KR100760525B1 - 병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트 및 검출방법 - Google Patents

병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트 및 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혼성화 반응(hybridization reaction) 및 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용한 병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트 및 이를 이용하여 병원성 미생물을 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것으로, 낚시탐침(fishing probe)이 고정된 혼성화 모듈(hybridization module), 태그(tag)가 표지된 보고탐침(reporter probe), 표준시료(standard sample), 혼성화 완충용액(hybridization buffer), 세척용액, 변성용액, 중화용액, 항체 희석용액, 효소연결 항-태그 항체(enzyme-linked anti-Tag antibody) 및 상기 효소의 기질용액을 포함하는 본 발명의 검출킷트는 유전물질을 정제하거나 증폭하지 않고 혼성화 반응 및 ELISA의 조합에 의해 바이러스, 세균, 원생생물 등 여러 종류의 병원성 미생물을 한번에 정량적으로 검출할 수 있게 하며, 간단한 방법에 의해 재생하여 반복 사용할 수 있으므로 시간과 비용 면에서 매우 경제적이다.

Description

병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트 및 검출방법{KIT AND METHOD FOR QUANTITATIVELY DETECTING MULTIPLE PATHOGENS WITHOUT GENE AMPLIFICATION}
도 1은 본 발명에 따라 낚시탐침이 고정된 DNA 혼성화 모듈을 제작하는 과정을 나타내는 모식도이고,
도 2는 도 1에 따라 제작된 DNA 혼성화 모듈을 이용하여 혼성화 반응 및 ELISA를 통해 병원성 미생물을 검출하는 과정을 나타내는 모식도이고,
도 3은 흰반점 바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)의 게놈 염기서열에서 낚시탐침 및 보고탐침이 인식하는 부위와 이들 각각을 증폭하도록 고안된 프라이머들을 나타낸 것이고,
도 4는 간췌장 바이러스(hepatopancreatic parvo-like virus, Hpv)의 게놈 염기서열에서 낚시탐침 및 보고탐침이 인식하는 부위와 이들 각각을 증폭하도록 고안된 프라이머들을 나타낸 것이고,
도 5는 도 1에 따라 제작된 DNA 혼성화 모듈을 여러 종류의 병원성 미생물을 동시에 다중 분석하기 위해 배열한 모식도를 나타낸 것이고,
A: 2종 병원성 미생물을 검출하기 위한 배열
B: 12종 병원성 미생물을 검출하기 위한 배열
도 6은 도 1에 따라 제작된 DNA 혼성화 모듈을 병원성 미생물을 정량적으로 분석하기 위해 배열한 모식도를 나타낸 것이고,
도 7a 및 7b는 각각 본 발명에 따른 검출킷트를 이용하여 간췌장 바이러스 및 흰반점 바이러스의 표준시료를 대상으로 표준곡선을 작성한 결과이고,
도 8a 및 8b는 본 발명에 따른 검출킷트에 의해 작성된 표준곡선의 회귀곡선 방정식을 이용하여 실제 표본시료를 대상으로 간췌장 바이러스 및 흰반점 바이러스를 검출한 결과이고,
도 9a 및 9b는 각각 본 발명에 따른 검출킷트를 이용하여 담배모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus, TMV) 및 무잎말림병 바이러스(Beet Curly Top Virus, BCTV)의 표준시료를 대상으로 작성한 표준곡선과 이를 이용하여 실제 표본시료를 대상으로 담배모자이크 바이러스 및 무잎말림병 바이러스를 검출한 결과이고,
도 10a 및 10b는 각각 본 발명에 따른 검출킷트를 이용하여 돌돔 이리도바이러스(Rock Bream Iridovirus, RBIV) 유래 MCP 유전자의 표준시료를 대상으로 작성한 표준곡선과 이를 이용하여 실제 표본시료를 대상으로 돌돔 이리도바이러스 유래 MCP 유전자를 검출한 결과이고,
도 11a 및 11b는 각각 본 발명에 따른 검출킷트를 이용하여 양식 대하(Penaeus chinensis) 유래 CHH/GIH/MIH 유전자의 표준시료를 대상으로 작성한 표준곡선과 이를 이용하여 실제 표본시료를 대상으로 양식 대하 유래 CHH/GIH/MIH 유전자를 검출한 결과이고,
도 12a 및 12b는 각각 본 발명에 따른 검출킷트를 이용하여 비브리오 벌니휘 쿠스(Vibrio vulnificus) 유래 사이토라이신(cytolysin) 유전자의 표준시료를 대상으로 작성한 표준곡선과 이를 이용하여 실제 표본시료를 대상으로 비브리오 벌니휘쿠스 유래 사이토라이신 유전자를 검출한 결과이다.
본 발명은 유전물질을 정제하거나 증폭하지 않고도 혼성화 반응 및 효소면역분석법의 조합에 의해 병원성 미생물을 정량적으로 검출하고 정확하게 진단할 수 있는 킷트 및 이를 이용하여 병원성 미생물을 정량적으로 검출하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 병원성 미생물체의 진단방법으로 증상을 관찰하는 방법, 현미경을 이용하여 관찰하는 방법, 병원성 미생물의 특정 항원을 검출하는 면역학적 방법, 그리고 PCR 기술을 이용하여 특이 유전자를 증폭하는 방법 등이 이용되고 있다. 증상 관찰로 병의 원인이 되는 생물체를 추정하는 것은 전통적인 방법이지만 직접적인 진단방법이 되지 못하기 때문에, 현미경으로 병원성 미생물을 관찰하거나 병원성 미생물이 독특하게 가지는 항원에 대한 면역반응을 이용하여 병의 원인균을 확인하는 것이 필요하다.
그러나, 현미경적 방법을 적용하려면 병원체가 일반 현미경으로 관찰할 수 있을 정도로 커야 하고, 표본에서 쉽게 찾아볼 수 있을 정도로 밀도가 높아야 할 뿐만 아니라 그 형태가 다른 생물체와 뚜렷하게 구분되어야 한다. 즉, 바이러스와 같은 미세한 생물체나 서로 모양이 유사한 세균들의 경우에는 현미경을 이용해서는 정확한 진단이 어렵다.
병원성 미생물의 항원을 추적하는 면역학적 방법은 원인 생물체를 정확하게 진단할 수는 있지만, 이를 위해서는 원인 생물체의 밀도가 충분히 높아야만 하고 모든 원인 생물체의 유일 항원에 대한 항체를 입수하는 것이 항상 가능하지 않다는 문제점이 있다.
병원성 미생물을 진단하는 가장 진보된 기술은 병원성 미생물만이 갖는 특정 유전자를 증폭한 후 이 유전자의 존재 여부를 확인하여 진단하는 PCR 방법이다. 이 PCR 방법은 모든 생물체가 공통적으로 가지는 DNA 혹은 RNA 유전체를 이용하여 특정 유전자를 증폭하는 것이므로, 이러한 특정 유전자에 대한 정보만 있다면 생물체의 크기, 형태, 밀도 여부와 무관하게 모든 생물체에 대하여 진단이 가능하다. 최근에 개발된 실시간(Real-Time) PCR 방법을 이용하면 병원성 미생물의 정확한 정량도 가능하다.
PCR 방법은 매우 정밀하고 정확한 진단을 가능하게 하지만 반드시 유전자 증폭과정을 거쳐야 하기 때문에 여러 가지 요인에 의해서 크게 영향을 받는다. 예를 들면, 유전물질을 정제하는 과정에서 남아 있는 불순물들이 증폭을 저해하거나 비특이적 증폭을 유발할 수 있고, 유전물질을 정제하고 유전자를 증폭하는 과정에서 많은 시간과 비용이 소요되며, 고가의 정밀 기기와 숙련된 전문가를 필요로 하는 등의 문제점이 있다.
이에, 본 발명자는 기존에 병원성 미생물을 진단하는 방법에 있어서의 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 유전자 증폭을 하지 않고 혼성화 반응(hybridization reaction) 및 효소면역항체분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)의 조합을 이용하여 생물종 특이적 유전자를 직접 검사함으로써 질병의 원인이 되는 생물체를 정확하게 검출하고 정량할 수 있는 킷트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 혼성화 반응 및 ELISA를 이용하여 간단하고 경제적인 방법으로 병원성 미생물을 정확하고 정량적으로 검출할 수 있는 킷트 및 이를 이용하여 병원성 미생물을 정량적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈, 태그가 표지된 보고탐침, 표준시료, 혼성화 완충용액, 세척용액, 변성용액, 중화용액, 항체 희석용액, 효소연결 항-태그 항체 및 상기 효소의 기질용액을 포함하고, 유전물질을 정제하거나 증폭하지 않고도 혼성화 반응 및 ELISA의 조합에 의해 병원성 미생물을 정량적으로 검출하고 정확하게 진단할 수 있는 킷트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 킷트를 이용하여 병원성 미생물을 검출하고 정량하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 "낚시탐침(fishing probe)"이란 검출하고자 하는 특정 병원성 미생물의 특이 유전자 부위를 인식하도록 고안된 염기서열을 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드(또는 단일가닥 DNA 사슬)로서, 상기 특이 유전자 부위를 포함하는 분석시료 및 보고탐침과 혼성화되어 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체를 형성한다.
또한, 본 발명에서 "보고탐침(reporter probe)"이란 검출하고자 하는 특정 병원성 미생물의 특이 유전자들 중에서 상기 낚시탐침의 인식부위와 중복되지 않는 다른 특이 유전자 부위를 인식하도록 고안된 염기서열을 갖는 태그(tag)가 표지된 이중가닥 폴리뉴클레오티드(또는 이중가닥 DNA 사슬)로서, 분석시료 및 낚시탐침과 혼성화되어 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체를 형성한다.
아울러, 본 발명에서 "표준시료(standard sample)"란 검출하고자 하는 특정 병원성 미생물의 유전자를 주형으로 하여 낚시탐침에 의해 인식되는 특이 유전자 부위와 보고탐침에 의해 인식되는 또 다른 특이 유전자 부위를 모두 포함하도록 PCR로 증폭된 DNA이다.
본 발명에 따른 병원성 미생물을 검출하고 정량하기 위한 킷트는
1) 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈;
2) 태그가 표지된 보고탐침;
3) 표준시료;
4) 혼성화 완충용액;
5) 세척용액;
6) 변성용액;
7) 중화용액;
8) 항체 희석용액;
9) 효소연결 항-태그 항체; 및
10) 상기 효소의 기질용액을 포함한다.
먼저, 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈은
1) 특정 병원성 미생물의 특이 유전자 부위를 인식하는 낚시탐침을 증폭할 수 있는 낚시프라이머(fishing primer) 쌍을 고안하고, 이들 중 역방향 낚시프라이머를 분석용기의 표면에 공유 결합시키는 단계;
2) 상기 낚시프라이머 쌍을 이용한 고체상 PCR(solid-phase PCR) 반응을 통해서 낚시탐침을 증폭하는 단계;
3) DNA를 변성시켜 고정된 단일가닥 낚시탐침만 남기고 나머지 가닥들을 제거하는 단계; 및
4) 비특이적 DNA를 이용하여 용기 표면의 비특이적 부착력(non-specific binding capacity)을 제거하는 단계에 의해 제작될 수 있다(도 1 참조).
단계 1)에서, 낚시탐침은 병원성 미생물의 특이 유전자 부위를 포함하는 단 일가닥 폴리뉴클레오티드로서, 상기 유전자 부위를 인식하도록 고안된 낚시프라이머 쌍을 이용한 고체상 PCR 반응을 통해서 증폭된다. 먼저, 분석용기의 고체 표면에 낚시프라이머를 공유결합시켜 고정하기 위해서는 표면에 프라이머의 인산화 말단과 공유결합을 형성할 수 있는 작용기가 노출된 스트립 모듈(NucleoLinkTM strip module, NUNC Inc.)과 5'-말단이 인산화된 프라이머(5'-phosphorylated primer)가 필요하다. 이때, 양 방향 프라이머의 5'-말단을 모두 인산화시키는 것이 아니라 역방향 프라이머의 5'-말단만을 인산화시켜 모듈에 고정시키고 정방향 프라이머는 PCR 반응용액에 첨가하여 용액상으로 제공한다. 이로 인해 정방향 프라이머는 주형에 대한 혼성화와 변성이 자유롭게 일어날 수 있어 PCR 반응동안의 어닐링 효율을 증가시킬 수 있다.
각 반응 웰(well)당 100 내지 200 ng(약 10 내지 20 pmole)의 역방향 낚시프라이머를 80 ㎕의 10 mM 1-메틸-이미다졸(1-methyl-imidazole) 용액과 10 mM 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide) 용액에 희석하여 모듈의 미세 컵에 동일한 부피로 첨가하고 50℃에서 1 내지 3일 동안 반응시킨다. 반응시간이 경과하면 반응액을 버리고 반응액의 1.5 내지 2배 부피의 NaOH 변성용액(Tween 20 함유)을 넣고 50℃에서 2분간 3회, 15분간 1회 및 2분간 3회 세척한다. 세척한 용기에 변성용액과 동일한 부피의 중화용액을 넣고 15분간씩 3회 세척한다.
단계 2)는 단계 1)에서 분석용기의 표면에 고정시킨 역방향 낚시프라이머로 부터 낚시탐침을 신장시키는 단계로, 모듈의 각 미세 컵에 정방향 및 역방향 낚시프라이머를 포함하는 고체상 PCR(solid-phase PCR) 반응용액 50 ㎕를 넣고 PCR 반응을 수행한다.
단계 2)에서 PCR이 완료되면, 반응액을 버리고 1.5 내지 2배 부피의 NaOH 변성용액(Tween 20 함유)을 첨가하고 50 내지 55℃에서 2분간 3회, 15분간 1회 및 2분간 3회 세척함으로써 고정된 단일가닥 낚시탐침만 남기고 나머지 가닥들은 제거한다. 여기에 동일한 부피의 중화용액(100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1％ Tween 20)을 넣고 15분간 3회 세척하여 잔류한 NaOH 변성용액를 제거한다.
단계 4)에서는 모듈의 각 미세 컵에 50 ㎕의 혼성화 완충용액과 동일량의 비특이 DNA 용액을 넣은 뒤 1 내지 3시간 동안 50 내지 55℃에서 혼성화 반응을 수행한다. 혼성화 완충용액을 버리고 1.5 내지 2배 부피의 NaOH 변성용액(Tween 20 함유)을 넣고 50 내지 55℃에서 2분간 3회, 15분간 1회 및 2분간 3회 세척함으로써 분석용기 표면의 비특이적 부착력을 제거한다. 이와 같이 준비된 모듈은 밀봉하여 4℃에 보관한다.
또한, 태그가 표지된 보고탐침은 다음과 같이 제작된다.
먼저, 검출하고자 하는 병원성 미생물에서 낚시탐침이 인식하는 특이 유전자 부위와 겹치지 않는 다른 특이 유전자 부위를 선발하고 이 부위를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 고안한다. 병원성 미생물의 게놈 DNA를 대상으로 상기 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 보고탐침 DNA 절편을 증폭한다. 이때, dNTP와 함께 태그가 표지된 dUTP, 예를 들면, 딕옥시제닌(digoxygenin), 바이오틴(biotin), 플루 오르세인(fluorescein) 등이 표지된 dUTP를 첨가하거나 또는 방사성 동위원소가 표지된 데옥시뉴클레오티드(deoxynucleotide)를 첨가하여 PCR 반응을 수행함으로써 태그가 표지된 보고탐침을 증폭할 수 있다. 이로부터 증폭된 산물을 아가로스 겔에서 정제하고 농도를 측정한 후 4℃에 보관한다.
표준시료(standard sample)는 검출하고자 하는 병원성 미생물의 특이적 유전자를 PCR로 증폭하여 제조하는데, 낚시탐침이 인식하는 부위와 보고탐침이 인식하는 부위를 모두 포함하도록 고안하여야 한다. 이로부터 증폭된 표준시료는 아가로스 겔에서 정제한 후 DNA 양을 정량하고 몰농도를 측정하여 유전자 카피수(gene copy number)를 계산한다.
낚시탐침-분석시료-보고탐침이 혼성화된 3중 복합체를 형성하기 위한 혼성화 완충용액은 10× SSC(1.5 M NaCl, 0.15 M 소듐 시트레이트, pH 7.0), 0.2％ 사르코신(sarcosine), 0.04％ SDS(sodium dodecyl sulfate), 0.2% 차단용액(0.2% 탈지유단백질(w/v) 50 mM, Tris-HCl 150 mM, pH 7.4) 및 1 내지 4 mM CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)을 포함한다.
세척용액은 0.5× 내지 2× SSC(75 내지 300 mM NaCl, 7.5 내지 30 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액을 사용하는데, 예비 혼성화 반응 후의 세척단계에서는 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액을 사용하고, 혼성화 반응 후 잔존하는 혼성화 완충용액과 결합되지 않은 보고탐침을 제거하는 세척단계에서는 2× SSC(300 mM NaCl, 30 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0); 1× SSC(150 mM NaCl, 15 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0); 및 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시 트레이트, pH 7.0) 각각을 순차적으로 사용한다.
변성용액으로는 0.4 N NaOH(0.25％ Tween 20 함유) 용액과 0.2 N NaOH(0.1％ Tween 20 함유) 용액 두 가지를 사용한다. 0.4 N NaOH(0.25％ Tween 20 함유) 용액은 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈 제작시 분석용기의 표면에 공유결합되지 않은 낚시프라이머를 제거하기 위해 사용된다. 또한, 0.2 N NaOH(0.1％ Tween 20 함유) 용액은 분석용기의 표면에 고정된 단일가닥의 낚시탐침을 제외한 나머지 가닥들을 제거하고, 비특이적 부착력 제거를 위해 사용된 비특이 DNA를 제거하며, 분석이 완료된 후 분석용기의 낚시탐침에 혼성화된 분석시료와 보고탐침을 제거하여 분석용기를 재생시킨다.
중화용액은 상기 변성용액 처리 후 이를 중화시키거나 분석용기에 부착된 낚시 탐침을 활성화하기 위해 사용되는 것으로 100 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl 및 0.1％ Tween 20을 포함한다.
항체 희석용액은 ELISA 분석에 사용될 효소연결 항-태그 항체를 적절한 농도로 희석하기 위해 사용되는 용액으로, 1％ 탈지유단백질(w/v), 50 mM Tris-HCl(pH 7.4), 및 150 mM NaCl을 포함한다.
효소연결 항-태그 항체(enzyme-linked anti-Tag antibody)는 보고탐침에 표지된 태그에 대한 항체로 기질과의 반응에 의해 발색반응을 일으킬 수 있는 효소가 연결되어 있다. 이러한 효소로는 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다제(β-galactosidase) 등이 사용될 수 있다. 상기 효소연결 항-태그 항체는 낚시탐침-분 석시료-보고탐침의 3중 복합체에서 보고탐침에 표지된 태그에 결합하고, 이후 첨가된 기질과의 반응에 의해 발생반응을 나타내므로, 발색의 강도를 측정함으로써 분석시료가 검출하고자 하는 해당 병원성 미생물에 감염되었는지 여부를 정량적으로 확인할 수 있다. 이때, 상기 효소의 기질로는 루미놀(luminol), 4-나이트로페닐인산(4-nitrophenyl phosphate), CSPD(Disodium 3-(4-metho xyspiro {1,2-dioxetane-3,2-(5-chloro)tricyclo [3.3.1.13,7]decan}-4-yl)phenyl phosphate), X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-d-galactoside) 등 각 효소에 적합한 기질이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 킷트를 이용하여 병원성 미생물을 검출하고 정량하는 방법을 제공한다 (도 2 참조).
상기 방법은
1) 혼성화 모듈에 고정된 낚시탐침을 활성화시키는 단계;
2) 상기 혼성화 모듈에 분석시료, 보고탐침과 혼성화 완충용액을 넣고 혼성화 반응을 유도하여 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체를 형성하는 단계;
3) ELISA를 이용하여 상기 3중 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
4) 혼성화 모듈을 세척하여 재생하는 단계를 포함한다.
단계 1)에서는, 분석하고자 하는 병원성 미생물의 종류에 따라 해당 병원성 미생물의 특이 유전자 부위를 인식하도록 고안된 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈을 적당한 조합으로 고정틀에 끼우고 중화용액(100 mM Tris-Cl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1％ Tween 20)으로 15분간 3회 세척하여 낚시탐침을 활성화시킨다.
단계 2)는 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체 형성을 위한 혼성화 단계로, 분석시료와 태그가 표지된 보고탐침을 혼합하여 95 내지 100℃에서 10 내지 20분간 변성시킨 후 동량의 혼성화 완충용액과 함께 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈에 첨가한다. 상기 혼성화 모듈을 50 내지 55℃에서 1 내지 3시간 동안 가볍게 교반하면서 혼성화 반응을 유도하여 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체를 형성한다.
이때, 분석시료는 다음과 같이 준비한다: 병원성 미생물의 감염여부를 확인하고자 하는 생물 시료를 잘게 자르거나 균질화(chopping or homogenizing)한 다음 단백질 분해효소 K(proteinase K)를 37 내지 50℃에서 1 내지 3시간 동안 처리한다. 이 반응액을 원심분리하여 얻은 상등액(supernatant)을 2배 부피의 100％ 에탄올을 첨가하여 유전물질을 침전시킨 후 분석시료로 사용한다. 분석 시료를 농축하고자 할 때는 유전물질을 침전시킨 후, 침전 전 용액의 부피보다 적은 부피의 증류수에 녹여 사용한다. 분석시료 용액의 제조시간을 단축하고자 할 때는 에탄올 침전을 생략하고 상등액을 바로 사용할 수 있다. 상기 단계 2)의 혼성화 반응을 수행하기 전에 단계 1)에서 활성화된 혼성화 모듈에 0.3% 차단용액을 포함하는 증류수와 동일한 부피의 혼성화 완충용액을 넣고 예비 혼성화 반응을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 즉, 예비 혼성화 단계에서는 0.3% 차단용액이 추가로 첨가되어 총 0.5% 차단용액이 사용된다.
이러한 예비 혼성화 반응은 표본 DNA나 보고탐침 DNA가 플라스틱 모듈의 벽에 비특이적으로 부착하는 것을 차단하기 위한 것으로, 50 내지 55℃에서 0.5 내지 1시간 동안 수행하는 것이 바람직하다. 이 단계에서는 차단용액(1％ 탈지유단백질(w/v) 50 mM, Tris-HCl 150 mM, pH 7.4)을 과량으로, 바람직하게는 0.2 내지 0.6% 정도로 사용함으로써 표본 DNA나 보고탐침의 비특이적 결합을 방지할 수 있고, 예비 혼성화 반응에 사용되는 혼성화 완충용액은 DNA를 포함하지 않으므로 CTAB을 포함하지 않는 것이 바람직하다.
상기와 같이 예비 혼성화를 수행하는 경우에는, 예비 혼성화 반응이 완료된 모듈을 동일한 온도, 즉 50 내지 55℃에서 세척용액으로 세척한 후 혼성화 반응에 들어간다. 이때, 세척과정은 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액을 이용하여 1회 수행한다. 혼성화 반응이 일어나는 동안 혼성화 모듈은 습도 100% 용기에서 55℃를 유지하면서 2시간 동안 250 내지 350 rpm으로 가볍게 흔들어 준다.
또한, 단계 2)의 혼성화 반응이 완료되면, 단계 3)의 ELISA 분석에 들어가기 전에 혼성화 모듈을 50 내지 55℃에서 세척하여 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체를 형성하지 않은 미반응물들을 제거하는 것이 바람직하다. 이때, 세척용액은 0.5× 내지 2× SSC(75 내지 300 mM NaCl, 7.5 내지 30 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액을 사용하는데, 혼성화 반응 후 잔존하는 혼성화 완충용액과 결합되지 않은 보고탐침을 완전히 제거하기 위하여 2× SSC(300 mM NaCl, 30 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 2분간 3회 세척하고, 1× SSC(150 mM NaCl, 15 mM 소듐 시트 레이트, pH 7.0) 용액으로 15분간 1회 세척하고, 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 2분간 3회 세척하는 것이 바람직하다.
단계 3)은 ELISA 분석단계로, 혼성화 반응이 완료된 모듈에 3중 복합체에서 보고탐침의 태그를 인식하는 효소연결 항-태그 항체를 첨가하여 1 내지 3시간 동안 20 내지 25℃에서 반응시키면서 항원-항체 반응을 유도한다. 결합되지 않은 항체를 상온에서 중화용액으로 7회 세척하여 제거한 후 상기 항체에 연결된 효소의 기질을 첨가하고 적정온도에서 반응시켜 발광 또는 발색반응을 유도한다. 이로부터 유도된 발광 또는 발색정도를 각각 발광측정기(Luminometer) 또는 ELISA 판독기 등을 이용해 측정하여 효소활성을 확인한다. 이때, 각 분석시료에서 측정된 효소활성을 표준시료 DNA로부터 얻은 표준곡선과 비교하여 병원성 미생물의 양을 결정한다.
단계 4)는 ELISA 분석이 끝난 후 반응용액을 버리고 낚시탐침에 혼성화된 분석시료 및 보고탐침을 제거하여 혼성화 모듈을 재사용할 수 있도록 재생하는 단계로, 혼성화 모듈에 1.5배 부피의 0.2 N NaOH 변성용액(Tween 20 함유)을 첨가하여 50 내지 60℃에서 3분간 3회, 15분간 1회 세척하고, 0.1% CTAB 용액으로 동일한 온도에서 1시간, 0.1% 사르코신(0.1% SDS 및 0.1% Tween 20 함유) 용액으로 1시간 동안 세척한다. 이때, 측정값이 매우 높은 경우에는 완전한 세척을 위해 0.1% CTAB 용액과 0.1% 사르코신 용액의 세척을 1 내지 2회 추가할 수 있다. 소량의 DNA가 혼성화된 경우에는, 0.1 N NaOH 변성용액(Tween 20 함유)으로 15 내지 30분간 3회 세척하는 것만으로도 혼성화 모듈을 효과적으로 재생시킬 수 있지만, 측정값이 20 만 RLU 이상인 경우에는 상기와 같은 다단계의 세척과정을 거치는 것이 바람직하다. 세척이 충분하게 이루어졌는지 여부는 표본 DNA를 넣지 않은 상태에서 보고탐침 DNA만 넣어 혼성화시킨 후 나타나는 활성을 측정함으로써 검사할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일례에서는, 양식 대하에서 바이러스성 질병을 유발하는 흰반점 바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)와 간췌장 바이러스(hepatopancreatic parvo-like virus, Hpv)를 대상으로 이들을 검출할 수 있도록 낚시탐침 및 보고탐침을 고안하고(도 3 및 4 참조) 이를 이용한 검출킷트를 제작한다. 상기 검출킷트를 이용하여 흰반점 바이러스 및 간췌장 바이러스의 표준시료 DNA를 대상으로 검출함으로써 본 발명의 병원성 미생물 검출킷트가 검출하고자 하는 흰반점 바이러스 및 간췌장 바이러스 표준시료 DNA를 정량적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있다(도 7a 및 7b 참조). 또한, 흰반점 바이러스와 간췌장 바이러스가 감염된 양식 대하와 상기 바이러스들이 감염되지 않은 대하를 대상으로 본 발명의 검출킷트를 이용하여 바이러스를 정량함으로써 각각의 진단키트가 해당 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 8b 참조).
또한, 본 발명의 검출킷트는 단일가닥 DNA 바이러스(ss DNA virus)인 무잎말림병 바이러스와 단일가닥 RNA 바이러스(ss RNA virus)인 담배모자이크 바이러스를 유효한 측정범위 내에서 검출할 수 있어(도 9a 및 9b 참조) 이중가닥 DNA 유전체뿐만 아니라 단일가닥 DNA 유전체와 단일가닥 RNA 유전체의 검출에도 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 검출킷트는 돌돔 이리도바이러스(Rock Bream Iridovirus, RBIV)의 주요 표면 단백질(Major capsid protein, MCP) 유전자를 바이러스의 감염 단계에 따라, 감염된 여류의 장기에 따라 특이적으로 검출할 수 있어(도 10a 및 10b 참조) 바이러스의 감염 확산 양상을 분석하는데 유용하고, 갑각류인 양식 대하(Penaeus chinensis)에서 성장을 조절하는 주요 신경 호르몬 유전자인 CHH/GIH/MIH(Crustachean Hyperglycemic Hormone[CHH]/Gonad Inhibiting Hormone[GIH]/Molt-Inhibiting Hormone[MIH]) 유전자 또한 특이적으로 검출할 수 있어(도 11a 및 11b 참조), 본 발명에 따른 혼성화 모듈을 이용한 검출방법이 바이러스나 박테리아뿐만 아니라 훨씬 큰 유전체를 가지는 다세포 생물체의 유전자를 검출하는데도 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 본 발명의 검출킷트는 비브리오 벌니휘쿠스(Vibrio vulnificus)와 비브리오 헤모리티쿠스(Vibrio haemolyticus)와 같이 분류학적으로 매우 유사한 세균들도 종 특이적으로 검출할 수 있다(도 12a 및 12b 참조).
본 발명에 따른 킷트를 이용하여 다양한 종류의 병원성 미생물을 동시에 다중 분석하기 위해서는 다음과 같은 모듈 배치(module array)가 가능하다.
만약 8×12의 96-웰 마이크로플레이트형 고정틀(NUNC frame)에 1×8 형태의 혼성화 모듈을 배치한다고 하면, 검사를 원하는 병원성 미생물의 종류에 따라 서로 다른 낚시탐침이 고정된 다양한 조합의 혼성화 모듈을 배치할 수 있다. 예를 들어, 두 가지 병원성 미생물을 검사하고자 할 때는 두 종류의 낚시탐침이 고정된 각 각의 혼성화 모듈을 열마다 번갈아 배치하고(도 5의 A 참조), 12가지 병원성 미생물을 검사하고자 할 때는 각 열에 전부 다른 종류의 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈을 배치하면 된다(도 5의 B 참조).
또한, 병원성 미생물의 숫자를 정량적으로 분석하기 위해서는 다음과 같은 모듈 배치가 가능하다. 먼저, 이러한 정량분석을 위해서는 병원성 미생물 특이적인 유전자의 카피수(gene copy number)를 알고 있는 표준시료가 필요하다. 시료를 배치할 때 첫 번째 열(A)에는 공시료(blk; blank)를 넣어 비특이적 결합을 측정하고, 두 번째 열(B)에는 표준시료(STa; standard a, STb; standard b)를 배치하여 정량의 기준으로 삼는다(도 6 참조). 정확한 진단을 위해 표준곡선을 그려서 정량하고자 할 때는, 표준시료 열의 두 번째 행에서부터 여덟 번째 행까지 연속적으로 희석한 표준시료를 배치한다.
한편, 본 발명에 따른 킷트를 사용하여 병원성 미생물을 검출하고 정량하는 방법의 민감도를 증가시키기 위해서는 다음과 같은 방법이 적용될 수 있다.
먼저, 한 종의 병원성 미생물에 대하여 보고탐침이 인식하는 유전자 부위를 복수 개 선발하여 복수 개의 보고탐침을 혼성화시키면 한 개의 낚시탐침-분석시료-복수 개의 보고탐침이 혼성화된 3중 복합체가 형성되고, 혼성화된 보고탐침의 수에 비례하여 최종적으로 검출하는 신호의 강도가 증가하게 된다. 또한, 분석시료를 침전 농축하여 사용하거나, 분석시료의 병원성 미생물 특이 유전자를 미리 PCR로 증폭하여 사용하면 10 유전자 카피수 이하의 병원성 미생물도 검출이 가능하다. 뿐만 아니라, 항체에 연결된 효소의 기질을 선택할 때 발색기질 대신 형광기질이나 발광기질을 사용하면 민감도를 훨씬 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 킷트를 사용하여 병원성 미생물을 검출하고 정량하는 방법으로 특이성을 증가시키기 위해서는 다음과 같은 방법이 고려될 수 있다.
한 종의 병원성 미생물에 대하여 낚시탐침과 보고탐침이 인식하는 복수 개의 유전자 부위를 선발하고, 이를 인식하도록 고안된 서로 다른 낚시탐침과 보고탐침의 조합을 이용한 혼성화 반응을 유도하면, 유사한 유전자를 가진 병원성 미생물도 서로 구별하여 검출할 수 있다. 또한, 분석시료를 복수로 희석하여 분석하면 희석비율에 따라 최종 신호의 강도가 달라지게 되고, 비특이적 반응은 희석비율에 비례하는 변화를 보이지 않으므로 이로부터 특이적 반응을 구분할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 병원성 미생물 검출킷트의 제작
혼성화 반응 및 ELISA를 이용한 병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트를 제작하기 위하여, 먼저 검출하고자 하는 병원성 미생물로 양식 대하에서 바이러스성 질병을 유발하는 흰반점 바이러스(white spot syndrome virus, WSSV)와 간췌장 바이러스(hepatopancreatic parvo-like virus, Hpv)를 선발하였다. 흰반점 바이러스는 이중가닥 DNA 바이러스이고, 간췌장 바이러스는 단일가닥 DNA 바이러스이 다.
<1-1> 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈의 제작
분석용기의 고체 표면에 낚시탐침의 합성을 위한 낚시프라이머를 공유결합시켜 고정하기 위해서 표면에 프라이머의 인산화 말단과 공유결합을 형성할 수 있는 작용기가 노출된 뉴클레오링크 스트립 모듈(NucleoLinkTM strip module, NUNC Inc.)을 분석용기로 사용하였다. 공지된 흰반점 바이러스의 게놈 염기서열(Yang, et al., J. Virol. 75(23): 11811-11820, 2001)에서 66771-67236 뉴클레오티드 부위를 인식하는 낚시탐침 WSV f460을 증폭하기 위해서 서열번호: 1로 기재되는 정방향 프라이머 Wssv3Xba 및 서열번호: 2로 기재되는 역방향 프라이머 Ts6MHtm을 고안하였다(도 3). 이때, 역방향 프라이머 Ts6MHtm은 분석용기의 표면에 고정시키기 위하여 5'-말단을 인산화시켰다. 서열번호: 2의 Ts6MHtm 역방향 프라이머 100 ng을 20 mM 1-메틸-이미다졸(1-methyl-imidazole, pH 7.0)로 희석하여 상기 희석액 50 ㎕와 20 mM 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminoprophyl)-carbodiimide) 50 ㎕를 모듈의 분석용기에 첨가하고 50℃에서 48시간 이상 반응시켜 분석용기의 표면에 상기 프라이머를 고정시켰다. 반응시간이 경과하면 반응액을 버리고 반응액의 1.5배 부피의 0.4 N NaOH 변성용액(0.25％ Tween 20 함유)을 분석용기에 넣고 50℃에서 2분간 3회, 15분간 1회 및 2분간 3회 세척하였다. 세척한 용기에 변성용액과 동일한 부피의 중화용액(100 mM Tris- HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1％ Tween 20)을 넣고 15분간씩 3회 세척하여 분석용기의 표면에 고정되지 않은 프라이머들을 제거하였다.
서열번호: 2의 Ts6MHtm 프라이머가 고정된 분석용기에 50 ㎕의 고체상 PCR(solid-phase PCR) 반응용액을 넣고 PCR 반응을 수행하였다. 이때, PCR 반응용액은 10× 완충용액 5 ㎕, MgCl2 3.5 mM, 정방향 프라이머 Wssv3Xba 0.5 μM, 역방향 프라이머 Ts6MHtm 0.06 μM, 주형 DNA 0.5 ㎕(100 pg), dNTP 0.1 mM 및 Taq 중합효소 2.5 U(Elpis Inc., Korea)을 혼합한 후 증류수로 최종부피를 50 ㎕로 맞추었다. 이때, 분석용기 표면에 고정되어 있는 역방향 프라이머 이외에 PCR 반응용액에 역방향 프라이머를 추가로 첨가하는 이유는 초기 PCR 증폭반응을 촉진하여 용기 벽면에 부착된 낚시프라이머의 신장반응을 충분하게 일어나도록 하기 위한 것이다. 또한, 고정된 역방향 프라이머에 비해 정방향 프라이머가 현저하게 많이 첨가되는 것은 PCR 반응이 일어날 때 가능하면 고체 표면에 고정된 프라이머가 사용되어 많은 양의 낚시탐침이 합성되도록 하기 위해서이다. 이 반응에서 주형 DNA로는 흰반점 바이러스 유전체 DNA로부터 상기한 정방향 프라이머 Wssv3Xba 0.5 μM와 역방향 프라이머 Ts6MHtm 0.5 μM를 사용하여 PCR로 증폭한 460 bp DNA 절편을 분리·정제하여 사용하였고, 이때 농도는 200 pg/㎕로 맞추었다. 상기 반응용액을 94℃에서 1분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분(변성), 54℃에서 1분(어닐링) 및 72℃에서 1분(신장)의 반응을 35회 반복하고 최종적으로 72℃에서 5분간 증폭시켰다.
PCR이 완료되면 분석용기에서 반응액을 제거한 후 1.5배 부피의 0.2 N NaOH 변성용액(0.1％ Tween 20 함유)을 이용하여 55℃에서 2분간 3회, 15분간 1회 및 2분간 3회 세척하여 분석용기 표면에 고정된 프라이머로부터 증폭된 DNA를 변성시킴으로써 고정된 단일가닥 낚시탐침만을 남기고 나머지 가닥들은 제거하였다. 여기에 동일한 부피의 중화용액(100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.1％ Tween 20)을 넣고 15분간 3회 세척하여 잔류 NaOH 성분을 제거하였다. 이와 같이 증폭된 흰반점 바이러스의 낚시탐침 WSV f460은 단일가닥 폴리뉴클레오티드로서 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 갖는다.
상기에서 준비된 모듈의 비특이적 부착력을 제거하기 위해 분석용기 각각에 50 ㎕의 2× 혼성화 완충용액과 비특이 DNA로 동일량의 차단용액(blocking solution; 1％ 탈지유단백질(w/v) 50 mM, Tris-HCl 150 mM, pH 7.4, Roche Inc.)에 희석한 100 pg의 pBluescript 벡터 DNA(Invitrogen Inc.)를 첨가한 후 55℃에서 2시간 동안 혼성화 반응을 수행하였다. 이때, 2× 혼성화 완충용액은 10× SSC(1.5 M NaCl, 0.15 M 소듐 시트레이트, pH 7.0), 0.2％ 사르코신(sarcosine), 0.04％ SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 2 mM CTAB(cetyltrimethylammonium bromide)을 혼합하여 제조하는데, 2 mM CTAB는 100 mM CTAB으로 1/50 부피로 희석하여 별도로 첨가한다. 혼성화 반응이 완료된 후 혼성화 완충용액을 버리고 1.5배 부피의 0.2 N NaOH 변성용액(0.1％ Tween 20 함유)을 이용하여 분석용기를 50℃에서 2분간 3회, 15분간 1회 및 2분간 3회 세척함으로써 표면의 비특이적 부착력을 제거하였다. 이와 같이 준비된 모듈은 밀봉하여 실험에 사용하기 전까지 4℃에 보관하였다.
상기와 동일한 방법으로 간췌장 바이러스에 대한 낚시탐침을 제작하였는데, 이때 공지된 간췌장 바이러스의 게놈 염기서열(Bonami, et al., J. Gen. Virol. 76(Pt4): 813-817, 1995)에서 1805-2190 뉴클레오티드 부위를 인식하는 낚시탐침 hpv f390을 증폭하기 위하여 서열번호: 4로 기재되는 정방향 프라이머 Hpv20L 및 5'-말단이 인산화된 서열번호: 5로 기재되는 역방향 프라이머 Hpv30R을 사용하였고(도 4), 이로부터 증폭된 낚시탐침은 단일가닥 폴리뉴클레오티드로 서열번호: 6으로 기재되는 염기서열을 갖는다.
<1-2> 태그가 표지된 보고탐침의 제작
상기 실시예 <1-1>에서 흰반점 바이러스에 대한 낚시탐침이 인식하는 특이 유전자 부위와는 다른 특이 유전자 부위를 인식하는 태그가 표지된 보고탐침을 다음과 같이 제작하였다. 먼저, 흰반점 바이러스의 게놈 염기서열에서 67266-67454 뉴클레오티드 부위를 인식하는 보고탐침 WSV p190을 증폭하기 위해서 서열번호: 7로 기재되는 정방향 프라이머 WS5Mid 및 서열번호: 8로 기재되는 역방향 프라이머 WSSV5를 고안하였다(도 3). PCR 반응을 위한 주형 DNA로는 흰반점 바이러스 유전체 DNA를 상기 WS5Mid 및 WSSV5 프라이머 쌍을 이용한 PCR로 중폭한 후 이로부터 증폭된 190 bp DNA 절편을 아가로스 겔에서 정제하여 사용하였다. 이때, PCR 반응은 94℃에서 1분간 변성시킨 후 94℃에서 1분(변성), 54℃에서 1분(어닐링) 및 72℃에서 1분(신장)의 반응을 30회 반복하고, 72℃에서 5분간 증폭하였다. 여기서, 흰반점 바이러스 유전체 DNA를 바로 PCR로 증폭하지 않고 PCR로 증폭된 절편을 사용하는 이유는 후자의 경우에 순도가 높은 보고탐침이 대량으로 생산되기 때문이 다.
상기에서 준비된 서열번호: 7 및 8의 프라이머 쌍과 흰반점 바이러스 DNA 절편을 이용하여 보고탐침 증폭을 위한 PCR을 수행하였다. PCR 반응용액은 10× 완충용액 5 ㎕, MgCl2 3.5 mM, 정방향 프라이머 WS5Mid 0.5 μM, 역방향 프라이머 WSSV5 0.5 μM, 주형 DNA 0.5 ㎕, dNTP 0.2 mM(dTTP만 0.12 mM), 딕옥시제닌(digoxygenin)-11-dUTP(Roche Inc., Germany) 0.08 mM 및 Taq 중합효소 2.5 U(Elpis Inc., Korea)을 혼합한 후 증류수로 최종부피를 50 ㎕로 맞추었다. 상기 반응용액을 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분(변성), 56℃에서 1분(어닐링) 및 72℃에서 1분(신장)의 반응을 35회 반복하고 최종적으로 72℃에서 5분간 증폭시켰다. 이로부터 증폭된 산물을 1.6％ 아가로스 겔에서 정제하고 농도를 측정한 후 4℃에 보관하였다. 흰반점 바이러스에 대한 보고탐침 WSV 9190은 이중가닥 폴리뉴클레오티드로서 서열번호: 9로 기재되는 염기서열을 갖는다.
상기와 동일한 방법으로 간췌장 바이러스에 대한 보고탐침을 제작하였는데, 이때 공지된 간췌장 바이러스의 게놈 염기서열에서 2243-2563 뉴클레오티드 부위를 인식하는 보고탐침 hpv p320을 증폭하기 위하여 서열번호: 10으로 기재되는 정방향 프라이머 Hpvp2L 및 서열번호: 11로 기재되는 역방향 프라이머 Hpvp2R을 사용하였고(도 4), 이로부터 증폭된 보고탐침 hpv 9320은 이중가닥 폴리뉴클레오티드로 서열번호: 12로 기재되는 염기서열을 갖는다.
<실시예 2> 병원성 미생물 정량을 위한 표준곡선의 제작
<2-1> 표준시료의 준비
상기 실시예 1에서 제작된 병원성 미생물 검출킷트를 이용한 표준곡선(standard curve)을 제작하기 위하여, 흰반점 바이러스와 간췌장 바이러스에 대한 표준시료(standard sample)로서 각각의 낚시탐침과 보고탐침이 인식하는 부위를 모두 포함하는 DNA 절편을 다음과 같이 PCR로 증폭하였다. 흰반점 바이러스의 표준 DNA는 도 4에서 낚시탐침 WSV f460 인식부위와 보고탐침 WSV p190 인식부위를 모두 포함하는 p680XP 부위로 흰반점 바이러스 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 1의 Wssv3xba 정방향 프라이머 및 서열번호: 8의 WSSV5 역방향 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 또한, 간췌장 바이러스의 표준 DNA는 도 5에서 낚시탐침 hpv f390 인식부위와 보고탐침 hpv p320 인식부위를 모두 포함하는 s760 부위로 간췌장 바이러스 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 4의 Hpv20L 정방향 프라이머 및 서열번호: 11의 Hpvp2R 역방향 프라이머를 이용하여 증폭하였다. 이때, PCR 반응용액은 10× 완충용액 5 ㎕, MgCl2 3.5 mM, 정방향 프라이머 0.5 μM, 역방향 프라이머 WSSV5 0.5 μM, 주형 DNA 200 pg, dNTP 0.2 mM 및 Taq 중합효소 2.5 U(Elpis Inc., Korea)를 혼합한 후 증류수로 최종부피를 50 ㎕로 맞추었다. 상기 반응용액을 94℃에서 2분간 변성시킨 후, 94℃에서 1분(변성), 56℃에서 1분(어닐링) 및 72℃에서 1분(신장)의 반응을 35회 반복하고 최종적으로 72℃에서 5분간 증폭시켰다.
이로부터 증폭된 표준시료 DNA는 아가로스 겔에서 정제한 후 DNA 양을 정량 하였고, 이로부터 몰농도를 측정하여 유전자 카피수(gene copy number)를 계산하였다. 그 결과, 흰반점 바이러스의 표준시료 DNA의 분자량은 4.61×105로 1 ng당 유전자 카피수는 1.3×109이었다. 또한, 간췌장 바이러스의 표준시료 DNA의 분자량은 5.0×105로 1 ng당 유전자 카피수는 1.2×109이었다.
<2-2> 표준곡선의 제작
상기 <2-1>에서 준비된 흰반점 바이러스 표준시료와 간췌장 바이러스 표준시료를 실시예 1에서 제작된 병원성 미생물 검출킷트로 하기와 같이 검출하여 각각의 표준곡선을 작성하였다.
먼저, 흰반점 바이러스 및 간췌장 바이러스 각각에 대한 낚시탐침이 고정되어 있는 혼성화 모듈을 고정틀에 끼우고 중화용액으로 15분간 3회 세척함으로써 건조상태의 낚시탐침을 수화시켜 혼성화되기 쉬운 상태로 활성화시켰다. 활성화된 혼성화 모듈에 0.5% 차단용액을 포함하는 증류수 50 ㎕와 동일한 부피의 CTAB을 포함하지 않는 혼성화 완충용액(hybridization buffer)을 첨가하고 55℃에서 1시간 동안 예비 혼성화를 수행하였다. 예비 혼성화 반응이 완료된 후, 혼성화 모듈을 동일한 온도에서 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 1회 세척하여 혼성화 용액을 완전히 제거하였다.
상기에서 준비된 각각의 바이러스에 대한 표준시료 DNA의 농도를 1.0×108 카피수로 맞춘 후 증류수로 5배씩 희석하여 일련의 표준시료 희석액을 준비하였다. 이와 같이 준비된 각각의 표준시료 희석액에 딕옥시제닌이 표지된 보고탐침 1 ng을 첨가한 후 증류수로 최종 부피를 50 ㎕로 맞추었다. 상기 혼합액을 98℃에서 15분간 처리하여 변성시킨 후 이를 0.2% 차단용액을 포함하는 동량의 혼성화 완충용액과 함께 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈에 첨가하였다. 상기 혼성화 모듈을 55℃에서 2시간 동안 200 rpm으로 흔들면서 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체 형성을 위한 혼성화 반응을 수행하였다.
혼성화 반응이 종결된 후, 혼성화 모듈을 55℃에서 2× SSC(300 mM NaCl, 30 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 2분간 3회, 1× SSC(150 mM NaCl, 15 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 15분간 1회, 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 2분간 3회 세척하여 반응용액을 제거하였다. 여기에 차단용액으로 항-딕옥시제닌-퍼옥시다제(Roche)를 1:4000배로 희석한 용액 100 ㎕를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 반응시키면서 항원-항체 반응을 유도하였다. 3중 복합체에 결합되지 않은 항체를 중성화 용액으로 상온에서 7회 세척하여 제거한 후 상기 항체에 연결된 효소의 기질로 100 ㎕의 BM 화학발광 기질(BM Chemiluminecence substrate, Roche Inc., Germany)을 첨가하고 상온에서 5분간 반응시켜 발색반응을 유도하였다. 이로부터 발색된 정도를 조도계(luminometer, Berthod)를 이용하여 0.5 내지 2초간 측정하여 상대적인 효소활성을 계산하였다.
발광반응이 끝난 혼성화 모듈은 반응용액을 버리고 1.5배 부피의 0.2 N NaOH 변성용액(0.1％ Tween 20 함유)으로 55℃에서 3분간 3회, 15분간 1회 세척하고, 0.1% CTAB 용액으로 55℃에서 1시간, 0.1% 사르코신(0.1% SDS 및 0.1% Tween 20 함유) 용액으로 1시간 동안 세척함으로써 낚시탐침에 혼성화된 분석시료 및 보고탐침을 제거하였고, 이후 모듈은 다른 시료의 분석을 위해 재사용하였다.
그 결과, 도 7a 및 7b에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 상기 실시예 1에서 제작된 병원성 미생물 검출킷트는 검출하고자 하는 흰반점 바이러스 및 간췌장 바이러스 표준시료 DNA를 정량적으로 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 도 7a 및 7b의 표준곡선의 측정치를 회귀 분석하여 회귀곡선 방정식을 구하게 되면 상기 방정식에 각 표본시료의 측정치를 대입함으로써 실제로 감염된 바이러스의 유전자 카피수를 계산할 수 있다.
<실시예 3> 표준곡선을 이용한 병원성 미생물의 검출 및 정량
상기 실시예 2에서 작성된 표준곡선을 기준으로 실시예 1에서 제작된 킷트를 이용하여 실제표본을 대상으로 흰반점 바이러스와 간췌장 바이러스를 다음과 같이 정량하였다.
우선, 외관상 흰반점 바이러스와 간췌장 바이러스 감염 증상이 보이지 않는 대하와 표본을 무작위로 선발하여 실험하였다. 대하의 유영지(배다리) 50 ㎎을 잘게 잘라서 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube)에 넣고 여기에 500 ㎍/㎖의 단백질 분해효소 K(Proteinase K)를 함유하는 분해효소 완충용액(30 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 1％ SDS) 500 ㎕을 첨가한 후 50℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응액을 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액에 2배 부피의 100％ 에탄올을 넣 어 유전물질을 침전시킨 후 이를 500 ㎕ 증류수에 용해시켰다. 증류수에 용해되지 않은 부분(침전된 단백질)은 다시 원심분리하여 제거하고 사용하였다.
이와 같이 준비된 표본시료들을 상기 실시예 2에 기재된 방법에 따라 딕옥시제닌이 표지된 보고탐침과 혼합하여 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈에 첨가하고 혼성화 반응을 수행한 후 발색반응을 통해 발광정도를 측정하였다.
먼저, 동일한 과정을 거쳐서 측정된 흰반점 바이러스 및 간췌장 바이러스 표준시료를 이용하여 작성된 도 7a 및 7b의 표준곡선으로부터 각각의 회귀곡선 방정식을 하기와 같이 구하였다(도 8a).
1) 흰반점 바이러스의 회귀곡선 방정식(WSSV regression curve)
F(x)= 7.63e+5 × x/(1-6.192e-3 × x)
2) 간췌장 바이러스의 회귀곡선 방정식(HPV regression curve)
F(x)=7.45e+5 × x/(1-6.28e-3 × x)
상기 방정식들에서 x는 변수, 즉 상대적 활성도를 나타낸다.
상기와 같이 얻어진 회귀곡선 방정식에 본 발명의 검출킷트를 이용하여 측정된 각 실제 표본의 상대적인 효소활성 값을 대입하여 각 표본시료들에 감염된 바이러스를 정량하였다(도 8b). 간췌장 바이러스(HPV)와 흰반점 바이러스(WSSV) 각각의 1.0×108 카피수의 표준시료(E8 Standard)를 100％, 증류수 표본(음성 대조군)을 0 ％ 활성으로 보았을 때 각각의 표본시료의 측정치와 방정식에 대입한 환산치를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112006025635775-pat00001
상기 표 1에 나타난 바와 같이, GR1 및 GR2 표본에서는 흰반점 바이러스(WSSV)가 약 1.0×107 내지 108 카피수로 강하게 검출된 반면, 동일한 표본에서 간췌장 바이러스(HPV)는 6.0×105 카피수 정도로 매우 약하게 검출되었다. 그러나, KC21 표본에서는 간췌장 바이러스(HPV)가 4.0×107 카피수 정도로 강하게 검출되고 흰반점 바이러스(WSSV)는 2.2×106 카피수 정도로 약하게 검출되었다. 상기 결과들로부터 본 발명의 검출킷트가 실제 표본시료로부터 각각의 해당 바이러스를 선택적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
<실시예 4> 담배모자이크 바이러스(Tobacco Mosaic Virus, TMV) 및 무잎말림병 바이러스(Beet Curly Top Virus, BCTV)의 검출
<4-1> 표준곡선의 제작
본 발명에 따른 미생물 검출킷트를 이용하여 담배모자이크 바이러스(TMV) 및 무잎말림병 바이러스(BCTV)를 검출하기 위하여, 상기 실시예 1의 <1-1>과 동일한 방법으로 공지된 담배모자이크 바이러스의 게놈 염기서열(GenBank 등재번호: NC_001367 )에서 5829 내지 5848 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 13의 정방향 프라이머 TMV-415F와 6217 내지 6243 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 14의 역방향 프라이머 TMV-415RP를 이용하여 서열번호: 15의 낚시탐침(415 bp)이 고정된 혼성화 모듈을 제작하였고, 공지된 무잎말림병 바이러스의 게놈 염기서열(GenBank 등재번호: NC_001412 )에서 858 내지 877 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 16의 정방향 프라이머 BCTV-4L과 1123 내지 1145 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 17의 역방향 프라이머 BCTV-4RP를 이용하여 서열번호: 18의 낚시탐침(288 bp)이 고정된 혼성화 모듈을 제작하였다.
또한, 실시예 1의 <1-2>와 동일한 방법으로 담배모자이크 바이러스의 게놈 염기서열에서 5102 내지 5121 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 19의 정방향 프라이머 TMV-NF와 5338 내지 5357 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 20의 역방향 프라이머 TMV-NR을 이용하여 서열번호: 21의 보고탐침 1(256 bp)을 제작하였고, 5591 내지 5610 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 22의 정방향 프라이머 TMV-2F173과 5745 내지 5764 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 23의 역방향 프라이머 TMV-173R을 이용하여 서열번호: 24의 보고탐침 2(173 bp)를 제작하였다. 아울러, 무잎말림병 바이러스의 게놈 염기서열에서 1300 내지 1319 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 25의 정방향 프라이머 BCTV-RF와 1498 내지 1518 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 26의 역방향 프라이머 BCTV-RR을 이용하여 서열번호: 27의 보고탐침(218 bp)을 제작하였다. 이때, 담배모자이크 바이러스에 대해서는 검출의 민감도를 증가시키기 위하여 서로 다른 부위를 인식하는 두 개의 보고탐침을 제작하였다.
한편, 담배모자이크 바이러스의 표준시료 DNA로는 6,395개 염기의 담배모자이크 바이러스 RNA 유전체를 서열번호: 14의 역방향 프라이머 TMV-415RP를 이용하여 역전사시켜 cDNA를 제조한 후, 이를 서열번호: 19의 정방향 프라이머 TMV-NF 와 서열번호: 14의 역방향 프라이머 TMV-415RP를 이용하여 PCR로 증폭한 1,141 bp의 DNA 절편(TMV gp4, gp5 및 gp6에 해당하는 5,102 내지 6,243 뉴클레오티드 부위)을 사용하였다. 단일가닥 DNA 바이러스인 무잎말림병 바이러스의 표준시료 DNA로는 2,994 염기의 무잎말림병 바이러스 유전체 중 BCTV gp4에 해당하는 858 내지 1,518 뉴클레오티드 부위를, 서열번호: 16의 정방향 프라이머 BCTV-4L과 서열번호: 26의 역방향 프라이머 BCTV-RR을 이용하여 PCR로 증폭된 660 bp의 DNA 절편을 사용하였다. 표준시료 DNA 농도는 109 내지 106까지 연속적으로 희석하여 사용하였다. 상기에서 각각의 PCR 반응조건 및 반응용액의 조성은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
상기에서 제작된 각각의 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈과 보고탐침을 이용하여 담배모자이크 바이러스와 무잎말림병 바이러스의 표준시료 DMA를 검출하여 각각의 표준곡선을 작성하였다. 그 결과, 도 9a에 나타난 바와 같이, 담배모자이크 바이러스의 표준시료는 f(x)=6.89e5×x/(1-3.14e-3×x)의 방정식을 갖는 회귀곡선을 나타내었고, 이 곡선은 측정치와 상관계수 R=0.999978 및 Rsqr=0.999957의 값을 나타내었다. 무잎말림병 바이러스의 표준시료는 f(x)=9.37e+5×x/(1-6.53e-4×x)의 방정식을 갖는 회귀곡선을 나타내었고, 이 곡선은 측정치와 R=0.999963 및 Rsqr=0.999926의 상관관계를 보였다. 상기 방정식에서, x는 변수, 즉 상대적 활성도를 나타낸다.
<4-2> 표준곡선을 이용한 담배모자이크 바이러스 및 무잎말림병 바이러스의 검출
담배모자이크 바이러스와 무잎말림병 바이러스에 감염된 담배 잎을 채취하여 건조시킨 후 이 표본으로부터 바이러스 숫자를 측정하였다. 건조표본 100 ㎍당 1 ㎖의 PBS를 첨가하고 표본을 으깬 다음 이로부터 얻은 추출액 2 ㎕를 상기 실시예 4의 <4-1>에서 제작된 검출킷트로 분석한 후 각각의 표준곡선으로부터 각 시료에 감염된 바이러스를 정량하였다. 이때, 양성 대조군으로는 담배모자이크 바이러스 1×108 카피수(TMV 1E+8)와 무잎말림병 바이러스 1×108 카피수(BCTV 1E+8)를 사용하였으며, 각각을 서로에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 하기 표 2에서 "검출되지 않음"은 표준곡선의 최저범위(lower limit)를 벗어나 검출되지 않은 것을 의미하고, "범위를 벗어남"은 최고범위(upper limit)를 벗어난 값을 의미한다.
Figure 112006025635775-pat00002
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 담배모자이크 바이러스 검출용 혼성화 모듈에서는 무잎말림병 바이러스 대조군(BCTV 1E+8)이 전혀 검출되지 않았고 무잎말림병 바이러스 검출용 혼성화 모듈에서는 담배모자이크 바이러스 대조군(TMV 1E+8)이 전혀 검출되지 않았는데, 이는 각각의 혼성화 모듈이 담배모자이크 바이러스와 무잎말림병 바이러스에 특이적임을 나타내는 것이다. 각각의 시료에 대해서, 담배모자이크 바이러스는 6.28×105 내지 4.53×107개의 바이러스가 유효범위 내에서 검출되었고, 무잎말림병 바이러스는 1.59×106 내지 2.29×107개의 바이러스가 유효범위 내에서 검출되었다. 반면, BCTV3 시료에서는 바이러스의 수가 상기 유효범위를 벗어나 검출감도 이하로 측정되었다. 단일가닥 DNA 바이러스(ss DNA virus)인 무잎말림병 바이러스와 단일가닥 RNA 바이러스(ss RNA virus)인 담배모자이크 바이러스가 유효한 측정범위 내에서 검출되었다는 사실은 본 발명에 따른 검출킷트가 이중가닥 DNA 유전체뿐만 아니라 단일가닥 DNA 유전체와 단일가닥 RNA 유전체의 검출에도 효과적으로 사용될 수 있음을 의미하는 것이다.
<실시예 5> 돌돔 이리도바이러스(Rock Bream Iridovirus, RBIV)의 검출
<5-1> 표준곡선의 제작
본 발명에 따른 미생물 검출킷트를 이용하여 양식 돌돔(Rock bream)에서 대량 폐사를 일으키는 원인 바이러스인 돌돔 이리도바이러스(Rock Bream Iridovirus, RBIV)를 검출하기 위하여, 돌돔 이리도바이러스의 유전체에서 1,362 bp의 주요 표면 단백질(Major capsid protein, MCP) 유전자를 대상으로 하기와 같이 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈과 보고탐침을 제작하였다. 먼저, 상기 실시예 1의 <1-1>과 동일한 방법으로 공지된 돌돔 이리도바이러스의 게놈 유래 MCP 유전자의 염기서열(GenBank 등재번호: AB109371)에서 729 내지 748 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 28의 정방향 프라이머 MCP 408F와 1108 내지 1136 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 29의 역방향 프라이머 MCP 408RP를 이용하여 서열번호: 30의 낚시탐침(408 bp)이 고정된 혼성화 모듈을 제작하였다. 또한, 실시예 1의 <1-2>와 동일한 방법으로 돌돔 이리도바이러스 유래 MCP 유전자의 염기서열에서 216 내지 235 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 31의 정방향 프라이머 MCP 282F와 478 내지 497 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 32의 역방향 프라이머 MCP 282R을 이용하여 서열번호: 33의 보고탐침(282 bp)을 제작하였다.
한편, 돌돔 이리도바이러스 검출을 위한 표준시료 DNA로는 1,362 bp의 MCP 유전자 중에서 216 내지 1,136 뉴클레오티드 부위를 서열번호: 31의 정방향 프라이머 MCP 282F와 서열번호: 29의 역방향 프라이머 MCP 408RP를 이용하여 PCR로 증폭한 920 bp의 DNA 절편을 사용하였다. 표준 DNA 농도는 109 내지 106까지 연속적으로 희석하여 사용하였다. 상기에서 각각의 PCR 반응조건 및 반응용액의 조성은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
상기에서 제작된 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈과 보고탐침을 이용하여 돌돔 이리도바이러스 유래 MCP 유전자의 표준시료 DNA를 검출하여 표준곡선을 작성한 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이, 표준시료 DNA는 f(x)=5.3e5×x/(1-4.7e-3×x)의 방정식을 갖는 회귀곡선을 나타내었고, 이 곡선은 측정치와 R=0.999986 및 Rsqr=0.999972의 상관계수를 보였다.
<5-2> 표준곡선을 이용한 돌돔 이리도바이러스의 검출
돌돔의 간과 지라에서 20 ㎎의 조직을 떼어내 150 ㎕의 STE 완충용액(1.0% SDS, 30 mM Tris-Cl (pH 8.0), 10 mM EDTA)에서 균질화한 후, 단백질 분해효소 K(Proteinase K, 500 ㎍/㎖)를 첨가하고 3시간 동안 반응시켜 조직을 분해하였다. 이 반응액을 15,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액만을 분리하였고, 분리된 상층액 20 ㎕를 이후의 바이러스 유전자 측정에 사용하였다. 이때, 표준시료로는 돌돔 이리도바이러스 유래 MCP 유전자 1×108 카피수(1E+8)를 사용하였다.
Figure 112006025635775-pat00003
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 일반적으로 이리도바이러스는 간보다 지라에서 더 많이 검출되지만 감염단계에 따라서는 간에서 더 높게 검출되기도 한다(도 10b). 상기 결과는 본 발명에 따른 검출킷트가 돌돔 이리도바이러스의 MCP 유전자를 특이적으로 검출할 수 있으므로 상기 바이러스의 감염 단계에 따라서, 그리고 감염된 어류의 장기에 따라서 바이러스의 감염 확산 양상을 분석할 수 있음을 보여주는 것이다.
<실시예 6> 양식 대하 유전자의 검출
<6-1> 표준곡선의 제작
본 발명에 따른 검출킷트가 다세포 생물의 유전자 검출에도 적용될 수 있는지를 확인하기 위하여, 갑각류인 양식 대하(Penaeus chinensis)에서 성장을 조절하는 주요 신경 호르몬 유전자인 CHH/GIH/MIH(Crustachean Hyperglycemic Hormone[CHH]/Gonad Inhibiting Hormone[GIH]/Molt-Inhibiting Hormone[MIH]) 유전자를 대상으로 하기와 같이 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈과 보고탐침을 제작하였다. 먼저, 상기 실시예 1의 <1-1>과 동일한 방법으로 공지된 양식 대하 유래 CHH/GIH/MIH 유전자의 907 bp 염기서열(GenBank 등재번호: AY346378)에서 231 내지 250 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 34의 정방향 프라이머 Pem-5와 496 내지 515 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 35의 역방향 프라이머 Pem300RP를 이용하여 서열번호: 36의 낚시탐침(285 bp)이 고정된 혼성화 모듈을 제작하였다. 또한, 실시예 1의 <1-2>와 동일한 방법으로 양식 대하 유래 CHH/GIH/MIH 유전자의 염기서열에서 14 내지 33 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 37의 정방향 프라이머 Pem-CL과 162 내지 180 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 38의 역방향 프라이머 Pem-2R165b를 이용하여 서열번호: 39의 보고탐침 1(165 bp)를 제작하였고, 602 내지 623 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 40의 정방향 프라이머 Pem-R602F와 717 내지 736 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 41의 역방향 프라이머 Pem-3을 이용하여 서열번호: 42의 보고탐침 2(137 bp)를 제작하였다.
한편, CHH/GIH/MIH 유전자 검출을 위한 표준시료 DNA로는 907 bp 크기의 CHH/GIH/MIH 유전자 중에서 14 내지 736 뉴클레오티드 부위를 서열번호: 37의 정방향 프라이머 Pem-CL과 서열번호: 41의 역방향 프라이머 Pem-3을 이용하여 PCR로 증폭한 723 bp의 DNA 절편을 사용하였다. 표준시료 DNA 농도는 109 내지 106까지 연속적으로 희석하여 사용하였다. 상기에서 각각의 PCR 반응조건 및 반응용액의 조성은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
상기에서 제작된 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈과 보고탐침을 이용하여 양식 대하의 CHH/GIH/MIH 유전자의 표준시료 DNA를 검출하여 표준곡선을 작성한 결과, 도 11a에 나타난 바와 같이, 표준시료 DNA는 f(x)=6.21e5×x/(1-3.80e-3×x)의 방정식을 갖는 회귀곡선을 나타내었고, 이 곡선은 측정치와 R=0.999997 및 Rsqr=0.999994 값의 상관계수를 보였다.
<6-2> 표준곡선을 이용한 신경 호르몬 유전자의 검출 및 정량
대하의 간췌장과 유영지에서 각각 100 ㎎의 조직을 떼어내 500 ㎕의 STE 완충용액(10% SDS, 30 mM Tris, 1 mM EDTA)에서 균질화한 다음, 단백질 분해효소 K(500 ㎍/㎖)를 첨가하고 3시간 동안 반응시켜 조직을 분해하였다. 이 반응액을 15,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 분리한 후 이를 페놀과 클로로폼으로 정제하여 대하의 유전체 DNA를 얻었다. 얻어진 유전체 DNA를 500 ㎕의 증류수에 녹인 후 이중 50 ㎕를 CHH/GIH/MIH 유전자의 검출에 사용하였다.
Figure 112006025635775-pat00004
그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 각 표본에서는 추출된 DNA 양에 비례하여 CHH/GIH/MIH 유전자가 5×105 내지 1×106 범위에서 측정되었는데(도 11b), 이러한 결과는 본 발명에 따른 혼성화 모듈을 이용한 검출방법이 바이러스나 박테리아뿐만 아니라 훨씬 큰 유전체를 가지는 다세포 생물체의 유전자를 검출하는데도 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다. 또한, 본 발명에 따른 검출방법은 다수의 표본을 신속하게 검사해야 하는 유전자 조작 생물체(genetically modified organism, GMO) 검출에도 유용하게 이용될 수 있다.
<실시예 7> 비브리오 벌니휘쿠스( Vibrio vulnificus )의 검출
<7-1> 표준곡선의 제작
패혈증의 원인균인 비브리오 벌니휘쿠스(Vibrio vulnificus)를 검출하기 위하여 이 세균의 전체 유전체에서 독소 유전자인 사이토라이신(cytolysin) 유전자를 대상으로 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈과 보고탐침을 제작하였다. 먼저, 상기 실시예 1의 <1-1>과 동일한 방법으로 공지된 비브리오 벌니휘쿠스 유래 2,237 bp의 사이토라이신 유전자의 염기서열(GenBank 등재번호: M34670)에서 399 내지 428 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 43의 정방향 프라이머 Vvh383F와 752 내지 781 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 44의 역방향 프라이머 Vvh383RP를 이용하여 서열번호: 45의 낚시탐침(383 bp)이 고정된 혼성화 모듈을 제작하였다. 또한, 실시예 1의 <1-2>와 동일한 방법으로 비브리오 벌니휘쿠스 유래 사이토라이신 유전자의 염기서열에서 1263 내지 1282 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 46의 정방향 프라이머 Vvh266F와 1484 내지 1503 뉴클레오티드 부위를 인식하는 서열번호: 47의 역방향 프라이머 Vvh428R을 이용하여 서열번호: 48의 보고탐침(241 bp)를 제작하였다.
한편, 사이토라이신 유전자 검출을 위한 표준시료 DNA로는 2,237 bp 크기의 사이토라이신 유전자 중에서 399 내지 1,503 부위를 서열번호: 43의 정방향 프라이머 Vvh383F와 서열번호: 47의 역방향 프라이머 Vvh428R을 이용하여 PCR로 증폭한 1,100 bp의 DNA 절편을 사용하였다. 표준시료 DNA 농도는 109 내지 106까지 연속적으로 희석하여 사용하였다. 상기에서 각각의 PCR 반응조건 및 반응용액의 조성은 실시예 1과 동일하게 수행하였다.
상기에서 제작된 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈과 보고탐침을 이용하여 비브리오 벌니휘쿠스의 사이토라이신 유전자의 표준시료 DNA를 검출하여 표준곡선을 작성한 결과, 도 12a에 나타난 바와 같이, 비브리오 벌니휘쿠스의 표준시료 DNA는 f(x)=9.16e5×x/(1-8.67e-4×x)의 방정식을 갖는 회귀곡선을 나타내었고, 이 곡선은 측정치와 R=0.999988 및 Rsqr=0.999976 값의 상관계수를 보였다.
<7-2> 표준곡선을 이용한 비브리오 벌니휘쿠스의 검출
비브리오 벌니휘쿠스와 비브리오 파라헤모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)를 2 ㎖의 해양 액체배지(marine broth)에 접종하여 30℃에서 밤새 배양한 후, 원심분리하여 세균을 수확하였고 600 ㎕의 분해용액(0.5% SDS, 100 ㎍/㎖ 단백질 분해효소 K)을 첨가하여 3시간 동안 반응시켜 조직을 분해하였다. 이 반응액에 100 ㎕의 5 M NaCl 용액(최종농도 0.7 M NaCl)과 80 ㎕의 CTAB/NaCl 용액(최종농도 10% CTAB, 0.7 M NaCl)을 첨가하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 동일한 양의 페놀:클로로폼:아이소아밀알콜(25:24:1)을 2회 처리하여 세균의 유전체 DNA를 추출하였다. 이 DNA를 100 ㎕의 TE 완충용액에 녹여 이후의 실험에 사용하였다.
이와 같이 준비된 비브리오 벌니휘쿠스 및 비브리오 파라헤모리티쿠스 DNA 시료 20 ㎕를 대상으로 상기 실시예 7의 <7-1>에서 제작된 검출킷트와 표준곡선을 이용하여 사이토라이신 유전자를 정량한 결과, 비브리오 벌니휘쿠스의 표본에서는 약 3×107 카피수의 유전자가 측정된 반면, 또 다른 패혈증 세균인 비브리오 파라헤모리티쿠스의 표본에서는 유효 측정범위를 벗어나는 측정값이 나타났다(도 12b). 이러한 결과는 본 발명의 혼성화 모듈이 비브리오 벌니휘쿠스 유래 사이토라이신 유전자를 종 특이적으로 검출할 수 있으며, 유전적으로 매우 유사한 세균들을 구별하는데 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 병원성 미생물의 무증폭 다중 정량 검출킷트는 특정 병원성 미생물이 가지는 종 특이적 유전자의 정제 또는 증폭반응 없이 혼성화 반응과 효소면역분석법을 이용하여 병원성 미생물을 정확하고 간단하게 진단할 수 있어 바이러스, 세균, 단세포 생물을 포함한 모든 생물체에 대하여 적용이 가능하고 여러 종류의 병원성 미생물을 동시 다중으로 진단할 수 있으며 반복해서 사용할 수 있으므로 병원성 미생물의 정량적 검출에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
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  11. 1) 혼성화 모듈(hybridization module)에 고정된 낚시탐침(fishing probe)을 활성화시키는 단계;
    2) 활성화된 혼성화 모듈에 차단용액을 포함하는 증류수 및 혼성화 완충용액(hybridization buffer)을 첨가하여 예비 혼성화 반응시키는 단계;
    3) 예비 혼성화 반응이 완료된 혼성화 모듈에 분석시료, 태그(tag)가 표지된 보고탐침(reporter probe) 및 혼성화 완충용액을 넣고 혼성화 반응을 유도하여 낚시탐침-분석시료-보고탐침의 3중 복합체를 형성하는 단계;
    4) 효소면역항체분석법(ELISA)을 이용하여 상기 3중 복합체의 양을 측정하는 단계; 및
    5) 혼성화 모듈을 세척하여 재생하는 단계를 포함하고,
    상기 낚시탐침이 검출하고자 하는 분석시료인 병원성 미생물의 특이 유전자 부위를 인식하도록 고안된 염기서열을 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드이고, 상기 보고탐침이 상기 병원성 미생물의 특이 유전자들 중에서 상기 낚시탐침의 인식부위와 중복되지 않는 다른 특이 유전자 부위를 인식하도록 고안된 염기서열을 갖는 이중가닥 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는,
    병원성 미생물을 정량적으로 검출하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    단계 1)에서 75 내지 125 mM Tris-HCl(pH 7.5), 125 내지 175 mM NaCl 및 1 내지 2％ 트윈 20을 포함하는 중화용액으로 혼성화 모듈을 세척하여 낚시탐침을 활성화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 삭제
  14. 제 11항에 있어서,
    단계 2)의 예비 혼성화 반응이 혼성화 모듈에 0.2 내지 0.6% 차단용액을 포함하는 증류수 및 동일한 부피의 혼성화 완충용액을 첨가하여 50 내지 55℃에서 0.5 내지 2시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 혼성화 완충용액이 10× SSC(1.5 M NaCl, 0.15 M 소듐 시트레이트, pH 7.0), 0.2％ 사르코신(sarcosine), 0.04％ SDS(sodium dodecyl sulfate), 및 0.2% 차단용액(0.2％ 탈지유단백질(w/v) 50 mM, Tris-HCl 150 mM, pH 7.4)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 11항에 있어서,
    단계 2)에서 예비 혼성화 반응이 완료된 모듈을 50 내지 55℃에서 세척하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    세척이 세척용액으로서 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액을 이용하여 1회 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 11항에 있어서,
    단계 3)에서 혼성화 반응이 분석시료와 태그가 표지된 보고탐침을 혼합하여 95 내지 100℃에서 10 내지 20분간 변성시키는 단계; 상기 변성액을 동량의 혼성화 완충용액(hybridization buffer)과 함께 낚시탐침이 고정된 혼성화 모듈에 첨가하는 단계; 및 상기 혼성화 모듈을 50 내지 55℃에서 1 내지 3시간 동안 교반하는 단계에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11항에 있어서,
    분석시료가 병원성 미생물의 감염여부를 확인하고자 하는 생물 시료를 잘게 자르거 나 균질화(chopping or homogenizing)하는 단계; 여기에 단백질 분해효소 K(proteinase K)를 37 내지 50℃에서 1 내지 3시간 동안 처리하는 단계; 및 얻어진 반응액을 원심분리하여 상등액(supernatant)을 얻는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 11항에 있어서,
    단계 3)에서 혼성화 반응이 완료된 모듈을 50 내지 55℃에서 세척하여 미반응물들을 제거하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    혼성화 모듈을 2× SSC(300 mM NaCl, 30 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 2분간 3회 세척하고, 1× SSC(150 mM NaCl, 15 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 15분간 1회 세척하고, 0.5× SSC(75 mM NaCl, 7.5 mM 소듐 시트레이트, pH 7.0) 용액으로 2분간 3회 세척하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 11항에 있어서,
    단계 4)에서 ELISA 분석이 혼성화 반응이 끝난 모듈에 보고탐침의 태그를 인식하는 효소연결 항-태그 항체를 첨가하여 1 내지 3시간 동안 20 내지 25℃에서 반응시키면서 항원-항체 반응을 유도하는 단계; 결합되지 않은 항체를 중화용액으로 세척하여 제거하는 단계; 상기 항체에 연결된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 발색정도를 측정하여 효소활성을 확인하는 단계; 및 각 분석시료에서 측정된 효소활성을 표준시료(standard sample)로부터 얻은 표준곡선(standard curve)과 비교하여 병원성 미생물의 양을 결정하는 단계에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 11항에 있어서,
    단계 5)에서 혼성화 모듈에 1.5배 부피의 0.2 N NaOH 변성용액(트윈 20 함유)을 첨가하여 50 내지 60℃에서 3분간 3회, 15분간 1회 세척하고, 0.1% CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 용액으로 동일한 온도에서 1시간, 0.1% 사르코신(0.1% SDS 및 0.1% 트윈 20 함유) 용액으로 1시간 동안 세척하여 낚시탐침에 혼성화된 분석시료 및 보고탐침을 제거함으로써 혼성화 모듈을 재생하는 것을 특징으로 하는 방법.
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