KR100245283B1 - 인 시튜 혼성화 방법(in situ hybridization method) - Google Patents

인 시튜 혼성화 방법(in situ hybridization method) Download PDF

Info

Publication number
KR100245283B1
KR100245283B1 KR1019940700703A KR19940700703A KR100245283B1 KR 100245283 B1 KR100245283 B1 KR 100245283B1 KR 1019940700703 A KR1019940700703 A KR 1019940700703A KR 19940700703 A KR19940700703 A KR 19940700703A KR 100245283 B1 KR100245283 B1 KR 100245283B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
probe
reporter
complex
nucleic acid
reca
Prior art date
Application number
KR1019940700703A
Other languages
English (en)
Inventor
에이. 자링 데이비드
제이. 칼호운 코넬리아
피. 세나 엘리사
Original Assignee
이노우에 노리유끼
다이낑 고오교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이노우에 노리유끼, 다이낑 고오교 가부시키가이샤 filed Critical 이노우에 노리유끼
Application granted granted Critical
Publication of KR100245283B1 publication Critical patent/KR100245283B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 고정 세포 또는 아세포의 생물학적 구조체에 함유된 핵산중 공지의 표적서열의 존재를 확인하는 방법에 관한 것이다. 안정한, 리포터-표지된 RecA/단일사슬 프로브 복합체를 상기한 세포 또는 아세포의 구조체에 첨가함으로써, 표적서열은 인 시튜 혼성화에 의해 효과적으로 표지될 수 있으며, 이로써 표적서열을 조직학적으로 또는 현미경적으로 관찰할 수 있거나 또는 인 시튜 시토메트리 또는 세포분류 유동 기술에 의해 검출할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]
인 시튜 혼성화(In situ Hybridization)방법
본 출원은 계류중인 1991년 9월 4일자 출원된, 미합중국 특허출원 제07/755,291호의 CIP 출원이다.
[발명의 분야]
본 발명은 이중사슬 DNA 표적물로 인시튜 혼성화물 실시하기 위한 진단방법에 관한 것이다.
[관련 문헌]
Alexandrov, S.P.M., et al., chromosoma, 96 : 443(1988).
Baan, R.A., et al., Prog Clin Biol Res 340A : 101(1990).
Blum, H.E., et al., Lancet, 771(1984).
Blum, H.E., et al., Virology, 139 : 87(1984).
Buchbinder, A., et al., J of Virol Methods, 21 : 191(1988).
Chen, T.R., Cytogenet Cell Genet 48 : 19(1988).
Cheng. S., et al., J. Biol. Chem. 263 : 15110(1988).
Cherif, D., et al., Human Genetics 81 : 358(1989).
Cooke, H.J., et al., Nucleic Acids Res. 6 : 3177(1979).
Disteche, C.M., et al., Cytometry 11 : 119(1990).
Emmerich, P., et al., Exp Cell Res 181 : 126(1989).
Fujiyama, A., et al., Nucleic Acids Res. 11 : 4601(1983).
Galbert, F., et al., Nature 281 : 646(1979).
Griffith, et al., Biochem. 24 : 158(1985).
Haase, A.T., et al., Virology, 140 : 201(1985).
Haase, A.T., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87 : 4971(1990).
Harders, J., et al., EMBO J, 8(13) : 3941(1989).
Joseph, A., et al., Exp Cell Res, 183 : 494(1989).
Keller, G.H., et al., Anal. Biochem. 170 : 441(1988).
Kitazawa, S., et al., Histochemistry, 92 : 195(1989).
Korba, B.E., et al., Virology, 165 : 172(1988).
Korenberg, J.R., et al., Cell, 53 : 391(1988).
Lawrence, J.B., et al., Cell, 52 : 51(1988).
Lawrence, J.B., et al., Genome Analysis, 1 : 1(1990).
Lebo, R.V., et al., Science, 225 : 57(1984).
Lichter, P., et al., Science, 247 : 64(1990).
Lichter, P., et al., Nature, 345 : 93(1990).
Lucas, J.N., et al., Int J Radiat Biol, 56(1) : 35(1989).
Madiraju, M., at al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 6592(1988).
McCormick, M.K., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 : 9991(1989).
Meyne, J., et al., Genomics 4 : 472(1989).
Moyzis, R.K., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85 : 6622(1988).
Narayanswami, S., et al., Cytometry, 11 : 144(1990).
Niedobitek, G., et al., Am J of Pathology, 131(1) : 1(1988).
Noonan, C.A., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 83 : 5698(1986).
Ono, Y., et al., Nucleic Acids Res. 11 : 1747(1983).
Pinkel, D. et al. Proc Nat Acad Sci, 83 : 2934(1986).
Shen, D., et al., Cancer Research. 48 : 4334(1988).
Shibata, T., et al., J. Bio. Chem., 256 : 7557(1981).
Simon, D., et al., Cytogenet Cell Genet, 39 : 116(1985).
Trask, B., et al., Hum Genet 78 : 251(1988).
Unger, E. R., et al., Am J of Surg Pathology, 10(1) : 1(1986).
Urdea, M.S. et al., Nucl Acid Res, 16 : 4937(1988).
Van Dekken, H., et al., Acta histo, 37 : 91(1989).
Van Dekken, H., et al., Cytometry, 11 : 153(1990).
Van Dekken, H., et al., Cytometry, 11 : 579(1990).
Weier, H., et al., BioTechniques 10(4) : 498(1991).
Zischler, H., et al., Hum Genet, 82 : 227(1989).
[발명의 배경]
인 시튜 혼성하는 DNA 프로브를 생물학적 구조체, 전형적으로는 투과성 세포, 아세포 분획물, 또는 고정 크로모좀 제제중의 DNA 또는 RNA와 직접적인 혼성화를 하는데 사용된다. 이 방법은 고정된 생물학적 구조체중의 특이-서열 표적 핵산(들)의 국소화에 대한 형택학적 정보를 제공할 수 있기 때문에, 발육생물학, 세포 생물학, 유전학 및 특히 유전자 지도, 병리학 및 유전자 진단학과 같은 여러 생의학 연구분야에 적용할 수 있다.
대부분의 적용분야에서, 인 시튜 혼성화는 이중사슬의 핵산, 전형적으로는 병원균에 연관되거나 또는 바이러스 또는 세포 염색체 DNA 중 선택된 서열에 연관되는 DNA 이중사슬중의 표적서열에 대해 실시하는 것이다. 이 방법에 있어서는, 현재까지 실시되어 온 것과 같이, 단일 사슬의 표지된 프로브를 표적 이중핵산을 변성시키기에 충분한 온도로 가열시킨, 투과성 구조체에 가하고, 프로브와 변성된 핵산을 적합한 혼성화 상태에서, 또는 제어닐링 조건하에 반응되도록 방치한다. 비결합(비-잡종화)된 프로브를 제거한 후, 구조체를 리포터 라벨 존재여부에 대해 시험하여 표적 이중핵산에 결합하는 프로브의 위치가 생물학적 구조체내에, 예를 들면 세포중에 또는 아세포 형태중에 위치하도록 한다.
상기한 방법은 특이 유전자 서열의 위치와 공지된 유전자 서열들간의 거리를 지도화하기 위해(Lichter, Meyne, Shen), 세터라이트 또는 반복 DNA의 염색체 분포를 연구하기 위해(Weier, Narayanswami, Meyne, Moyzis, Joseph, Alexandrov), 헥 유기체화 시험을 하기 위해(Lawrence, Disteche, Trask), 염색체 이상을 분석하기 위해(Lucas), 단세포 또는 조직중 DNA 손상을 국소화 하기 위해(Baan) 그리고 플로우 시토메트릭 분석에 의한 염색체 함량을 측정하기 위해(Trask) 염색체 DNA에 널리 적용되어 왔다. 숙주-세포 염색체로 통합된 바이러스 서열의 국소화에 대한 여러 가지 연구결과가 발표되었다(예. Harders, Lawrence, Lichter, Korba, Simon). 상기한 방법은 또한 분열된 헥의 3차원적 재구성에 의해 염색체의 위치를 연구하는데(Van Dekken), 그리고 디지털 영상 분석을 이용하여 수은화 및 비오티닐화된 프로브로 이중 인 시튜 혼성화에 의해 간기 염색체 토포그래피(topography)를 연구하는데(Emmerich) 사용되었다.
기타 인 시튜 혼성화 방법은 일반적으로 진단도구(Unger, Haase, Noonan, Niedobitek, Blum)로서 숙주 세포중 바이러스를 검출하는데 적용된다. 감염 세포중 바이러스 입자수가 매우 적은 경우, 인 시튜 채택폴리머라제 사슬 반응(PCR)법(Haase, 1990, Buchbinder)에 의해 먼저 바이러스 서열을 증폭하는 것이 필요할 수 있다.
상술한 인 시튜 혼성화 방법에는 많은 제한이 따른다. 가장 심각하게 제한되는 것은 표적의 필수적인 단일 사슬형태를 형성하는데 있어, 이중표적 DNA를 변성화 하는 것이 요구된다는 것이다. 변성화는 일반적으로 시료를 가열하거나 화학약품 및 열로 처리하여 실시한다. 이 열처리는 구조 변화와 DNA 내의 반복서열에 재결합된 핵산과 관련한 시험에서, 핵산의 의사(Spurious) 및 바람직하지 못한 변화를 일으킬 수 있다. 반복된 DAN 서열은 서로 불규칙하게 재결합할 수 있다. 이 열처리는 또한 상기한 방법에서 요구되는 시간과 노력을 가중시킨다.
다음으로, 관심의 대상인 표적서열이 매우 낮은 카피 수(copy number) 내에 존재하는 경우, 상기 방법은 복원 운동학에 의해 제한되어 복원시간이 길어지게 된다. 또한 상기한 방법은 낮은 표적 농도에서는 프로브/표적 복원이 불가능할 수 있다. 이 제한은 상기에서 언급한 바와 같이, 먼저 변형 PCR 방법에 의해 인 시튜 표적 중복체를 증폭화함으로써 부분적으로 해소시킬 수 있다. 그러나, 이 PCR 방법은 추가의 공정 단계를 포함하고 있으며, 게놈 염색체 DNA 서열의 국소화를 포함하는 것과 같은, 많은 인 시튜 연구에 부적합할 수 있다.
[발명의 요약]
본 발명의 목적은 (a)표적이중체의 열변성을 필요로하지 않고 (b)복원 운동학에 의해 표적이중체 카피수에 제한받지 않는, 고정된 생물학적 구조체중에 표적핵산, 전형적으로 이중 DNA를 검출 및/또는 국소화하는데 사용하기 위한, 인 시튜 혼성화 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 구조와 특히 형태학적 관계에 있어서, 세포 또는 아세포 생물학적 구조체 중에 함유된 이중사슬 핵산 중에 공지된 표적서열의 존재를 확인하는 방법을 포함한다. 본 방법은 상기한 구조체에, 복합체가 이중핵산과 접촉할 수 있는 조건하에, 이중표적체 서열의 사슬들중 하나에 상보적인, 단일사슬, 리포터-표지된 핵산 프로브에 안정하게 결합된 RecA 단백질로 구성된 프로브 복합체를 가하는 단계를 포함한다. 이 복합체는 비-변성 조건하에 표적서열에 결합하도록 방치한다. 결합되지 않은 복합체를 제거한 후, 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브의 존재 여부에 대해 시험한다.
상기 복합체는 ATPγS의 존재하에 제조하여 안정화시키는 것이 바람직하다. 상기 프로브는 방사표지, 효소 또는 형광 태그(tag)와 같은 검출 가능한 리포터로, 또는 리간드에 대해 특이적인 리포터 분자와 후속반응할 수 있고, 검출가능한 리포터를 수반하는, 비오틴 또는 디곡시게닌(digoxigenin)과 같은 리간드로 표지할 수 있다. 상기 복합체는 ATPγS, GTPγS, ATP, dATP 및 ATPγS와 ADP와의 조합체를 포함한, 다른 공인자를 사용하여 안정화할 수도 있다.
일반적인 한가지 적용에 있어, 본 발명은 중기 스프레드(spreads) 내의 고정된 염색체 DAN 구조(들)중에 게놈 서열(들)의 검출 및 국소화에 사용된다. 한 실시형태에 있어서, 염색체의 현미경적 초미소구조는, 예를 들면 형광 밴드 패턴을 사용하여 형광 현미경에 의해 측정한다. 공지된 초미소구조에 결합된 복합체의 위치는 독립적으로, 예를 들면 형광 여기 파장이 염색체 밴드 형광과는 상이한 형광-표지된 프로브 복합체에 의해, 측정한다. 이와 달리, 고정된 세포 또는 세포구조체를 현탁액중에서 프로브한 후, 플로우 시토메트릭(cytometric) 또는 현미경 분석 한다.
다른 일반적 적용에 있어서, 본 방법은 숙주세포중 바이러스 또는 통합된 바이러스 특히 게놈 서열의 존재여부를 검출하는데 사용할 수있다. 바이러스 서열에의 형광-표지된 프로브의 결합은 형광 현미경 또는 형광 활성화 분류화(FACS) 또는 일광 또는 형광 또는 레이저 주사현미경에 의해 측정할 수 있다. 효소 표지를 사용한 경우, 일광 현미경으로 리포터 효소에 의해 생성된 착색(예. 블랙) 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제 산물을 식별하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 고정된 세포 또는 아세포의 생물학적 구조체에 함유된 공지의 바이러스성 핵산 표적서열의 존재를 확인하는 방법을 포함한다. 상기한 공지의 바이러스성 핵산 표적물은 이들의 생활주기에서 검출가능한 이중핵산 기(phase)를 가질 수 있는 공지된 DNA 바이러스(예. B형 간염 바이러스) 또는 RNA 바이러스가 포함된다. 이 방법에서는, 반응 효율을 증가시키기 위해 고정된 구조체 또는 아구조체들을 RecA 프로브 복합체를 첨가하기 전에, 100mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 7.5)중에서 55 내지 60℃의 온도에서 배양시킬 수 있다. 이 단계에서는 세포 DNA가 변성되지 않는다.
본 발명은 또한 단일 카피 핵산서열, 전형적으로는 세포 또는 아세포 생물학적 구조체에 함유된, 이중 DNA 서열을 검출하는 방법도 포함한다. 이 방법에 의해서는 세포 또는 아세포 생물학적 구조체(들)이 고정된다. 프로브 복합체(단일 카피 핵산 표적서열에 상보적인 단일사슬, 리포터-표지된 프로브에 안정하게 결합된 RecA 단백질로 이루어짐)를 복합체가 핵산 표적서열과 접촉할 수 있는 조건하에 세포 구조체 또는 아구조체에 첨가한다. 이 복합체는 그후 비-변성 조건하에 방치하여 표적서열에 결합되게 한다. 결합되지 않은 복합체는 그후 구조체로부터 제거하고 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브의 존재여부에 대해 시험한다.
단일-카피 핵산을 검출하는 이 방법에서는, 세포 구조체 또는 아구조체를 고정하고 용액중 또는 슬라이드사에서 분석할 수 있다. 고정화는 고정된 구조체 또는 아구조체를 10mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 7.5)중 55 내지 60℃에서 배양하는 단계를 포함할 수도 있다. 본 발명에 따른 이 방법에서는 복합체를 비-변성 조건하에 2시간 미만으로 수행된 반응을 통해 표적서열에 결합시킬 수 있다.
본 발명의 방법은 단일사슬 결합단백질(SSB), 포토이소머라제 I 또는 포토이소머라제 II와 같은, 보조단백질을 첨가하는 단계를 포함할 수도 있다.
본 발명은 또한 상술한 방법을 수행하는데 유용한 성분들을 함유하는 킷트도 포함한다. 시료중 기지의 바이러스성 핵산의 인 시튜 검출용 킷트의 한예로는 (ⅰ) 바이러스 DNA 서열로부터 유도된 프로브, (ⅱ)프로브를 코팅하는데 효과적인 RecA 단백질 및 (ⅲ)시료중 기지의 바이러스 DNA에의 프로브의 결합을 검출하는 수단이 포함될 수 있다. 이러한 킷트에는 RecA-단백질 코팅된 DNA 가 포함될 수 있다.
본 발명의 이들 목적과 기타의 목적 및 특징들은 하기 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 상세한 내용의 설명을 파악한다면 더욱 명확하게 알 수 있을 것이다.
[도면의 간단한 설명]
제1a도 및 제1b도는 천연의 비변성(1A) 및 열-변성(1B) 메탄올-아세트산 고정 간기 HEp-2 세포핵 중 탈축합 또는 부분 탈축합 알파 세터라이트 염색체 동원체의 DNA 표적서열의 검출에 사용되는 염색체 X 알파 세터라이트 DNA 프로브의 형광 광현미경 사진이고; 제2a도 및 제2b도는 간기 HEp-2 세포중의 천연의 비변성(2A) 및 열-변성(2B) 고정된 핵 내의 탈축합 염색체 동원체 DNA 표적서열의 검출에 사용되는 염색체(7)에 대한 알파 세터라이트 DNA 프로브의 형광 광현미경 사진이고; 제3a도 및, 제3b도는 분열되는 고정된 HEp-2 세포핵 중 염색체 X 알파 세터라이트 DNA의 분배를 나타내는, 동일 촛점에서의 형광 현미경(3A) 및 상 현미경(3B)으로 촬영한 광현미경 사진이고; 제4a도 내지 제4d도는 본 발명의 방법을 사용하여 염색체상의 유전자 국소화 단계를 나타낸 도면이고; 제5a도 내지 제10도는 다양한 형태의 염색체 이상(상부 프레임 A) 및 상기한 이상으로 나타날 수 있는 상응하는 형광 패턴(하부 프레임 B)을 나타낸 도면이고; 제11a도 내지 제11c도는 본 발명에 따라 형광 활성화된 세포분류에 의해 세포의 바이러스 감염을 검출하는 단계를 나타낸 도면이고; 제12도는 인간 염색체 1알파-세터라이트 동원체 서열에 RecA-코팅되고, 비오티닐화된, 니크-이동 프로브로 혼성화된 고정 HEp-2 중기 염색체로부터 혼성화 시그널을 나타내는 세포 작제 사진이고; 제13a도 내지 제13f도는 현탁액중의 ATCC HEp-2 및 HCC "알렉산더" 세포내의 독특한 p53 염색체(17)종양 억제 유전자 서열의 RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화 검출을 나타낸 도면이고; 제14a도 내지 제14d도는 슬라이드사의 ATCC HEp-2 세포핵 내의 유일한 p53 유전자 서열의 RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화 검출을 나타낸 도면이고; 제15a도 내지 제15e도는 현탁액중의 ATCC HCC "알렉산더" 세포내의 B형 간염 바이러스(HBV) 핵산서열의 RecA-매개된 천연 형광 인시튜 혼성화 검출을 나타낸 도면이고; 제16a도 내지 제16c도는 경쟁적 혼성화에 의해 시험된 인간 HCC 세포중 RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화 검출을 이용하여 HBV 표적 검출의 특이성을 나타낸 도면이다.
[발명의 상세한 설명]
[Ⅰ. 인 시튜 혼성화 방법]
여기에서는 반복 또는 독특한 염기쌍 서열을 가지는 이중 DNA 표적체를 함유하는 다양한 생물학적 구조체에 적용하는, 본 발명에 따른 인 시튜 혼성화에 대한 기본적인 방법론을 기술한 것이다.
A. DNA 검출용 생물학적 구조체의 작제
본 발명의 방법은 이중핵산, 통상적으로는 DNA/DNA 이중핵산을 함유하는 생물학적 구조체중에 선별된 표적서열을, 상보적-염기쌍 혼성화에 의해 검출하기 위해 창안된 것이다. 생물학적 구조체는 세포, 정충, 기생체, 표적핵산을 함유하는 아세포 분획물 또는 염색체 제제와 같은, 형태학적으로 특징을 갖는 구조체 모두가 포함된다.
구조체중 표적이중체는 전형적으로 염색체 DNA 또는 바이러스 코트 단백질에 캅셀화된 것으로부터 방출되거나 캅셀화된 바이러스 이중게놈으로 구성된 바이러스 입자와 같은, 바이러스, 기생체 또는 박테리아 병원균과 연관되는 핵산 이중물질이다. 세포, 헥 염색체 제제와 같은, 고정된 생물학적 구조체를 제조하는 방법은 일반적으로 DNA 이중변성 및 제어닐링에 의해 통상적인 인 시튜 혼성화에 사용되는 방법에 따른다.
간단히 말하면, 세포성분 및 DNA 구조는 이들의 천연의 형태학적 연관성으로 구조적 성분을 고정하기 위해 유기용매 및 산 또는 가교결합제로 처리하여 고정하거나 침투시킬 수 있다. 통상의 고정제는 아세트산, 염, 메탄올, 포르말린, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드가 포함된다. 고정후, 조식시료는 왁스에 투입하거나 또는 동결한 다음, 이어서 얇은 조각으로 분할하여 슬라이드 제제용으로 만들 수 있다.
더욱 일반적으로는, 구조체를 제단백화 및/또는 제리피드화 할 수 있는 1종 이상의 시약으로 생물학적 물질을 처리한다. 상기한 방법은 프로테아제, 리파제, 산, 알콜을 포함한 유기용매, 세정제 또는 열 변성제 또는 이들 처리제의 조합물을 사용하는 것이 포함될 수 있다. 통상의 처리는 메탄올 : 아세트산으로 1회 이상 세정하는 것이다.
핵산의 비특이적 결합 억제제의 사용과 같은, 백그라운드를 감소시키는데 다른 전처리가 유용할 수 있다. 예를 들면, 비특이성 캐리어 DNA(예. 연어 정충) 또는 RNA(예. tRNA)로 미리 혼성화하면 고정된 DNA-표적 구조에 비특이성 프로브가 결합하는 것을 감소하는 작용을 할수 있다.
유익한 세포 구조체들은, 예를 들면 세포배양물에서 얻어지는 개개의 세포, 조직 단편 또는 체액에 존재하는 세포일 수 있다. 전형적으로, 조직에서 얻어진 세포 구조체는 저온학적으로 단편으로 만든다음, 상술한 바와 같은, 메탈올 : 아세트산으로 처리하는 것과 같이 슬라이드상에서 처리하여 단편을 침투시킨다. 세포 구조체들은 게놈 표적서열(들)의 세포내 국소화를 결정하는데, 또는 바이러스, 박테리아 또는 세포내 기생체와 같은 감염 생물의 존재 및/또는 국소화를 검출하는데 연구대상이 될 수 있다.
핵 및 미토콘드리와와 같은, 아세포 구조체는 동밀도 원심분리와 같은, 통상의 분별화법에 의해 작제하여, 보강되거나 또는 실제로 순수한 형태의 아세포 물질을 얻을 수 있다. 그후, 보강된 구조체 작제물은 상기와 같이, 투과시키고 탈단백질화하고, 용액중에서 프로브하거나 또는 건조에 의해 슬라이드상에 고착시킬 수 있다.
이와 달리, 세포들은 75mM KCl로 전처리한 다음, 이어서 메탄올 : 아세트산으로 처리하여 원형질을 제거시킬 수 있다. 정제후의 이 분획물은 프로브 혼성화를 위해 더욱 처리할 수 있다. 이 방법은 인 시튜 혼성화용 HEp-2 세포핵을 제조하기 위해 실시예 3 내지 4 및 12 내지 14에 기술하였다.
이들 실시예를 간략히 말하면, HEp-2 세포를 저속 원심분리에 의해 펠렛화하고 얻어진 펠렛을 핵 팽윤이 일어날 수 있는 소정량으로 75mM KCl에 5 내지 15분간 재현탁시킨 다음, 이이서 얼음 냉각한 메탈올 : 아세트산을 첨가하고 원심분리한다. 빙냉한 메탈올 : 아세트산을 추가한 후, 세포들을 온화하게 교반한 다음 원심분리하여, 핵으로부터 원형질을 붕괴시킨다. 얻어진 분리된 핵 제제를 메탄올 : 아세트산에 재현탁시키고 현미경용 슬라이드상에 10㎕ 분취액을 놓고 건조후, 슬라이드들을 추후 사용을 위해 -20℃에 저장한다. 이와 달리, 세포들을 표준조건을 사용하여 얻은 다음, 1 X 인산염 완충된 염수(PBS)로 세정하고 100% 메탄올 또는 70% 에탄올에 고정시킨 다음 -20℃에 저장한다. 이들 세포들은 액상 혼성화 검출반응에 사용할 수 있다.
일반적으로 유익한 다른 구조체는 전형적으로 중기의 세포로부터 유도된, 고정된 염색체 제제이다(Pinkel, cherif). 이 제제는 제1a도 및 제1b도의 제제와 같은 세포로부터 얻어진 게놈 염색체 전부 또는 공지된 방법(Lebo, McCormick)에 의해 얻을 수 있는 것과 같은 개개의 분리된 염색체 또는 염색체 단편들을 함유할 수 있다. 이 염색체는 일반적으로 메탄올 : 아세트산으로 처리한 후, 슬라이드상에 놓고 건조하여 슬라이드에 고착시킨다.
미토콘드리아와 같은 각종의 다른 아세포 구조체 또는 바이리온 입자와 같은, 혈액 시료 또는 세포로부터 분리된 기생체를 포함하여 병원성 구조체를 표준방법에 따라 제조하고, 상기와 같은 고정후, 인 시튜 혼성화를 위해 침투시킬 수 있다.
B. 표적-특이성 DNA 프로브
본 방법에 사용된 프로브는 단일사슬 핵산, 통상적으로 DNA 사슬 프로브 또는 표적 이중핵산의 단일사슬 또는 이중사슬에 상보적인 이중 프로브의 변성에 의해 유도된 것이다. 프로브 서열은 브로브 및 표적체의 서열-특이적 혼성화를 보장하기 위해, 표적서열과 상동성 서열을 적어도 90 내지 95% 함유하는 것이 바람직하다. 단일사슬 프로브는 길이가 전형적으로 100 내지 600 염기이나, 이보다 더 짧거나 더 긴 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용할 수도 있다.
이 프로브는 많은 표준방법들중 한 방법으로 작제하거나 또는 얻을 수 있다. 다양한 세터라이트 DNA 서열과 같은, 많은 프로브들은 단일 사슬 또는 이중사슬 형태로 시판되고 있다. 기타의 프로브들은 바이러스, 플라스미드 및 코스미드로부터, 또는 다른 벡터 운반 특이 서열로부터 직접 얻을 수 있으며, 필요시, 벡터와 같은, 프로브 DNA 공급원의 제한 소화에 이어 특이 제한 소화단편의 전기영동 분리에 의해 얻을 수 있다. 이러한 방법으로 얻은 프로브는 전형적으로 이중사슬 형태이나, 필요에 따라, M13 파지 벡터와 같은, 단일 사슬 벡터 형태로 사브클로운 할 수 있다.
이와 달리, 상기한 프로브는 올리고뉴클레오티드 합성법에 의해 단일사슬 형태로 제조할 수 있는데, 이 방법은 프로브를 더 길게 하기 위해, 프로브의 아단편을 형성시킨 다음, 이들 아단편을 함께 피스(piece)화하는 공정을 필요로 한다.
상기 프로브는 리포터 또는 리간드 또는 표적서열을 그 위치에서 검출할 수 있는 잔기로 표지한다. 오토라디오그래피 검출용의 리포터는, 예를 들면 표지된 뉴클레오티드의 존재하에 니크이동 또는 폴리머라제 쇄반응에 의해 형성된32P-표지된 프로브와 같은 방사라벨이다.
형광 검출을 위해서는, 프로브를 FITC, BODIPY, Texas Red또는 490, 540 및 361㎚과 같은 특정 파장에서 여기할 수 있는, Cascade Blue와 같은, 형광 그룹중에서 선택된 1종으로 표지할 수 있다. 이들 그룹은 표준방법(Urdea, Keller, Zischler)에 따라 3' 또는 5' 프로브 말단으로 유도되거나, 또는 내부위치에서의 혼입 또는 반응에 의해 유도된다.
이와 달리, 상기 프로브는 비오틴(Weier). 디곡시게닌(Zischler), 또는 브로모데옥시유리딘(BrdUrd) 또는 플루오레스세인-11-dUTP(Boehringer-Mannheim)(Kitazawa)를 포함한 다름 변형된 염기와 같은 리간드-형 리포터로 표지할 수 있다. 이 프로브 리코터 그룹들은 (a)특이적이고, 프로브 리간드에 높은 친화성을 갖고 결합하며, (b)검출가능한 리포터를 함유하는 제2의 리포터 분자와 혼성화된 프로브를 그 위치에서 반응시켜 검출한다. 제2분자의 결합 잔기로서, 비오티닐화된 뉴클레오티드에 결합하기 위해서는 아비딘 또는 스트렙트아비딘이, 디곡시게닌-표지된 뉴클레오티드에 결합하기 위해서는 항-디곡시게닌 항체가, 그리고 BrdUrd-표지된 프로브에 결합하기 위해서는 항-BrdUrd 항체가 될 수 있다.
제2분자내의 검출 가능한 리포터는 전형적으로 형광 라벨이 될 수 있으나, 오토라디오그래피 검출을 위해서는 방사성 라벨이, 적절한 기질 존재하에 비색적정 또는 화학발광 검출을 위해서는 항체 또는 효소가, 전자 현미경 식별화에 사용하기 위해서는 콜로이드성 금(Narayanswami)이 될 수도 있다.
C. RecA 및 돌연변이체 RecA 803 단백질의 정제
본 발명에서 사용되는 RecA/프로브 복합체를 형성하는데 사용하기 위한, RecA 및 RecA 803 단백질은 E. Coli 균주 JC 12772 및 JC 15369(A. J. Clark and M. Madiraju로부터 얻음)와 같은, 과생산되는 균주로부터 분리하는 것이 바람직하다. 이들 균주는 세포당 높은 비율의 카피수가 존재하는 "런웨이" 복제 플라스미드 벡터상에 서열을 암호화하는 RecA를 함유한다. RecA 803 단백질은 와일드타입 RecA의 고활성 돌연변이체(Madiraju)이다.
RecA 단백질은 파마시아(Pharmacia)로부터 구입하거나 또는 히드록실아파타이트 칼럼에 이어 음이온(MonoQ) 교환컬럼 상에서의 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 이용하여 정제할 수 있다. 분리방법은 공개된 방법(Shibata et al., Griffith)을 조합하고 변형한 방법이다. 이 방법은 실시예 1에 상세히 기재되어 있다.
단백질의 정제를 모니터링하는 표준 어세이는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의한 38,000달톤 RecA 단백질 어세이(Pharmacia Phastgel systme), 0.5M LiCl 침 0.25M 포름산의 용매에 전개된 [γ-32P] ATP 및 PEI 셀롤로스 박층 크로마토그래피를 사용하는 ssDNA-의존성 ATPase 활성효소 어세이, DNase의 어세이, 500-mer 올리고뉴클레오티드 프로브로 D-루프 활성의 어세이가 포함된다.
SDS-PAGE(변성조건)에 의한 JC12772 및 JN15369 세포 추출물로 부터의 총 단백질의 분석에서는 38,000달톤 RecA 단백질이 이들 균주에서 생산된 주 단백질인 것으로 나타났다.
최종 모노-Q-정제된 RecA 및 RecA 803 단백질의 SDS-PAGE 프로파일에서는 은 염색에 의한 검출에서 다른 세포성 폴리펩타이드가 함유되지 않은, 단일 38,000달톤 밴드를 나타내었다.
D. RecA DNA 프로브 복합체의 제조
유익한 생물학적 구조체 내의 이중핵산을 단일사슬 프로브에 안정하게 결합된 RecA 단백질로 이루어진 프로브 복합체와 반응시킨다. 이 복합체는 ATPγS의 존재하에 안정화된 형태로 제조하는 것이 바람직하다.
프로브의 RecA 단백질 코팅은 정상적으로는 실시예 2에 기술된 바와 같이 실시한다. 간략하면, 상기, 프로브는, 이중사슬 또는 단일사슬이던 간에, 사용하기 전에 95 내지 100℃에서 5분간 가열하여 변성시킨 다음, 빙욕에 20초 내지 1분간 둔다음, 0℃에서 약 20초간 원심분리한다. 변성된 프로브는 -20℃의 냉동기에서 보관할 수 있으나, 바람직하기는, 변성된 프로브를 즉시 실온에서 ATPγS를 함유하는 표준 RecA 코팅반응 완층액에 가하고, 여기에 RecA 단백질을 가한다.
프로브-RecA 혼합물을 37℃에서 10 내지 15분간 배양시켜 프로브의 RecA 코팅을 개시한다. 프로브와의 반응중에 시험된 RecA 단백질의 농도는 프로브의 크기와 프로브의 첨가량에 따라 달라지나, 약 2 내지 25μM 범위가 바람직하다. 단일사슬 프로브가 이들의 상동성 프로브 사슬들을 개별적으로 코팅한 RecA인 경우, ATPγS 및 RecA의 mM 및 μM 농도는 각기 이중사슬 프로브로 사용된 것의 절반으로 감소된다(예. RecA 및 ATPγS 농도의 비율은 통상적으로 사용된 프로브가 단일 사슬 또는 이중사슬 인가에 따라 개개의 프로브 사슬의 특정농도에서 일정하게 유지된다).
E. 투과성 생물체에 대한 프로브의 혼성화
본 발명의 한 중요한 특징에 따라, 생물학적 구조체 내에 함유된 표적 이중체로의 RecA/프로브 복합체의 서열-특이적 결합은 프로브 복합체를 비변성 조건하에, 예컨대 이중 DNA의 변성온도 이하에서, 생물학적 구조체에 가한 다음, 복합체를 표적 이중체와 접촉하도록 방치하는데, 전형적으로는 37℃에서 1 내지 4시간 동안, 표적 DNA 서열에 프로브 복합체의 상동성 결합이 일어날 때까지 방치한다.
프로브가 표적 DNA 서열에 결합한 후, 표적구조체를 세정하여 결합되지 않은 프로브 복합체를 제거한다. 통상의 경우, 프로브 리포터가 비오틴과 같은, 리간드인 경우, 세정된 구조체를 형광-표지된 아비딘(FITC-아비딘)과 같은, 검출가능한 리코터 분자와 접촉시켜 표적-결합된 프로브에 검출가능한 리포터가 결합되게한다. 그후, 이 시료물질을 더욱 세정하여 결합되지 않은 리포터 분자를 제거한다. 다양한 세정방법이 적합하게 사용된다. 구조체는 육안으로 관찰되거나, 그렇지 않으면 이하에 예로든 바와 같이, 현미경에 의해, 형광 활성화된 세포의 분류에 의해, 또는 오토라디오그래피 등에 의해 관찰하거나 또는 검출하다.
비오티닐화된 프로브의 형광-리포터 검출에 사용되는 실시예 3에 기술된 혼성화 조건을 예시한다. 간략하면, 유리 슬라이드상의 고정제제에 10 내지 20㎕ 프로브 복합체를 적용한다. 유리 카바슬립으로 혼성화 영역을 덮고 밀봉한 다음 이 반응물들을 37℃ 7% CO2인큐베이터 내의 가습용기 내에서 1 내지 4시간 동안 배양시킨다. 배양후, 카바슬립 고무질 시멘트 밀봉제를 제거하고, 슬라이드를 카바슬립과 함께 여러번 세정하여 카바슬립이 느슨해지도록 한후, 떼어낸 다음 결합되지 않은 복합체를 제거한다.
슬라이드를 프리블록액(preblock solution)에 넣은 다음, 이어서 (a)암소에서 프리블록액중, 녹인 FITC(플루오레스세인 이소티오시아네이트)-아비딘 용액에 침지하거나 도포하고, 여러번 세정하여 결합되지 않은 FITC-아비딘을 제거한다. 퇴색 방지제를, 프로피디움 요다이드와 같은, 대응 염색액의 존재 또는 부제하에 사용하여 광표백을 감소시킬 수 있다. 필요한 경우, 슬라이드상의 물질과 비오티닐화된 항-아비딘 항체와 반응시킨 다음 수회의 세정단계를 거친 후, 표적 이중체에 결합된 형광시그널의 양이 증가하도록 FITC-아비딘을 첨가하여 프로브 시그널을 증폭시킬 수 있다.
그후 표적 구조체에 대해 형광 현미경 또는 레이저 주사 현미경에 의해 표적 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브의 존재여부를 시험한다.
제1a도는 본 발명에 따라 유리 슬라이드상에 고정된, 제조되어 분리된 HEp-2 세포 간기 핵에 대한 염색체 X 알파 세터라이트 DNA 프로브의 인 시튜 혼성화한 후, 증폭하지 않고 실시예 3에 기술된 프로토콜을 하여 얻은 FITC 시그널을 나타낸 것이다. 염색체 X는 알파 세터라이트 서열 약 5,000카피/세포를 함유하는 것으로 추정되었다(ONCOR literature), 상기 비오티닐화된 프로브는 상기한 바와 같이, 반응시키고 FITC-아비딘으로 후-표지한다.
대조 목적하에, 제1a도의 방법에서 사용된 것과 동일한 원액으로부터 변성된 비오티닐화 염색체 X 알파 세터라이트 프로브를 통상의 프로토콜하에 포름아미드 및 덱스트란 황산염과 혼합한 다음, 선행기술의 열변형(및 복원)을 이용하여 HEp-2 세포 핵으로 혼성화하였다. 결과는 제1b도와 같다. 이 방법은 총 제조시간과 혼성화 시간이 시그널 증폭을 포함하여, 제1a도 방법에서 보다 수시간이나 더 소요되었으며, 핵을 통한 형광 시그널의 수준은 더 낮았다.
실시예 4에 기록된, 제2의 방법에서는 프로브 시그널 증폭이 없이도, 이 방법이 낮은 카피 수 표적서열에 높은 프로브 표적 특이성을 부여하는 것을 나타내었다. 이 방법에서는 염색체-7 알파 세터라이트 DNA/RecA 복합체를 상기한 바와 같이, HEp-2 간기 핵과 혼성화 한다. 염색체 7은 사용된 알파 세터라이트 서열 프로브(ONCOR크로브 D7Z2) 약 10 카피를 함유한다.
제2a도는 본 발명에 따라, 프로브의 결합 및 FITC 표지후의 표적 시그널 패턴을 나타낸 것이다. 도면으로부터 알수 있는 바와 같이, 상기 프로브는 아마도 알파 세터라이트 서열을 함유한 두 개의 염색체 7'에 상응하는, 두 개의 뚜렷한 반점내에 위치한다.
제2b도는 인 시튜 혼성화 프로브 결합된 표적 패턴은 상술한 선행 기술의 방법에 따라 증폭한 후, 동일 프로브로 달성할 수 있다는 것을 보여주고 있다. 프로브의 국소화는 본 발명의 방법에서 보다 덜 특이적인 것으로 보인다. 더욱이, 총 제조시간 및 프로브 혼성화 시간은 더 많이 소요되었다.
실시예 5에 기술된, 제3의 방법은 공촛점 레이저 주사현미경(Zeiss LSM-10)을 사용하여, 다른 표적화된 DNA 서열 및/또는 핵막에 관련된 핵 용적내에 표적서열을 국소화하는 능력을 입증하는 것이다. 이 방법에서는 100% 메탄올 고정 HEp-2 세포들을 현탁액중에서 RecA/염색체-X 알파 세터라이트 DNA 프로브 복합체로 프로브 한후, 상기 제1a도 에서와 같이, FITC-아비딘으로 표지하였다. 제3a도는 분열핵중 프로브의 결합 패턴을 나타낸 것이다. 결합된 프로브룰 국소화시키기 위해, 렌즈의 촛점을 바꾸지 않고, 동일 부분을 상 콘트라스트 현미경으로 관찰하였다(제3b도). 두 광현미경사진을 검사해 봄으로서, 프로브-표지된 염색체에 관련된 핵막 및 핵분열면의 상대위치를 알 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 천연 RecA 매개된 형광 인 시튜 혼성화를 이용하여 중기 염색체중의 특이성 DNA 서열의 검출을 용이하게 할 수 있다. 인간 염색체 1 알파-세터라이트 동원체 서열에 특이적인 RecA 코팅된 비오티닐화된 프로브를 천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화를 이용하여 슬라이드상에 고정된 HEp-2 세포와 반응시킨다(실시예 6). RecA-코팅된 프로브 믹스를 첨가하기 전에, 10mM 트리스-아세테이트(pH 7.5)로 60℃에서 배양시켰다. 세포 핵산 표적체의 변성온도 이하에서 수행하는, 이 배양단계에 의해 형광 인 시튜 반응의 효율이 향상된다. 이 배양단계를 이용하는, 실시예 6에서, 모든 세포핵의 73%가 형광 혼성화 시그널을 나타내었다. FITC 혼성화 시그널을 488㎚ 아르곤-이온 레이저 주사형인 Zeiss LSM을 사용하여 관찰하였다. FITC 혼성화 시그널은 그의 위치를 확인하기 위해 염색체의 기(phase) 영상에 중첩시켰다(제12도). FITC 프로브 시그널은 예측한 대로, 동원체에 위치하였다.
RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화로 특이한 유전자 서열의 검출을 용이하게 할 수 있다. p53 유전자(oncor)에 특이적인 RecA-코팅된 비오티닐화된 프로브는 천연 형광 인 시튜 혼성화 반응을 이용하여 현탁액 중에서 고정 세포와 반응시킨다(실시예 7). FITC 프로브 시그널을 488㎚ 아르곤-이온 레이저-주사형인 Zeiss LSM으로 관찰한 결과, 시그널은 전혀 증폭되지 않은 것으로 나타났다(예. 엑스트라 시그널 증폭단계). 이 분석 결과는 제13도에 표시하였다. 즉, 제13a도, 제13c도 및 제13e도는 FITC 혼성화 시그널, 제13b도, 제13d도 및 제13f도는 각기 제13a도, 제13c도 및 제13e도의 세포의 기 영상; 제13a도 내지 제13d도는 HEp-2 세포; 그리고 제13e도 및 제13f도는 HCC "알렉산더" 세포에 대한 것이다. 제13e도에서의 FITC 혼성화 시그널은 제13f도의 세포의 기 경상위에 중첩되어 있다. 모든 혼성화 시그널은 세포 핵내에 존재하며, 또한 FITC 시그널은 종종 새로 복제되 DNA의 쌍 표시체로 나타난다. 제13d도의 세포핵은 분열이 진행되는 것으로 나타났다. 이들 결과는 혼성화 반응용액중의 독특한 서열을 검출하는데 있어서의 본 발명의 방법이 지닌 민감성을 입증하는 것이다.
혼성화 반응 용액중 독특한 서열의 검출 이외에, 본 발명의 방법은 슬라이드상의 고정된 세포를 사용하는 독특한 유전자 서열을 검출하는데 효과적이다. RecA-코팅된 비오티닐화된 p53 프로브(Oncor)는 천연 형광 인 시튜 혼성화 반응을 사용하여 슬라이드상의 고정된 HCC 세포와 반응시킨다(실시예 8). 이 반응에는 토포이소머라제 Ⅱ가 함유되며, 프로브 첨가 전에는 완축액 중에서 배양하지 않는다(실시예 8). FITC 프로브 시그널을 488㎚ 레이저-주사 모드인 Zeiss LSM 으로 관찰하였다. 혼성화 시그널은 시그널이 전혀 증폭되지 않은 것으로 나타났다(예. 엑스트라 시그널 증폭단계). 시료의 결과들을 제14도에 표시하였다. 제14도에 있어서 제14a도 및 제14c도는 FITC 시그널; 제14b도 및 제14d도는 각기 제14a도 및 제14c도에서 나타난 세포의 기 영상에 대한 것이다. 모든 혼성화는 핵내에 존재하고 시그널은 종종 쌍으로 나타난다. 예컨대, 제14a도 및 제14b도에 나타난 핵중 시그널 쌍의 위치는 DNA 복제후의 스테이지를 나타낼 수 있다. 이들 결과는 혼성화 반응에 고정된 세포를 사용하여 독특한 서열을 검출하는데 있어서의 본 발명의 방법의 민감성을 입증하고 있다.
독특한 세포 유전자 서열의 검출에 사용되는 본 발명의 방법의 능력이외에, 본 방법은 독특한 바이러스 핵산서열의 검출에 사용될 수도 있다. RecA-코팅된 HBV DNA 프로브 pAM6 및 "BIOPROBE"는 천연 형광 인 시튜 혼성화 반응을 이용하여 현탁액중 100% 메탄올 고정세포와 반응시킨다(실시예 9). 이들 실험에서 사용된 양 프로브들에 의해 효율이 높은 인간 HCC 세포 내에서 HBV 서열이 검출되었다("BIOPROBE", 81%; pAM6, 95%). FITC 혼성화 시그널은 레이저 주사형인 Zeiss LSM으로 관찰하였다. 제15도에서, HBV 프로브로부터 관찰된 FITC 시그널은 세포의 기 영상에 중첩된 것으로 나타났다 : 제15a도 및 제15b도, "BIOPROBE"; 제15c도 내지 제15e도, pAM6 프로브. 모든 시그널은 핵 영역 내에 존재하는 것을 나타났다. "BIOPROBE"시그널은 pAM6 프로브 시그널 보다 강도가 덜하다. 이것은 사용된 프로브의 크기에 기인하는 것 같다. 용액중 단일 사슬 프로브(들)와 선형 이중 표적 DNA 간의 RecA-매개된 쌍 반응은 프로브 사슬 크기의 증가에 따라 효율도 증가한다. 단일 사슬인 "BIOPROBE"사슬은 크기가 평균 <250bs 이고 pAM6 단일사슬은 크기가 평균 300 내지 500염기이다. 이 차이는 프로브가 상이한 혈청형(serotypes) HBV 게놈("BIOPROBE", adr-4; pAM6, adw)을 함유하는 사실에 기인할 수도 있다. 이들 결과는 본 발명의 방법이 바이러스 DNA 서열의 검출에 유용하다는 것을 시사하고 있는 것이이다. 유익한 모든 바이러스 DNA 표적체에 특이적인 프로브를 생산하고 RecA-단백질 코팅하여 본 발명의 인 시튜 혼성화 방법에서 사용될 수 있다. 형광 검출 이외에, 다음과 같은 다수의 다른 검출방법, 즉 화학발광(Tropix INC., Bedford MA) 및 방사능을 포함하여 사용될 수 있으나, 그러나 이들 방법에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은 또한 표적 검출의 우수한 특수성을 갖는다. 본 발명의 방법의 특수성은 다음과 같이 시험하였다. RecA 코팅된 단일사슬 비오티닐화된 HBV 프로브(pAM6) 30ng를 표준 천연 현탁 형광 인 시튜 혼성화 프로토콜을 사용하여 ATCC HCC "알렉산더" 세포와 반응시켰다(실시예 10).
HBV 표적체에 대한 반응 시그널의 특이성은 RecA-코팅된 단일사슬 비-비오티닐화된 상동성 DNA 240ng을 가하거나 또는 비상동성 경쟁 DNA 240ng을 가하여 시험하였다(실시예 10). 비오니틸화된 HBV 프로브 및 비-비오티닐화된 HBV 및 φ X 174 경재 DNA를 이들이 유사한 크기(평균 400∼500bs)로 존재할 수 있도록 동일 조건하에 니크-이동하였다. 비표지된 인간 태반 DNA(100 내지 120bp 단편)은 Oncor("BLOCKITTMDNA")로부터 수득하였다. 이들 결과(표 1; 실시예 10)는 이종 DNA가 아니라, 단지 상동성 HBV DNA 만이 비오티닐화된 HBV DNA 프로브 시그널과 특이적으로 경쟁한다는 것을 보여주고 있다.
표 1에 기술된 경쟁 시험으로부터의 대표적인 세포들은 제16도에 표시한 바와 같다. 제16도에 있어서, 제16a도는 비오티닐화된 HBV 프로브+과량의 비표지된 HBV DNA를; 제16b도는 비오티닐화된 HBV 프로브+과량의 비표지된 φ X 174 DNA를; 그리고 제16도는 비오티닐화된 HBV 프로브+과량의 비표지된 인간 태반 DNA를 나타낸다. FITC 프로브 시그널은 레이저 주사형인 Zeiss LSM으로 관찰하였다. HBV 프로브로부터 관찰된 FITC 시그널은 세포의 기 영상에 중첩된 것으로 나타났다. 상동성 HBV DNA는 비오티닐화된 HBV DNA 프로브 시그널과는 특이적으로 경쟁하나 이종 DNA와는 경쟁하지 않는다는 것을 시그널 및 기 영상으로부터 명백히 알 수 있다. 따라서, RecA-매개된 천연 형광인 시튜 혼성화 반응에 의해 표지된 프로브 DNA에 상동성인 특이 핵산 표적체를 검출할 수 있다.
상기한 내용으로부터, 본 발명의 다양한 목적과 특징으로 부합시키는 방법을 잘 알 수 있을 것이다. 본 발명은 생물학적 구조체 내에 표적 서열을 국소화하는데 있어서 간편하고도 시간이 덜 소요되는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의하면 열 변형 단계의 필요성을 없애주고, 시그널 향상의 필요성을 감소시킴으로써 인위구조체를 감소시킬 수 있고, 낮은 카피수의 표적서열을 포함하여, 표적서열을 더욱 신속하고도 정화하게 검출할 수 있다.
특히, 본 발명의 방법은 먼저 서열을 증폭하지 않고도저-카피 서열을 검출할 수 있다. 제2a도와 제2b도의 비교에서 이 특징은 선행기술의 방법에 비해, 본 방법의 특이성 및 해결책을 크게 향상시켜 준다는 것이 입증되었다. 대부분의 유전자 지도와 염색체에 대한 연구에서 특이적 저-카피 서열이 포함된다는 것을 예측할 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 진단 유전자 지도 연구 뿐만 아니라, 다양한 병원체 서열의 독특하거나 또느 저-카피수를 포함한 진단 적용에 중대한 이점을 제공한다. 이들 중 후자의 적용은 이하 Ⅱ난에 기술되어 있다.
또한 여기에 기술된 방법은 용액중 및 슬라이드 상에서 수행한 혼성화 반응에서, (ⅰ)독특한, 예컨대 단일카피, 유전자 서열 및 (ⅱ)유일하거나 또는 다중의 바이러스 핵산서열의 검출에 효과적이다.
본원과 동일자에 출원된 "이중 D-루프 형성의 진단적용"이란 명칭하에 공동 출원한 명세서에 기술된 바와 같이, 이중 DNA 단편으로부터 제조된 안정한 RecA-코팅된 프로브는 표적 이중 DNA와 이중-프로브 히브리드 구조체를 형성할 수 있다. 그러한 이중-프로브 구조체는 인시튜 혼성화 조건하에 결합하는 프로브에서는 나타나지 않았으나, 그러한 구조체의 존재는, 형성된다면, 인 시튜 표적 부위에서 생산된 시그널의 양을 배로 늘리는데 효과적으로 이용될 수 있다. 또한 두 개의 프로브를 서로 다른 리포터 그룹, 예컨대 흡수 또는 방출 피크가 다른 형광 프로브로 표지함으로써, 이들 양 프로브를 함유하는 표적부위가 프로브 한 개만을 함유하는 부위와 뚜렷히 구별될 수 있다 :
Ⅱ. 적용
본 발명의 일반적인 적용은 염색체중 및/또는 염색체의 특정부위 중 선변된 유전자 또는 조절 서열을 국소화하고 가시화하는데 있어서의 진단용도로 사용되는 것이다. 표적 유전자 또는 서열은 (a)선별된 유전자 산물을 생산하는 것; (b)리보좀, 온코(onco) 유전자 또는 종양 억제 유전자의 작용과 같은, 중요한 세포-제어 작용을 받는 것, (c)반복서열과 관련이 있는 것, (d)활성 유전자 산물의 발현을 방지하는 유전적 결손을 함유하는 것, (e)기지의 지도 위치와 함께 표식체 프르브 영역에 대한 염색체 위치와 관련되는 것, 및/또는 (f)고정 크로마틴 또는 고정 바이리온중 DNA-간염 바이러스(예. B형 간염 바이러스(HBV)(Ono, et al.; Fujiyama, et al.; Galibert, et al.))와 같은, 통합 또는 비-통합된 바이러스 서열을 나타낼 수 있는 것 중 1종일 수 있다.
본 방법에서 사용된 진단 프로브는 어떤 경우, 인간 게놈 라이브러리에서 얻어지는 것과 같은, 바이러스 또는 다른 벡터 입수 가능한 플라스미드, 코스미드로부터 얻을 수 있거나 또는 화학적으로 합성할 수 있다. 유전자 산물이 얻어지는 경우, PCR 증폭용 프로브를 생성하기에 충분한 단백질 산물을 서열화하고, PCR 형태의 프로브를 사용하여 게놈 DNA 중 상응하는 유전자 서열을 증폭 및 태깅하여 프로브를 생성시킬 수 있다. 증폭된 유전자 물질은 전기영동에 의해 정제하여 직접 프로브로서 사용하거나 또는 표준 프로토콜을 사용하여 적절한 벡터로 클로운 할 수 있다.
전형적인 방법에서는 핵을 공지된 방법을 사용하여 중기 단계의 세포로부터 유도한 다음, 고정하고, 유리 슬라이드상에 "드롭핑"하여 중기 염색체 스프레드(spread)를 생성시킨다. 이와 달리, 연구 대상 염색체 물질은 분리된 개개의 염색체(들)의 스프레드일 수 있다.
제4a도는 소마틱-세포 염색체 전체를 함유한 영역의 일부로 또는 분리된 형태로 존재할 수 있는 단일 중기 염색체(10)를 나타낸다. 염색체는, 염섹체 상에 지도 위치가 공지되고 유익한 유전자 영역을 함유한 것으로 여겨지는 기지의 표식체 영역(12)(유전자 부위 M)을 함유한다.
슬라이드상의 염색체 제제를 제4a도 중 부호 14에 표시되고 부호 18에 원으로 표시한, RecA 단백질로 코팅된 프로브(16)로 구성되고, 비오틴그룹을 가지며, 부호 26에 수직 대시로 표시된 프로브 복합체와 반응시킨다. 본 발명에 따라, 염색체 물질과 프로브 복합체와의 반응은 유익한 표적영역인 유전자 부위 S(제4b도)에 프로브의 상동성 결합을 유발시킨다.
결합부위 S는 다양한 방법으로 부위 국소화에 대해 관찰할 수 있다. 제4c도에서 설명된, 한 방법에서는 공지된 영역(12)(유전자 부위 M)에 상동성인 프로브(24)로 구성되고 또한 비오틴 그룹(26)을 함유하는 제2프로브 복합체(22)를 염색체 제제에 가하고 방치하여 그것의 상동영역에 결합시킨다. 세정하여 결합되지 않은 프로브를 제거한 후, 제제를 FITC-아비딘 리포터(28)와 반응시켜 형광 tag을 가진 염색체 상에 양부위를 표지시킨다.
형광 현미경으로 관찰한 결과, 제4c도에서 나타난 것과 같은 영역이, 제4c도에서 부호 30에 표시된 2개의 형광점이 나타났으며, 이것은 염색체 상의 시험서열과 표지체간에 거리를 두고 있음을 나타내는 것이다.
제4d도는 표시된 다른 가시화 방법에서는, 염색체를 부호 32에 표시한, 중기 염색체(Korenberg, Lawrence, 1990)에 특징적 염색 패턴을 부여하는, 1종 이상의 특이 형광 염료로 표지한다. 염색체는 또한 형광 분자(들)이 염색되는 밴드와 상이한 형광 여기 파장을 갖는 형광 라벨을 함유하는 아비딘 리포터(34)로 표지한다. 형광 현미경을 사용하여 제4d도에서 부호 36에 표시한 바와 같이, 제1파장에서 가시화되고, 염색체 부위상의 프로브의 위치는 제2여기파장에서 가시화 된다. 1종의 동족체와의 반응을 제4d도에 표시했으나, 모든 상동성 서열은 프로브와 반응할 수 있다.
본 발명은 각종의 염색체의 비정상도를 검출하는 개선된 방법도 제공한다.
제5도 내지 제10도는 다양한 형태의 염색체 이상을 검출하는데 있어서의 본 발명의 적용방법을 설명한 것이다. 제5도의 프레임 A는 염색체 아암의 한쪽에 결합된 두 개의 표지체 영역(42) 및 (44)을 함유하는 정상 염색체(40a)를 나타낸 것이다. 염색체 내의 두 영역은 본 발명에 따라 개개의 프로브 복합체와 혼성화한 후, 상이한 형광 태그로 표시한다. 예를 들면, 영역중 한쪽은 제1의 프로브 복합체상의 비오틴 그룹에 대해 특이적인 아비딘-결합된 형광 리포터로 표지하고, 제2의 영역은 제2의 프로브 복합체 상의 디곡시게닌 그룹에 특이적인 항-디곡시게닌 항체상에서 실시된 제2형광 리포터로 표지할 수 있다. 제1및 제2형광리포터는 각기 제5도 및 제6도 내지 제10도에 하얀원 및 검은원으로 표시되어 있다.
두 영역을 형광 현미경으로, 적절한 여기파장에서 검사한 결과, 두 영역은 두 개의 특징을 지닌 형광 반점(프레임 B에서, 하얀원 및 검은원 으로 표시됨)이 국소화되어 있다. 이 두 개의 반점은 정상 염색체중 두 개의 게놈영역간의 거리와 상대배향을 나타낸다.
제6도의 프레임 A는 염색체 영역(44)의 삭제에 의해 염색체(40a)와 상이한 염색체(40b)를 설명한 것이다. 돌연변이는 프레임 B에서 단지 영역(42)에 상응하는 여기파장에서 단일 형광 반점으로 나타나 있다.
제7도의 프레임 A는 염색체중 영역(42), (44) 사이의 삽입에 의해 염색체(40a)와 상이한 염색체(40c)를 설명한 것이다. 삽입은 프레임 B에서 나타난 형광 현미경에 의한 영역에 있어서, 제5도에 있어서의 거리와 관련하여 두 개의 형광 반점간의 거리가 더 큰 것으로 확인되었다.
제8도의 프레임 A는 영역(44)의 중복에 의해 염색체(40a)와 상이한 염색체(40d)를 설명한 것이다. 중복은 프레임 B에 표시된 바와 같이, 영역(44) 프로브의 여기 파장에서 이중선으로 나타나 있다.
제9도의 프레임 A는 영역(44)을 함유한 세그먼트가 제2염색체(48e)로 전위된 점에서 염색체(40a)와 상이한 염색체(40e)를 설명한 것이다. 전위는 프레임 B에서, 넓은 간격을 가진 형광 반점들에 의해 입증되어 있다. 염색체(48e)의 확인은 상기와 같이, 특징적 중기 밴드 패턴을 형성하는 염료로 상기와 같이 염색체를 염색하여(또는 염색체(48) 표식체의 혼성화를 이용하여)측정할 수 있다.
제10도의 프레임 A는 영역(42), (44)을 수반하는 세그먼트가 반전된 점에서 염색체(40a)와 상이한 염색체(40f)를 나타낸 것이다. 반전은 프레임 B에서, 두 개의 형광 반점의 위치가 역전된 것에 의해 입증되었다.
제12도는 천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화를 이용하여 중기 염색체 중에서 특이 염색체 DNA 서열을 검출하는 본 발명에 따른 방법의 능력을 나타낸 것이다. 이들 데이터는 슬라이드상에서의 천연 형광인 시튜 혼성화를 위한 본 발명의 방법의 용도를 뒷받침하고 있다. 실시예 6은 다음을 포함하여 제12도에 나타난 중기 염색체 형광 인 시튜 혼성화 시그널을 발생시키는데 사용되는 단계들을 설명한 것이다 : 아세테이트 완충액으로 60℃에서 전 처리한 염색체 1 알파-세터라이트 프로브 및 HEp-2 세포의 제조. 예측되는 바와 같이, 제12도에서, FITC 혼성화 시그널은 동원체에 위치하고 있다. 이들 데이터는 천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화 기술을 고정 염색체 또는 크로마틴 중에서 비변성화된 DNA 상의 서열 및 유전자 위치를 식별하는데 사용할 수 있다.
제13도 및 제14도는 종량 억제 유전자 서열의 RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화 검출능력을 나타낸 것이다. 천연 RecA-매개된 형광 혼성화 기술을 이용하여, 시그널 증폭 단계를 전혀 거치지 않고 현탁액중(제13a도 내지 제13f도) 및 슬라이드상(제14a도 내지 제14d도)의 고정 세포중 독특한 단일 카피 유전자 서열을 검출하고, 식별할 수 있다. 이들 결과는 ATCC HEp-2 및 HCC "알렉산더"세포(실시예 7 및 8)중 염색체 17상의 독특한 p53 서열의 검출 결과를 보여주는 것이다.
제15도는 현탁액중 ATCC HCC "알렉산더" 세포에서 HBV 핵산서열을 검출할 수 있는 RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화의 능력을 설명한 것이다. 제15도(실시예 9)는 두 개의 상이한 비오티닐화된 HBV 프로브, "BIOPROBE"(제15a도 내지 제15b도) 및 pAM6(제15c도 및 제15e도)를 사용하여 얻은 혼성화 시그널을 나타낸 것이다. 바이러스 표적체는 세포 현탁액중 천연 현광 인 시튜 혼성화 기술을 사용하여 프로브되고, HBV 핵산서열을 함유하는 것으로 공지된, ATCC HCC "알렉산더" 세포에서 검출되었다. HBV 핵산서열로 감열되지 않고, 동일 프로브 및 방법으로 프로브된, HEp-2 세포는 혼성화 시그널이 전혀 나타나지 않았다. 이들 결과는 HBV-감염된 인간 간장 세포에서 진단학적으로 중요한 바이러스 표적서열을 검출하는데 본 발명의 방법의 용도를 뒷받침하고 있다.
제16도는 천연 형광 인 시튜 혼성화를 사용하는 HBV 표적 검출의 특이성을 입증한 것이다. 천연 형광 인 시튜 혼성화 어세이에 의하면 프로브 DNA(제16도 및 표 1)에 상동성 핵산 표적체를 특이적으로 동정할 수 있다. 이것은 비오티닐화된 pAM6 HBV DNA 프로브 혼성화 시그널은 반응물이 과량의 상동성 비표지된 pAM6 DNA(제16a도)를 함유한 경우, 특이적으로 경쟁하나, 반응물이 과량의 이질성 비표지된 φ X 174 DNA(제16b도)를 함유하거나 또는 과량의 비표지된 인간 태반 DNA(제16c도)를 함유한 경우는 특이적으로 경쟁하지 않는다는 것이 나타남으로써 입증되었다. 이들 경쟁 실험의 결과는 예를 들면, 현탁액중 HBV 프로브 DNA 및 HCC 세포에서 나타난, 천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화 시그널이 HBV 특이적이라는 것을 입증해 주고 있다.
일반적으로, 본 발명의 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화 반응에서는 RecA 단백질, 공인자와 1 내지 2시간의 배양시간이 사용된다. 넓은 범위에 걸친 단일사슬 프로브는 평균 크기가 100 내지 200, 200 내지 400, 300 내지 500, 400 내지 600 및 이상에서 작용하나, 이러한 크기에 한정되는 것은 아니다. 전형적으로는 100 내지 200 이상의 크기가 바람직하나, 가장 바람직하기는 300 내지 500이다. RecA 단백질로 코팅된 프로브는 추후 사용을 위해 냉동기에 저장할 수 있으며; 7일 이하에서 저장된 프로브가 우수한 혼성화 시그널을 제공하는 것으로 시험에 의해 확인되었다.
상기한 경쟁성 실험에서 RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화가 상동성 핵산서열의 검출에 특이적이라는 것이 입증되었다. 혼성화 반응에 의해 단일 카피 유전자 및 서열(예. p53), 다중 카피 서열(예. 알파-세터파이트 염색체 1) 및 진단학적으로 중요한 바이러스 표적서열(예. HBV)을 검출할 수 있다. 천연 RecA-단백질 매개된 형광 인 시튜 반응은 일반적으로, 표준 변성 형광 인 시튜 혼성화 어세이에서 보다 더 신속하게 이루어진다. 본 발명은 뒷받침하는, 실시된 실험에서는 혼성화 후 1.75 X SSC 세정에 의해 시그널은 증가하고 백그라운드는 감소된다는 것이 나타나있다.
천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화에 있어서의 본 발명의 특징 중에는 다음과 같은 것이 포함된다 : 천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화는 현탁액중에서, 1 X PBS로 세정되고, 100% 메탄올 고정된(또는 70% 에탄올 고정) 세포상에서 사용될 수 있다; 시그널은 프로브로 2시간 이하의 배양으로 달성될 수 있다; 반응은 예컨대, 50ng 프로브와 표준조건이 효과적이며, 반응에서는 사용된 프로브의 농도에 따라, 평균적으로 세포의 65 내지 90%가 시그널을 나타낸다; 반응은 50ng 프로브 미만-프로브 농도는 10ng 초과가 바람직하다-에서 작용한다; ATPγS, GTPγS, ATP, dATP, 및 ATPγS 및 ADP의 조합체를 포함하여 다수의 공인자가 이들 반응에서 작용한다-한 실시형태에서는 ATPγS의 농도를 약 0.24 내지 약 2.4mM(바람직한 실시형태는 약 0.24 내지 0.48mM의 범위이다) 범위에서 사용한다; 광범위한 RecA 모너머; 뉴클레오티드 비율에서, 즉 1 : 1, 1 : 0.8, 1 : 2 및 1 : 2.5(바람직힌 실시형태에서는 1 : 2를 사용한다)에서 잘 작용한다; 염색체 #1 알파-세터라이트 프로브 및 슬라이드상에서 HEp-2 세포와 천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화로 얻어진 시그널의 양은 표준 변성 형광 인 시튜 혼성화 기술을 사용하여 얻어지는 것에 필적한다; 반응은 보조 단백질(예. 단일사슬 결합 단백질(SSB), 토포이소머라제 Ⅰ 및 토포이소머라제 Ⅱ) 존재하에 작용한다; 반응을 슬라이드상에서 고정된 시료로 수행한 경우 반응 효율은 RecA-코팅된 프로브 믹스를 첨가하기 전에 슬라이드를 10mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 7.5)중 55 내지 60℃에서 30 내지 45분간 배양함으로써, 평균범위 5 내지 20%로부터 55 내지 80%까지 증가된다. 이 온도는 세포내 핵산의 변성 온도 이하이다.
어느 정도까지 단일 또는 소-카피-수 표적서열에 결합하는 프로브를 포함하는 상기한 방법의 적용은 본 발명의 방법을 연구하는데 매우 적합하다는 것을 알수 있을 것이다.
본 발명의 방법의 다른 일반적인 적용은 전형적으로 염색체 배수성 또는 재배열의 변화를 또는 감염된 생물, 기관, 조직 또는 세포중 바이러스 또는 박테리아 또는 기생성 병원균의 존재하에 검출하는 진단학 분야이다. 이 적용은 상기에서 구체적으로 언급되었으며, 일반적으로 세포 50과 같은, 바이러스 감염된 세포의 검출에 관한 제11a도 내지 제11c도에 설명되어 있다. 세포에 함유된 바이리온 입자(또는 통합된 바이러스 게놈)는 부호 54에 표시되어 있다. 세포, 예컨대 혈액세포는 시험 대상물로부터 얻어진 것이며, 상술한 바와 같이, 세포구조를 투과하도록 처리하였다. 투과성 세포(제11a도)에 바이러스 이중핵산에 DNA 복합체를 결합한 특이서열을 가진, 바이러스-특이성 DNA 프로브 복합체(56)를 가하고, 이이서 바이러스-복합체의 표지화(제11b도)를 위해, 형광 표식체분자(58)를 가한다. 프로브 시그널은, 필요시, 상술한 리포터 시약, 예. 비오티닐화된 항-아비딘 항체를 증폭한 다음, 제2의 형광-표지된 아비딘 리포터 분자를 증폭하여 향상시킬 수 있다.
표지된 세포는 형광 현미경 검사에 의해 세포내에 바이러스 핵산에 감염을 검출하고 국소화 할 수 있다. 이와 달리, 세포감염 및 세포 감염율은 제11c도에 설명된 바와 같이, 형광 활성화 세포분류(FACS)에 의해 측정할 수 있다. 이 도면을 검출 엉역을 통과하는 개개의 세포중 형광성을 검출하기 위해 검출기(66)을 부착한 FACS 장치에 있어서 모세관(64)을 통과하는 세포(60), (62)와 같은 혈액세포 그룹을 나타낸 것이다. 형광 표지된 세포는 도면에서 어두운 부분으로 표시되어 있다. 본 방법은 진단 목적을 위해, 감염된 세포의 검출을 신속하게 할 수 있고, 감염된 세포의 감염정도와 감염율을 측정할 수 있다. 따라서, 예컨대, 본 방법은 처치가간을 통해 세포 감염의 감소를 측정함으로써 항-바이러스 처치의 진행을 추정하는데 이용될 수 있다.
FACS 장치에는 형광-표지된 세포를 포획하기 위한 분류장치를 더 부착하여 감염된 세포의 농축물을 형성시킬 수 있다. 이 농축물은, 한편 바이러스 게놈을 확인하고 크로운할 목적하게 바이러스 핵산 원으로 사용할 수 있다.
다음에 제시된 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 이들로써 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이들 실시예로 본 발명의 특수한 방법과 적용을 설명한다.
[실시예 1]
[RecA-단백질의 정제]
RecA 및 RecA 803 단백질은 과잉 생산균주 JC12772 및 JC15369(A. J. Clark and M. Madiraju)로부터 분리한 것이거나, 또는 RecA는 Pharmacia로부터 구입한 것이다.
RecA 및 RecA 803 단백질은 히드록실 아파타이트 칼럼(BioRad로부터 분말로서 수득)에 이어, 음이온("MONOQ", Pharmacia) 교환 칼럼을 사용하여 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 포함한 공개된 방법(Shibata, Griffith)을 변형하여 정제하였다.
단백질의 정제는 다음과 같이 모니터 하였다 :
(ⅰ) 38,000-달톤 RecA 단백질의 SDS-PAGE("PHASTGEL"계, Pharmacia, Piscataway NJ)에 의한 동정;
(ⅱ) [γ-32P]ATP 및 단일사슬 DNA(Shibata)를 사용하는 RecA ssDNA-의존성 ATPase 활성의 어세이.
반응 생성물은 PEI 셀루로스 박층 크로마토그래피(EM Science, NJ)를 사용하여 분리하였다 : 상기 PEI 플레이트는 0.5M LiCl 및 0.25M 포름산 용매중에서 전개시키고, 생성물은 오토라디오 그래피로 검출하였다.
(ⅲ) DNase 활성의 어세이.
DNase 활성은 RecA 단백질 시료를 φX 174 선형 및 고차코일 환상 이중사슬 RF 및 환상 단일사슬 DNA의 혼합물로 RecA 사슬-접합전달 완충액(Cheng) 중에서 37℃에서 1시간 동안 배양하여 모니터하였다. DNA 니킹 및 소화는 아가로즈 겔 전기영동 후 에티디움 브로마이드로 DNA를 가시화하고 제단백화한 후 RecA 배양된 시료 중 각 DNA 형태의 양과 RecA가 없이 완충액중에 배양된 것의 양을 비교하여 모니터 하였다. 검출 가능한 DNase 활성을 나타내지 않는 RecA 단백질 시료만을 사용하였다.
(ⅳ) 쳉(Cheng)으로부터 변형된 방법을 사용하는 500-mer 올리고뉴클레오티드 프로브로 D-루프 활성의 어세이.
최종 "MONO-Q"-정제된 RecA 및 RecA 803 단백질의 은 착색 SDS-폴리아크릴아미드 겔 프로파일은 다른 세포성 폴리펩티드가 실제로 함유되지 않는 각 제제에서 단일 38,000-달톤 밴드를 타나냈었다.
[실시예 2]
[프로브 복합체의 제조]
비오티닐화된 염색체 X 알파 세터라이트 DNA 프로브는 ONCOR(Gaithersburg, MD)로부터 입수하였다.
멸균 Milliq(밀리포어) H2O에 희석한 프로브를 0.5㎖ 마이크로원심 분리관 중 100℃ 가열 블록중에서 5분간 변성시킨 다음, 즉시 빙수욕에 넣었다. 혼성화 혼합물에 변성된 프로브를 첨가하기 대략 5분전에 -20℃ 냉동기 중 얼음에 두었다. 프로브 혼성화 혼합물은 다음과 같은 농도범위가 넓은 성분을 함유하는데, 여기에 나열된 순서대로 혼합하였다 :
1㎕의 10 X RecA 반응완충액 [10 X RecA 반응완충액 : 100mM 트리스 아세테이트 pH 7.5(37℃에서) 20mM 마그네슘 아세테이트, 500mM 나트륨 아세테이트, 10mM DTT 및 50% 글리세롤(Cheng)]; 16.2mM 원액으로부터 1.5㎕의 ATPγS(3.24 및 1.62mM 원액을 사용할 수도 있다),(Pharmacia)(어떤 반응에서는 rATP, dATP, GTPγS, 또는 ATPγS 및 ADP의 조합물을 사용할 수 있다); 0.75㎕의 20mM 마그네숨 아세테이트; 4 내지 60ng(또는 그 이상, 어떤 반응의 경우)의 멸균 ddH2O 또는 TE(20mM 트리스 HCl, pH 7.5 및 0.1mM EDTA) 중 변성 프로브; RecA(자체내 실험실에서 제조한 경우 첨가된 ㎕의 정확한 양은 원액농도에 따라 달라지며, Pharmacia로부터 구입한 경우, 1.25㎕의 0.137mM원액. 혼합물을 37℃에서 10분간 배양후 이어서 0.5㎕/반응의 200mM 마그네슘 아세테이트를 첨가하였다. 반응성분의 최종 농도는 다음과 같다 : 4.0mM 내지 10mM 트리스 아세테이트, 2.0mM 내지 15mM 마그네슘 아세테이트, 20.0mM 내지 50mM 나트륨 아세테이트, 0.4mM 내지 1.0mM DTT, 2% 내지 5% 글리세롤, 0.24mM 내지 2.5mM ATPγS, 0.005 mM 내지 0.02mM RecA.
[실시예 3]
[염색체 X 프로브를 사용하는 인 시튜 혼성화]
A. HEp-2 세포핵의 제조
HEp-2 세포는 인간 수(male) 후두 유포피 암 조직으로부터 유래된 것이다. HEp-2는 가변성 배수성 염색체이다(Chen).
세포를 10% FBS, 나트륨 피루베이트 및 펜스트렙(Penstrep), 항생물질 혼합물을 보충한 DMEM(Whittaker 또는 GIBCO-BRL)을 37℃에서 표준 조건하에 시딩한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포를 저속 원심분리에 의해 펠렛화하고 37℃ 수욕상에서 75mM KCl에 서서히 재현탁시킨 다음 핵의 팽윤이 원하는 정도로 일어나도록 5 내지 15분간 배양시킨 후 이어서 얼음냉각한 메탈올 : 아세트산(3 : 1)을 첨가하고 6℃에서 원심분리 하였다.
상기에서 얻은 유동액 1㎖를 펠렛화된 세포가 있는 튜브에 넣고, 얼음 냉각된 메탄올 : 아세트산을 추가한 다음, 튜브를 온화하게 혼합하여 세포를 현탁시키고 이어서 원심 분리하였다. 메탄올 : 아세트산의 첨가를 반복하여 원형질을 붕괴하고 상기와 같이 메탄올 : 아세트산을 반복 첨가한 다음, 혼합 및 원심분리하여 분리된 핵을 얻었다(HEp-2 및 다른 형태의 세포를 다른 방식으로 고정할 수 있으나, 이중 어떤 것은 고정된 원형질 구조를 붕괴하지 않는다).
최종적으로 핵 제제를 약 2 X 106/㎖ 농도에서 3 : 1 메탄올 : 아세트산에 재현탁시키고 10㎕ 분취액을 -20℃에서 저장된 깨끗한 유리 슬라이드 상으로 피펫을 사용하여 적하하거나 또는 현탁된 핵 또는 세포제제를 후사용을 위해 -20℃에 저장해둔다.
B. 비변성 핵산 표적-혼성화 반응
실시예 2에서 얻은 10㎕의 프로브 혼합물/반응을 유리 슬라이드상의 고정된 제제에 적용하였다. 유리 카바슬립을 혼성화 영역에 걸쳐 덮고 고무질 시멘트로 밀봉한 후 반응물을 37℃ CO2배양기 내에서 가습용기 중 1 내지 4시간 동안 배양시켰다. 배양후, 고무질 시멘트를 제거하고 슬라이드를 37℃ 수욕상에서 각기 2 X SSC(20 X SSC : 3M NaCl, 0.3M 나트륨 시트레이트, pH 7.0를 이들 어세이에서 모든 SSC 함유 제제를 사용)에 10분간 3회에 걸쳐 Coplin 병에서 세정하였다. 다른 세정 조건을 사용할 수도 있다.
슬라이드를 프리블록액[4 X SSC, 0.1% 트리톤X -100, 5% 카네이션탈지 분유, 2% 정상 염소 혈청(Gibco), 0.02% 나트륨 아지드 pH 7.0]에 실온(RT)에서 25분간 담근 다음, 프로블록액중 5㎍/㎖ FITC-아비딘 DCS, 세포분류 급(Vector, A-2011)에 실온에서 25분간 침지하였다. 이들 슬라이드를 4 X SSC, 4 X SSC 및 0.1% 트리톤 X -100, 그리고 4 X SSC에 실온에서 각기 10분간 세정하고, 이어서 2회 증류한 물에 간단히 린스한 다음 건조하였다. 퇴색방지제[글리세롤 90㎖에 첨가한 0.5M탄산염-중탄산염 완충액(10㎖의 ddH2O에 녹인 NaOH로 pH 9로 조정한 NaCHO30.42g)으로 pH 8로 조정한 PBS 10㎖ 및 0.22㎛ 필터레드중 p-페닐렌디아민 이염산염(Sigam P1519) 100㎎]를 적용하고 퇴색방지제를 첨가한 배지와 카바슬립을 상기 제제위에 덮었다. 때로는 퇴색방지제만을 사용하는 대신, 프로피디움 요다이드 또는 DAPI와 같은 대응 착색제를 함유한 탈색방지제가 사용되기도 한다. 제1a도는 상기 제제(시그널 증폭이 없는)로부터 세포핵의 형광 현미경 사진을 보여주는 것이다.
필요시, 시그널 증폭은 다음과 같이 수행할 수 있다 : 슬라이드를 4 X SSC 및 0.1% 트리톤 X -100에 실온에서 5 내지 10분간 세정하여 카바슬립 및 퇴색방지제를 제거한 다음, 프리블록액 중에서 20분 이하로 배양시키고 비오티닐화된 염소 항-아비딘 항체(Vectro BA-0300)를 프리블록액에 희석한 5㎍/㎖ 농도에서 37℃에서 30분간 배양시켰다. 슬라이드를 4 X SSC, 4 X SSC 및 0.1% 트리톤X -100, 4 X SSC에서 각각 10분동안 실온에서 세정한 후, 20분동안 실온에서 프리블록액 중에 배양 하였다. 이어서, 실온에서 20분동안 5㎍/㎖ FITC-아비딘을 포함하는 프로블록액 중에 침지하였다. 슬라이드를 4X SSC 종들로 세정하고 ddH2O에 간단히 세정한 다음 퇴색방지제 또는 대응착색제 함유 퇴색방지제를 첨가하였다.
C. 핵산 표적체의 열 변성에 의한 혼성화
비교 목적으로, 핵 기질의 열 변성에 의한 인 시튜 혼성화를 병행하여 실시하였다. 변성 표지 X 염색체 프로브를 핵에 가하여 ONCOR 프로토콜 하에 슬라이드 상에서 변성시켰다. 동일 핵 제제를 비변성 방법에 사용하였다. ONCOR에 의해 제시된 시그널 증폭방법을 사용하여 혼성화 시그널을 증가시켰다. 그후, 슬라이드를 37℃에서 하룻밤 유지시켰다. 사용된 방법 및 물질은 ONCOR염색체 인 시튜 킷트(In Situ Kit), Cat No. S1370에 준하였다.
제1b도는 상기한 시그널 증폭된 제제로부터 얻어진 세포 핵의 형광 현미경 사진을 보여주는 것이다.
[실시예 4]
[염색체 7 프로브를 사용하는 인 시튜 혼성화]
염색체 7 알파 세터라이트 DNA에 대한 비오티닐화된 DNA 프로브를 ONCOR로부터 얻었다. 이 프로브를 변성시켜, 5주 이상 냉동상태에서 저장할 수 있다. 16㎕(1 : 2, 프로브 : H2O, 2ng/㎕ DNA) 중 변성된 갓 해동한 DNA 프로브 32ng를 동일양의 혼성화 혼합물에, 실시예 2에서 기술된 순서와 동일한 순서로 첨가하였다. 이 프로브 혼합물을 37℃에서 10분간 배양시킨 후 0.5㎕의 200mM 마그네슘 아세테이트를 마지막으로 첨가하여, 반응물은 총 21㎕를 함유하였다.
프로브는 CO2인큐베이터 내에서 비변성된 HEp-2 표적 세포핵(실시예 3B)상에서 37℃에서 2.5시간 배양시킨 다음, 실시예 3B에서 염색체 X에 대한 프로브에 대해 기술한 것과 동일하게 세정, 블로킹 및 FITC-아비딘 배양을 하였다. 슬라이드를 일련의 에탄올 처리를 포함하고, 실험에 소용된 시간은 대략 5시간이었다. 제2a도는 처리된 제제로부터 얻어진 세포핵의 형광 현미경 사진을 보여주는 것이다.
비교하기 위해, 실시예 3C에서와 같이 핵을 열-변성 조건하에 염색체 7 프로브와 반응시켰다. 간략하면, 염색체 7 알파 세터라이트 DNA에 대한 변성프로브 5ng을 혼성화 완충액(HybrisolVI, ONCOR, 제1b도 참조)와 혼합하고 ONCOR 프로토콜을 사용하여 변성시켰다. 이 프로브 혼합물 7㎕를 HEp-2 세포핵과 16시간 동안 혼성화하고, 반응물을 시그널 증폭을 포함하여, ONCOR 프로토콜에 따라 처리하였다. 제2b도는 처리된 변성 핵의 형광 광현미경 사진을 보여주는 것이다.
[실시예 5]
[현탁액중 메탄올 고정 간기 핵에서의 특이 염색체 서열의 검출]
ONCOR 프로브 스톡(실시예 2에서도 사용됨)인 X 염색체 알파 세터라이트 DNA에 특이적 프로브를 희석하고 100℃에서 5분간 변성시킨 즉시, 빙수욕에 넣고(약 15분간), 혼성화 혼합물에 첨가하기 전에 -20℃ 냉장고에 잠시(약 5분간) 두었다. 이 혼성화 혼합물을 다음 순서(성분, 농도 및 혼합물은 실시예 2에 상세히 기술되어 있다) : 1㎕의 10 X RecA 반응완충액(참조 실시예 2), 1.5㎕의 ATPγS(16.2mM 원액, Pharmacia) 0.75㎕의 마그네숨 아세테이트(20mM 스톡), 12㎕의 변성프로브(ONCOR, 물에 1 : 2로 희석한 것 60ng 함유(20ng 또는 60ng 이상을 사용할 수도 있다)], RecA(0.137mM 원액, Pharmacia)대로 혼합하였다. 혼합물을 37℃ 수욕에 10분간 배양시키고 이어서 0.5㎕의 200mM 마그네슘 아세테이트를 첨가하였다.
HEp-2 세포를 약 2.5 X 106/㎖의 농도에서 -20℃에서 100% 메탄올(또는 다른 적절한 용액)에 고정시켰다. 이 현탁된 세포 약 0.5㎖(1.25 X 106)를 1.5㎖들이 마이크로원심분리관에 넣어 6℃에 맞춘 "TOMY" 원심분리기에서 원심분리한 다음, 이어서 200㎕ 내지 1㎖의 70%, 85% 및 100% 얼음 냉각한 EtOH를 넣어 원심분리하여 재현탁시켰다. 마지막 원심분리하고 100% EtOH 상등액을 제거한 후, 펠렛을 실온에서 200 내지 500㎕의 1 X RecA 반응 완충액에 재현탄시키고 0.5㎖들이 원심분리관에 넣어 원심분리 하였다.
완성한 프로브 혼합물을 펠렛과 혼합하고 이 튜브를 37℃ 수욕중에 1.5 내지 2.5시간 동안 두었다. 250㎕의 2 X SSC(37℃로 미리 가온함)를 첨가하여 배양을 중지시키고, 이이서 원심분리하였다. 펠렛을 2 X SSC(37℃로 미리 가온함)에 재현탁시키고 37℃에서 5분간 배양하였다. 원심분리에 이어 펠렛을 500㎕의 블로킹액에 실온에서 20분간 재현탁시킨 다음 원심분리하고 100㎕의 블로킹액 중 10㎍/㎖ FITC 아비딘에 암소중 실온에서 20분간 재현탁시켰다. 튜브를 원심분리하고 250㎕의 4 X SSC를 펠렛과 혼합하고 다시 원심분리한 후 0.1% 트리톤X -100과 함께 250㎕의 4 X SSC를 펠렛과 혼합하고 다시 250㎕의 4 X SSC와 모두 실온에서 원심분리하였다. 최종 원심분리 후, 펠렛을 약 20㎕의 퇴색방지제와 혼합하였다. 현탁된 세포중 약 30%에서 특이 시그널이 나타났다. 100% 메탄올 고정 전체 세포 및/또는 고정핵과 세정성분을 달리한 기타의 농도를 사용한 실험에서는 50 내지 90% 반응을 나타내었다.
제3a도 현미경 사진은 Zeiss LSM-10 현미경으로 관찰된 바와 같이, 분열성 고정 HEp-2 세포 핵을 보여주는 것으로, 이것은 대칭적으로 위치한 FITC-표지된 프로브-결합 동원체 표적체를 설명해 주는 것이다. 이하 제3b도의 상 사진은 현미경의 초점을 변경하지 않고 동일한 핵을 촬영한 것이다.
[실시예 6]
[중기 염색체중 특이염색체 DNA 서열의 검출]
bio-14-dATP(Giboc-BRL, Gaithersburg MD) 존재하여 BRL 니크-이동계를 사용하여 염색체 1 알파-세터라이트 동원체 서열(pU C1. 77 : DNA 벡터 pUC9중 1.77 염기쌍 길이의 인간 EcoR1 단편; Cooke, et al.; Emmerich, et al.)에 대한 비오티닐화된 프로브를 제조하였다. 니크 이동은 하기한 변형법으로 제조처(BRL)에 의해 게재된 바와 같이 실시 하였다 : 권장량의 두배의 효소를 가하고 반응물을 15℃에서 1시간 45분간 배양시켰다. 이들 니크이동 반응에 의해 평균 단일사슬 크기가 대략 300 내지 400bp인 프로브가 얻어졌다.
니크-이동된 프로브는 에탄올 중 0.3M 나트륨 아세테이트에 침전시키고 10mM 트리스-HCl(pH 7.5), 0.1mM EDTA에 재현탁시키고 DNA 농도를 "DNA DIPSTICKTM"(invitrogen)으로 측정하였다. 슬라이드상에 놓여진 메탄올 : 아세트산 고정 HEp-2 세포(대부분 핵; 실시예 3과 유사하게 제조)를 일련의 70, 85 및 100% 냉각 에탄올 배양물에 노출시켜 탈수 시켰다. 그후 슬라이드상의 탈수된 세포를 10mM 트리스-아세테이트 완충액, pH 7.5 중 60℃에서 45분간 전배양 시키는 반면 RecA-코팅된 염색체 1 알파-세터라이트 동원체 서열 프로브 믹스를 제조하였다.
60℃ 전배양 처리로는 표적 DNA가 변성되지 않으나, 슬라이드상에서의 고정된 세포에 대해 실시된 천연 RecA-매개된 형광 인 시튜 혼성화 반응의 효율은 향상되었다(혼성화는 5 내지 2-%에서 60 내지 82%로 향상), 고정 세포 핵 제제에 제조된 프로브 믹스를 가하기 전에 가온된 슬라이드를 37℃ 표면위에서 37℃로 냉각시켰다. 세포를 카바슬립으로 덮고 반응물을 고무질 시멘트로 밀봉하였다.
DNA 프로브는 5.16㎕의 ddH2O 중 100℃에서 5분간 열변형시키고 빙수욕 중에서 급냉시킨 다음 4℃에서 "TOMY" 마이크로원심분리기 중에서 20초간 원심분리하여 액체를 수집한 후, 즉시 다른 반응성분들을 함유하는 혼합물에 가하였다. 염색체 1 프로브는 1㎕의 10 X 아세테이트 반응 완충액(Cheng et al., 1988), 1.5㎕의 16.2mM ATPγS(Sigma), 0.75㎕의 20mM Mg(OAc)2, 0.59㎕의 RecA(11.05㎍/㎕), 1㎕의 DNA 프로브(50ng/㎕)을 함유한 반응 혼합물 중에서 RecA 단백질로 코팅하였다. 프로브 첨가후의 반응 믹스 총 부피는 10㎕이었다. 프로브 반응 믹스는 37℃에서 10분간 배양한 다음 0.5㎕의 0.2M Mg(OAc)2를 가하였다. 프로브 믹스를 37℃에서 슬라이드상의 완충액 처리된 세포핵에 가하였다. 반응물을 카바슬립으로 덮고 고물질 시멘트로 밀봉한 다음 가습된 챔버내에서 37℃에서 2시간 동안 배양하였다.
프로브로 세포 배양한 후, 고물질 시멘트를 제거하고 슬라이드를 1.75 X SSC(pH 7.4)로 37℃에서 3회 세척하였는데 매회 세척은 10분이었다. 슬라이드를 여과한 프리블록액(100㎕)중 실온에서 20분간 배양한 다음, 여과된 프리블록중 5㎍/㎖ FITC-아비딘(Vector, DCS 급)으로 실온에서 20분간 암소에서 배양시켰다.
슬라이드를 실온에서 1 X 4 X SSC, 1 X 4 X SSC+0.1% "트리톤X -100" 마지막으로 1 X 4 X SSC에 세정하였다. 슬라이드를 마지막 세정후 ddH2O에 잡시 침지하고 풍건하였다. 카바슬립을 첨가하기 전, 퇴색방지제를 가하고 Zeiss LSM으로 세포를 관찰하였다.
제12도는 인간 염색체 1 알파-세터라이트 동원체 서열에 RecA 코팅되고, 비오티닐화 및 니크이동된 프로브로 고정한 HEp-2 중기 염색체로부터 혼성화 시그널을 나타낸 것이다. 이들 조건하에 염색체 스프레드(Spread)를 포함하여 세포간기 핵 73%가 시그널을 나타내었다. 염색체 1 알파 세터라이트는 염색체 1 동원체와 특이적으로 혼성화 되었다.
[실시예 7]
[RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화]
[독특한 p53 염색체 17 종양 억제 유전자 서열의 검출]
A. 제1조건 : 제13a도 및 제13b도
1.25 X 106100% 메탄올 고정된 ATCC HEp-2(ATCCl : American Type culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville MD 20852) 세포를 마이크로원심분리관에 넣고 일련의 70%, 85% 및 100% 에탄올(Lawrence, 1988 및 1990; 실시예 5)을 넣었다. 세포를 고정화 단계중 펠렛화하고, 100% 에탄올 처리 단계후, 세포를 1 X 아세테이트 반응 완충액 세정을 하기 직전까지 펠렛으로 만들었다. 공정사이의 모든 세포의 원심분리는 2.5K에서 "TOYM" 마이크로원심분리기 중 30초간 이었다.
프로브를 RecA 단백질과 배양시키면서, 펠렛화된 세포를 아세테이트 반응 완충액(Cheng et al., 1988)으로 1회 세정하였다. 세포를 다시 펠렛화하고 RecA-코팅 프로브 반응 믹스를 첨가하기 전에 가능한한 완충액 세정액을 거의 전부 제거하였다.
프로브를 1㎕의 10 X 아세테이트 반응 완충액, 0.75㎕의 0.02M Mg(OAc)2, 1.5㎕의 1.62mM ATPγS(sigma), 0.59㎕의 11.02㎍/㎕ RecA, 열변성 프로브[5㎕의 p53 프로브(10ng/㎕; ONCOR Inc., Gaithersburg MD) 및 1.16㎕의 ddH2O]를 함유한 혼합물 중 37℃에서 10분간 RecA 단백질로 코팅하였다. 프로브를 세정된 세포 펠렛에 첨가하기 전에, 0.5㎕의 0.2M Mg(OAc)2를 프로브 믹스에 첨가하였다. 세포를 프로브와 혼합하고 37℃에서 3시간 50분 동안 배양하였다.
배양후, 세포를 1.75 X SSC(pH 7.4)에 매회 250㎕씩 3회 세정한 다음 실온에서 20분간 여과된 프로블록중에서 배양하고 펠렛화하고 프로블록을 제거하였다. 이 단계후 5.0㎍/㎖ FITC 아비딘을 함유한 여과된 프리블록 50㎕로 실온에서 20분간 배양하였다. 세포를 각기 250㎕의 4 X SSC, 4 X SSC+0.1% "트리톤X-100" 4 X SSC(모두 pH 7.4이다)에 세정하였다.
소량(예. 대략 20㎕)의 퇴색방지제를 최종 세포 펠렛에 가하고 세포 부분을 슬라이드상에 놓고 카바슬립으로 덮은 다음 Zeiss LSM을 사용하여 관찰하였다. 이들은 일반적 조건하에, 세포중 65% 이상이 광택 p53 혼성화 시그널을 나타내었다(제13a도 및 제13b도).
B. 제2조건 : 제13c도 및 제13d도
모든 세포 및 세포 세정액은 실시예 7A에서와 동일하였다. 프로브를 0.02M Mg(OAc)2대신에 0.75㎕의 ddH2O를 첨가하는 것을 제외하고는 상술한 바와 같이 RecA와 반응시켰다. 이들 조건하에, 세포중 40%가 광택 혼성화 시그널을 나타내었다(제13c도 및 제13d도).
C. 제3 조건 : 제13e도 및 제13f도
모든 세포 세정액은 실시예 7A에서와 동일하였다. 프로브 코팅믹스가 1.5㎕의 16.2mM ATPγS를 함유하고, 반응 믹스를 0.5㎕의 0.2mM Mg(OAc)2를 첨하기 전에, 37℃에서 13분간 배양시키고, RecA 코팅된 프로브를 1.25 X 106100% 메탄올 고정 ATCC HCC "알렉산더" 세포에 가하고 37℃에서 3시간 20분간 반응시키는 것을 제외하고는 프로브를 상기(실시예 7A)에 기술한 바와 같이 반응시켰다. 프로브 반응후 세포 세정은 세포를 10.0㎍/㎖ FITC-아비딘을 함유한 50㎕의 여과 프리블록과 반응시키는 것을 제외하고는, 실시예 7A에 기술된 바와 같이 실시하였다. 이들 조건하에, 세포중 82%가 광택 혼성화 시그널을 나타내었다(제13e도 및 제13f도).
[실시예 8]
[RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화]
[슬라이드상의 HEp-2 세포핵중 독특한 p53 유전자 서열의 검출]
슬라이드상의 메탄올 : 아세트산 고정 ATCC HEp-2 세포를 RecA-코팅된 p53-(ONCOR) 프로브와 반응시켰다. 세포를 세정하고 10mM 아세테이트 완충액(pH 7.4)과 45분간 배양하는 단계를 생략한 것을 제외하고는 실시예 6에 기술된 바와 같이 프로브를 제조하였다.
p53 프로브 DNA 코팅은 1.5㎕의 3.24mM ATPγS, 0.59㎕의 5.51㎍/㎕ RecA 및 0.5㎕의 2U 토포이소머라제 II(United States Biochemicals Corp. (Cleveland OH)과 변성된 프로브 대략 2분의 1 정도[3.66㎕의 ddH2O중 2.5㎕(25ng 프로브)]를 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 6에 기술된 바와 같이 실시하였다.
RecA 단백질로 프로브를 코팅한 후, 0.5㎕의 0.2M Mg(OAc)2를 가하고 프로브 믹스를 슬라이드 상의 핵에 가하였다. 프로브와의 반응후 세정 조건은 실시예 6에서 기술된 바와 같다. 이들 조건하에 핵중 20%가 광택 혼성화 시그널을 나타내었다(제14a도 내지 제14d도). 이 실험에서 혼성화 시그널을 가진 간기 핵의 수는 제12도(실시예 6)에서 관찰된 것보다 더 적었다. 이 프로토콜에서는 완충액 배양단계를 포함시키지 않았다.
[실시예 9]
[RecA-매개된 천연 형광 인 시튜 혼성화]
[현탁액중 ATCC HCC "알렉산더" 세포내의 HBV 핵산 서열의 검출]
반응당 100% 메탄올 고정 HCC 세포 1 X 106개를 0.5㎖들이 멸균 마이크로원심분리관에 넣고 "TOMY" 원심분리기에서 4℃에서 2K rpm 으로 30초간 원심분리하였다. 빙냉각한 200㎕의 70% EtOH를 가하고, 처리된 세포를 4℃에서 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 탈수단계를 반복한 다음, 시료를 연소적으로 85% 및 100% 빙냉각 EtOH를 사용하여 상기와 같이 원심분리 하였다.
세포를 원심분리하고 200㎕의 1 X 아세테이트 반응완충액(글리세롤을 함유하지 않은 것 이외에는, 표준 RecA 아세테이트 반응완충액과 동일)에 재현탁시키고, 원심분리한 다음, 동일 1 X 아세테이트 반응완충액(글리세롤 비함유)에 재현탁시켰다. 프로브 반응 혼합물을 첨가하기 직전에, 세포를 37℃에서 10분간 배양하고 실온에서 원심분리 후 상등액을 제거하였다.
비오틴-표지된 HBV-특이성 "BIOPROBE"를 Enzo Diagnostics, Inc.(New York NY)로부터 입수하였다. 이 니크-이동 프로브는 bio-11-dUTP로 비오티닐화 한 것이며, 전 HBV 게놈(adr4 혈청형태)을 함유하며 이중사슬 프로브 단편은 크기가 평균 250bp이다
제2프로브, pAM6는 ATCC로부터 입수하였다. pAM6는 플라스미드 pBR322중 전 HBV 게놈(adw 혈청형태)을 함유한다. pAM6는 실시예 6에 기술된 바와 같이 BRL 니크-이동계로 니크 이동에 의해 bio-14-dATP로 표지시켰다. 열변성 단일사슬 프로브는 크기가 평균 300 내지 500 염기이었다.
이들 양 HBV 프로브들은 반응액 10㎕에서 RecA 단백질로 코팅하였다. 상기 10㎕ 반응액은 1㎕의 10 X 아세테이트 반응 완충액(Cheng, et al., 1988), 1.5㎕의 3.24mM ATPγS, 0.75㎕의 20mM Mg(OAc)2, 0.53㎕의 5.5㎍/㎕ RecA 및 열변성 프로브를 함유한다[0.83㎕의 "BIOPROBE"(60ng/㎕)는 5.39㎕의 ddH2O에 존재하고, 5㎕의 pAM6 프로브(10ng/㎕)는 1.22㎕의 ddH2O에 존재). 프로브 코팅 반응물을 37℃에서 10분간 배양한 후, 0.5㎕의 0.2M Mg(OAc)2원액을 가한 다음, 프로브 믹스를 제조된 세포 펠렛에 가하였다.
제조된 프로브 믹스를 각각 첨가하여 세포 시료를 분리하고 37℃ 수욕상에서 2시간 동안 배양하였다. 250㎕의 1.75 X SSC(pH 7.4)를 37℃에서 첨가하여 반응을 중지시켰다. 각 시료를 혼합하고, 세포를 펠렛화 한 다음 상등액을 제거하였다. 250㎕의 1.75 X SSC를 첨가하고 시료를 37℃에서 5분간 배양하였다. 이 세정조작을 반복한 다음, 세포를 펠렛화한 후, 각 시료에 여과된 프리블록 300㎕를 가하였다. 시료를 실온에서 20분간 배양 시킨 후 세포를 펠렛화하고 프리블록을 제거하였다.
상기 시료에 여과된 프리블록중 5㎍/㎎ FITC-아비딘 90㎕를 가하였다. 시료를 실온 및 암소에서 20분간 배양하고 시료를 펠렛화한 후 상등액을 제거하였다. 각 시료에 250㎕의 4 X SSC를 가하고 시료를 온화하게 혼합한 다음, 세포를 펠렛화하였다. 상등액을 제거하고 250㎕의 4 X SSC+0.1% "트리톤X-100" 가하였다. 세포를 펠렛화하고 상등액을 제거한 후 펠렛을 풍건하고 20㎕의 퇴색방지제를 가하였다. Zeiss LSM을 사용하여 시료를 검사하였다.
제15a도 및 제15b도는 "BIOPROBE"를 사용한 상기 혼성한 결과를 나타낸 것이다 : 세포중 81%가 혼성화 시그널을 나타내었다. 제15c도 내지 제15e도는 pAM6 프로브를 사용한 상기 혼성화 결과를 나타낸 것이다 : 세포중 95%가 혼성화 시그널을 나타내었다.
[실시예 10]
[경쟁 혼성화로 시험된 인간 HCC 세포중 천연 형광 인 시튜 혼성화를 사용하는 HBV 표적체 검출의 특이성]
A. 경쟁 어세이용 프로브의 제조
BRL 니크-이동계를 사용하는 니트-이동에 의해 비오티닐화 되고, 비표지된 pAM6(ATCC) 및 φ X 174 RFI(New England Biolabs) 양 DNA를 제조하였다. 니트-이동은 비표지된 DNA를 생산하는 반응물이 bio-14-dATP 대신에 dATP를 함유한 것 이외에는, 근본적으로 실시예 6에 기술된 바와 같이 수행하였다.
각 경쟁반응에서는 1 X 106100% 메탄올 고정세포를 사용하고 비오티닐화된 pAM6 HBV 프로브 DNA 30ng 및 경쟁 DNA 240ng을 함유하였다. 비오티닐화된 HBV 프로브 DNA 및 비표지된 경쟁 DNA는 별도의 반응에서 RecA를 코팅하였다. RecA 코팅후, 각 반응물의 Mg++이온농도를 코팅 반응 10㎕당 0.2mM Mg(OAc)20.5㎕를 가하여 조정하였다. 그후, RecA-코팅된 bio-pAM6 프로브(DNA 30ng) 10.5㎕를 동 용적의 RecA-코팅된 경쟁 DNA(240ng)와 혼합하였다. RecA-코팅된 비오티닐화된 HBV 프로브 및 경쟁 DNA의 각 혼합물의 최종 용적은 21㎕이었다.
모든 비오티닐화된 pAM6 DNA를 RecA로 코팅하고 단일 반응용으로 제조하여, 이중 10.5㎕를 각 경쟁 실험에 사용하였다. 한 반응에서의 모든 비닐회된 pAM6 프로브의 코팅은 DNA 경쟁자들 이외에는 반응들간에 차이가 없는 것이 보증되었다. 적절한 RecA 코팅이 되기 위해서는, 양 프로브 및 경쟁 DNA 코팅반응물에는 RecA 대 뉴클레오티드가 동일한 평균비율(1 RecA 단백질 모노머 : 2 뉴클레오티드)로 함유되었다.
모든 비오티닐화된 pAM6 프로브를 4㎕의 10 X 아세테이트 반응 완충액(Cheng, et al., 1988), 6㎕의 3.24mM ATPγS, 3㎕의 20mM Mg(OAc)2, 3.16㎕의 2.2㎍/㎕ RecA 및 12㎕의 10ng/㎕ bio-pAM6 프로브(이것은 11.84㎕의 ddH2O에서 열변성 되지 않음)를 함유한 반응액에서 RecA를 코팅하였다.
각경쟁자 RecA DNA 프로브 믹스는 1㎕의 10 X 아세테이트 완충액, 1.5㎕의 3.24mM ATPγS, 0.75㎕의 20mM Mg(OAc)2, 1.25㎕의 11.05㎍./㎕ RecA 및 0.7㎕의 ddH2O 중 열변성된 50ng/㎕ 경쟁자 DNA(비-비오티닐화된 φ X 174 또는 비-비오티닐화된 pAM6) 4.8㎕, 또는 3.1㎕의 ddH2O에 열변셩된 50㎍/㎕ 비-비오티닐화된 태반 DNA("BLOCKIT"; ONCOR) 2.4㎕를 함유하였다.
모든 프로브를 100￠에서 5분간 열변성 시키고 약 20초간 빙수에 냉각시킨 후, 4℃에서 원심분리하여 액체를 모두 수집한 다음 이들 각 RecA 반응 혼합물에 즉시 가하였다.
프로브를 37℃에서 15분간 RecA로 코팅한 다음 10㎕의 DNA 혼합물 0.5㎕의 0.2M Mg(OAc)2를 가하였다.
B. 반응혼합물
-20℃ 저장 메탄올-고정 세포를 일련의 냉각 EtOH 세정액들로 탈수한 다음 이어서 1 X 아세테이트 반응 완충액(글리세롤 비함유)에 2회 세정하여 상기 실시예 9에 기술한 바와 같이 평광 인 시튜 혼성화를 위해 제조하였다. 완충액을 제거하기 전에, 세포를 37℃에서 10분간 마지막 세정 완충액 중에서 배양시키고, RecA-코팅되고 비오티닐화된 프로브 및 경쟁 DNA 혼합물 21㎍을 상기 세포 펠렛에 가하였다.
프로브를 37℃ 수욕중에서 3시간 동안 세포와 반응시키고, 37℃에서 250㎕의 1.75 X SSC(pH 7.4)를 가하여 반응을 중지시키고, 저어준 다음, 실온에서 원심분리하여 세포를 펠렛화 한 후, 상등액을 제거하였다. 세포를 37℃에서 5분간 250㎕의 1.75 X SSC로 2회 세정한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 여과된 프리블록 300㎕를 처리되고 세정된 세포에 가하고, 실온에서 20분간 배양하였다. 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 여과된 프리블록중 5㎍/㎖ FITC-아비딘 90㎕를 각 반응물에 가하고 암소 중 실온에서 20분간 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화한 후 FITC-아비딘을 제거하였다. 반응된 세포를 4 X SSC(pH 7.4)에 연속적으로 세정하고 세포들을 온화하게 혼합시키고, 다시 250㎕의 4 X SSC+01% "트리톤X-100" 및 250㎕의 4 X SSC에 세정하였다.
각기 세정후, 세포를 펠렛화하고 세정액을 제거하였다.
최종 세정후, 세포를 풍건하고 대략 20㎕의 퇴색방지제를 각 세포반응물에 가하였다. 세포를 슬라이드상에 놓고 카바슬립으로 덮은 다음 Zeiss LSM으로 검사하였다. 중간 내지 광택 혼성화 시그널(들)을 함유한 세포들을 혼성화에 대해 양성으로 기록하였다(표 1 참조).
[표 1]
[인간 HCC 세포중 HBV 형광 인 시튜 혼성화의 특이서]
a. 비-비오티닐화 됨.
b. 이들 세포중 4.5%가 매우약한 FITC 혼성화를 나타내었다. 다른 경쟁 DNA의 경우 FITC 시그널은 형광 현미경만을 사용하여 쉽게 관찰할 수 있었는데 비해, 이 시료의 경우 시그널은 488㎚ 아르곤-이온레이저 일루미네이션을 사용한 경우에만 단지 관찰할 수 있었다.
* 형광 인 시튜 혼성화
표 1에 제시된 결과는 이질성 DNA가 아니라, 단지 상동성 HBV DNA만이 비오티닐화된 HBV DNA 프로브 시그널과 특이적으로 경쟁한다는 것을 보여주고 있다.
제16a도 내지 제16c도에 나타난 세포는 표 1에 기술된 경쟁 시험에서 얻어진 것이다. 제16도에서 16A는 비오티닐화된 HBV+프로브+과량의 비표지된 HBV 프로브 DNA; 16B는 비오티닐회된 HBV 프로브+과량의 비표지된 φ X 174 DNA; 16C는 비오티닐화된 HBV 프로브+과량의 비표지된 인간 태반 DNA("BLOCKITTM"; ONCOR)를 나타낸다. FITC프로브 시그널은 레이저 주사형 Zeiss LSM으로 관찰하였다.
상기 HBV 프로브로부터 관찰된 FITC 시그널은 세포의 기 영상에 중첩된 것을 나타내었다. 각 시험에서 얻어진 수종 세포가 나타났다. 이로서 시그널 및 세포 영상으로부터 상동성 HBV DNA는 비오티닐화된 HBV DNA 프로브 시그널과 특이적으로 경쟁하나, 이질성 DNA는 경쟁하지 않는다는 것이 명백하다.
본 발명을 특정한 프로토콜 및 적용과 관련하여 설명하였으나, 본 발명의 범위내에서 본 발명은 다양하게 변경 및 변화시킬 수 있다는 것을 알수 있을 것이다.

Claims (49)

  1. 구조와 관련하여 한정된 형태학적 연관성을 가지며, 고정 세포 또는 아세포의 생물학적 구조체내에 함유된 이중사슬 핵산 중에서 공지된 표적서열의 존재를 확인하는 방법에 있어서, 상기한 구조체에, 복합체가 이중 핵산 표적체와 접촉할 수 있는 조건하에, 이중 표적서열에 상보적인 단일사슬이고, 리포터-표지된 프로브에 안정하게 결합된 RecA 단백질로 구성된 프로브 복합체를 가하는 단계와, 상기 복하체가 비변성 조건하에 상기 표적서열에 결합하도록 방치하는 단계와, 상기 구조체로부터 결합되지 않은 복합체를 제거하는 단계와, 그리고 상기 구조체를 검사하여 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브의 존재를 확인하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기한 복합체를 ATPγS, GTPγS, ATP, dATP 및 ATPγS와 ADP의 조합체로 이루어진 그룹에서 선택된 공인자에 의해 안정화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기한 프로브가 리간드 리포터로 표지되고, 상기한 검사단계는 구조체에, 상기한 리간드에 안정하게 결합하기에 효과적이며, 검출 가능한 리포터 그룹을 가지며, 항체를 포함하는 특이 리간드 분자를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 숙주 세포중 병원성(이(異)) 표적 이중 핵산서열의 존재를 검출하기위해, 상기한 복합체를, 숙주세포를 고정시킨 조건하에 세포에, 가하고, 상기한 검사단계는 상기한 고정세포중에 프로브-결합된 리포터의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기한 검사단계에서 현미경 또는 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여, 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브에 결합된 형광 리포터를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 숙주 세포 게놈에 통합된, 선별된 표적 이중 핵산서열을 국소화하기 위해, 상기한 복합체를 세포의 염색체에 가하고, 상기한 검사단계에서는 염색체를 현미경으로 검사하여 염색체의 초미소구조에 리포터-표지된 프로브의 상대위치를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기한 염색체가 제1의 형광 리포터로 표지되고, 상기한 프로브는 제2의 형광 리포터로 표지되며, 상기한 검사단계에서는 상기한 두 개의 리포터 각각에 있어 형광성을 여기하기에 효과적인 파장에서 따로따로 형광 현미경에 의해 세포들을 관찰하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 선별된 염색체내의 표적서열을 국소화하기 위해, 선별된 염색체의 기지 영역내에 있는 이중사슬에 상보적인, 단일사슬이고, 리포터-표지된 핵산 프로브에 안정하게 결합된 RecA 단백질로 구성된 제2프로브 복합체를 상기한 구조체에 첨가하는 단계를 더욱 포함하고, 상기한 검사단계에서는 두 복합체 각각에 연관된 리포터의 상대위치를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기한 제1복합체 및 제2복합체가 서로 상이한 형광 리포터로 표지되고, 상기한 검사단계에서는 두 개의 리포터 각각에 형광성을 여과하기에 효과적인 파장으로 따로 따로 형광 현미경에 의해 세포를 관찰하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기한 구조체에 첨가하기 전에, 표적 이중핵산을 증폭하는 단계가 더욱 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 폴리머라제의 첨가에 의해 표적체에 결합된 브로브와, 데옥시뉴클레오티드중 하나가 리포터 표지인, 4개의 모든 데옥시뉴클레오티드를 증폭시키는 단계가 더욱 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기한 고정된 구조체가 용액중 또는 슬라이드상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기한 고정 구조체에 RecA 프로브 복합체를 첨가하기 전에 이 구조체를 pH 7.5, 55 내지 60℃로 조절된 10mM 트리스-아세테이트 완충액 중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기한 복합체를 비변성 조건하에 표적서열에 결합하도록 방치하는 단계가, 2시간 미만으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기한 첨가단계가 보조단백질의 첨가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기한 보조단백질이 토포이소머라제 I 또는 토포이소머라제 II인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 고정 세포 또는 아세포의 생물학적 구조체내에 함유된 공지의 이중사슬 바이러스 핵산 표적서열의 존재를 확인하는 방법에 있어서, 상기한 구조체에, 복합체가 이중사슬 핵산 표적체와 접촉할 수 있는 조건하에, 이중사슬 바이러스 핵산 표적서열에 상보적인 단일사슬이고, 리포터-표지된 프로브에 안정하게 결합된 RecA 단백질로 구성된 프로브 복합체를 가하는 단계와, 상기 복합체가 비변성 조건하에 상기 표적서열에 결합하도록 방치 하는 단계와, 상기 구조체로부터 결합되지 않은 복합체를 제거하는 단계와; 그리고 상기 구조체를 검사하여 상기 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브의 존재를 확인하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기한 공지 바이러스 표적체가 B형 간염 바이러스로부터 유도된 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기한 고정 구조체에 RecA 프로브 복합체를 첨가하기 전에 이 구조체를 pH 7.5, 55 내지 60℃로 조절된 10mM 트리스-아세테이트 완충액 중에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기한 복합체를 ATPγS, GTPγS, ATP, dATP 및 ATPγS와 ADP의 조합체로 이루어진 그룹에서 선택된 공인자에 의해 안정화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기한 프로브가 리간드 리포터로 표지되고, 상기한 검사단계는 구조체에, 상기한 리간드에 안정하게 결하하기에 효과적이며, 검출 가능한 리포터 그룹을 가지는 특이 리간드 분자를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기한 리간드 리포터가 디곡시게닌 또는 비오틴이고, 상기한 리간드 분자는 항체, 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기한 검사단계에서 현미경 또는 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브에 결합된 형광 리포터를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 숙주 세포 게놈에 통합되, 선별된 표적 이중 핵산서열을 국소화하기 위해, 상기한 복합체를 세포의 염색체에 가하고, 상기한 검사단계에서는 염색체를 현미경으로 검사하여 염색체의 초미소구조에 대해 리포터-표지된 프로브의 상대위치를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 바이러스 핵산서열로부터 유도된 RecA-단백질 코팅된 DNA 프로브를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는, 제17항의 방법을 실시하기 위한 킷트.
  26. 제25항에 있어서, 상기한 프로브가 B형 간염 바이러스 서열로부터 유도된 것임을 특징으로 하는 킷트.
  27. 제25항에 있어서, 상기한 프로브가 리포터 표지된 것임을 특징으로 하는 킷트.
  28. 제27항에 있어서, 상기한 리포터가 비오틴 또는 디곡시게닌인 것을 특징으로 하는 킷트.
  29. 제25항에 있어서, 상기한 킷트가 시료중의 공지의 이중사슬 바이러스 핵산서열에 프로브가 결합하는 것을 검출하는 수단을 더욱 포함하고, 상기한 검출수단은 현미경 또는 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 핵산에 결합된 리포터 표지된 프로브에 결합된 형광 리포터를 검출하는 것을 포함함을 특징으로 하는 킷트.
  30. 제17항에 있어서, 상기한 고정된 구조체가 용액중 또는 슬라이드상에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제17항에 있어서, 상기한 복합체를 비변성 조건하에 표적서열에 결합하도록 방치하는 단계가 2시간 미만으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제17항에 있어서, 상기한 첨가제가 보조단백질의 첨가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기한 보조단백질이 토포이소머라제 I 또는 토포이소머라제 II인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 세포 또는 아세포의 생물학적 구조체내에 함유된 단일 카피 핵산 표적서열을 검출하는 방법에 있어서, 세포 또는 아세포의 생물학적 구조체를 고정하는 단계와; 상기한 구조체에, 복합체가 핵산 표적체와 접촉할 수 있는 조건하에, 단일 카피핵산 표적서열에 상보적인 단일사슬이고, 리포터-표지된 프로브에 안정하게 결합된 RecA 단백질로 구성된 프로브 복합체를 가하는 단계와; 상기 복합체가 비변성 조건하에 상기 표적서열에 결합하도록 방치하는 단계와; 상기 구조체로부터 결합되지 않은 복합체를 제거하는 단계와; 그리고 상기 구조체를 검사하여 상기 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브의 존재를 확인하는 단계로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기한 고정단계가 용액중 또는 슬라이드상에서 수해되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기한 고정단계가, pH 7.5, 55 내지 60℃로 조절된 10mM 트리스-아세테이트 완충액 중에서, 고정된 구조체의 배양을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, 상기한 복합체를 비변성 조건하에 표적서열에 결합하도록 방치하는 단계를 2시간 미만으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제34항에 있어서, 상기한 첨가단계가 보조단백질의 첨가를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기한 보조단백질이 토포이소머라제 I 또는 토포이소머라제 II인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제34항에 있어서, 상기한 복합체를 ATPγS, GTPγS, ATP, dATP 및 ATPγS와 ADP의 조합체로 이루어진 그룹에서 선택된 공인자에 의해 안정화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제34항에 있어서, 상기한 프로브가 리간드 리포터로 표지되고, 상기한 검사단계는 구조체에, 상기한 리간드에 안정하게 결합하기에 효과적이며, 검출 가능한 리포터 그룹을 가지는 특이 리간드 분자를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기한 리간드 리포터가 디곡시게닌 또는 비오틴이고, 상기한 리간드 분자는 항체, 아비딘 또는 스트렙트아비딘으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 방법.
  43. 제34항에 있어서, 상기한 검사단계가 현미경 또는 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 핵산에 결합된 리포터-표지된 프로브에 결합된 형광 리포터를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제34항에 있어서, 숙주 세포 게놈에 통합된, 선별된 표적 이중 핵산서열을 국소화하기 위해, 상기한 복합체를 세포의 염색체에 가하고, 상기한 검사단계에서는 염색체를 현미경으로 검사하여 염색체의 초미소구조에 대해 리포터-표지된 프로브의 상대위치를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 단일 카피 핵산서열로부터 유도된 RecA-단백질 코팅된 DNA 프로브를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는, 제34항의 방법을 실시하기 위한 킷트.
  46. 제45항에 있어서, 상기한 프로브가 p53 종양 억제 유전자 서열로부터 유도된 것임을 특징으로 하는 킷트.
  47. 제45항에 있어서, 상기한 프로브가 리포터 표지된 것임을 특징으로 하는 킷트.
  48. 제47항에 있어서, 상기한 리포터가 비오틴 또는 디곡시게닌인 것을 특징으로 하는 킷트.
  49. 제45항에 있어서, 상기한 킷트가 시료중의 단일 카피 핵산서열에 프로브가 결합하는 것을 검출하는 수단을 더욱 포함하고, 상기한 검출수단은 현미경 또는 형광 활성화된 세포 분류기를 사용하여 핵산에 결합된 리포터 표지된 프로브에 결합된 형광 리포터를 검출하는 것을 포함함을 특징으로 하는 킷트.
KR1019940700703A 1991-09-04 1992-09-03 인 시튜 혼성화 방법(in situ hybridization method) KR100245283B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US7/755,291 1991-09-04
US07/755,291 US5506098A (en) 1991-09-04 1991-09-04 In situ hybridization method
PCT/JP1992/001128 WO1993005177A1 (en) 1991-09-04 1992-09-03 In situ hybridization method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100245283B1 true KR100245283B1 (ko) 2000-03-02

Family

ID=25038542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019940700703A KR100245283B1 (ko) 1991-09-04 1992-09-03 인 시튜 혼성화 방법(in situ hybridization method)

Country Status (13)

Country Link
US (2) US5506098A (ko)
EP (1) EP0614492B1 (ko)
JP (1) JP2819830B2 (ko)
KR (1) KR100245283B1 (ko)
AT (1) ATE145674T1 (ko)
AU (1) AU664045B2 (ko)
CA (1) CA2116214C (ko)
DE (1) DE69215533T2 (ko)
DK (1) DK0614492T3 (ko)
ES (1) ES2094928T3 (ko)
FI (1) FI941015A (ko)
NO (1) NO940746D0 (ko)
WO (1) WO1993005177A1 (ko)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2101867T3 (es) * 1990-05-07 1997-07-16 Daikin Ind Ltd Aplicaciones diagnosticas de la formacion de lazos d dobles.
US20020108136A1 (en) * 1997-03-21 2002-08-08 Sri Transgenic animals produced by homologous sequence targeting
DE4216949C2 (de) * 1992-05-22 1997-07-24 Christoph Prof Dr Dr Cremer Nichtenzymatisches Verfahren zur In-situ-Hybridisierung bei spezifischen Proben
AU7401394A (en) * 1993-07-20 1995-02-20 University Of Massachusetts Medical Center In vivo nucleic acid hybridization method
EP0687738A4 (en) * 1993-12-28 1999-05-19 Daikin Ind Ltd IN SITU HYBRIDIZATION METHOD USING RECA PROTEIN, WHICH HAS A MARKER OR LIGAND FOR USE IN THIS METHOD
US5766891A (en) 1994-12-19 1998-06-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase
US5750340A (en) * 1995-04-07 1998-05-12 University Of New Mexico In situ hybridization solution and process
US6022689A (en) * 1995-04-07 2000-02-08 University Of New Mexico Situ hybridization slide processes
DE69730145T2 (de) 1996-08-29 2005-07-14 Tapestry Pharmaceuticals, Inc., Boulder VERFAHREN ZUM AUFFINDEN, NACHWEISEN, ANREICHERN UND/ODER ISOLIEREN VON ZIEL-NUcLEINSÄURESEQUENZEN UNTER VERWENDUNG VON VON RECA ÄHNLICHER REKOMBINASE
FR2755148B1 (fr) * 1996-10-31 1999-01-29 Calvo Fabien Procede destine a mettre en evidence l'etat d'une cellule maligne et procede de traitement
JP3891620B2 (ja) * 1996-11-14 2007-03-14 株式会社アイシン・コスモス研究所 ヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法
WO1998037231A2 (de) * 1997-02-22 1998-08-27 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Markierung von nukleinsäuren mit speziellen probengemischen
US5948653A (en) 1997-03-21 1999-09-07 Pati; Sushma Sequence alterations using homologous recombination
US5948617A (en) * 1997-06-13 1999-09-07 Biospeparations, Inc. Methods of in situ hybridization
US6194146B1 (en) 1997-06-13 2001-02-27 Bioseparations, Inc. Situ and in vitro hybridization method and buffer
CA2294465A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Life Technologies, Inc. Improved method for isolating and recovering target dna or rna molecules having a desired nucleotide sequence
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
DE69835342T2 (de) 1998-04-27 2007-08-23 Corning Inc. Verfahren zur Ablage von biologischen Proben mit Hilfe eines nachgezogenen Kapillarspeichers
US6350618B1 (en) * 1998-04-27 2002-02-26 Corning Incorporated Redrawn capillary imaging reservoir
US6884626B1 (en) 1998-04-27 2005-04-26 Corning Incorporated Redrawn capillary imaging reservoir
CA2332510C (en) * 1998-05-18 2011-07-26 Igenex, Inc. In situ hybridization method for detecting target nucleic acid
US6762061B1 (en) 1998-07-03 2004-07-13 Corning Incorporated Redrawn capillary imaging reservoir
WO2000014281A2 (en) 1998-08-21 2000-03-16 Naxcor Assays using crosslinkable immobilized nucleic acids
US6581011B1 (en) * 1999-06-23 2003-06-17 Tissueinformatics, Inc. Online database that includes indices representative of a tissue population
US6611833B1 (en) * 1999-06-23 2003-08-26 Tissueinformatics, Inc. Methods for profiling and classifying tissue using a database that includes indices representative of a tissue population
EP1210461A4 (en) * 1999-08-21 2005-11-23 John S Fox DETECTION WITH HIGH SENSITIVITY OF BIOMOLECULES USING MAGNETIC PARTICLES
US20010016317A1 (en) * 1999-09-13 2001-08-23 Dolores M. Berger Method for providing long term stability to cells for diagnostic testing
US20040224421A1 (en) * 2000-06-15 2004-11-11 Deweerd Herman Bi-directional scanning method
EP1172445A1 (en) * 2000-07-14 2002-01-16 Praenadia GmbH A method for direct genetic analysis of target cells by using fluorescence probes
AU2002303176A1 (en) * 2001-03-27 2002-10-15 University Of Delaware Genomics applications for modified oligonucleotides
US7468244B2 (en) * 2001-09-27 2008-12-23 University Of Delaware Polymorphism detection and separation
US20030175818A1 (en) * 2002-03-15 2003-09-18 Ross Amelia A. Devices and methods for isolating and recovering target cells
US7754155B2 (en) * 2002-03-15 2010-07-13 Ross Amelia A Devices and methods for isolating target cells
WO2003091455A1 (en) * 2002-04-23 2003-11-06 U.S.Genomics, Inc. Compositions and methods related to two-arm nucleic acid probes
US20040053399A1 (en) * 2002-07-17 2004-03-18 Rudolf Gilmanshin Methods and compositions for analyzing polymers using chimeric tags
US20040180345A1 (en) * 2003-03-14 2004-09-16 Ingeneus Corporation Pre-incubation method to improve signal/noise ratio of nucleic acid assays
ES2391975T3 (es) * 2003-07-25 2012-12-03 Genvec, Inc. Vacunas a base de vector adenovírico
WO2005012575A1 (en) * 2003-08-01 2005-02-10 U.S. Genomics, Inc. Methods and compositions related to the use of sequence-specific endonucleases for analyzing nucleic acids under non-cleaving conditions
JP2007529758A (ja) * 2004-03-19 2007-10-25 ユー．エス． ジェノミクス， インコーポレイテッド 単一分子の検出のための組成物および方法
EP1784493A2 (en) * 2004-09-01 2007-05-16 The Government of the United States of America as Represented by The Department of Health and Human Services Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation
KR100760525B1 (ko) 2006-04-13 2007-10-04 김재만 병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트 및 검출방법
WO2009009127A2 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 U.S. Genomics, Inc. Method and system for transferring and/or concentrating a sample
ES2399088T3 (es) 2007-11-01 2013-03-25 Perseid Therapeutics Llc Polipéptidos y ácidos nucleicos inmunosupresores
GB201010580D0 (en) 2010-06-23 2010-08-11 Reckitt Benckiser Nv Machine dishwashing compositions and methods
EP3847274A4 (en) * 2018-09-05 2022-06-08 Readcoor, LLC METHODS AND SYSTEMS FOR THERAPEUTIC AGENT ANALYSIS
JP2022535747A (ja) * 2019-05-28 2022-08-10 ケース ウエスタン リザーブ ユニバーシティ Ｄｎａのメチル化を保存するための組成物および方法
CN113741375B (zh) * 2021-09-18 2023-02-03 中国科学院近代物理研究所 重离子微孔膜专用生产终端控制系统

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985005685A1 (en) * 1984-06-01 1985-12-19 National Biomedical Research Foundation Catalyzed nucleic acid hybridization using enzymatic reagent
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4888274A (en) * 1985-09-18 1989-12-19 Yale University RecA nucleoprotein filament and methods
AU6403886A (en) * 1985-09-18 1987-04-07 Yale University Reca nucleoprotein filament and methods
EP0322311B1 (en) * 1987-12-21 1994-03-23 Applied Biosystems, Inc. Method and kit for detecting a nucleic acid sequence
ES2101867T3 (es) * 1990-05-07 1997-07-16 Daikin Ind Ltd Aplicaciones diagnosticas de la formacion de lazos d dobles.
US5223414A (en) * 1990-05-07 1993-06-29 Sri International Process for nucleic acid hybridization and amplification

Also Published As

Publication number Publication date
EP0614492A1 (en) 1994-09-14
NO940746L (no) 1994-03-03
AU664045B2 (en) 1995-11-02
JPH06510200A (ja) 1994-11-17
DE69215533T2 (de) 1997-03-20
DK0614492T3 (da) 1997-06-02
WO1993005177A1 (en) 1993-03-18
ATE145674T1 (de) 1996-12-15
CA2116214A1 (en) 1993-03-05
JP2819830B2 (ja) 1998-11-05
US5506098A (en) 1996-04-09
AU2500792A (en) 1993-04-05
FI941015A (fi) 1994-05-03
EP0614492B1 (en) 1996-11-27
US5719023A (en) 1998-02-17
NO940746D0 (no) 1994-03-03
DE69215533D1 (de) 1997-01-09
CA2116214C (en) 1998-12-22
ES2094928T3 (es) 1997-02-01
FI941015A0 (fi) 1994-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100245283B1 (ko) 인 시튜 혼성화 방법(in situ hybridization method)
JP5579999B2 (ja) ヒト第２０染色体の２０ｑ１３領域における新規アンプリコンおよびその使用
JP4226078B2 (ja) 分子コーミングによる遺伝病の診断法および診断用キット
JP3871066B2 (ja) 正常部位抑制ハイブリダイゼーシヨンおよびその使用
JP4338783B2 (ja) 核酸アレイへの比較蛍光ハイブリダイゼーション
US5985549A (en) Non-isotopic in-situ hybridization method for detection of nucleic acids
US5965361A (en) In-situ hybridization method using RecA protein and RecA protein having marker or ligand for use in said method
US6203977B1 (en) Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization
JP2015508995A (ja) 核酸ハイブリダイゼーションプローブ
JP6284487B2 (ja) 膀胱癌の診断及びその再発のモニタリングのための材料及び方法
JP2002538838A (ja) 黒色腫の検出
Carter Fluorescence in situ hybridization—state of the art
WO2009029937A2 (en) Methods and assays for screening stem cells
EP2843047B1 (en) Nucleic acid detection method
JP2002541826A (ja) 悪性黒色腫由来のメラニン細胞母斑を区別するための染色体コピー数の変化の検出
JP2010004873A (ja) 核酸マイクロアレイを用いた解析方法
JP3401722B2 (ja) 核酸ハイブリッド形成アッセイにおける、またはそれに関する改良
Smajkan Applications of Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Morrison Detection of Genomic Abnormalities by Fluorescence in Situ Hybridization
Schwanitz et al. Fluorescence in situ hybridization
Schoumans et al. Laboratory methods for the detection of chromosomal abnormalities
Speel et al. Primed in situ nucleic acid labeling combined with immunocytochemistry to simultaneously localize DNA and proteins in cells and chromosomes
KEARNEY Detection of genomic sequences by fluorescence in situ hybridization to
Basic PROTOCOL LIST
Isa Optimization and Application of Chromosome In Situ Suppression Hybridization.

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20041001

Year of fee payment: 6

LAPS Lapse due to unpaid annual fee