JP2819830B2 - インサイチューハイブリダイゼーション法 - Google Patents

インサイチューハイブリダイゼーション法

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、1991年９月４日に出願され、共に所有さ
れ、係属中の同種出願米国出願第07/755,291号の一部継
続出願である。
1.発明の分野 本発明は、二本鎖のDNA標的とインサイチューハイブ
リダイゼーションを行なう診断方向に関する。
2.参照文献 Alexandrov,S.P.M.ら,Chromosoma,96:443（1988）． Baan,R.A.ら,Prog Clin Biol Res 340A:101（199
0）． Blum,H.E.ら,Lancet,771（1984）． Blum,H.E.ら,Virology,139:87（1984）． Buchbinder,A.ら,J of Virol Methods,21:191（198
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ーブと、生物構造、代表的には透過性を高めた細胞、細
胞下画分（subcellular）、または固定された染色体調
製物中のDNAまたはRNAとの直接ハイブリダイゼーション
を使用する。この方法は、固定された生物構造中の特定
の配列標的核酸類の局在についての形態学的な情報を生
じ得、発生生物学、細胞生物学、遺伝学および特に遺伝
子マッピング、病理学および遺伝子診断法などの生体臨
床医学研究の多くの分野に適用し得る。
大部分の使用において、インサイチューハイブリダイ
ゼーションは二本鎖二重鎖（duplex）の核酸、代表的に
は病原体に、または、ウイルスまたは細胞の染色体DNA
中の選択された配列に関連する二本鎖DNAに含まれる標
的配列中の標的配列に向けられる。この方法では、従来
から実施されたように、一本鎖のラベルされたプローブ
を、標的二重鎖核酸を変性するのに十分な温度まで加熱
された、上記透過性を高めた構造に添加し、このプロー
ブおよび変性した核酸を、適切なハイブリダイゼーショ
ン、または、リアニーリング条件下で反応させる。未結
合（ハイブリダイズしなかった）のプローブを除去した
後、前記構造は、レポーターラベルの存在を検査するの
に処理され、標的二重鎖核酸にプローブが結合する部位
を、生物構造で、即ち、細胞または細胞下形態の状況
で、局在化させる。
この方法は、特定遺伝子配列の位置のマッピングおよ
び既知の遺伝子配列間の距離のマッピング（Lichter、M
eyne、Shen）、サテライトDNAまたは反復DNAの染色体上
分布（Weier、Narayanswami、Meyne、Moyzis、Joseph、
Alexandrov）の研究、核組織の検査（Lawrence、Distec
he、Trask）、染色体異常の解析（Lucas）、単一細胞類
または組織中のDNA損傷の局在化（Baan）およびフロー
サイトメトリー分析による染色体含量の測定（Trask）
など、染色体DNAに広く適用されている。宿主細胞染色
体に組み込まれたウィルス配列の局在化に関して幾つか
の研究が報告されている（例えば、Harders、Lawrenc
e、Lichter、Korba、Simom）。この方法はまた、断面化
された核の三次元的再構築により（van Dekken）、そし
て、間期染色体トポグラフィーを研究するためのデジタ
ルイメージ分析を用いる、水銀処理されたおよびビオチ
ン化されたプローブを用いた二重のインサイチューハイ
ブリダイゼーションにより（Emmerich）、染色体の位置
を研究するのに使用されている。
インサイチューハイブリダイゼーション法の別の一般
的な使用としては、診断手段として、宿主細胞中のウイ
ルスの存在の検出がある（Unger、Haase、Noonan、Nied
obitek、Blum）。感染された細胞中のウイルス粒子の数
が非常に少ない特定の場合は、インサイチューで採用さ
れたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法によって最初にウ
イルス配列を増幅することが必要であり得る（Hasse、1
990、Buchbinder）。
上記のインサイチューハイブリダイゼーション法は多
くの制約を有する。最も重大な制約は、二重鎖標的DNA
を変性する必要がある点にあり、該標的の一本鎖形態を
形成する必要がある。変性は代表的には、試料を加熱す
ることにより、または、化学薬剤および加熱を用いて処
理することにより行われる。この加熱処理は、DNA内の
構造変化及び反復配列間の核酸再結合に関連する、予期
できない見せかけのおよび望ましくない変化を検出され
る核酸中に生じ得る。この反復配列は互いにランダムに
再結合しうる。この工程はまた、この方法において必要
な時間および労力を付加する。
第２に、目的の標的配列が極めて低コピー数で存在す
る場合は、この方法は、復元動力学によって、長い復元
時間に制約される。その時でさえ、この方法は、低標的
濃度でプローブ／標的復元反応を生じ得ない。この制約
は、上記のように、最初に改変されたPCR法により、イ
ンサイチューで標的二重鎖を増幅することによって、部
分的には克服し得る。しかし、PCRアプローチは、付加
的な工程を含み、そしてゲノム染色体DNA配列の局在化
を含むインサイチュー研究のような、多くのインサイチ
ュー研究には不適切である。
4.発明の要旨 本発明の一般的な目的は、それ故、固定された生物構
造で、標的核酸、代表的には二重鎖DNAを検出する工程
および／または局在化する工程で使用する、インサイチ
ューハイブリダイゼーション法を提供することにあり、
該方法は、（ａ）標的二重鎖の熱変性を必要とせず、そ
して（ｂ）再生動力学によって標的二重鎖コピー数で制
限されない。
本発明は、細胞または細胞下の生物構造中に、該構造
と特定の形態学的関係で含まれた二本鎖核酸中の既知の
標的配列の存在を同定する方法を包含する。この方法
は、該構造に、二重鎖標的配列の鎖の一方に相補的な、
レポーターでラベルされた一本鎖核酸プローブに安定に
結合されたRecAタンパク質からなるプローブ複合体を、
この複合体が二重鎖核酸と接触し得る条件下で添加する
工程を包含する。上記複合体は、非変性条件下で標的配
列に結合し得る。未結合の複合体を除去する工程の後、
上記構造は、核酸に結合されたレポーターでラベルされ
たプローブの存在を検査される。
前記複合体は、好適には、ATPγＳの存在下の調製に
よって安定化される。プローブは、放射性ラベル、酵素
または蛍光タグのような検出可能なレポーターを用い
て、または、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような、
続いてリガンドに特異的なレポーター分子と反応し得、
そして検出可能なレポーターを有するリガンドを用いて
ラベルされ得る。上記複合体はまた、ATPγＳ、GTPγ
Ｓ、ATP、dATP、およびATPγＳとADPとの組み合せを含
み、しかしこれに限定されず、他のコファクターを用い
て安定化され得る。
一つの一般的な適用において、本発明の方法は、分裂
中期拡散物（metaphase spreads）中の固定された染色
体DNA構造中のゲノム配列の検出および局在に用いられ
る。一つの実施態様において、染色体の顕微鏡的超微細
構造が、例えば、蛍光バンディングパターンを用いる蛍
光顕微鏡使用により測定され得る。次いで、既知の超微
細構造に関係して結合した複合体の位置は、例えば、染
色体バンディング蛍光励起波長と異なる励起波長を有す
る蛍光ラベルされたプローブ複合体により独立に測定さ
れる。あるいは、固定された細胞または細胞構造類は、
懸濁液中でプローブされ、フローサイトメーターまたは
顕微鏡分析される。
別の一般的な使用において、本発明の方法は、宿主細
胞中のウィルスまたは組み込まれたウィルス特異的なゲ
ノム配列の存在を検出するのに使用し得る。このウィル
ス配列への蛍光ラベルされたプローブの結合は、蛍光顕
微鏡使用、または、蛍光活性化細胞ソーティング（FAC
S）、または、光学または蛍光またはレーザー走査顕微
鏡により測定され得る。酵素ラベルが使用される場合、
光学顕微鏡が、レポーター酵素により生成され、着色さ
れた（例えば、黒）ペルオキシダーゼまたはアルカリホ
スファターゼ生産物を可視化するのに使用され得る。
本発明の別の実施態様は、固定された細胞または細胞
下生物構造中に含まれる既知のウィルス核酸標的配列の
存在を同定する方法を包含する。そのような既知のウィ
ルス核酸標的類は、既知のDNAウィルス（Ｂ型肝炎ウィ
ルスのような）またはそのライフサイクル中の検出可能
な二重鎖核酸フェーズを有し得るRNAウィルスを含む。
この方法では、固定された構造類または細胞下構造類
は、反応効率を増加するために、前記RecAプローブ複合
体の添加前に、pH7.5の10mMトリス−酢酸緩衝液中、55
−60℃でインキュベートされ得る：この工程は、細胞DN
Aを変性しない。
本発明はまた、単一コピー核酸配列、代表的には、細
胞または細胞下生物構造に含まれる二重鎖DNA配列を検
出する方法を包含する。この方法では、細胞または細胞
下生物構造が固定される。プローブ複合体（単一コピー
の核酸標的配列に相補的な、一本鎖の、レポーターでラ
ベルされたプローブに安定に結合したRecAタンパク質か
らなる）を、この複合体が前記核酸標的配列と接触し得
る条件下で、細胞構造または細胞下構造に添加される。
前記複合体は、次いで、非変性条件下で標的配列に結合
させる。非結合の複合体は、次いで前記構造から除去さ
れ、そしてこの構造は、核酸配列に結合されたレポータ
ーラベルされたプローブの存在を検査される。
単一コピー核酸検出するこの方法において、細胞構造
または細胞下構造は、溶液中またはスライドガラス上で
固定されそして分析され得る。この固定はまた、55−60
℃で、固定された細胞構造または細胞下構造の、pH7.5
の10mMトリス−酢酸緩衝液中でのインキュベーションを
包含し得る。本発明の方法において、前記複合体は、２
時間以下で行われる反応中で、非変性条件下で標的配列
に結合され得る。
本発明の方法はまた、一本鎖結合タンパク質（SS
B）、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼIIの
ようなアクセサリータンパク質の添加を包含し得る。
本発明はまた、上記方法を実行するのに有用な成分を
含むキット類を包含する。試料中の既知のウィルス核酸
のインサイチュー検出のキットの一例は、（ｉ）このウ
ィルスDNA配列に由来するプローブ、（ii）このプロー
ブをコーティングするために有効なRecAタンパク質、そ
して（iii）試料中の既知のウィルスDNAへのプローブの
結合を検出する手段を含有し得る。そのようなキット類
はまた、RecAタンパク質でコートされたDNAを含有し得
る。
本発明の、これらのおよび他の目的および特徴は、以
下の発明の詳細な説明を、付属の図面と組み合わせて読
んだときに、より充分に明らかになり得る。
図面の簡単な説明 図1Aおよび1Bは、ネイティブな非変性の（1A）および
熱変性された（1B）メタノール−酢酸固定された間期HE
p−２細胞核中の、脱コンデンスされたまたは部分的に
脱コンデンスされたアルファサテライト染色体セントロ
メアDNA標的配列の検出に使用された、Ｘ染色体アルフ
ァサテライトDNAプローブの蛍光顕微鏡写真である； 図2Aおよび2Bは、間期HEp−２細胞中のネイティブな
非変性の（2A）および熱変性された（2B）固定核中の脱
コンデンスされた染色体セントロメアDNA標的配列の検
出に用いられた、第７染色体へのアルファサテライトDN
Aプローブの蛍光顕微鏡写真である； 図3Aおよび3Bは、蛍光顕微鏡（3A）および位相顕微鏡
（3B）検鏡下、同一焦点で撮られた顕微鏡写真を示し、
固定された分裂中のHEp−２細胞核中のＸ染色体アルフ
ァサテライトDNAの分布を示す。
図4A−4Dは、本発明の方法を用いる、染色体上の遺伝
子局在化のための工程を図示する； 図５−10は、種々のタイプの染色体異常（上部フレー
ムＡ）、およびそのような異常で見られるであろう、対
応する蛍光パターンを示し（下部フレームＢ）；そして 図11A−11Cは、蛍光活性化された細胞ソーティングに
よる、本発明の細胞のウィルス感染を検出する工程を図
示する。
図12は、ヒト第１染色体アルファサテライトセントロ
メア配列への、RecAコートされたビオチン化されたニッ
クトランスレートされたプローブとハイブリダイズし
た、固定されたHEp−２分裂中期染色体からのハイブリ
ダイゼーションシグナルを示す細胞調製物の写真を示
す。
図13Aから13Fは、懸濁液中の、ATCC HEp−２およびHC
C“Alexander"細胞中の、唯一つのp53染色体17腫瘍サプ
レッサー遺伝子配列の、RecAが介在したネイティブの蛍
光インサイチューハイブリダイゼーション検出を示す。
図14Aから14Dは、スライド上の、ATCC HEp−２細胞核
中の、唯一つのp53遺伝子配列の、RecAが介在したネイ
ティブの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション検
出を示す。
図15Aから15Eは、懸濁液中の、ATCC HCC“Alexander"
細胞中のＢ型肝炎ウィルス（HBV）核酸配列の、RecAが
介在したネイティブの蛍光インサイチューハイブリダイ
ゼーション検出を示す。
図16Aから16Cは、競合ハイブリダイゼーションにより
試験されたヒトHCC細胞中の、RecAが介在したネイティ
ブの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション検出を
用いるHBV標的検出の特異性を示す。
6.発明の詳細な説明 I.インサイチューハイブリダイゼーション法 このセクションでは、繰り返し、または、唯一の特定
の塩基対配列を有する、二重鎖DNA標的を含む種々の生
物構造類に適用されるものとして、本発明による、イン
サイチューハイブリダイゼーションの基本的な方法論を
記載する。
A.DNA検出のための生物構造類の調製 本発明の方法は、相補的塩基対ハイブリダイゼーショ
ンによって、二重鎖核酸、通常、DNA/DNA二重鎖核酸を
含む生物構造中の選択された標的配列を検出するために
デザインされる。生物構造は、標的核酸配列を含む、細
胞、精子、寄生体、細胞下画分または染色体調製物のよ
うな、任意の形態的に明瞭な構造である。
この構造中の標的二重鎖は、代表的には、染色体DN
A、または、包膜化されたまたはウィルスコートタンパ
ク質中に包膜化されている状態から遊離したウィルス二
重鎖ゲノムからなるウィルス粒子のような、ウィルス、
寄生体または細菌病原体に関連した核酸二重鎖物質であ
る。細胞、核、および染色体調製物のような、固定され
た生物構造類を調製する方法は、通常、DNA二重鎖の変
性およびリアニーリングによる従来のインサイチューハ
イブリダイゼーションで使用される方法に従う。
要約すれば、細胞区画およびDNA構造は、そのままの
形態学的関係で、構造成分を固定するために、有機溶媒
そして酸または架橋剤を用いる処理により、さらに固定
されまたは透過性を高められ得る。常用の固定化剤は、
酢酸、塩類、メタノール、ホルマリン、パラホルムアル
デヒド、そしてグルタルアルデヒドを包含する。固定
後、組織試料は、ワックス中に包埋することによりまた
は凍結することにより、次いで、薄いスライスに分割す
ることにより、スライド形態で調製され得る。
より一般的に、生物材料は、前記構造を除タンパク質
化するおよび／または脱脂肪化し得る多くの薬剤の一つ
または一つ以上で処理される。このような方法は、プロ
テアーゼ、リパーゼ、酸、アルコール類を含む有機溶
媒、界面活性剤類または熱変性またはこれら処理の組み
合せの使用を含み得る。常用の処理は、メタノール：酢
酸を用いる一回または一回以上の洗浄を含む。
核酸の非特異的結合のインヒビターの使用のような、
他の前処理が、バックグラウンドを減少することにおい
て有用であり得る。例えば、非特異的なキャリアDNA
（例えば、サケ精子）、またはRNA（例えば、tRNA）を
用いるプレハイブリダイゼーションが、固定されたDNA
−標的構造への非特異的プローブ結合を減少するために
作用し得る。
目的の細胞構造は、例えば、細胞培養、組織切片また
は体液中に存在する細胞から得られた個々の細胞であり
得る。代表的には、組織からの細胞構造は、冷凍して薄
片にされ、次いで、上記のように、メタノール：酢酸を
用いた処理による等で、スライド上で処理され、薄片の
透過性を高める。細胞構造は、ゲノム標的配列の細胞内
局剤化を測定するために、または、細胞内のウィルス、
細菌、または寄生体などの感染性生物の存在および／ま
たは局在化を検出するために研究され得る。
核およびミトコンドリアなどの細胞下構造は、等密度
遠心分離のような従来の分画法により調製され得、濃縮
されてまたは実質的に精製された形態で細胞下構造を得
る。その後、濃縮された構造調製物は、上記のように、
透過性を高められ得、そして除タンパク質化され得、溶
液中でまたは乾燥することによりなどのようにスライド
ガラスに固着されてプローブされ得る。
あるいは、細胞は、75mM KCl、次いで、メタノール：
酢酸で処理することにより前処理され得、細胞質を除去
する。この画分は、精製後、さらにプローブハイブリダ
イゼーションのために処理され得る。この方法は、イン
サイチューハイブリダイゼーションのためのHEp−２細
胞核の調製のための実施例３−４および12−14に説明さ
れている。
要約すれば、これらの実施例では、HEp−２細胞を低
速遠心分離によりペレット化し、そしてこのペレットを
75mM KCl中に５分から15分間、所望の量の核膨潤を起こ
すために懸濁され、次いで、氷冷したメタノール：酢酸
を添加し、遠心分離する。通常、さらに氷冷したメタノ
ール：酢酸の添加および各添加の後の細胞の穏和な撹
拌、次いで、引き続く遠心分離で、細胞質は核から除去
された。得られた単離された核調製物を、メタノール：
酢酸中に再懸濁し、顕微鏡スライドガラス上の10μｌア
リコート中に置き、乾燥し、そしてこのスライドガラス
を後に使用するため−20℃で保存した。あるいは、細胞
は、標準条件を用いて集められ得、１×リン酸緩衝液
（PBS）中で洗浄され得、そして100％メタノールまたは
70％メタノール中で固定され、次いで、−20℃で保存し
得る：これらの細胞は、溶液ハイブリダイゼーション検
出反応で使用し得る。
一般的な目的の別の構造は、代表的には、分裂中期の
細胞に由来する固定された染色体調製物である（Pinke
l、Cherif）。この調製物は、図1Aおよび1B中の調製物
のような細胞、または、公開された方法（Lebo、McCorm
ick）または染色体フラグメントにより得られ得るよう
な、個々の単離された染色体からの完全なセットのゲノ
ム染色体を含有し得る。この染色体は、一般に、メタノ
ール：酢酸で処理され得、スライドガラス上に置かれ
得、次いで、乾燥することにより、スライドガラス上に
固着される。
ミトコンドリアのような種々の他の細胞下構造、また
は、ビリオン粒子のような細胞または血液試料から単離
された寄生体を含む病原性構造はまた、標準方法に従っ
て調製され得、そして固定されそして上記のようにイン
サイチューハイブリダイゼーションのために透過性を高
められ得る。
B.標的特異的DNAプローブ 本発明の方法で使用されたプローブは、一本鎖の核酸
で、通常DNA鎖プローブ、または二重鎖プローブの変性
に由来し、それは、標的二重鎖核酸の一方（または両
方）鎖に相補的である。プローブ配列は、好適には標的
配列と少なくとも90−95％配列相同性を含み、プローブ
および標的の配列特異的ハイブリダイゼーションを確実
にする。一本鎖プローブは、より短い、または、より長
いポリヌクレオチドプローブを使用し得るが、代表的に
は、約100−600塩基長である。
プローブは、多くの標準法の一つにより構築または得
られ得る。種々のサテライトDNA配列のような多くのプ
ローブが一本鎖または二本鎖形態で市販されている。他
のプローブが、ウィルス、プラスミドおよびコスミドま
たは特定配列を担持する他のベクターから直接、また
は、所望ならば、ベクターのようなプローブDNAの供給
源から制限酵素消化、次いで、特定制限酵素消化フラグ
メントの電気泳動的単離により得られ得る。このように
して得られたプローブは、代表的には、二本鎖形態であ
るが、必要ならば、M13ファージベクターのような一本
鎖ベクター中にサブクローンされ得る。
あるいは、上記プローブは、オリゴヌクレオチド合成
法により一本鎖形態で調製され得るが、この方法では、
より長いプローブについては、プローブのサブフラグメ
ントを形成し、次いで、サブフラグメンを一緒につなぎ
あわせることが必要である。
上記プローブは、レポーターまたはリガンドまたはイ
ンサイチューに標的された配列の検出を可能にする部分
でラベルされる。オートラジオグラフィー検出には、レ
ポーターは、例えば、ラベルされたヌクレオチドの存在
下でニックトランスレーションまたはポリメラーゼ連鎖
反応により形成された32P−ラベルされたプローブのよ
うな放射性ラベルである。
蛍光検出には、プローブは、490、540、および361nm
のような特定波長で励起可能な、FITC、BODIPY 、Texa
s Red 、またはCascade Blue のような蛍光基の選択
の一つでラベルされ得る。これらの基は、３′または
５′プローブ末端にまたは標準法（Urdea、Keller、Zis
chler）に従い、内部位置で取り込みまたは反応によっ
て誘導体化される。
あるいは、プローブは、ビオチン（Weier）、ジゴキ
シゲニン（Zischler）、または、ブロモデオキシウリジ
ン（BrdUrd）またはフルオレセイン−11−dUTP（Boehri
nger−Mannheim）（Kitazawa）を含む他の修飾塩基のよ
うな、リガンドタイプレポーターでラベルされ得る。プ
ローブレポーター基は、ハイブリダイズされたプローブ
の第２のレポーター分子との反応によりインサイチュー
に検出される。このレポーター分子は、（ａ）プローブ
リガンドに特異的におよび高い親和性で結合し、そして
（ｂ）検出可能なレポーターを含む。第２の分子の結合
性部分は、ビオチン化されたヌクレオチドへの結合に
は、アビジンまたはストレプトアビジン、ジゴキシゲニ
ンでラベルされたヌクレオチドへの結合には、抗ジゴキ
シゲニン抗体、そしてBrdUrdでラベルされたプローブへ
の結合には、抗BrdUrd抗体であり得る。
第２の分子中の検出可能なレポーターは、代表的に
は、蛍光ラベルであり、しかしまた、オートラジオグラ
フ検出には、放射性ラベル、適切な基質の存在下での比
色または化学ルミネセンス検出には、抗体、酵素、また
は、電子顕微鏡可視化には、clloidal gold（Narayansw
ami）であり得る。
C.RecAおよび変異体RecA803タンパク質の精製： 本発明で使用されるRecA/プローブ複合体を形成する
のに用いるRecAおよびRecA803タンパク質は、好適に
は、E.coli JC12772およびJC15369株（A.J.Clarkおよび
M.Madirajuから得た）のような過剰生産株から単離され
る。これらの株は、RecAコーディング配列を、細胞あた
り高コピー数で存在する“runaway"複製プラスミドベク
ター上に含む。RecA803タンパク質は、野生型RecA（Mad
iraju）の高活性変異体である。
RecAタンパク質は、Pharmacia社から購入し得、また
はヒドロキシアパタイトカラム上の高速タンパク質液体
クロマトグラフィー（FPLC）次いでアニオン（Mono
Ｑ）交換カラムを用いて精製し得る。単離手法は、公
開された手法（Shibataら、Griffith）の組み合せおよ
び改変である。詳細は、実施例１で提供される。
タンパク質精製をモニターする標準アッセイは、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）（Pharmaci
a Phastgelsystem）による38,000ダルトンRecAタンパク
質のアッセイ、［γ−32P］ATPおよび0.5MLiClおよび0.
25Mギ酸溶媒中で展開されたPEIセルロース薄層クロマト
グラフィーを用いるssDNA依存性ATPアーゼ活性の酵素ア
ッセイ、DNアーゼのアッセイ、500マーオリゴヌクレオ
チドプローブを用いるＤ−ループ活性のアッセイを包含
する。
SDS−PAGE（変性条件）による、JC12772およびJC1536
9細胞抽出物からの全タンパク質の分析は、38,000ダル
トンRecAタンパク質が、これら株で産生された主要タン
パク質であることを示す。
最終のMono−Ｑ−精製されたRecAおよびRecA803タン
パク質のSDS−PAGEプロフィールは、銀染色により検出
されたように、他の細胞ポリペプチドのない、単一の3
8,000ダルトンのバンドを示した。
D.RecA DNAプローブ複合体の調製 目的の生物構造中の二重鎖核酸は、一本鎖プローブに
安定に結合したRecAタンパク質からなるプローブ複合体
と反応する。この複合体は、好適には、ATPγＳの存在
下で安定化された形態で調製される。
プローブのRecAタンパク質コーティングは、通常、実
施例２に詳細に記載されたように行われる。要約すれ
ば、プローブは、二本鎖または一本鎖にかかわらず、95
−100℃で５分間加熱することにより変性され、次いで2
0秒から１分間氷浴中に置かれ、その後、使用前に約20
秒間０℃で遠心分離される。変性されたプローブは、−
20℃でフリーザー中に保存し得る；しかしながら、好適
には、それらは、直ちに、室温で、ATPγＳを含む標準R
ecAコーティング反応緩衝液に添加され、そしてこれにR
ecAタンパク質が添加される。
プローブのRecAコーティングは、37℃で10−15分間、
プローブRecA混合物をインキュベートすることにより開
始する。プローブとの反応の間、試験されたRecAタンパ
ク質濃度は、プローブサイズおよび添加されたプローブ
の量に依存し、そして好適には、約２から25μＭの間の
範囲にある。一本鎖プローブが、その相同プローブ鎖と
は独立にRecAコートされるとき、ATPγＳおよびRecAのm
MおよびμＭ濃度は、それぞれ、二本鎖プローブで使用
されたそれらの半分に減少し得る（即ち、RecAおよびAT
PγＳ濃度比は、通常、一本鎖または二本鎖プローブが
使用されるか否かに依存し、個々のプローブ鎖の特定濃
度で一定に保たれる）。
E.透過性を高めた生物構造へのプローブハイブリダイゼ
ーション 本発明の重要な特徴に従って、RecA/プローブ複合体
に、生物構造中に含まれる標的二重鎖への配列特異的結
合は、この構造に、非変性条件下、即ち、二重鎖DNAの
変性温度以下で、プローブ複合体を添加する工程によ
り、そして該標的二重鎖に該複合体を、代表的には、１
−４時間、37℃でプローブ複合体の標的DNA配列への相
同結合が起こるまで接触させる工程により達成される。
標的DNA配列へのプローブ結合の後、標的構造は洗浄
され非結合のプローブ複合体を除去する。通常の場合で
は、プローブレポーターがビオチンのようなリガンドで
あるとき、洗浄された前記構造は、蛍光ラベルされたア
ビジン（FITC−アビジン）のような検出可能なレポータ
ー分子と接触され、検出可能なレポーターを標的に結合
したプローブに結合する。試料物質は、次いで、非結合
のレポーター分子を除去するためにさらに洗浄される。
種々の洗浄手法が適切である。前記構造は、例えば、以
下に記載されたように、可視化され、または顕微鏡によ
り、蛍光活性化された細胞ソーティング、オートラジオ
グラフィーなどにより観察または検出される。
ビオチン化されたプローブの蛍光レポーター検出にお
ける使用のための、実施例３に記載されたハイブリダイ
ゼーション条件は例示である。要約すれば、10−20μｌ
の間のプローブ複合体が、スライドガラス上の固定され
た調製物に適用される。ハイブリダイゼーション領域の
上にカバーガラスを置き、そしてシールし、そして反応
物は37℃７％CO2インキュベーター中、湿潤コンテナ中
で、１−４時間インキュベートされる。インキュベーシ
ョンに続き、カバーガラスラバーセメントシールを除去
し、そしてスライドガラスをカバーガラスと共に数回洗
浄し、カバーガラスを緩めそしてカバーガラスを除去
し、そして非結合のプローブ複合体を除去する。
スライドガラスを、前ブロック溶液中に置き、次いで
（ａ）暗所中で前ブロック溶液中でFITC（フルオレセイ
ンイソチオシアネート）−アビジンに浸漬または適用
し、次いで、数回洗浄して非結合のFITC−アビジンを除
去する。抗退色剤を、ヨウ化プロビジウムのようなカウ
ンター染色と共にまたはカウンター染色剤なしで、光退
色を防ぐために使用し得る。
必要であれば、スライド上の材料を、標的二重鎖に結
合する蛍光シグナルの量を増加させるために、ビオチン
化された抗アビジン抗体と反応させた後、数回の洗浄工
程およびFITC−アビジンを添加して、プローブシグナル
は増幅される。
次いで、標的構造を、標的核酸を結合したレポーター
でラベルされたプローブの存在を、例えば、蛍光顕微鏡
使用またはレーザー走査顕微鏡使用により検査する。
図1Aは、実施例３で詳細に記載されたプロトコールに
従った、本発明によりそして増幅なしの、スライドガラ
ス上に固定された、調製され、単離されたHEp−２細胞
間期核へのＸ染色体アルファサテライトDNAプローブの
インサイチューハイブリダイゼーションからのFITCシグ
ナルを示す。Ｘ染色体は、約5,000コピー／細胞のアル
ファサテライト配列（ONCORの文献）を含むと推定され
る。ビオチン化されたプローブを、上記のようなFITC−
アビジンと反応そしてポストラベルする。
比較の目的で、図1Aの方法で使用した同一のストック
からの変性されたビオチン化されたＸ染色体アルファサ
テライトプローブを、ホルムアミドおよびデキストラン
サルフェートと従来のプロトコールで組み合わせ、そし
て先行技術の熱変性（および再生）工程を用いてHEp−
２細胞核にハイブリダイズした。結果を図1Bした。この
手法は、図1Aの方法より数時間多い全調製およびハイブ
リダイゼーション時間を必要とし、シグナル増幅を必要
とし、そして一般的に、核を通じて、蛍光シグナルのよ
り低いレベルを与えた。
実施例４に報告された第２の方法は、この方法が、プ
ローブシグナル増幅なしに、低コピー数標的配列に高い
プローブ標的特異性を与えることを示す。この方法で
は、第７染色体アルファサテライトDNA/RecA複合体を、
上記のように、HEp−２間期核とハイブリダイズする。
第７染色体は、約10コピーの使用されたアルファサテラ
イト配列プローブを含む（ONCOR プローブD7Z2）。
図2Aは、本発明による、プローブ結合およびFITCラベ
リリング後の、標的シグナルパターンを示す。図に見ら
れるように、プローブは、二つの明瞭なスポットに局在
化し、多分、二つの第７染色体に含まれるアルファサテ
ライト配列に対応する。
図2Bは、上記の先行技術の方法に従った増幅後の、同
一プローブで達成されたインサイチューハイブリダイゼ
ーションプローブ結合標的パターンを示す。プローブの
局在化は、本発明の方法におけるより特異性が低いよう
に見える。さらに、全調製時間およびプローブハイブリ
ダイゼション時間は、多時間より長かった。
実施例５に報告された、第３の方法は、共焦点のレー
ザー走査顕微鏡（Zeiss LSM−10）を用いる、他の標的
されたDNA配列および／または核膜に対する核容量内の
標的配列を局在化する能力を示す。この方法では、100
％メタノールで固定されたHEp−２細胞を、上記図1Aの
ように、懸濁液中、RecA/染色体アルファサテライトDNA
プローブ複合体でプローブし、そしてFITC−アビジンで
ラベルした。図3Aは分裂する核中のプローブ結合のパタ
ーンを示す。結合したプローブを局在化するため、レン
ズの焦点を変えずに、位相コントラスト顕微鏡使用によ
り同一視野を検鏡した（図3B）。この二つの顕微鏡写真
を検査することにより、核膜および核分裂平面の相対位
置が、プローブラベルされた染色体に関して観察され得
る。
本発明による方法はまた、ネイティブなRecAが介在し
た蛍光インサイチューハイブリダイゼーションを用い
て、分裂中期染色体における特定DNA配列の検出を容易
にする。ヒト第１染色体アルファサテライトセントロメ
ア配列に特異的なRecAコートされたビオチン化されたプ
ローブを、ネイティブなRecAが介在した蛍光インサイチ
ューハイブリダイゼーションを用いて、スライドガラス
上で固定されたHEp−２細胞と反応させた（実施例
６）。RecAコートされたプローブ混合添加前に、細胞
を、60℃で10mMトリス−酢酸（pH7.5）でインキュベー
トした。このインキュベーション工程は、細胞核酸標的
の変性温度以下で、蛍光インサイチューハイブリダイゼ
ーション反応の効率を改善する。実施例６では、このイ
ンキュベーション工程を用いて、全細胞核の73％が蛍光
ハイブリダイゼーションシグナルを示した。FITCハイブ
リダイゼーションシグナルは、488nmアルゴンイオンレ
ーザー走査モードのZeiss LSMを用いて可視化された。
このFITCハイブリダイゼイーションシグナルを、その位
置を同定するために染色体の位相イメージ上に二重に焼
き付けた（図12）。FITCプローブシグナルは、予期され
たように、セントロメアに位置していることに留意。
RecAが介在した蛍光インサイチューハイブリダイゼー
ションはまた、唯一の遺伝子配列の検出を容易にする。
p53遺伝子（Oncor）に特異的なRecAコートされたビオチ
ン化されたプローブを、ネイティブな蛍光インサイチュ
ーハイブリダイゼーション反応を用いて懸濁液中で、固
定された細胞と反応させた（実施例７）。FITCプローブ
シグナルを488nmアルゴンイオンレーザー走査モードのZ
eiss LSMで観察した。シグナルは、任意のシグナル増幅
（即ち、余分のシブナル増幅工程）なしに明瞭であっ
た。この分析の結果は図13にある：図13A、13Cおよび13
E、FITCハイブリダイゼーションシグナル；図13B、13D
および13F、それぞれ13A、13C、および13Eにおける細胞
の位相イメージ；図13Aから13D、HEp−２細胞；および
図13Eおよび13F、HCC“Alexander"細胞。図13Eにおける
FITCハイブリダイゼーションシグナルは、図13Fにおけ
る細胞の位相イメージ上に二重に焼き付けられている。
全てのハイブリダイゼーションシグナルが、細胞核内に
あり、そしてFITC信号が、しばしば、新規に複製された
DNAを示すペアとして見られることに留意。図13D中の細
胞核は、分裂のプロセスにあるように見える。これらの
結果は、溶液ハイブリダイゼーション反応で唯一の配列
を検出する本発明の方法の感度を顕示する。
溶液ハイブリダイゼーション反応における唯一の配列
の検出に加えて、本発明の方法はまた、スライドガラス
上の固定された細胞を用いる唯一遺伝子配列の検出に有
効である。RecAコートされたビオチン化されたp53プロ
ーブ（Oncor）を、ネイティブ蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーション反応を用いてスライドガラス上の固
定されたHCC細胞と反応させた（実施例８）。この反応
は、トポイソメラーゼIIを含み、そしてプローブ添加前
に緩衝液中でインキュベートしなかった（実施例８）。
FITCプローブシグナルを488−nmレーザー走査モードのZ
eiss LSMで観察した。ハイブリダイゼーションシグナル
は、任意のシグナル増幅（即ち、余分のシグナル増幅工
程）なしに明瞭であった。試料の結果は図14にある。図
14において:14Aおよび14C、FITCシグナル;14Bおよび14
D、それぞれ14Aおよび14Cで見られる細胞の位相イメー
ジ。全てのハイブリダイゼーションシグナルが核内であ
りそしてシグナルがしばしばペアとして見られることに
留意。示された核中のシグナルペアの位置は、例えば、
14Aおよび14Bにおいて、この核では、シグナルがDNA複
製後のステージを示し得ることを示している。これらの
結果は、ハイブリダイゼーション反応で固定された細胞
を用いて唯一配列を検出する本発明の方法の感度を示
す。
唯一の細胞遺伝子配列の検出に用いられるべき本発明
の方法の能力に加えて、この方法はまた、唯一のウィル
ス核酸配列の検出に使用され得る。RecAコートされたHB
V DNAプローブpAM6および“BIOPROBE"を、懸濁液中で、
ネイティブ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
反応を用いて、100％メタノール固定された細胞と反応
させた（実施例９）。これらの実験で用いられた両プロ
ーブは、ヒトHCC細胞中のHBV配列を高効率で検出した
（“BIOPROBE ”、81％;pAM6、95％）。FITCハイブリ
ダイゼーションシグナルをレーザー走査モードのZeiss
LSMで観察した。図15で、観察されたHBVプローブからの
FITCシグナルを、細胞の位相イメージ上に二重の焼き付
けて示す:15Aおよび15B、“BIOPROBE ";15C−15E、pAM
6プローブ。全てのシグナルが、核領域内にあるように
見えることに留意。両DNAプローブは、各HCC細胞核にお
いて複数のFITCハイブリダイゼーションシグナルを生じ
た。“BIOPROBE ”シグナルは、pAM6シグナルより強く
ないように見える。これは、使用されたプローブのサイ
ズに起因するらしい。溶液中の、一本鎖プローブと直鎖
状二重鎖標的DNAとの間の、RecAで促進されたペアリン
グ反応は、プローブ鎖サイズの増加と共に効率が増加す
る：一本鎖“BIOPROBE ”鎖は、平均＜250bsで、そし
てpAM6一本鎖は、平均300−500塩基のサイズである。こ
の差異はまた、プローブが、異なる血清型のHBVゲノム
（“BIOPROBE ”、adr−4;pAM6、adw）を含む事実によ
るためであり得る。これらの結果は、本発明による方法
は、ウィルスDNA配列の検出に有用であることを示す。
目的の任意のウィルスDNA標的に特異的なプローブを生
成し、RecA−タンパク質でコートされ得、そして本発明
のインサイチューハイブリダイゼーション法において使
用し得る。蛍光検出に加えて、多くの他の検出法を使用
し得、制限されないが、以下を包含する：化学ルミネセ
ンス（Tropix Inc.,Bedford MA）および放射能。
本発明の方法はまた、標的検出の良好な特異性を有す
る。本発明の方法の特異性は、以下のように検査され
た。30ngのRecAコートされた一本鎖ビオチン化されたHB
Vプローブ（pAM6）を、標準のネイティブの懸濁液中の
蛍光インサイチューハイブリダイゼーションプロトコー
ルを用いて、ATCC HCC“Alexander"細胞と反応させた
（実施例10）。
HBV標的に対する反応シグナルの特異性は、240ngの過
剰のRecAコートされた一本鎖のビオチン化されていない
相同DNA、または、240ngの非相同の競合剤DNAのいずれ
かを添加することにより試験した（実施例10）。ビオチ
ン化されたHBVプローブおよびビオチン化されていないH
BVおよびφX174競合剤DNAを同一条件下でニックトラン
スレートし、それらが類似のサイズ（平均400−500bs）
であることを確実にした。非ラベルのヒト胎盤DNA（100
−120bpフラグメント）を、Oncorから入手した（“BLOC
KITTMDNA”）。結果（表1;実施例10）は、非相同のDNA
でない、相同HBV DNAのみが、ビオチン化されたHBV DNA
プローブシグナルと特異的に競合することを示す。
表１に記載された競合実験からの代表的な細胞を図16
に示す。図において:16A、ビオチン化されたHBVプロー
ブ＋過剰の非ラベルのHBV DNA;16B、ビオチン化されたH
BVプローブ＋過剰の非ラベルのφX174 DNA;そして16C、
ビオチン化されたHBVプローブ＋過剰の非ラベルのヒト
胎盤DNA。FITCプローブシグナルをレーザー走査モード
のZeiss LSMで観察した。HBVプローブからの観察された
FITCシグナルを、細胞の位相イメージ上に二重に焼き付
けて示す。シグナルおよび細胞イメージから、相同HBV
DNAが、特異的に、ビオチン化されたHBV DNAプローブシ
グナルと競合するが、非相同DNAは競合しないことが明
かであることに留意のこと。それ故、RecA促進されたネ
イティブの蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
反応が、ラベルされたプローブDNAに相同である特異的
核酸標的を検出する。
前記から、本発明の種々の目的および特徴がどのよう
に満たされたか認識し得る。本発明は、生物構造におい
て標的配列を局在化するための単純化されたそしてより
短時間の手法を提供する。この方法は、熱変性工程の必
要がないことにより、シグナル増強の必要を減じること
によりアーチファクトを減じ、そして、低コピー数の標
的配列を含む、標的配列のより早いそしてより明瞭な検
出を可能にする。
特に、この方法は、最初に配列を増幅する必要なし
に、低コピー配列の検出を可能にする。図2Aおよび2Bの
比較は、この特徴が、先行技術アプローチに比べ、本方
法の特異性および解像度を非常に増強することを顕示す
る。大部分の遺伝子マッピングおよび染色体研究が、特
定の低コピー配列を含むと予想されるので、本発明の方
法が、診断遺伝子マッピング研究、および唯一のまたは
低コピー数の種々の病原体配列を含む診断用途に重要な
利点を提供する。これらの後者の使用は、以下のセクシ
ョンIIに記載される。
さらに、本明細書に記載された方法は、溶液中および
スライドガラス上で行われるハイブリダイゼーション反
応で、（ｉ）唯一、即ち、単一コピー、遺伝子配列、お
よび（ii）唯一または複数のウィルス核酸配列の検出に
有効である。
本出願と同日に出願され、共に所有された、特許出
願”ダブルＤ−ループ形成の診断応用”で開示されたよ
うに、二重鎖DNAフラグメントから調製された安定なRec
Aコートされたプローブは、標的二重鎖DNAとのダブル−
プローブハイブリッド構造を形成し得る。そのようなダ
ブル−プローブ構造が、インサイチューハイブリダイゼ
ーション条件下でのプローブ結合に関しては示されてい
ないが、そのような構造の存在は、もし形成されれば、
インサイチュー標的部位で生成されたシグナルの量を効
果的に２倍にするために利用され得る。さらに、この二
つのプローブが異なるレポーター基、例えば、異なる吸
収または放射ピークを有する蛍光プローブでラベルされ
得、その結果、両方のプローブを含む標的部位が、一つ
のプローブのみを含む部位から区別し得る。
II.応用 本発明の一つの一般的な応用は、染色体中、および／
または染色体の特定領域中の選択された遺伝子または調
節配列を位置づけおよび可視化する診断的使用である。
標的遺伝子または配列は、（ａ）選択された遺伝子産物
を生成する、（ｂ）リボソーム、癌遺伝子、または腫瘍
サプレッサー遺伝子などの機能のような重要な細胞コン
トロール機能を行うと考えられる、（ｃ）反復配列に関
係する、（ｄ）活性な遺伝子産物の発現を妨害する遺伝
子欠陥を含むと考えられる、（ｅ）染色体位置におい
て、既知のマップ位置を持つマーカープローブ領域に関
係する、および／または（ｆ）固定されたクロマチンま
たは固定されたビリオン中のDNA−肝炎ウィルス（例え
ば、Ｂ型肝炎ウィルス（HBV）（Onoら;Fujiyamaら;Gali
bertら））のような、組み込まれたまたは組み込まれて
いないウィルス配列を示し得る、遺伝子または配列であ
り得る。
この方法で使用された診断プローブは、特定の場合で
は、ヒトゲノムライブラリーのようなところから入手で
きるプラスミド、コスミド、ウィルスまたは他のベクタ
ーから得られるか、または化学的に合成される。遺伝子
産物が利用できる場合、プローブを、PCR増幅のための
プローブを生成するのに十分なタンパク質産物のシーク
エンシング、および、ゲノムDNA中の対応する遺伝子配
列の、PCRフォーマット中のプローブを用いる増幅およ
びダグ付けにより生成し得る。増幅された遺伝子物質
は、電気泳動により精製し得、そしてプローブとして直
接使用し得、または標準プロトコールを用いて適切なベ
クター中にクローンされ得る。
代表的な方法では、核は、周知の方法を用いて分裂中
期のステージにある細胞に由来し、次いで、固定されそ
してスライドガラス上に「滴下され」分裂中期染色体拡
散物を生成する。あるいは、調査中の染色体物質は、単
離された個々の染色体の拡散物であり得る。
図4Aは、単一の分裂中期第10染色体を示し、それは単
離された形態または体細胞染色体の完全なセットを含む
視野の一部であり得る。染色体は、染色体上のマップ位
置が知られている、既知のマーカー領域12（遺伝子位置
Ｍ）を含み、そして目的の遺伝子領域を含むと考えられ
る。スライドガラス上の染色体調製物は、図4A中14で示
された、プローブ複合体と反応し、そして18で円によっ
て示された、RecAタンパク質でコートされたプローブ16
から成り、そして26で縦のダッシュで示されたビオチン
基を有する。本発明による、プローブ複合体と染色体物
質との反応は、目的の標的領域である遺伝子部位Ｓ（図
4B）へのプローブの相同結合に導く。
結合部位Ｓは、種々の方法により部位局在化のために
可視化され得る。図4Cで図示された方法では、既知の領
域12（遺伝子部位Ｍ）に相同なプローブ24からなりそし
てまたビオチン基26を含み第２のプローブ複合体22を、
染色体調製物に添加し、そして相同のその領域に結合さ
せる。未結合プローブを除去するために洗浄した後、こ
の調製物をFITCアビジンレポーター28と反応し、蛍光タ
グで染色体上の両方の部位をラベルする。
蛍光顕微鏡使用により観察するとき、図4C中30で示さ
れた、二つの蛍光ポイントを有する、図4Cで示されたよ
うな視野が見られ、染色体上で、マーカーと試験配列と
の間の距離のめやすを提供する。
図4Dで示された、別の可視化方法では、染色体を、32
で示された、一種または一種以上の特定の蛍光色素でラ
ベルし、それは、分裂中期染色体中で特徴的な染色パタ
ーンを与える（Korenberg、Lawrence、1990）。染色体
はまた、バンド染色蛍光分子の蛍光励起波長と異なる蛍
光励起波長を有する蛍光ラベルを含むアビジンレポータ
ー34でラベルされる。蛍光顕微鏡を用い、図4D中の36で
示されたように、染色体を一種の波長で可視化し、そし
て染色体部位上のプローブの位置を、第２の励起波長で
可視化する。一種の相同体との反応を示す（4D）けれど
も、全ての相同配列がプローブと反応し得る。
本発明はまた、種々の染色体異常を検出する、改良さ
れた方法を提供する。
図５−10は、この方法がどのように種々のタイプの染
色体異常の検出に適用され得るのかを図示する。図５、
フレームＡは、染色体アームの一つ上にある２種類の連
鎖したマーカー領域42および44を含む正常染色体40aを
示す。染色体上の二つの領域は、本発明により、個々の
プローブ複合体とハイブリダイズし、次いで、異なる蛍
光タグでラベルされる。例えば、一つの領域は、一つの
プローブ複合体上のビオチン基に対して特異的なアビジ
ンに結合した蛍光レポーターで、そして第２の領域は、
第二のプローブ複合体上のジゴキシゲニン基に対して特
異的な抗ジゴキシゲニン抗体を持つ第２の蛍光レポータ
ーでラベルされ得る。第１および第２の蛍光レポーター
は、図５および関連する図６−10で、それぞれ白丸およ
び黒丸で示される。
二つの領域が、適切な励起波長で、蛍光顕微鏡使用で
検査されるとき、この二つの領域は、二つの区別し得る
蛍光スポット（フレームＢで白丸および黒丸で示され
る）により局在化される。この二つのスポットは、正常
染色体中の二つの遺伝子領域中の相対的な配向および距
離を示す。
図６は、フレームＡで、染色体40bを図示し、それ
は、染色体領域44の欠失により染色体40aと異なる。フ
レームＢにおいて、領域42のみに対応する励起波長で単
一の蛍光スポットとして変異が見られる。
図７は、フレームＡで染色体40Cを示し、それは染色
体中で領域42と44のあいだの挿入によって染色体40aと
異なる。この挿入は、フレームＢで見られる蛍光顕微鏡
視野で、図５の距離について二つの蛍光スポットの間の
より大きい距離によって証明される。
図８は、フレームＡで染色体40dを図示し、それは領
域44の二重化によって染色体40aと異なる。この二重化
は、フレームＢで、示されたように、領域44プローブの
励起波長でダブレットとして観察される。
図９は、フレームＡで、染色体40eを示し、それは領
域44を含むセグメントが第２の染色体48eに転座したこ
とで、染色体40aと異なる。この転座は、フレームＢ
で、広くスペースされた蛍光スポットにより証明され
る。染色体48eの正体は、上記のように、染色体を、特
徴的な分裂中期バンディングパターンを形成する色素で
染色することにより（または染色体48マーカーハイブリ
ダイゼーションを用い）、上記のように決定し得る。
図10は、フレームＡで染色体40fを示し、それは、領
域42、44を有するセグメントが反転したことにより染色
体40aと異なる。この反転は、フレームＢで、二つの蛍
光スポットの位置の逆転により証明される。
図12は、ネイティブのRecAが介在した蛍光インサイチ
ューハイブリダイゼーションを用いる分裂中期染色体に
おける特定染色体DNA配列を検出する本発明の方法の能
力を示す。これらのデータは、スライドガラス上のネイ
ティブ蛍光インサイチューハイブリダイゼーションに対
し、本発明の方法の使用を支持する。実施例６は、図12
で示された分裂中期染色体蛍光インサイチューハイブリ
ダイゼーションシグナルを生成するのに使用される工程
を記載し、以下を含む：第１染色体アルファサテライト
プローブ、および、60℃で酢酸緩衝液で前処理されたHE
p−２細胞の調製。図12では、予想されたように、FITC
ハイブリダイゼーションシグナルがセントロメアに位置
している。これらのデータは、ネイティブのRecAが介在
した蛍光インサイチューハイブリダイゼーション技法
は、固定された染色体またはクロマチン中の非変性DNA
上で配列および遺伝子位置を可視化するのに使用され得
ることを支持する。
図13および14は、腫瘍サプレッサー遺伝子配列のRecA
が介在したネイティブ蛍光インサイチューハイブリダイ
ゼーション検出の能力を示す。ネイティブのRecAが介在
した蛍光インサイチューハイブリダイゼーション技法
は、懸濁液中（図13Aから13F）およびスライドガラス上
（図14Aから14D）の固定された細胞中の唯一の単一コピ
ー遺伝子配列を任意のシグナル増幅工程なしに、検出お
よび可視化するのに使用され得る。これらの結果は、AT
CC HEp−２およびHCC“Alexander"細胞（実施例７およ
び８）中の第17染色体上の唯一のp53配列の検出を示
す。
図15は、懸濁液中のATCC HCC“Alexander"細胞中のHB
V核酸配列を検出する、RecAが介在するネイティブの蛍
光インサイチューハイブリダイゼーション検出の能力を
示す。図15（実施例９）は、二種類の異なる、ビオチン
化されたHBVプローブ、“BIOPROBE ”（図15Aから15
B）およびpAM6（図15Cから15E）を用いて得られたハイ
ブリダイゼーションシグナルを示す。ウィルス標的が、
HBV核酸配列を含むことが知られるATCC HCC“Alexande
r"細胞中で検出され、細胞懸濁液中でネイティブ蛍光イ
ンサイチューハイブリダイゼーション技法を用いてプロ
ーブされた。HBV核酸配列で感染されず、そして同一プ
ローブおよび技法でプローブされた、HEp−２細胞は、
任意のハイブリダイゼーションシグナルを示さなかっ
た。これらの結果は、HBV感染されたヒト肝臓細胞中
で、診断学的に重要なウィルス標的配列を検出するため
に本発明の方法の使用を支持する。
図16は、ネイティブ蛍光インサイチューハイブリダイ
ゼーションを用いるHBV標的検出の特異性を示す。この
ネイティブ蛍光インサイチューハイブリダイゼーション
アッセイは、プローブDNAに相同な核酸標的を、特異的
に同定する（図16および表１）。このことは、ビオチン
化されたpAM6HBV DNAプローブハイブリダイゼーション
シグナルが、反応が過剰の非相同非ラベルφX174DNA
（図16B）または過剰のヒト胎盤DNA（図16C）を含むと
きでなく、反応が過剰の相同非ラベルpAM6 DNAを含むと
き（図16A）、特異的に競合されることを示すことによ
り顕示された。これらの競合実験の結果は、ネイティブ
のRecAが介在した蛍光インサイチューハイブリダイゼー
ションシグナルが、例えば、懸濁液中でHBVプローブDNA
およびHCC細胞を用いた場合、HBV特異的であることを示
す。
一般的に、本発明の、RecAが介在した蛍光インサイチ
ューハイブリダイゼーション反応は、RecAタンパク質、
コファクター、および１−２時間のインキュベーション
時間を使用する。平均サイズ100−200、200−400、300
−500、400−600、そしてそれ以上のサイズを含む、し
かし、これらに限定されず、広いサイズ範囲の一本鎖プ
ローブが作用する。代表的には、約100−200以上のサイ
ズ範囲が好適であり、そして300−500が最も適してい
る。RecAタンパク質でコートされたプローブは、将来の
使用のためにフリーザー中に保存され得る:7日までの間
保存されたプローブが試験され、そして良好なハイブリ
ダイゼーションシグナルを与えた。
上記の競合実験は、RecAが介在したネイティブ蛍光イ
ンサイチューハイブリダイゼーションが、相同核酸配列
の検出に特異的であることを示した。ハイブリダイゼー
ション反応は、単一コピー遺伝子および配列（例えば、
p53）、多重コピー配列（例えば、アルファサテライト
第１染色体）、そして診断学的に重要なウィルス標的配
列（例えば、HBV）を検出し得る。ネイティブのRecAタ
ンパク質を用いる蛍光インサイチューハイブリダイゼー
ション反応は一般に、標準の変性インサイチューハイブ
リダイゼーションアッセイより迅速である。本発明を支
持において実行される実験は、ハイブリダイゼーション
後の1.75×SSC中の洗浄が、シグナルを改善し、そして
バックグラウンドを減少させることを示した。
ネイティブのRecAが介在した蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーションのための本発明のいくつかの特徴
は、以下を含む：ネイティブのRecAが介在した蛍光イン
サイチューハイブリダイゼーションは、懸濁液中の１×
PBS洗浄された、100％メタノール固定された（または70
％エタノール固定された）細胞に使用し得る；シグナル
は、二時間またはそれ以下のプローブとのインキュベー
ションで得られ得る；この反応は効率的である−−例え
ば、50ngプローブおよび標準条件を用いて、反応は、使
用されたプローブの濃度に依存して、平均して65−90％
の間の細胞がシグナルを有する；反応は、50ngプローブ
より以下で実行でき−−プローブの濃度は、10ngを超え
るのが好適である;ATPγＳ、GTPγＳ、ATP、dATP、およ
びATPγＳとADPとの組み合せを含む多くのコファクター
がこれらの反応で作用する−−一つの実施態様ではATP
γＳを約0.24から約2.4mMの範囲の濃度で使用し（好適
な実施態様は、約0.24から0.48mMの範囲を含む）;1:1、
1:0.8、1:2および1:2.5を含む、広範な範囲のRecAモノ
マー：ヌクレオチド比が良く作用し（好適な実施態様
は、1:2を利用する）；スライドガラス上でHEp−２細胞
との、第１染色体アルファサテライトプローブおよびネ
イティブのRecAが介在した蛍光インサイチューハイブリ
ダイゼーションで得られたシグナルの量は、標準変性蛍
光インサイチューハイブリダイゼーション技法を用いて
得られたシグナルに匹敵し；反応は、アクセサリータン
パク質（例えば、一本鎖結合タンパク質（SSB）、トポ
イソメラーゼＩおよびトポイソメラーゼII）の存在下で
作用し；そして反応がスライドガラス上で固定された試
料に対して実施されるとき、RecAコートされたプローブ
ミックスを添加する前に、30−45分間、55−60℃で、pH
7.5の10mMトリス−酢酸緩衝液中でスライドガラスをイ
ンキュベートすることにより、５−20％から55−80％の
平均範囲で反応効率が改善される。この温度は、細胞内
核酸の変性温度未満である。
この方法の上記の応用が、それらが、単一または小コ
ピー数の標的配列へのプローブ結合を含む範囲まで、本
発明の方法により研究するのが唯一適していることが認
識され得る。
本発明の方法の別の一般的な応用は、診断用途、代表
的には、感染された生物、器官、組織または細胞におい
て、染色体の倍数性または再配列、もしくは、ウィルス
または細菌または寄生病原体の存在を検出することであ
る。この応用は、特定して上記で論議され、そして一般
的に、細胞50のような、ウィルス感染された細胞の検出
する図11A−11Cに図示される。細胞に含まれるビリオン
粒子（または組み込まれたウィルスゲノム）が54で示さ
れる。細胞、例えば、血液細胞が、試験対象から得ら
れ、そして上記で論議されたように処理され細胞構造の
透過性を高める。透過性が高まった細胞に（図11A）、
ウィルスに特異的なDNAプローブ複合体56を添加し、ウ
ィルス二重鎖核酸に対するDNA複合体の配列特異的結合
をさせ、次いで、ウィルス−複合体ラベリング（図11
B）のために蛍光マーカー分子58を添加する。プローブ
シグナルは、もし必要ならば、上記のようにレポーター
試薬の増幅により、たとえば、ビオチン化された抗アビ
ジン抗体、ついで第２の蛍光ラベルされたアビジンレポ
ーター分子によって増幅され得る。
ラベルされた細胞は、蛍光顕微鏡使用により検査され
得、細胞中で、感染ウィルス核酸を検出および局在化す
る。あるいは、細胞感染、および感染された細胞のパー
セントは、図11Cに図示されたように、蛍光活性化細胞
ソーティング（FACS）により測定され得る。この図は、
細胞60、62のような血液細胞のグループを示し、それら
は、検出器66を備えたFACS装置中のキャピラリーチュー
ブ64を通過し、検出器領域を通過する個々の細胞中の蛍
光が検出される。蛍光ラベルされた細胞は、図において
暗い影で示される。この方法は、診断目的のために、感
染された細胞の迅速検出を提供し、感染のレベルおよび
感染された細胞のパーセンテージを測定し得ることがわ
かる。それ故、例えば、この方法は、治療期間に渡っ
て、細胞感染の減少を測定することにより、抗ウィルス
治療の進行を評価するのに使用され得る。
FACS装置は、さらに、蛍光ラベルされた細胞を捕捉す
るために、ソーティング装置を装着し得、感染された細
胞の濃縮物を形成する。濃縮物は、順々に、ウィルスゲ
ノムを同定しそしてクローニングする目的に、ウィルス
核酸配列の供給源として使用され得る。
以下の実施例は、本発明を説明する意図であり、しか
し本発明を限定せず、本発明の特定の方法および応用を
説明する。
実施例１ RecAタンパク質の精製 RecAおよびRecA803タンパク質を、過剰生産株JC12772
およびJC15369（A.J.ClarkおよびM.Madirajuから得た）
から単離し、またはRecAは、Pharmaciaから購入した。
RecAおよびRecA803タンパク質は、ヒドロキシルアパ
タイトカラム（Bioradから粉末として得た）高速タンパ
ク質液体クロマトグラフィー（FPLC）、次いでアニオン
（“MONO Q",Pharmacia）交換カラムを含む公開された
手法（Shibata、Griffith）の改変によって精製され
た。
タンパク質精製は、以下のようにモニターされた： （ｉ）SDS−PAGEによる38,000ダルトンRecAタンパク質
の同定（“PHASTGELTM”システム、Pharmacia、Piscata
way NJ）； （ii）［γ−32P］ATPおよび一本鎖DNA（Shibata）を用
いる、RecA ssDNA依存性ATPアーゼ活性のアッセイ。こ
の反応の生成物を、PEIセルロース薄層クロマトグラフ
フィー（EM Science、NJ）を用いて分離した：このPEI
プレートは、0.5MLiClおよび0.25Mギ酸の溶媒中で展開
した。生成物を、オートラジオグラフィーで検出した。
（iii）DNアーゼ活性のアッセイ。DNアーゼ活性は、Rec
Aタンパク質試料を、RecA鎖転移緩衝液（Cheng）中で、
線状化されたφX174およびスーパーコイル状の環状二本
鎖RFおよび環状一本鎖DNAの混合物と、37℃で１時間イ
ンキュベートすることによりモニターした。DNAのニッ
キングおよび消化は、脱タンパク質化の後、アガロース
ゲル電気泳動後のエチジウムブロマイドを用いた可視化
により、そしてRecAとインキュベートした試料中の各DN
Aタイプの量をRecAなし緩衝液中でインキュベートした
それと比較することによりモニターした。検出可能なDN
アーゼ活性を示さないRecAタンパク質試料のみを用い
た。
（iv）Chengから改変された方法を用いる、500マーオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いるＤ−ループ活性のアッ
セイ。
最終の“MONO−Ｑ ”−精製されたRecAおよびRecA80
3タンパク質の銀染色されたSDSポリアクリルアミドゲル
プロフィールは、本質的に他の細胞ポリペプチドのな
い、各調製物から単一の38,000ダルトンのバンドを示し
た。
実施例２ プローブ複合体の調製 ビオチン化されたＸ染色体アルファサテライトDNAプ
ローブをONCOR（Gaithersburg、MD）から得た。
滅菌MilliQ （Millipore）H2O中で希釈されたプロー
ブを、100℃ヒートブロック溶液中の0.5ml微量遠心分離
チューブ中で、５分間変性し、そしてこのチューブを直
ちに氷水浴中に置いた。ハイブリダイゼーション混合物
に、変性されたプローブを添加する約５分前に、プロー
ブを含むチューブを、−20℃のフリーザー中の氷の中に
置いた。このプローブハイブリダイゼーション混合物
は、以下の成分を広い濃度範囲で含みリストされた順で
組み合わさせる:1μｌの10×RecA反応緩衝液［10×RecA
反応緩衝液:100mMトリス−酢酸37℃でpH7.5、20mM酢酸
マグネシウム、500mM酢酸ナトリウム、10mMDTTおよび50
％グルセロール（cheng））;16.2mM保存液からの1.5μl
ATPγＳ（3.24および1.62mM保存液もまた使用し得
る）、（Pharmacia）（rATP、dATP、GTPγＳ、またはAT
PγＳおよびADPの組み合せが、特定の反応で使用し得
る）;0.75μｌの20mM酢酸マグネシウム;4−60ng（また
は特定の反応ではそれ以上）の殺菌ddH2OまたはTE（20m
Mトリス塩酸、pH7.5、そして0.1mM EDTA）中の変性され
たプローブ;RecA（発明者らの実験室で調製されたとき
添加される正確なμｌ量が保存液の濃度に依存して変わ
り、Pharmaciaから購入されたときは、1.25μｌの0.137
mM保存液）。この混合物を37℃で10分間インキュベート
し、次いで、0.5μl/200mM酢酸マグネシウム反応液を添
加する。反応成分の最終濃度は:4.0mMから10mMのトリス
酢酸、2.0mMから15mMの酢酸マグネシウム、20.0mMから5
0mMの酢酸ナトリウム、0.4mMから1.0mMのDTT、２％から
５％のグリセロール、0.24mMから2.5mMのATPγＳ、0.00
5mMから0.02mMのRecAである。
実施例３ Ｘ染色体プローブとのインサイチューハイブリダイゼー
ション A.HEp−２細胞核の調製 HEp−２細胞は、もとはヒト男性咽頭類表皮腫癌腫組
織に由来した。HEp−２の染色体倍数性は可変性である
（Chen）。
細胞を、標準条件下、37℃で、10％FBS、ピルビン酸
ナトリウムおよびペンストレップ（Penstrep）抗生物質
ミックスを添加したDMEM（WhittakerまたはGIBCO−BR
L）中に接種した後、24時間培養した。これらの細胞
を、低速遠心分離によりペレット化し、そしてゆっくり
と37℃水浴中で、75mMKCl中に再懸濁し、そして所望の
量の核膨潤を起こすために５分から15分間インキュベー
トし、次いで、氷冷したメタノール：酢酸3:1を添加
し、そして６℃で遠心分離した。
1mlの液体を、ペレット化された細胞とともにチュー
ブに残し、さらに氷冷したメタノール：酢酸を添加し、
そしてチューブを穏やかに混合することにより細胞を懸
濁し、次いで遠心分離した。メタノール：酢酸の繰り返
された添加は細胞質を分解し、そして単離された核は、
上記のように繰り返された、メタノール：酢酸の添加に
引き続く混合および遠心分離により得られた。（HEp−
２および他の細胞タイプは、別の方法で固定化され得、
それらのいくつかは、固定された細胞質構造を分解しな
い）。
最後に、核調製物は、約２×106/ml濃度で3:1メタノ
ール：酢酸中に再懸濁され、そしてピペットにより10μ
ｌアリコートで清浄なスライドガラス上に滴下され−20
℃で保存されたか、または、懸濁された核または細胞調
製物は後の使用のために−20℃で保存される。
B.非変性核酸標的−ハイブリダイゼーション反応 実施例２からの10μｌのプローブ混合物／反応物を、
スライドガラス上の固定された調製物に適用した。カバ
ーガラスをハイブリダイゼーション領域の上に置き、そ
してラバーセメントでシールし、そして反応物を37℃CO
2インキュベータ中の湿潤コンテナ内で封入し１−４時
間の間インキュベートした。インキュベーションに続い
て、ラバーセメントを取り除き、そしてスライドガラス
を、37℃の水浴中、コプリンジャー中で３回、各10分間
２×SSC中（これらアッセイにおいて全てのSSCを含む調
製物中において、20×SSC:3M NaCl、0.3Mクエン酸ナト
リウム、pH7.0が用いられる）で洗浄した。他の洗浄条
件もまた、使用し得る。
このスライドガラスを、前ブロック溶液［４×SSC、
0.1％Triton X−100、５％Carnation 脱脂ドライミ
ルク、２％正常ヤギ血清（Gibco）、0.02％アジ化ナト
リウム、pH7.0］中、室温（RT）で25分間置き、次い
で、前ブロック溶液中、５μg/m1 FITC−アビジンDCS、
細胞ソーターグレード（Vector、Ａ−2011）中で、RTで
25分間浸漬した。このスライドガラスを、４×SSC、４
×SSCおよび0.1％Triton X−100、そして４×SSCで、
RTで各10分間洗浄し、次いで、二回蒸留したH2Oで簡単
にリンスしそして乾燥した。抗退色剤を適用し［10mlPB
S中の100mg p−フェニレンジアミンジヒドロクロリド
（Sigma P1519）を。0.5M炭酸−重炭酸緩衝液（NaOHでp
H9に調整された0.42g NaHCO3（10ml ddH2O中））を用い
てpH8に調整し、90mlのグリセロールに添加し、0.22μ
ｍで濾過された］、そして抗退色マウティング媒体およ
びカバーガラスを調製物上に置いた。ヨウ化プロピジウ
ムまたはDAPIなどのようなカウンター染色剤を含む抗退
色剤が、しばしば、抗退色剤単独の代わりに使用され
た。図1Aは、上記調製物（シグナル増幅なし）からの細
胞核の蛍光顕微鏡写真を示す。
必要ならば、シグナル増幅は以下のように実施され得
る：スライドガラスを４×SSCおよび0.1％Triton X−10
0中、RTで５−10分間洗浄し、カバーガラスおよび抗退
色剤を除去し、次いで、20分間までの間前ブロック溶液
中でインキュベートし、そして37℃で30分間前ブロック
溶液中で希釈された５μl/mlの濃度で、ビオチン化され
たヤギ抗アビジン抗体（Vector BA−0300）とインキュ
ベートする。スライドガラスを各10分間、RTで４×SS
C、４×SSCおよび0.1％Triton X−100、４×SSCで洗
浄し、次いで、RTで、20分間前ブロック溶液中でインキ
ュベートし、そしてRTで20分間５μg/mlのFITCアビジン
を含む前ブロック溶液中に浸漬する。スライドガラスを
再び４×SSCシリーズ中で洗浄し、簡単にddH2O中でリン
スし、そして抗退色剤またはカウンター染色剤を含む抗
退色剤でマウントする。
C.各酸標的の熱変性によるハイブリダイゼーション。
比較の目的で、各基質の熱変性によるインサイチュー
ハイブリダイゼーションを平行して行った。変性され、
ラベルされたＸ染色体プローブを核に添加し、スライド
ガラス上でONCORプロトコール下で変性した。非変性方
法の場合と同じ核調製物が使用された。ONCORにより示
唆されたシグナル増幅手法をハイブリダイゼーションシ
グナルを増強するために使用した。その後、スライドガ
ラスを37℃で一晩維持した。これらの手法および材料
は、一般に、ONCOR Chromosome In situ Kit,Cat No.
S1370のそれらに従った。
図1Bは、上記のシグナル増幅された調製物からの細胞
核の蛍光顕微鏡写真を示す。
実施例４ 第７染色体プローブとのインサイチューハイブリダイゼ
ーション 第７染色体アルファサテライトDNAに対するビオチン
化されたDNAプローブをONCORから得た。プローブは変性
されそして少なくとも５週間凍結して保存し得た。16μ
ｌ（1:2、プローブ：H2O、2ng/μl DNA）中の32ngの変
性された新たに融解されたDNAプローブを、実施例２で
与えられたハイブリダイゼーション混合物の同一量に同
一順序で添加した。プローブ混合物の37℃で10分間のイ
ンキュベーションに続いて、そして0.5μｌの200mM酢酸
マグネシウムの最終添加で、反応物は全21μｌを含んで
いた。
プローブを、非変性のHEp−２標的細胞核上で、CO2イ
ンキュベーター中37℃で2.5時間インキュベートし（実
施例3B）、次いで、実施例3B中でＸ染色体に対するプロ
ーブで記載されたのと全く同様にして洗浄、ブロッキン
グ、およびFITC−アビジンインキュベーションした。実
験を行う時間は、スライドガラスのエタノールシリーズ
処理を含んで、約５時間であった。図2Aは、処理された
調製物からの細胞核の蛍光顕微鏡写真を示す。
比較のために、上記核は、第７染色体プローブと実施
例3C中のように、熱変性条件下で反応させた。要約すれ
ば、第７染色体アルファサテライトDNAへの5ngの変性さ
れたプローブを、ハイブリダイゼーション緩衝液（図1B
中のように、Hybrisol Vl、ONCOR）と合わせそしてON
CORプロトコールを用いて変性した。７μｌのプローブ
混合物を、HEp−２細胞核と16時間ハイブリダイズし、
そして反応液を、シグナル増幅を含むONCORプロトコー
ルに従って処理した。図2Bは、上記処理され、変性され
た核の蛍光顕微鏡写真を示す。
実施例５ 懸濁液中のメタノール固定された間期核中の特定の染色
体配列の検出 Ｘ染色体アルファサテライトDNAに特異的なプロー
ブ、Oncorプローブ保存液（実施例２で使用された）を
希釈しそして100℃で５分間変性し、直ちに氷水浴中に
置き（約15分間）そして上記ハイブリダイゼーション混
合物に添加する前−20℃フリーザーに短時間（約５分
間）保存した。このハイブリダイゼーション混合物を、
次の順で組み合わせた（成分、濃度、および混合物は、
実施例２で詳細に記載される）:1μl 10×RecA反応緩衝
液（実施例２参照）、1.5μl ATPγＳ（16.2mM保存液、
Pharmacia）、0.75μｌ酢酸マグネシウム（20mM保存
液）、H2O中1:2希釈で60ngを含む12μｌの変性プローブ
（ONCOR）（20ngまたは60ng以上がまた、使用し得
る）、RecA（0.137mM保存液、Pharmacia）。反応液を37
℃水浴中で10分間インキュベートし、次いで0.5μｌの2
00mM酢酸マグネシウムを添加した。
HEp−２細胞は、100％メタノール（または他の適切な
溶液）中、−20℃で約2.5×106/mlの濃度で固定され
た。懸濁された細胞（1.25×106）の約0.5mlを、“TOM
Y"遠心分離セット中で1.5ml微量遠心管中６℃で遠心分
離し、そして再懸濁し次いで20μｌから1mlの70％、85
％および100％氷冷EtOH中で遠心分離した。最後の遠心
分離および100％EtOH上澄液の除去の後、ペレットをRT
で、200−500μｌの１×RecA反応緩衝液中に再懸濁し、
そして0.5ml遠心管中に置き遠心分離した。
完成されたプローブ混合物をペレットと混合し、そし
てチューブを37℃水浴中に1.5−2.5時間置いた。インキ
ュベーションは、250μｌの２×SSC（37℃に予備加熱）
の添加により停止され、次いで遠心分離した。ペレット
を２×SSC（37℃に予備加熱）中に再懸濁し、そして37
℃で５分間インキュベートした。遠心分離に続いて、上
記ペレットをRTで20分間、500μｌのブロッキング溶液
中に再懸濁し、次いで遠心分離し、そして100μｌのブ
ロッキング溶液中の10μg/ml FITC−アビジン中に、RT
で暗所で、20分間再懸濁した。このチューブを遠心分離
し、そして250μｌの４×SSCとペレットを混ぜ、再び遠
心分離し、そして0.1％Triton Ｘ−100を含む250μｌ
の４×SSCとペレットを混ぜ、そして再び250μｌの４×
SSCで遠心分離した。すべては室温で行った。最後の遠
心分離後、ペレットを約20μｌの抗退色剤と混合した。
特異的なシグナルは、懸濁された細胞の約30％に認めら
れた。注記:100％メタノール固定された全細胞および／
または固定された核、および、異なる洗浄成分の他の濃
度を用いる実験は、50−90％反応を示した。
図3Aの顕微鏡写真は、Zeiss LSM−10顕微鏡で観察さ
れたように、分裂中の固定化されたHEp−２細胞核を示
し、対称的に位置されたFITCラベルされたプローブ結合
されたセントロメア標的を示す。図3B下の位相写真は、
顕微鏡写真の焦点を変えずに同一の核を撮影したもので
ある。
実施例６ 分裂中期染色体における特定の染色体DNA配列の検出 第１染色体アルファ−サテライトセントロメア配列
（pUC1.77:DNAベクターpUC9中の1.77塩基対長のヒトEco
RIフラグメント;Cookeら;Emmerichら）に対するビオチ
ン化されたプローブを、bio−14−dATP（Gibco−BRL、G
aithersburg MD）の存在下、BRL Nick−translation Sy
stemを用いて調製した。ニックトランスレーションは、
本質的に、製造者（BRL）によって記載されたように行
ったが、以下の改変をした：推奨された酵素量の二倍の
量を添加し、そして反応物は15℃で１時間45分間インキ
ュベートした。これらのニックトランスレーション反応
により、平均一本鎖サイズ約300−400bpのプローブを得
た。
ニックトランスレートされたプローブを、エタノール
中の0.3M酢酸ナトリウム中で沈澱させ、10mMトリス−塩
酸pH7.5、0.1mM EDTA中に再懸濁し、そしてDNA濃度を
“DNA DIPSTICKTM”（Invitrogen）で測定した。スライ
ドガラス上にカウントされたメタノール：酢酸固定され
たHEp−２細胞（大部分が核；実施例３と同様に調製さ
れた）を、70、85、および100％冷エタノールインキュ
ベーションのシリーズに曝すことにより脱水した。スラ
イドガラス上の脱水された細胞は、次いで、10mMのトリ
ス−酢酸緩衝液pH7.5中、60℃で45分間プレインキュベ
ートし、一方RecAコートされた第１染色体アルファサテ
ライトセントロメア配列プローブミックスを調製した。
60℃プレインキュベーション処理は標的DNAを変性せ
ずに、スライドガラス上の固定された細胞上で行われる
ネイティブのRecAが介在した蛍光インサイチューハイブ
リダイゼーション反応の効率を改善する（５−20％から
60−82％の改善されたハイブリダイゼーション）。加温
されたスライドガラスを、固定された細胞核調製物に調
製されたプローブ混合物を添加する前に、37℃表面上で
37℃まで冷却した。上記細胞をカバーガラスでカバー
し、そして反応物をラバーセメントでシールした。
DNAプローブを5.16μのddH2O中、100℃５分間加熱変
性し、氷水浴中で急冷し、４℃で“TOMY ”微量遠心分
離機で20秒間遠心分離し液体を集め、そして次いで直ち
に他の反応成分を含む混合物に添加した。第１染色体プ
ローブを、１μｌの10×酢酸反応緩衝液（Chengら、198
8）、1.5μｌの16.2mM ATPγＳ（Sigma）、0.75μｌの2
0mM Mg(OAc)2、0.59μｌのRecA（11.05μg/μｌ）、１
μｌのDNAプローブ（50ng/μｌ）を含む反応混合物中に
おいて、RecAタンパク質でコートした。プローブ添加後
の反応ミックスの全容量は10μｌであった。このプロー
ブ反応ミックスを37℃で10分間インキュベートし、そし
て次いで、0.5μｌの0.2M Mg(OAc)2を添加した。プロー
ブミックスを次いで、37℃でスライドガラス上の上記緩
衝液処理された細胞核に添加した。この反応物をカバー
ガラスでカバーし、ラバーセメントでシールし、そして
37℃で２時間湿潤チャンバーでインキュベートした。
プローブとの細胞インキュベーション後、ラバーセメ
ントを除去し、そしてスライドガラスを37℃で1.75×SS
C（pH7.4）中で３回洗浄した。各洗浄は10分行った。こ
のスライドガラスを濾過された前ブロック溶液（100μ
ｌ）中、室温で20分間、次いで、濾過された前ブロック
溶液中の５μg/mlFITC−アビジン（Vector、DCSグレー
ド）と暗所で20分間室温でインキュベートした。
スライドガラスを室温で、４×SSCで１回、４×SSC＋
0.1％“TRITON Ｘ−100"で１回、そして最後に４×SSC
で１回、洗浄した。スライドガラスを最後の洗浄の後、
簡単にddH2O中に浸し、そして空気乾燥した。カバーガ
ラスをのせる前に、抗退色剤を添加し、そして細胞をZe
iss LSMで観察した。
図12は、ヒト第１染色体アルファサテライトセントロ
メア配列に対する、RecAコートされ、ビオチン化され、
ニックトランスレートされたプローブとの、固定された
HEp−２分裂中期染色体からのハイブリダイゼーション
シグナルを示す。これらの条件下、染色体拡散物を含む
細胞間期核の73％がシグナルを示した。第１染色体アル
ファサテライトは特異的に第１染色体１セントロメアと
ハイブリダイズした。
実施例７ 唯一のp53第17染色体腫瘍サプレッサー遺伝子配列の、R
ecAが介在したネイティブ蛍光インサイチューハイブリ
ダイゼーション検出 A.第１の条件：図13Aおよび13B。
1.25×106の100％メタノール固定されたATCC HEp−２
（ATCC;American Type Culture Collection,12301 Park
lawn Dr.,Rockville MD 20852）細胞を微量遠心分離チ
ューブに置き、そして70％、85％および100％のエタノ
ールシリーズ処理を行った（Lawrence、1988および199
0;実施例５）。細胞を固定工程の間にペレット化した。
100％エタノール処理工程の後、細胞を１×酢酸反応緩
衝液洗浄の直前までペレットとして保存した。工程間の
全ての細胞遠心分離は、30秒間、2.5Kで“TOMY"微量遠
心分離機で行った。
プローブをRecAタンパク質とインキュベートしている
間、ペレット化された細胞を１×酢酸反応緩衝液（Chen
gら、1988）中で洗浄した。この細胞を再びペレット化
し、そしてRecAコートされたプローブ反応混合物の添加
前、洗浄緩衝液をできるだけ除去した。
プローブを、37℃で、10分間、１μｌの10×酢酸反応
緩衝液、0.75μｌの0.02M Mg(OAc)2、1.5μｌの1.62mM
ATPγＳ（Sigma）、0.59μｌの11.02μg/μl RecA、熱
変性プローブ［５μｌのp53プローブ（10ng/μl;Oncor
Inc.,Gaithersburg MD）および1.16μl ddH2O］を含む
混合物中、RecAタンパク質でコートした。洗浄された細
胞ペレットにプローブを添加する前、0.5μｌの0.2M Mg
(OAc)2をプローブ混合物中に添加した。細胞はプローブ
と混合され、そして37℃で３時間50分間インキュベート
した。
インキュベーション後、細胞を1.75×SSC pH7.4（250
μｌ洗浄）中で３回洗浄し、次いで、室温で20分間、濾
過された前ブロック溶液中でインキュベートし、ペレッ
ト化し、そして前ブロック溶液を除去した。この工程の
次に、5.0μg/mlのFITCアビジンを含む濾過された前の
ブロック溶液50μｌで20分間室温でインキュベートし
た。細胞を、４×SSC、４×SSC＋0.1％“TRITON Ｘ−1
00"、４×SSC、すべてpH7.4、（250μl/洗浄）で洗浄し
た。
少量（例えば、約20μｌ）の抗退色剤を、最終細胞ペ
レットに添加し、そして上記細胞の部分をスライドガラ
ス上に置き、カバーガラスをかぶせ、そしてZeiss LSM
を用いて観察した。これらの一般的な条件下で、65％ま
たはそれ以上の細胞が、明るいp53ハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを示した（図13Aおよび13B）。
B.第２の条件：図13Cおよび13D。
全ての細胞および細胞洗浄は、実施例7Aと同じであ
る。プローブを、0.02MのMg(OAc)2を省略し、そしてそ
の代わりに0.75μｌのddH2Oを添加したことを除いて、
上記のようにRecAと反応させた。これらの条件下で40％
の細胞が明るいハイブリダイゼーションリグナルを持っ
た（図13Cおよび13D）。
C.第３の条件：図13Eおよび13F。
全ての細胞洗浄は実施例7Aと同様に行った。プローブ
を、プローブコーティング混合物ミックスが1.5μｌの1
6.2mM ATPγＳを含み、反応混合物が、0.5μｌの0.2mM
Mg(OAc)2の添加前に37℃で13分間インキュベートされ、
RecAコートされたプローブが、1.25×106100％メタノー
ル固定されたATCC HCC“Alexander"細胞に添加され、そ
して37℃で３時間20分間反応させたことを除いて、上記
のように（実施例7A）反応させた。プローブ反応後の細
胞洗浄は、細胞が10.0μg/mlのFITC−アビジンを含む50
μｌの濾過された前ブロック溶液と反応させた点を除い
て、実施例7Aで記載されたように行った。
これらの条件下、82％の細胞が、明るいハイブリダイ
ゼーションシグナルを持った（図13Eおよび13F）。
実施例８ スライドガラス上のHEp−２細胞核中の唯一のp53遺伝子
配列のRecAが介在したネイティブ蛍光インサイチューハ
イブリダイゼーション検出 スライドガラス上のメタノール：酢酸固定されたATCC
HEp−２細胞を、RecAコートされたp53（Oncor）プロー
ブと反応させた。10mMの酢酸緩衝液pH7.4との45分間の
インキュベーションが省略されたことを除いて、実施例
６中に記載されたように、プローブ添加のために上記細
胞を洗浄しそして調製した。
p53プローブDNAコーティングを、1.5μｌの3.24mM AT
PγＳ、0.59μｌの5.51μg/μl RecAおよび2Uのトポイ
ソメラーゼII（United States Biochemicals Corp.,Cle
veland OH）を含む0.5μｌが添加され、そして変性プロ
ーブの半分が添加された［3.66μl ddH2O中の2.5μｌ
（25ngプローブ）］ことを除いて、実施例６に記載され
たように行われた。
RecAタンパク質を用いるプローブコーティング後、0.
5μｌの0.2M Mg(OAc)2を添加しそしてプローブミックス
をスライドガラス上の核に添加した。プローブとの反応
後の洗浄条件は、実施例６に記載されたようであった。
これらの条件下で、20％の核が、明るいハイブリダイゼ
ーションシグナルを有した（図14Aから14D）。この実験
におけるハイブリダイゼーションシグナルを有する間期
核の数は、図12（実施例６）中で観察されたより、少な
かった−−このプロトコールでは、緩衝液インキュベー
ション工程は含まれていない。
実施例９ 懸濁液中のATCC HCC“Alexander"細胞中のHBV核酸配列
の、RecAが介在したネイティブ蛍光インサイチューハイ
ブリダイゼーション検出 １×106の100％メタノール固定されたHCC細胞／反応
物を、0.5mlの滅菌微量遠心チューブ中に置き、４℃で
“TOMY ”微量遠心分離機中で2K rpmで30秒間遠心分離
し、そして上澄液を除去した。200μｌの氷冷70％EtOH
を添加し、処理された細胞を４℃で遠心分離し、上澄液
を除去し、脱水工程を繰り返し、そして試料を上記のよ
うに、85％および100％氷冷EtOHを連続的に用いて遠心
分離した。
上記細胞を遠心分離し、そして200μｌの１×酢酸反
応緩衝液（グリセロールがないことを除いて、標準RecA
酢酸反応緩衝液と同じ）中に再懸濁し、遠心分離し、そ
して同じ１×酢酸反応緩衝液（グリセロールなし）中に
再懸濁した。プローブ反応混合物の添加直前に、上記細
胞を37℃で10分間インキュベートし、室温で遠心分離
し、そして上澄を除去した。
ビオチンラベルされたHBV特異的な“BIOPROBE ”をE
nzo Diagnostics、Inc.（New York NY）から入手した。
このニックトランスレートされたプローブは、bio−11
−dUTPでビオチン化され、全ゲノム（adr4血清型）およ
び平均250bpのサイズの二本鎖プローブフラグメントを
含有する。
第２のプローブ、pAM6をATCC.から得た。pAM6は、プ
ラスミドpBR322中に全HBVゲノム（adw血清型）を含む。
pAM6を、実施例６で記載されたように、BRL Nick−tran
slation Systemを用いるニックトランスレーションによ
り、bio−14−dATPでラベルした。熱変性された一本鎖
プローブは、300−500塩基の平均サイズを有した。
両HBVプローブを、１μｌの10×酢酸反応緩衝液（Che
ngら、1988）、1.5μｌの3.24mM ATPγＳ、0.75μｌの2
0mM Mg(OAc)2、0.53μｌの5.5μg/μl RecA、および熱
変性プローブ［5.39μl ddH2O中の0.83μｌ“BIOPROBE
”（60ng/μｌ）＋1.22μl ddH2O中の５μl pAM6プロ
ーブ（10ng/μｌ）］を含む、RecAタンパク質10μｌ反
応物でコートした。プローブコーティング反応物を37℃
で10分間インキュベートし、次いで、0.5μｌの0.2M Mg
(OAc)2保存溶液を添加し、そして上記プローブ混合物
を、上記調製された細胞ペレットに添加した。
調製されたプローブ混合物を、個々に分離した細胞試
料に添加し、そして37℃で水浴中２時間インキュベート
した。この反応は、250μｌの1.75×SSC（pH7.4）を37
℃で添加することにより停止した。各試料を混合し、細
胞をペレット化し、そして上澄を除去した。250μｌの
1.75×SSCを添加し、そして試料を37℃で５分間インキ
ュベートした。この洗浄を次いで繰り返した。細胞をペ
レット化し、そして各試料に、300μｌの濾過された前
ブロック溶液を添加した。この試料を、室温で20分間イ
ンキュベートした。上記細胞をペレット化しそして前ブ
ロック溶液を除去した。
この試料に、濾過された前ブロック溶液中の90μｌの
５μg/ml FITC−アビジンを添加した。試料を室温で、
暗所で、20分間インキュベートした。試料を次いでペレ
ット化し、そして上澄を除去した。各試料に250μｌの
４×SSCを添加し、試料を穏やかに混合し、そして細胞
をペレット化した。上澄を除去し、そして250μｌの４
×SSC＋0.1％“TRITON Ｘ−100"を添加した。細胞をペ
レット化し、上澄を除去し、250μｌの４×SSCを添加す
る。細胞をペレット化し、上澄を除去し、ペレットを風
乾し、そして20μｌの抗退色剤を添加した。次いで、試
料をZeiss LSMを用いて検査した。
図15Aおよび15Bは、“BIOPROBE ”を用いる上記のハ
イブリダイゼーションの結果を示す:81％の上記細胞
が、ハイブリダイゼーションシグナルを有した。図15C
から15Eは、pAM6プローブを用いる上記ハイブリダイゼ
ーションの結果を示す:95％の上記細胞がハイブリダイ
ゼーションシグナルを有した。
実施例10 競合ハイブリダイゼーションにより試験されたヒトHCC
細胞におけるネイティブ蛍光インサイチューハイブリダ
イゼーションを用いるHBV標的検出の特異性 A.競合アッセイのためのプローブの調製。
ビオチン化されたおよび非ラベル両方の、pAM6（ATC
C）およびφX174 RFI（New England Biolabs）DNAをBRL
Nick−traslation Systemを用いるニックトランスレー
ションにより調製した。ニックトランスレーションは、
非ラベルのDNAを生成するための反応が、bio−14−dATP
の代わりにdATPを含んだこと以外は、本質的に実施例６
に記載されたように実行された。
各競合反応は、１×106100％メタノール固定された細
胞を使用し、そして30ngのビオチン化されたpAM6 HBVプ
ローブDNAおよび240ngの競合DNAを含む。ビオチン化さ
れたHBVプローブDNAおよび非ラベルの競合物DNAを別の
反応でRecAでコートした。RecAコーティングの後、各反
応のMg++イオン濃度を、10μｌのコーティング反応あた
り、0.5μｌの0.2mM Mg(OAc)2を添加することにより調
製した。次いで、10.5μｌのRecAコートされたbio−pAM
6プローブ（30ngのDNA）を、等容積のRecAコートされた
競合物DNA（240ng）と混合した。RecAコートされビオチ
ン化されたHBVプローブおよび競合剤DNAの各混合物の最
終容積は21μｌであった。
全てのビオチン化されたpAM6 DNAをRecAでコートし、
そして単一反応に使用するために調製し、その10.5μｌ
を各競合実験に使用した。一つの反応における全てのビ
オチン化されたpAM6プローブのコーティングは、DNA競
合物以外、反応間で相違がないことを確実にした。適切
なRecAコーティングを行うため、プローブおよび競合剤
DNAコーティング反応の両方は、同一の平均RecA:ヌクレ
オチド比（1RecAタンパク質モノマー:2ヌクレオチド）
を含有した。
全てのビオチン化されたpAM6プローブを、４μｌの10
×酢酸反応緩衝液（Chengら、1988）、６μｌの3.24mM
ATPγＳ、３μｌの20mM Mg(OAc)2、3.16μｌの2.2μg/
μl RecA、および12μｌの10ng/μl bio−pAM6プローブ
（これは、11.8μｌのddH2O中で熱変性した）を含む反
応物中でRecAでコートした。
各競合剤RecA DNAプローブコーティング混合物は、１
μｌの10×酢酸反応緩衝液、1.5μｌの3.24mM ATPγ
Ｓ、0.75μｌの20mM Mg(OAc)2、1.25μｌの11.05μg/μ
l RecA、および4.8μｌの50ng/μｌの、0.7μｌのddH2O
中で熱変性された競合物DNA（ビオチン化されていない
φX174またはビオチン化されていないpAM6）、または、
3.1μｌのddH2O中で熱変性された、2.4μｌの100ng/μ
ｌビオチン化されていない胎盤DNA（“BLOCKIT";Onco
r）を含む。
全てのプローブは、100℃５分間で熱変性され、氷浴
中で約20秒で冷却され、４℃微量遠心分離機中で分離さ
れ、全ての液体を集めそして直ちにそれらの各々のRecA
反応混合物に添加された。
プローブを、37℃で15分間RecAでコートし、そして次
いで、10μlDNA混合物当り、0.5μｌの0.2M Mg(OAc)2を
添加した。
B.反応混合物。
−20℃で保存されたメタノール固定された細胞を、実
施例９で前記に述べたように、冷EtOH洗浄のシリーズを
介した脱水、次いで、１×酢酸反応緩衝液（グリセロー
ルなし）中で２回洗浄することにより、蛍光インサイチ
ューハイブリダイゼーションのために調製した。細胞
を、緩衝液を除く前に、37℃で10分間最終洗浄緩衝液中
でインキュベートし、そして21μｌのRecAコートされ、
ビオチン化されたプローブおよび競合物DNA混合物を、
細胞ペレットに添加した。
プローブを、37℃水浴中で３時間細胞と反応させた。
反応物は、37℃で、250μｌの1.75×SSC（pH7.4）の添
加により、停止し、混合し、室温（RT）で遠心分離し細
胞をペレット化し、そして上澄を除去した。細胞を37℃
で250μｌの1.75×SSCで５分間２回洗浄し、次いで遠心
分離し、そして上澄を除去した。
300μｌの濾過された前ブロック溶液を、処理され、
洗浄された細胞に添加し、そしてRTで20分間インキュベ
ートした。遠心分離および上澄除去の後、濾過された前
ブロック溶液中の、90μｌの５μg/ml FITC−アビジン
を各反応に添加し、暗所中で20分間室温でインキュベー
トした。遠心分離により、細胞をペレット化した後、FI
TC−アビジンを除去した。反応した細胞を、細胞とゆっ
くり混合された４×SSC（pH7.4）中、250μｌの４×SSC
＋0.1％“TRITON Ｘ−100"、および250μｌの４×SSC
で連続的に洗浄した。各洗浄の後、細胞をペレット化
し、そして洗浄液体を除去した。
最終洗浄の後、細胞を風乾し、そして約20μｌの抗退
色剤を各細胞反応に添加した。細胞をスライドガラス上
のマウントし、カバーガラスでカバーし、そしてZeiss
LSMで検査した。適度ないし明るいハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを含有する細胞を、ハイブリダイゼーショ
ン陽性として数えた（表１参照）。
表１に示す結果は、異質なDNAでなく、相同なHBV DNA
のみが、特異的にビオチン化されたHBV DNAプローブシ
グナルと競合することを示す。
図16Aから16C中に示された細胞は、表１中に記載され
た競合実験から得られた。図16:16A、ビオチン化された
HBVプローブ＋過剰の非ラベルHBVプローブDNA;16B、ビ
オチン化されたHBVプローブ＋過剰の非ラベルφX174DN
A;16C、ビオチン化されたHBVプローブ＋過剰の非ラベル
ヒト胎盤DNA（“BLOCKITTM";Oncor）。FITCプローブシ
グナルは、レーザー走査モードのZeiss LSMを用いて観
察した。
HBVプローブからの観察されたFITCシグナルは、細胞
の位相イメージ上に二重に焼き付けられて示された。各
実験からのいくつかの細胞が示される。このシグナルお
よび細胞イメージから、相同HBV DNAが特異的にビオチ
ン化されたHBV DNAプローブシグナルと競合するが、異
質のDNAは競合しないことが明かである。
本発明が、特定のプロトコールと使用に関して記載さ
れているが、種々の変化および改変が本発明を離れるこ
となく成されるされ得ることが認識され得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 セナ，エリッサ ピー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94301，パロ アルト，キングスレイ アベニュー，555 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68,1/70 Ｍｅｄｌｉｎｅ

Claims (49)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】固定された、細胞または細胞下生物構造内
    に含まれる二本鎖の核酸中の既知の標的配列の存在を、
    該構造で規定された形態関係で同定する方法であって、 該構造に、二重鎖の標的配列に相補的な、一本鎖の、レ
    ポーターでラベルされたプローブに安定に結合したRecA
    タンパク質を含むプローブ複合体を、該複合体が、該二
    重鎖の核酸標的に接触し得る条件下で、添加する工程、 該複合体を、非変性条件下で、該標的配列に結合する工
    程、 該構造から、未結合の複合体を、除去する工程、および 該構造を、該核酸に結合したレポーターラベルされたプ
    ローブの存在について検査する工程、を包含する方法。
  2. 【請求項２】前記複合体が、ATPγＳ、GTPγＳ、ATP、d
    ATP、および、ATPγＳとADPとの組み合せからなる群か
    ら選択されるコファクターの存在により安定化される、
    請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記プローブがリガンドレポーターでラベ
    ルされ、そして、前記検査する工程が、前記構造に、該
    リガンドに安定に結合し、そして検出可能なレポーター
    基を有する抗体を包含する、特定のリガンド分子を添加
    する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】宿主細胞において、病原性（外来）標的二
    重鎖該酸配列の存在を検出するための、請求項１に記載
    の方法であって、前記複合体は、宿主細胞固定の条件下
    で該細胞に添加され、そして前記検査する工程が、該固
    定された細胞中でプローブに結合したレポーターの存在
    を検出する工程を包含する方法。
  5. 【請求項５】前記検査する工程が、顕微鏡使用または蛍
    光活性化細胞ソーターを用いて、前記核酸に結合したレ
    ポーターラベルされたプローブに結合した蛍光レポータ
    ーを検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】宿主細胞ゲノム中に組み込まれた、選択さ
    れた標的二重鎖核酸配列を局在化するための、請求項１
    に記載の方法であって、前記複合体が、前記細胞の染色
    体に添加され、そして前記検査する工程が、染色体を顕
    微鏡的に検査する工程を包含し、染色体超微細構造に関
    係するレポーターラベルされたプローブの相対位置を決
    定する方法。
  7. 【請求項７】前記染色体が、第１の蛍光レポーターでラ
    ベルされ、前記プローブが、第２の蛍光レポーターでラ
    ベルされ、そして前記検査する工程が、該２種類のレポ
    ーターの各々で蛍光を励起するのに有効な波長で、蛍光
    顕微鏡により、前記細胞を別々に観察する、請求項６に
    記載の方法。
  8. 【請求項８】選択された染色体中で標的配列を局在化す
    るための、請求項６に記載の方法であって、該方法は、
    さらに、前記構造に、選択された染色体の既知の領域中
    の二重鎖に相補的な、一本鎖の、レポーターでラベルさ
    れた核酸プローブに安定に結合したRecAタンパク質を含
    む第２のプローブ複合体を添加する工程を包含し、そし
    て前記検査する工程が、２種の複合体の各々と結合する
    レポーターの相対位置を測定する工程を包含する方法。
  9. 【請求項９】前記第１の複合体および第二の複合体が異
    なる蛍光レポーターでラベルされ、そして前記検査する
    工程が、該２種類のレポーターの各々で蛍光を励起する
    のに有効な波長で、蛍光顕微鏡により、前記細胞を別々
    に観察する、請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記添加する工程の前に、前記構造中の
    標的二重鎖核酸を増幅する工程をさらに包含する、請求
    項１に記載の方法。
  11. 【請求項１１】ポリメラーゼ、および４種類のデオキシ
    トリヌクレオチドの全てを添加することにより、前記標
    的に結合したプローブを増幅する工程をさらに包含す
    る、請求項１に記載の方法であって、該デオキシトリヌ
    クレオチドの一種が、レポーターラベルを含有する方
    法。
  12. 【請求項１２】前記固定された構造が、溶液中またはス
    ライドガラス上にある、請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記固定された構造が、前記RecAプロー
    ブ複合体の添加前に、pH7.5の10mMトリス−酢酸緩衝液
    中、55−60℃でインキュベートされる、請求項１に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】前記複合体を、非変性条件下で、標的配
    列に結合する工程が、２時間未満の間で実行される、請
    求項１に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記添加する工程が、アクセサリータン
    パク質の添加を包含する、請求項１に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記アクセサリータンパク質が、トポイ
    ソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼIIである、請求項
    15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】固定された細胞または細胞下生物構造中
    に含まれる既知の二本鎖ウィルス核酸標的配列の存在を
    同定する方法であって、 該構造に、該二重鎖ウィルス核酸の標的配列に相補的
    な、一本鎖の、レポーターでラベルされたプローブに安
    定に結合したRecAタンパク質を含むプローブ複合体を、
    該複合体が該二本鎖核酸標的に接触し得る条件下で添加
    する工程、 該複合体を、非変性条件下で該標的配列に結合させる工
    程、 該構造から未結合の複合体を除去する工程、および 該構造を、該核酸に結合した、レポーターラベルされた
    プローブの存在について検査する工程、を包含する方
    法。
  18. 【請求項１８】前記既知のウィルス標的が、Ｂ型肝炎ウ
    ィルスに由来する配列である、請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記RecAプローブ複合体の添加前に、前
    記固定された構造が、pH7.5の10mMトリス−酢酸緩衝液
    中、55−60℃でインキュベートされる、請求項17に記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】前記複合体が、ATPγＳ、GTPγＳ、AT
    P、dATP、および、ATPγＳとADPとの組み合せからなる
    群から選択されるコファクターの存在により安定化され
    る、請求項17に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記プローブがリガンドレポーターでラ
    ベルされ、そして、前記検査する工程が、前記構造に、
    該リガンドに安定に結合し、そして検出可能なレポータ
    ー基を有する、特定のリガンド分子を添加する工程を包
    含する、請求項17に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記リガンドレポーターが、ジゴキシゲ
    ニンまたはビオチンであり、そして前記リガンド分子
    が、抗体、アビジンおよびストレプトアビジンからなる
    群から選択される、請求項21に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記検査する工程が、顕微鏡使用または
    蛍光活性化細胞ソーターを用いて、前記核酸に結合した
    レポーターラベルされたプローブに結合した蛍光レポー
    ターを検出する工程を包含する、請求項17に記載の方
    法。
  24. 【請求項２４】宿主細胞ゲノム中に組み込まれた、選択
    された標的二重鎖核酸配列を局在化するための、請求項
    17に記載の方法であって、前記複合体が、前記細胞の染
    色体に添加され、そして前記検査工程が、染色体を顕微
    鏡的に検査する工程を包含し、染色体超微細構造に関係
    するレポーターラベルされたプローブの相対位置を決定
    する方法。
  25. 【請求項２５】請求項17に記載の方法を実施するための
    キットであって、前記ウィルス核酸配列に由来する、Re
    cA−タンパク質でコートされたDNAプローブを含有する
    キット。
  26. 【請求項２６】前記プローブがＢ型肝炎ウィルス配列に
    由来する、請求項25に記載のキット。
  27. 【請求項２７】前記プローブがレポーターラベルされ
    た、請求項25に記載のキット。
  28. 【請求項２８】前記レポーターがビオチンまたはジゴキ
    シゲニンである、請求項27に記載のキット。
  29. 【請求項２９】前記キットが、さらに、試料中の前記既
    知の二本鎖ウィルス核酸配列に対するプローブの結合を
    検出する手段を包含し、そして該検出手段が、顕微鏡使
    用または蛍光活性化細胞ソーターを用いて、核酸に結合
    したレポーターラベルされたプローブに結合した蛍光レ
    ポーターを検出することを包含する、請求項25に記載の
    キット。
  30. 【請求項３０】前記固定された構造が、溶液中またはス
    ライドガラス上にある、請求項17に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記複合体を、非変性条件下で、標的配
    列に結合する工程が、２時間未満の間で実行される、請
    求項17に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記添加する工程が、アクセサリータン
    パク質の添加を包含する、請求項17に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記アクセサリータンパク質が、トポイ
    ソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼIIである、請求項
    32に記載の方法。
  34. 【請求項３４】細胞または細胞下生物構造中に含まれる
    単一コピー核酸標的配列を検出する方法であって、 該細胞または細胞下生物構造を固定する工程、 該構造に、該単一コピー核酸標的配列に相補的な、一本
    鎖の、レポーターラベルされたプローブに安定に結合し
    たRecAタンパク質を含むプローブ複合体を、該複合体が
    該核酸標的に接触し得る条件下で添加する工程、 該複合体を、非変性条件下で、該標的配列に結合する工
    程、 該構造から、未結合の複合体を除去する工程、および 該構造を、該核酸に結合した、レポーターラベルされた
    プローブの存在について検査する工程、を包含する方
    法。
  35. 【請求項３５】前記固定が溶液中またはスライドガラス
    上である、請求項34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記固定する工程が、55−60℃で、固定
    された構造のpH7.5の10mMトリス−酢酸緩衝液中でのイ
    ンキュベーションを包含する、請求項34に記載の方法。
  37. 【請求項３７】前記複合体を、非変性条件下で、標的配
    列に結合する工程が、２時間未満の間で実行される、請
    求項34に記載の方法。
  38. 【請求項３８】前記添加する工程が、アクセサリータン
    パク質の添加を包含する、請求項34に記載の方法。
  39. 【請求項３９】前記アクセサリータンパク質が、トポイ
    ソメラーゼＩまたはトポイソメラーゼIIである、請求項
    38に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記複合体が、ATPγＳ、GTPγＳ、AT
    P、dATP、および、ATPγＳとADPとの組み合せからなる
    群から選択されるコファクターの存在により安定化され
    る、請求項34に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記プローブがリガンドレポーターでラ
    ベルされ、そして、前記検査する工程が、前記構造に、
    該リガンドに安定に結合し、そして検出可能なレポータ
    ー基を有する、特定のリガンド分子を添加する工程を含
    む、請求項34に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記リガンドレポーターが、ジゴキシゲ
    ニンまたはビオチンであり、そして前記リガンド分子
    が、抗体、アビジンおよびストレプトアビジンからなる
    群から選択される、請求項41に記載の方法。
  43. 【請求項４３】前記検査する工程が、顕微鏡使用または
    蛍光活性化細胞ソーターを用いて、前記核酸に結合した
    レポーターラベルされたプローブに結合した蛍光レポー
    ターを検出する工程を包含する、請求項34に記載の方
    法。
  44. 【請求項４４】宿主細胞ゲノム中に組み込まれた、選択
    された標的二重鎖核酸配列を局在化するための、請求項
    34に記載の方法であって、前記複合体が、前記細胞の染
    色体に添加され、そして前記検査する工程が、染色体を
    顕微鏡的に検査する工程を包含し、染色体超微細構造に
    関係するレポーターラベルされたプローブの相対位置を
    決定する方法。
  45. 【請求項４５】請求項34に記載の方法を実施するための
    キットであって、単一コピー核酸配列に由来するRecAタ
    ンパク質でコートされたDNAプローブを含有するキッ
    ト。
  46. 【請求項４６】前記プローブが、p53腫瘍サプレッサー
    遺伝子配列に由来する、請求項45に記載のキット。
  47. 【請求項４７】前記プローブが、レポーターラベルされ
    る、請求項45に記載のキット。
  48. 【請求項４８】前記レポーターが、ビオチンまたはジゴ
    キシゲニンである、請求項47に記載のキット。
  49. 【請求項４９】前記キットが、さらに、試料中の前記単
    一コピー核酸配列に対するプローブの結合を検出する手
    段を包含し、そして該検出手段が、顕微鏡使用または蛍
    光活性化細胞ソーターを用いて、核酸に結合したレポー
    ターラベルされたプローブに結合した蛍光レポーターを
    検出することを包含する、請求項45に記載のキット。
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