載の方法。 - 【請求項25】 前記標的核酸配列の非存在が、高危険度型のHPVによる
感染の非存在の診断となる、請求項1に記載の方法。 - 【請求項26】 さらに、前記標的核酸の増幅を包含する、請求項1に記載
の方法。 - 【請求項27】 前記増幅工程が、ポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を包含
する、請求項12に記載の方法。 - 【請求項28】 さらに、前記標的核酸分子を、PNA−DNA相互作用を
介して、固体支持体上へ捕捉させる工程を包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項29】 前記少なくとも1つのプローブの各々が少なくとも8塩基
を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項30】 前記少なくとも1つのプローブがPNAとは異なるヌクレ
オチドを含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項31】 前記少なくとも1つのプローブが配列番号1〜5からなる
群より選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項32】 前記少なくとも1つのプローブが検出可能マーカーで標識
されている、請求項1に記載の方法。 - 【請求項33】 前記少なくとも1つのプローブが分子標識プローブを含む
、請求項17に記載の方法。 - 【請求項34】 さらに、前記ハイブリダイゼーションを認識するための抗
体を使用する工程を包含する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項35】 サンプル中のヒトパピローマウイルス(HPV)の標的核
酸の存在を検出するための方法であって、以下の工程: 固体支持体上で、標的核酸を含む候補核酸を捕捉する工程; 該候補核酸をペプチド核酸(PNA)を含む少なくとも1つのプローブと接触
させる工程であって、該少なくとも1つのプローブが複数のHPV型の核酸の部
分に実質的に相補的である、工程;および 該少なくとも1つのプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検
出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項36】 候補核酸を捕捉する工程がDNA−DNA相互作用を含む
、請求項35に記載の方法。 - 【請求項37】 サンプル中におけるヒトパピローマウイルス(HPV)の
標的核酸の存在に関するインサイチュでの検出のための方法であって、以下の工
程: 懸濁されたサンプル細胞を均一に表面上へ移す工程; 該細胞中に含まれるHPVの標的核酸を、ペプチド核酸(PNA)を含む少な
くとも1つのプローブとインサイチュでハイブリダイズさせる工程であって、該
少なくとも1つのプローブが複数のHPV型の核酸の部分に実質的に相補的であ
る、工程;および 該少なくとも1つのプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検
出する工程、 を包含する、方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US19430400P | 2000-04-03 | 2000-04-03 | |
US60/194,304 | 2000-04-03 | ||
US22552400P | 2000-08-15 | 2000-08-15 | |
US60/225,524 | 2000-08-15 | ||
PCT/US2001/010795 WO2001075174A2 (en) | 2000-04-03 | 2001-04-03 | Detection and typing of human papillomavirus using pna probes |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008084592A Division JP2008188019A (ja) | 2000-04-03 | 2008-03-27 | Pnaプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003529376A true JP2003529376A (ja) | 2003-10-07 |
JP2003529376A5 JP2003529376A5 (ja) | 2008-05-15 |
Family
ID=26889880
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001573046A Pending JP2003529376A (ja) | 2000-04-03 | 2001-04-03 | Pnaプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング |
JP2008084592A Pending JP2008188019A (ja) | 2000-04-03 | 2008-03-27 | Pnaプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008084592A Pending JP2008188019A (ja) | 2000-04-03 | 2008-03-27 | Pnaプローブを使用するヒトパピローマウイルスの検出およびタイピング |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20020155427A1 (ja) |
EP (1) | EP1294939B1 (ja) |
JP (2) | JP2003529376A (ja) |
AT (1) | ATE456668T1 (ja) |
AU (2) | AU2001256976A1 (ja) |
DE (1) | DE60141205D1 (ja) |
WO (1) | WO2001075174A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012075376A (ja) * | 2010-09-30 | 2012-04-19 | Osaka Univ | アゾベンゼン架橋型ペプチド核酸を用いたインフルエンザウイルスを測定する方法 |
JP2013517802A (ja) * | 2010-01-29 | 2013-05-20 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物 |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6936443B2 (en) * | 2000-04-03 | 2005-08-30 | Cytyc Corporation | Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes |
US20040115692A1 (en) * | 2000-04-03 | 2004-06-17 | Cytyc Corporation | Methods, compositions and apparatuses for detecting a target in a preservative solution |
GB0207242D0 (en) * | 2002-03-27 | 2002-05-08 | Norchip As | Universal detection of human papillomavirus mRNA |
US20040248085A1 (en) * | 2002-11-29 | 2004-12-09 | Sang-Wha Lee | General primers and process for detecting diverse genotypes of human papillomavirus by PCR |
JP4498357B2 (ja) * | 2003-09-25 | 2010-07-07 | サード・ウェーブ・テクノロジーズ・インク | Hpvの検出法 |
WO2005033333A2 (en) | 2003-10-07 | 2005-04-14 | Dako Denmark A/S | Methods and compositions for the diagnosis of cancer |
WO2005090608A2 (en) * | 2004-03-05 | 2005-09-29 | Advandx, Inc. | High affinity probes for analysis of human papillomavirus expression |
EP1628135A1 (en) * | 2004-08-20 | 2006-02-22 | MTM Laboratories AG | Method for detecting medically relevant conditions in a solubilized LBC sample |
US20070238100A1 (en) * | 2004-11-30 | 2007-10-11 | Mcglennen Ronald C | Integrated methodologies for the detection and genotyping of human papillomaviruses |
US20060189893A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-08-24 | Diamics, Inc. | Systems and methods for detecting abnormal cells |
US20060161076A1 (en) * | 2005-01-06 | 2006-07-20 | Diamics, Inc. | Systems and methods for collection of cell clusters |
US20070111960A1 (en) * | 2005-03-04 | 2007-05-17 | Advandx, Inc. | High affinity probes for analysis of human papillomavirus expression |
US8080643B2 (en) * | 2006-09-05 | 2011-12-20 | Third Wave Technologies, Inc. | HPV primers |
US9090948B2 (en) | 2008-09-30 | 2015-07-28 | Abbott Molecular Inc. | Primers and probes for detecting human papillomavirus and human beta globin sequences in test samples |
WO2010126913A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-11-04 | Gen-Probe Incorporated | Methods and kits for use in the selective amplification of target sequences |
KR101951172B1 (ko) * | 2014-11-07 | 2019-02-22 | 주식회사 파나진 | 인유두종바이러스의 유전자형 검출을 위한 ρνα 프로브, 키트 및 방법 |
CN106520919A (zh) * | 2016-09-30 | 2017-03-22 | 苏州新海生物科技股份有限公司 | 一种检测目标核酸序列变异体的组合物和方法及试剂盒 |
MX2022012104A (es) * | 2020-04-14 | 2022-10-18 | Spectrum Solutions L L C | Productos y metodos para la deteccion de acido nucleico viral. |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999014377A2 (en) * | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Innogenetics N.V. | Detection and identification of human papillomavirus by pcr and type-specific reverse hybridization |
WO1999061661A1 (fr) * | 1998-05-27 | 1999-12-02 | Bio Merieux | Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre |
WO1999063118A1 (en) * | 1998-05-30 | 1999-12-09 | Visible Genetics Inc. | Method, reagent and kit for genotyping of human papillomavirus |
Family Cites Families (49)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1276575C (fr) * | 1984-11-30 | 1990-11-20 | Sylvie Beaudenon | Sondes a papillomavirus et procede de diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus |
US5876922A (en) * | 1985-07-31 | 1999-03-02 | Institute Pasteur | Papillomavirus probe and a process for in vitro diagnosis of papillomavirus infections |
US5411857A (en) * | 1985-07-31 | 1995-05-02 | Institut Nationale De La Sante | Probes for papillomaviruses and an in vitro diagnostic procedure for papilloma infections |
KR930007580B1 (ko) * | 1986-03-21 | 1993-08-13 | 엥스띠뛰 빠스뙤르 | 유두종 비루스 게놈으로부터 유도된 결정 dna 서열, 그의 시험관내 진단 목적용 용도 및 항원 조성물의 제조 방법 |
US5783412A (en) * | 1987-02-26 | 1998-07-21 | Biosearch International Pty. Ltd. | Method of detection of carcinogenic human papillomavirus |
US4849332A (en) | 1987-05-26 | 1989-07-18 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 35 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
US4908306A (en) * | 1987-06-12 | 1990-03-13 | Life Technologies, Inc. | Human papillomavirus 56 nucleic acid hybridization probes and methods for employing the same |
FR2629458B2 (fr) * | 1987-07-31 | 1991-08-09 | Ire Celltarg Sa | Nouvelles sondes d'acides nucleiques specifiques de differents types de virus de papillome humain |
US5639871A (en) * | 1988-09-09 | 1997-06-17 | Roche Molecular Systems, Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
US5447839A (en) * | 1988-09-09 | 1995-09-05 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction |
US5182377A (en) * | 1988-09-09 | 1993-01-26 | Hoffmann-La Roche Inc. | Probes for detection of human papillomavirus |
CA1339729C (en) * | 1988-10-26 | 1998-03-17 | Wayne D. Lancaster | Human papillomavirus type 52 dna sequences and methods for employing thesame |
DE3838269A1 (de) * | 1988-11-11 | 1990-05-17 | Behringwerke Ag | Nachweis humaner papillomavirus dna und ihrer expression in zervix-abstrichen |
US5863717A (en) * | 1989-11-03 | 1999-01-26 | Abbott Laboratories | Use of conserved oligonucleotide primers to amplify human papillomavirus DNA sequences |
US5580970A (en) * | 1989-12-01 | 1996-12-03 | Amoco Corporation | Detection of HPV transcripts |
NL9000134A (nl) * | 1990-01-19 | 1991-08-16 | Stichting Res Fonds Pathologie | Primers en werkwijze voor het detecteren van humaan papilloma virus genotypen m.b.v. pcr. |
FR2663040B1 (fr) * | 1990-06-11 | 1995-09-15 | Bio Merieux | Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich. |
US5143627A (en) * | 1990-07-09 | 1992-09-01 | Cytyc Corporation | Method and apparatus for preparing cells for examination |
US5484699A (en) * | 1990-09-28 | 1996-01-16 | Abbott Laboratories | Nucleotide sequences useful as type specific probes, PCR primers and LCR probes for the amplification and detection of human papilloma virus, and related kits and methods |
US5256571A (en) * | 1991-05-01 | 1993-10-26 | Cytyc Corporation | Cell preservative solution |
US5539082A (en) * | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
DK51092D0 (da) | 1991-05-24 | 1992-04-15 | Ole Buchardt | Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf |
US5543294A (en) * | 1991-07-19 | 1996-08-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism method for the detection and typing of myobacteria |
US6020124A (en) * | 1992-04-27 | 2000-02-01 | Trustees Of Dartmouth College | Detection of soluble gene sequences in biological fluids |
GB9211979D0 (en) | 1992-06-05 | 1992-07-15 | Buchard Ole | Uses of nucleic acid analogues |
US5719028A (en) * | 1992-12-07 | 1998-02-17 | Third Wave Technologies Inc. | Cleavase fragment length polymorphism |
US5679509A (en) * | 1993-09-28 | 1997-10-21 | University Of New Mexico | Methods and a diagnostic aid for distinguishing a subset of HPV that is associated with an increased risk of developing cervical dysplasia and cervical cancer |
WO1995011909A1 (en) | 1993-10-28 | 1995-05-04 | Case Western Reserve University | Peptide-based nucleic acid surrogates |
AU697841B2 (en) | 1993-11-12 | 1998-10-15 | Phri Properties, Inc. | Hybridization probes for nucleic acid detection, universal stems, methods and kits |
EP0760008A1 (en) * | 1994-05-19 | 1997-03-05 | Dako A/S | Pna probes for detection of neisseria gonorrhoeae and chlamydia trachomatis |
US5942391A (en) * | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
US6045995A (en) * | 1994-08-24 | 2000-04-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Capillary electrophoretic detection of nucleic acids |
US5629178A (en) * | 1994-10-28 | 1997-05-13 | Genetics & Ivf Institute | Method for enhancing amplification in the polymerase chain reaction employing peptide nucleic acid (PNA) |
US5871902A (en) * | 1994-12-09 | 1999-02-16 | The Gene Pool, Inc. | Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids |
US5888724A (en) | 1995-02-17 | 1999-03-30 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Detection of high oncogenic-risk papilloma virus in high grade cervical lesions and cancers by a PCR/ELISA assay |
US6509149B2 (en) | 1995-06-06 | 2003-01-21 | Hybridon, Inc. | HPV-specific oligonucleotides |
US5888733A (en) * | 1995-11-16 | 1999-03-30 | Dako A/S | In situ hybridization to detect specific nucleic acid sequences in eucaryotic samples |
US5854033A (en) * | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
US5981173A (en) * | 1996-02-14 | 1999-11-09 | Institut Pasteur | Genital human papillomavirus type 68a (HPV-68a), related to the potentially oncogenic HPV-39 |
JP3898228B2 (ja) | 1996-04-12 | 2007-03-28 | ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク | 検出プローブ、キット及びアッセイ |
US6265154B1 (en) * | 1996-10-25 | 2001-07-24 | Abbott Laboratories | Nucleic acid primers and probes for detecting oncogenic human papillomaviruses |
US6110676A (en) * | 1996-12-04 | 2000-08-29 | Boston Probes, Inc. | Methods for suppressing the binding of detectable probes to non-target sequences in hybridization assays |
US5837466A (en) * | 1996-12-16 | 1998-11-17 | Vysis, Inc. | Devices and methods for detecting nucleic acid analytes in samples |
US5846729A (en) * | 1997-02-27 | 1998-12-08 | Lorne Park Research, Inc. | Assaying nucleotides in solution using a fluorescent intensity quenching effect |
US5958738A (en) * | 1997-03-24 | 1999-09-28 | Roche Diagnostics Corporation | Procedure for subtractive hybridization and difference analysis |
US5849497A (en) * | 1997-04-03 | 1998-12-15 | The Research Foundation Of State University Of New York | Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker |
BR9814271A (pt) * | 1997-12-12 | 2001-03-20 | Digene Corp | Determinação de doenças relacionadas com o vìrus do papiloma humano |
US6287772B1 (en) * | 1998-04-29 | 2001-09-11 | Boston Probes, Inc. | Methods, kits and compositions for detecting and quantitating target sequences |
US6037130A (en) * | 1998-07-28 | 2000-03-14 | The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. | Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits |
-
2001
- 2001-04-03 EP EP01930439A patent/EP1294939B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-03 AU AU2001256976A patent/AU2001256976A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-03 US US09/825,482 patent/US20020155427A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-03 WO PCT/US2001/010795 patent/WO2001075174A2/en active Application Filing
- 2001-04-03 DE DE60141205T patent/DE60141205D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-04-03 JP JP2001573046A patent/JP2003529376A/ja active Pending
- 2001-04-03 AT AT01930439T patent/ATE456668T1/de not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-12-18 US US10/323,188 patent/US7803530B2/en active Active
-
2005
- 2005-11-24 AU AU2005237141A patent/AU2005237141B2/en not_active Ceased
-
2006
- 2006-01-11 US US11/329,834 patent/US20070128588A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-03-27 JP JP2008084592A patent/JP2008188019A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999014377A2 (en) * | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Innogenetics N.V. | Detection and identification of human papillomavirus by pcr and type-specific reverse hybridization |
WO1999061661A1 (fr) * | 1998-05-27 | 1999-12-02 | Bio Merieux | Procede d'amplification d'au moins une sequence nucleotidique particuliere et amorces de mise en oeuvre |
WO1999063118A1 (en) * | 1998-05-30 | 1999-12-09 | Visible Genetics Inc. | Method, reagent and kit for genotyping of human papillomavirus |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2013517802A (ja) * | 2010-01-29 | 2013-05-20 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物 |
JP2016104019A (ja) * | 2010-01-29 | 2016-06-09 | キアジェン ゲイサーズバーグ インコーポレイテッド | 核酸の配列特異的精製および多重分析のための方法および組成物 |
US9689047B2 (en) | 2010-01-29 | 2017-06-27 | Qiagen Gaithersburg Inc. | Methods and compositions for sequence-specific purification and multiplex analysis of nucleic acids |
JP2012075376A (ja) * | 2010-09-30 | 2012-04-19 | Osaka Univ | アゾベンゼン架橋型ペプチド核酸を用いたインフルエンザウイルスを測定する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008188019A (ja) | 2008-08-21 |
EP1294939A2 (en) | 2003-03-26 |
AU2001256976A1 (en) | 2001-10-15 |
US7803530B2 (en) | 2010-09-28 |
ATE456668T1 (de) | 2010-02-15 |
US20020155427A1 (en) | 2002-10-24 |
US20070128588A1 (en) | 2007-06-07 |
DE60141205D1 (de) | 2010-03-18 |
EP1294939B1 (en) | 2010-01-27 |
WO2001075174A3 (en) | 2003-01-23 |
US20030108866A1 (en) | 2003-06-12 |
AU2005237141B2 (en) | 2008-08-07 |
WO2001075174A2 (en) | 2001-10-11 |
AU2005237141A1 (en) | 2005-12-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2005237141B2 (en) | Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes | |
EP0433396B1 (en) | Detection of human papillomavirus by the polymerase chain reaction | |
JP5927243B2 (ja) | 眼および中枢神経系の細菌、真菌、寄生虫およびウイルス感染の同時検出と識別のための新規な方法 | |
Melchers et al. | Increased detection rate of human papillomavirus in cervical scrapes by the polymerase chain reaction as compared to modified FISH and southern‐blot analysi | |
US7393633B1 (en) | Genotyping kit for diagnosis of human papillomavirus infection | |
KR100245283B1 (ko) | 인 시튜 혼성화 방법(in situ hybridization method) | |
RU2441918C2 (ru) | In vitro диагностический набор для идентификации папилломавируса человека в клинических образцах | |
JPH0310700A (ja) | パピローマウイルスの検出方法 | |
US8455632B2 (en) | Primer set and probe for detection of human papillomavirus | |
CN113046488A (zh) | 检测生殖道常见病原体的核酸探针组合、试剂盒及方法 | |
US6936443B2 (en) | Detection and typing of human papillomavirus using PNA probes | |
KR100914911B1 (ko) | 실시간 중합효소 연쇄반응과 hpv dna 칩을 이용한정량 및 정성적 인유두종바이러스 검사 방법 및 이를 위한검사키트 | |
CN113508182A (zh) | 用于检测人乳头状瘤病毒(hpv)的测定 | |
US20050260561A1 (en) | Method for detecting and typing of cutaneous hpv and primers and probes for use therein | |
WO2024003260A1 (en) | Compositions and methods for detecting lymphogranuloma venereum (lgv) serovars of chlamydia trachomatis | |
Erasmus et al. | Basics of molecular biology and its applications-III. Polymerase chain reaction and in situ hybridization | |
CN116814854A (zh) | 人乳头瘤病毒基因分型检测引物探针组合物、应用、检测方法和试剂盒 | |
MX2008006322A (es) | Èmetodo para detectar patògenos |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080327 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080327 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101029 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20110128 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20110204 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20110830 |