JPS61502282A

JPS61502282A - 酵素剤を用いた触媒作用による核酸交雑方法

Info

Publication number: JPS61502282A
Application number: JP50263585A
Authority: JP
Inventors: ザポルスキ，エドワード・ジエイ; ガーステン，ダグラス・エム; レツドリー，ロバート・エス
Original assignee: ナショナル・バイオメディカル・リサ−チ・ファウンデ−ション
Priority date: 1984-06-01
Filing date: 1985-05-31
Publication date: 1986-10-09
Also published as: EP0183822A1; EP0183822A4; WO1985005685A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵素剤を用いた触媒作用による核酸交雑技術人また１この発明は、一般に目的とするＤＮＡ断片を処理して既知の遺伝子配列に同定するための交雑方法に関するものであり、特に中でもＲｅＣＡ蛋白質、１本鎖のＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）およびアデノシントリフオスフェート（Ａ丁Ｐ）からなる酵素交雑剤を用いて触媒作用が付与された交雑方法に関するものである。

五Ｉ］す先特定のサンプルにおいて既知の遺伝子配列の存在を同定するために用いられる核酸交雑技術は、近年のバイオテクノロジーの多くの工程において、およびほとんどすべての遺伝子工学の分野において必要な要素となっている。適当な条件下では、相補的な（相同性の）１本鎖の核酸は結合して２本鎖を形成する。この交雑のプロセスは、２重の核酸分子をほぐして（溶かして）、ゆっくりとリアニールして古典的な２本鎖のへソックスを自然に形成させる条件を利用することにより、一般に完成させることができる。このプロセスは、その厳格な特定性（相補的な塩基配列の鎖のみが対になる）のため、プローブとして用いられているＤＮＡの特定な１本鎖と相補的なりＮＡ　（目的の物質）の領域を捜して同定するのに用いられている。

交雑の応用の技術の中でもサザン・プロット法は、関心のある配列を含んだポリヌクレオチド断片のサイズに関しての情報をも与えてくれるので、特に価値がある。Ｊ、Ｍｏｆ、　Ｂｉｏｌ　、　、　”ｔサン、　Ｅ、　Ｍ、　ｉ！、　９８：５０３−５１７　（１９７５）を参照されたい。はとんどの場合、ＤＮＡ断片は、アガロースゲル中の電気泳動によってその大きざに従い分離され、アルカリで処理されて１本鎖に変性されて次に中和される。次に膜または特別に処理されたペーパマトリックスにプロッティングすることにより移される。

電気泳動により、この移動は促進されるはずである。次に核酸の断片は、ペイキングによりマトリックスに固定される。次に核酸を含む結合したマトリックスを、マトリック上の無関係のＤＮＡ結合サイトをマスクして、それによってバックグラウンドを減少させるために、相補的でないＤＮＡの交雑前処理溶液中に曝す。次に交雑を行ない、色々な組成の媒体および、できれば６５−７０℃の温度で、プルーブのＤＮＡを目的のＤＮＡの結合したマトリックスとアニーリングすることにより完成させる。成る構成では、５０％以上のディメチルホルムアミドまたは他の危険な物質を含み、アニーリングにより交雑が行なわれるようにＤＮＡの融点よりも低い温度で促進されている。

（先程特記した）サザンの最初の研究論文では、上述の内容から明らかなように、非常の多大の時間を消費する操作であって、さらに大きさの異なる断片は異なる割合で電気泳動のゲルからプロッティングマトリックスに移される傾向にある操作が記述されている。Ｍｅｔｈ　、　Ｅｎｚｍｏｌ　、　。

サザン、Ｅ、Ｍ、著、６８：１５２−１７６＜１９７９）を参照されたい。したがって、この方法の以上の点を克服できる変法を捜すという基本的なテーマの下に多くの変法が報告されている。

このような変法の中で最も将来有望なものの１つは、原位置での（ｉｎ　５ｉｔｕ）交雑であり、シンニック等によって最初に発表された。Ｎｕｃｌ　、　Ａｃ１ｄ　、　Ｒｅｓ、　、　シンニック等著、２：１９１１−１９２９　（１９７５）を参照されたい。この方法では、他のマトリックスに移動させることなく、電気泳動のゲル中で直接に交雑を行なう。さらに最近報告された改良法では、電気泳動のゲルが乾燥され、この乾燥したゲルを用いて交雑が行なわれている。Ａｎａ＋ｙｔ　。

３１ｏｃｈｅｎ、　、ボレロ等著、　１２８　＋　３９３−３９７　（１９８３）を参照されたい。

現今行なわれているＤＮＡの交雑操作は、アガロースゲル中原位置で（ｉｎ　５ｉｔｕ）行なわれるか、または他のマトリックスに移した後行なわれているが、次に示す工程と最小時間を必要としている。

（１）　アルカリによる変性−１Ｘ２時間（２）　中和−１Ｘ２時間（３）　プロッティング（６時間）または電気泳動く２時間）による他のマトリックスへの任意の移動（４）　交雑前処理−１時間（５）　交雑−６〜８時間、しかしながらおそらくは１６〜２０時間（６）　厳重な洗浄−２時間以上のように、アニーリングによる交雑には、少なくとも１２時間、多くの場合２４時間費される。

乾燥したゲル上（たとえばゲルの表面で）起こる交雑は、プルーブ物質がゲルの内部に移動するという限定的な条件のみをたかだか意味している。したがって、ゲルの表面で交雑を十分に行なうためには、十分な目的のＤＮＡが存在し、なければならない。後者の点を考慮すると、工程（３）におけるプロッティングまたは電気泳動移動の固有の非能率と同様に、上記の工程（１）、（２）、＜４）１５よび（５）に含まれる時間のために、目的の物質が成る程度失われることは避けられず、ここに従来技術の重要な問題点があることに気付くはずである。

この技術分野における従来技術は、米国特許４３０２２０４号、４３５８５３５号、４３９５４８６号、３９３０９５６号および４３４２８３３号に記載されている。これらは関連する背景となるものである。また、次の文献も関連する背景となる。

“大腸菌ＲｅＣＡ蛋白質の再結合活性”、ラディング、Ｃｅｔｌ、２５　二　３ −４　（Ｊｕｌｙ　１９８１）“明らかにされたＲｅＣＡの役割”セジイウイック、Ｎａｔｕｒｅ　２８７：６７６−６７７（１９８０年１０月２３日）特許ＨＥ　６１−５０２２８２　（３）“ＲｅｃＡ　Ｉ白質を触媒としたＡＴＰによるＤＮＡの変性”、ワインストック等、　Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７６巻、Ｎｏ、１．１２６−１３０頁（１９７９年１月） “大腸菌ＲｅｃＡ蛋白質により促進された相同性対合のキネティックスおよびトポロジー”、ラデイング等、　ＱｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　５ｙｉｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、、４５：“ＲｅｃＡ蛋白質およびＤＮＡによる発生期のへテロ二重構造の形成”、ウー・等、Ｃｅ１ｌ　、３０：３７−４４．（１９８２年８月） “Ｒｅｃ、６．蛋白質により促進されるＤＮＡ鎖交換における蛋白質に結合した１本鎖のＤＮＡの役割”、コックス等。

ジャーナル・オス・バイオロジカル・ケミストリー、２８５巻、Ｎｏ、４．２５７７−２５８５頁（１９８３年２月２５日）、および “ゲノム融合（ＧｅｎＯｌｉｌｌ　Ｆｕｓｉｏｎ　）″、ボッター等。

Ｃｏ１ｄ　３ｐｒｉｎａ　Ｈａｒｂｏｒ　５ｙｌｐ　、　Ｑｕａｎｔ、Ｂ　ｉｏｌ　、。

４５：３７１−３８３　（１９８０年）１ＬＩＬこの発明は、一般に酵素交雑剤を用いた触媒作用による交雑方法に関するものである。

さらに特定的には、この発明は、目的のＤＮＡ断片を処理して既知の遺伝子配列と同定するための交雑方法、すなわち、担体上に目的のＤＡＮ断片を配置し、放射性標識化されたのプルーブＤＮＡと触媒酸素からなる交雑剤を形成し、所定の時間この交雑剤中に担体を浸漬し、少なくとも１つの洗浄液中で担体を洗浄し、担体をＸ線フィルムに当て露光し、放射性標識化されたプルーブＤＮＡを捜し出して検知するためＸ線フィルムを現像し、次に既知の遺伝子配列と同定するという工程を含む方法に関するものである。

この発明は、アデノシントリフオスフェート（ＡＴＰ）存在下での大腸菌バクテリアからの２つの蛋白質、特にＲｅＣＡ蛋白質および１本鎖のＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＰ）が、溶液中で１本鎖のＤＮＡを刺激して相同性の二重構造に移行させるという事実の発見に関するものである。このＲｅｃＡ蛋白質は、相補的なりＮＡの１本鎖の熱的なディアニーリングとは動力学的に異なる機構によって、ＤＮＡの相同性の分子と対になるものと思われる。これは、相同性の１本鎖のＤＮＡが対になり二重鎖のＤＮＡを形成するか、もしくは１本鎖のＤＮＡの２本鎖のＤＮＡへの交換が促進されるものによると思われる。ＳＳＢ　ＤＮＡ結合蛋白質は、１本鎖のＤＮＡがＲｅＣＡ蛋白質の媒介した２本鎖のＤＮＡへ変換するのを増大するように、協力して、１本鎖の領域にあるＤＮＡと結合する。

この２つの蛋白質は、従来、ＤＮＡの再結合および回復の機構の研究のために用いられていたものである。ざらに、３８Ｂ　ＤＮＡ結合蛋白質は、電子顕微鏡においてＤＮＡの１本鎖の領域を捜し出すために用いられていたものである。しかしながら、従来技術においてはこの２つの蛋白質の生化学的活性は証明されていたが、ＤＮＡ交雑におけるこれらの有用性は従来は知られていなかった。ざらに、目的のＤＮＡを、溶液ではなく、マトリックスまたは担体上に配置する場合のこれらの２つの蛋白質の有用性も、従来技術では知られていない。

したがって、もう１つの発明では、マトリックス上の交雑に関し物理化学的な変性／復元に対する適切で新規な、かつ素早い酵素交換について述べるものである。この交換　１は、上述したように、従来の技術における固定化、変性、中和、長期のインキュベーション、高い温度および厳重な洗浄の工程を回避することができるものである。

この発明の方法に従えば、好ましくは、担体またはマトリックスが目的のＤＮＡ断片の置かれるゲルフィルムを含むものぞある。しかしながら、後で述べるように、目的のＤＮＡ断片は、サザン・プロッティング法もしくはその変法によって、そのようなマトリックスから他のマトリックスに移し変えることができ、それに応じて交雑方法を進めることができる。

この発明は、次に掲げる成分からなる酵素の交雑剤の有用性についても言及する。

４ＯＮマイクログラムのＲｅｃＡ蛋白質２８ＮマイクログラムのＳＳＢ　ＤＮＡ結合゛蛋白質２８ＯＮマイクログラムのアデノシン５−トリフオスフェートの２ナトリウム塩１０ＯＮマイクログラムのボバインアルブミン６Ｎマイクロモルのトリス（Ｔｒｉｓ）４Ｎマイクロモルの塩化マグネシウム（ここで、Ｎは交雑剤のミリリッター数を示す。）それゆえに、この発明の第１の目的は、目的のＤＮＡ断片を処理して既知の遺伝子配列と同定するための酵素触媒による交雑方法を提供することにある。

この発明の次の目的は、中でもＲｅＣＡ蛋白質、５ＳＢＤＮＡ結合蛋白質およびＡＴＰから形成される酵素の交雑剤を提供することにある。

この発−明のさらに次の目的は、従来の方法に比べ非常に速い様式で、目的のＤＮＡ断片を処理して既知の遺伝子配４Ｊと同定可能な交雑方法を提供することにある。

この発明のさらに次の目的は、拡散を少なくし工程を減らすことによりＤＮＡの損失を削減することを含む交雑方法を提供することにある。

この発明のさらに次の目的は、交雑していない残った放射性標識化されたプルーブのＤＮＡを、次の酵素の操作で再び使用する交雑方法を提供することにある。

以下に明らかにする、上記のおよび他のこの発明の目的ならびにこの発明の本質は、以下の明ｌｌＩ書および添付した特イ（口Ｕ６１−５０２２８２　（４）請求の範囲を参照することによりより明らかに理解されるであろう。

この発明の最も好ましい− ここでこの発明について、さらに詳細に説明する。処理される目的のＤＮＡ断片および交雑剤ｗＡ製の際にくまた以下に開示する特定の触媒酵素とともに）用いられる放射性標識化されたプルーブＤＮＡは、次のようにして調製された。

目的のＤＮ△ニラムダＤＮＡ−後ｍ消化（Ｈｉｎｄ　ｍ　ｄｉｇｅＳｔｉＯｎ　）断片（メリーランド、ゲゼルズブルグ１株式会社ベセスダ（３ｅｔｈｅｓｄａ　）研究所）をサンプルウェル（ＤＮＡの総１１．０または０，５マイクログラム）の中に置き、１５ｘ１５ｃｍの大きさのガラスプレートに取付けられたアガロ−昇スゲル（０，６％Ｗ／Ｖ）中で水平電気泳動により分子量に従って分離され、アガロースゲルは目的のＤＮＡを供与するため乾燥された。

プルーブＤＮＡ　：放射性標識化されたプルーブＤＮＡは、試薬キット（ＢＲＬ株式会社、メリーランド、ゲゼルズブルグ）および５０マイクロＣｉのディオキシチジン−５−一［α−＠２Ｐ］ｔ−リフオスフェート（アメルシャム（ＡｍｅｒＳｈａｌｌ　）株式会社２イリノイ州、アーリントンへイン）を用いて、１゜０マイクログラムのラムダＤＮＡのニック翻訳より調製した。

酵素の交雑剤（５ミリリツター）は、次のようにして製造した。

プルーブＤＮＡ　；２００マイクログラムのＲｅＣＡ　蛋白質（Ｐ−Ｌバイオケミカル株式会社（Ｐ −Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　、　１）ｉｖ、　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｔ　ｎｃ、　）　、ウイスコンシン、ミルウオーキー）１４０マイクログラムのＳＳＰ　ＤＮＡ結合蛋白質（ウオーシントン・ディアグノスティック・システム株式会社＜　Ｗｏｒｔｈｉｎａｔｏｎ　Ｄ　１ａａｎｏｓｔｉｃ　Ｓ　ｙｓｔｍｓ　）　、ニュジャジー、フリーホールド）１４００マイクログラムのアデノシン５−トリフオスフェートの２ナトリウム塩〈シグマケミカル会社（Ｓ　ｉｇｍａＣｈｅＩＩｌｉｃａｌ　）　、ニューズリ −、セントルイス）５００マイクログラムのベンテックス・ボバイン・アルブミン（株式会社マイルス研究所（Ｍｉｌｅｓ　１−ａｂｏｒａｔｏｒｔｅＳ）、インディアナ、エルクハート）３０マイクロモルのトリス（７ｒｉｓ）および２０マイクロモルのｐＨ７，４の塩化マグネシウム（Ｍ２Ｏ止、）もちろん、種々の成分の量に比例して調節するため、より多いまたはより少ない量の試薬を調製してもよい。

第１の例として、目的のＤＮＡ断片を含んだ乾燥ゲルフィルム゛（１５ｘ１５ｃｍ）を、０．５ＭのＮａ　ＯＨおよび３ＭのＮａＣｆＬを含んだ溶液中に１５分間浸漬し、次に０゜５Ｍのトリスおよび０．３ＭのＮａＣＱ中に１５分間浸漬し、さらに、標識化されたプルーブＤＮＡ、酵素および助因子を含んだ酵素剤（５ｍｌｌ）中に浸漬した。次に、１時間３７℃でインキニーベイトした。フィルムを付けたガラスプレートをゆっくりと掻き混ぜることにより、各洗浄において５分間、合計６回洗浄した。４回の洗浄は５０ｎ１２Ｘ　５ＳＰＥ−１％５ＤＳ１５す、最終の洗浄ハ５゜ｌ立の○、ＩＸ　５ＳＰＥ−１％ＳＤＳであった。注：５ＳＰＥは、１リツターあたり、８．７　ｕ＋、のＮａＣＱ、１゜３８ｇｍのＮａ　Ｈ２ＰＯ４・Ｈ２０、および０．３７ａｍ、のＥＤＴＡ　（２ナトリウム塩）ｐＨ７，４を含んでいる。

変性されていない目的のＤＮＡＩ、：酵素的に交雑される＄２ｐ−標識化されたプルーブのＤＮＡは、−７０℃でＸ線フィルムに２４時間露光した後現像して放射けい光法（ｒａｄｉｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ　）によって決定した。

第２の例として、アガロースゲルフィルム中の目的のＤＮＡに酵素的に交雑を行なう代わりに、目的のＤＮＡをサザン・プロッティング法によりニトロセルロース膜に移し、ペイキングにより固定化した。次に酵素による交雑は、上述のように厳密に行なった（交雑剤中への浸漬から始めて）。

この操作においてプルーブＤＮＡのいくらかは消費されてしまうが、薬剤中の酵素は消費されてしまわないことに注目しなければならない。

この発明の方法および薬剤を用いることにより、次に掲げる利点が得られる。

〈１）　目的のＤ−ＮＡ断片の処理のための時間を、従来の技術では常に１２〜２４時間であったものがわずかに２時間に短縮化される。

（２）　この発明の方法を用いることにより、従来の技術での損失に比べ、ＤＮＡの損失を結果として削減することができる。この削減されたＤＮＡの損失は、この発明の技術中のより少ない拡散およびより少ない工程数からもたらされるものである。

（３）　この発明の技術では、交雑されずに残った放射性標識化されたプルーブのＤＮＡを次の酵素の操作において再使用することができ、これはプルーブＤＮＡの調達／製造を含んだ費用を考慮すると特に有利なものとなる。

（４）　この発明の技術により、さらに温和な条件で用いることができるという利点が得られる。たとえば、標識化されたプルーブＤ　Ｎ　Ａ　、酵素および動因子を含んだ交雑剤中に浸漬された乾燥ゲルフィルムおよび目的のＤＮＡ断片のインキュベーションを、３７℃１時間で行なうことができる。

（５）　この発明の交雑方法では、その中で用いられている酵素の手法が、従来用いられでいる熱的なアニーリング技術よりも多くの場合より効果的であるため、高い感度を示すことに特徴づけられている。

（６）　最後に、この発明の交雑技術に従った処方では、特にその中に含まれる工程数が少ないことから、簡単であ特衣Ｏ胚１−５０２２８２　（５）ることに特徴プけられている。

以上のこの発明の説明において好ましい形および実１Ｍ倒について記載したが、この開示の精神および範囲内から逸脱しない範囲において詳細には色々な変化が可能であることは明らかである。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）１、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８５１０１０２６２、発明の名称酵素剤を用いた触媒作用による核酸交雑方法３、特許出願人住　所　アメリカ合衆国、２０００７　ワシントン、ディ・シーエヌ・ダブリュ、リザーヴワー・ロード、３９００国　籍　アメリカ合衆国４、代理人住　所　大阪市東区平野町２丁目８番地の１　平野町八千代ビル２３日９月１９８５年６、添付８類の目録補正された請求の範囲［１９８５年９月２３日国際事務局受理二元の請求の範囲１−１７を新しい請求の範囲１−１７（３頁）に置き換える〕１゜　（ａ）　目的のＤＮＡ断片を担体上に配置し、（ｂ）　放射性標識化されたプルーブＤＮＡと、ＲｅＣＡ蛋白質および触媒の酵素として用いる１本鎖のＤＮＡ結合蛋白質を含んだ他の成分とから、交雑剤を形成し、（Ｃ）　所定の時間担体を交雑剤中に浸漬し、（ｄ）　少な（とも１つの洗浄液中で担体な洗浄し、（ｅ）Ｘ線フィルムを担体で露光し、＜ＩＸ線フィルムを現像して放射性標識化されたプルーブＤＮＡを捜し出して検知し、および（ａ）　現像されたＸ線フィルムを既知の遺伝子の配列の同定に関係付ける各工程を備える、目的のＤＮＡ断片を処理して既知の遺伝子配列と同定する交雑方法。

２、　前記担体がゲルフィルムを備える、請求の範囲第１項の方法。

３、　工程（ａ　）が前記ゲルフィルム上のサンプルウェルの中に前記目的の（）ＮＡ断片を置き、電気泳動により重量に従って前記目的のＤＮＡ断片を分離することを備える、請求の範囲第２項の方法。

４、　工程（ａ）がガラスプレートにゲルフィルムを取付けることを含み、前記工程（ｄ　）がゲルフィルムおよびガラスプレートを前記の少なくとも１つの洗浄液中で洗浄することを備える、請求の範囲第２項の方法。

５ｏ　ゲルフィルムおよびガラスプレートが、最初５０　ＩＱ（７）２Ｘ　５ＳＰＥ〜１％ＳＤＳ中で洗浄される、請求の範囲第４項の方法。

６、　ゲルフィルムおよびガラスを、最終的に５０ｎｌの０１ＩＸ　５ＳＰＥ− １％ＳＯ８中で洗浄する、請求の範囲第４項の方法。

７、　前記交雑剤の前記他の成分が前記酵素の交雑剤１ミリリッターに対し下記の量からなる。請求の範囲第１項の方法。

Ｅ　４’　ＯマイクログラムのＲｅＣＡ蛋白質、２８マイクログラムの１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質、２８０マイクログラムのアデノシン５−トリフオスフェートの２ナトリウム塩、１００マイクログラムのボバインアルプミン、６マイクロモルのトリス（Ｔｒｙｓ’）および４マイクロモルの塩化マグネシウム〕８、　工程（ｂ）において前記放射性標識化されたブルー、プＤＮＡが１．０マイクログラムのラムダＤＮＡおよび５０マイクロＣ＋のデオキシチジンー５−− ［α−５２Ｐ］トリフオスフニー・トのニック翻訳により得られる、請求の範囲第１項の方法。

９、　工程（ｅ）が−７０℃で２４時間ＸＩ！フィルムの露？８１ＢＵ６１−５０２２８２　（６）光を備える、請求の範囲第８項の方法３゜１０、工程（ｅ）が−７０℃で２４時間Ｘｔｍフィルムの露光を備える１、請求の範囲第１項の方法。

１１８　前記担体がプロツアイングマトリックスを備える、請求の範囲第１項の方法。

１２、　工程＜ａ　＞がプロッティング法により前記目的のＤＮＡ断片を前記プロッティングマトリックスに移すことを備える、請求の範囲第１１項の方法。

１３゜　前記プロッティング法がサザン・プロッティング法である、請求の範囲第１２項の方法。

１４、　前記工程（ｄ）が最初に担体を５０ｍ１の２ＸＳＳＰＥ−１％ＳＤＳ中で洗浄することを備える、請求の範囲第１項の方法。

１５、　前記工程（ｄ）が最終的に担体を５０＋ｌの○。

ＩＸ　５ＳＰＥ−１％ＳＤＳ中で洗浄することを備える、請求の範囲第１項の方法。

１６、　放射性標識化されたプルーブＤＮＡおよび、触媒の酵素を含む他の成分から製造され、前記他の成分が酵素の交雑剤１ミリリッターの対して下記の量からなる、酵素の交雑剤。

［４０マイクログラムのＲｅｃ、Ａ、蛋白質、２８マイクログラムの１本鎖ＤＮＡ結合蛋白質、２８０マイクログラムのアデノシン５′トリフオスフエートの２ナトリウム塩、１００マイクログラムのボバインアルブミン、６マイクロモルのトリスおよび４マイクロモルの塩化マグネシウム］１７、　１￥Ｉ記放射性標識化されたプループＤＮＡが、１゜０マイクログラムのラムダＤＮＡおよび５０マイクロＣｉのデオキシチジンー５−−［α−”　Ｐｌ　トリフオスフェートのニック翻訳から得られる。請求の範囲第１６項の交雑剤。

閑　協　ｔＩｉ　審　報　失

Claims

【特許請求の範囲】

１．（Ａ）担体上に目的のＤＮＡ断片を配置し、（Ｂ）放射性標識化されたプループＤＮＡおよび触媒の酵素からなる交雑剤を製造し、（Ｃ）所定時間交雑剤中に担体を浸漬し、（Ｄ）少なくとも１つの洗浄液中で担体を洗浄し、（Ｅ）Ｘ線フイルムを担体で露光し、および（Ｆ）Ｘ線フイルムを現像して放射性標識化されたプループＤＮＡを捜し出して検知し、それによって既知の遺伝子配列と同定する各工程を備える、目的のＤＮＡ断片を処理して既知の遺伝子配列同定するための交雑方法。
２．前記担体がゲルフイルムを備える、請求の範囲第１項の方法。
３．前記目的のＤＮＡ断片を前記ゲルフイルム上のサンプルウェルの中に置き、電気泳動により重量に従って前記目的のＤＮＡ断片を分離することを工程（ａ）が含む、請求の範囲第２項の方法。
４．工程（ａ）においてガラスプレートにゲルフイルムを取付け、前記工程（ｄ）においてゲルフイルムおよびガラスプレートを前記の少なくとも１つの洗浄液中で洗浄する、請求の範囲第２項の方法。
５．ゲルフイルムおよびガラスプレートを、最初５０ｍｌの２Ｘ　ＳＳＰＥ−１％ＳＤＳ中で洗浄する、請求の範囲第４項の方法。
６．ゲルフイルムおよびガラスプレートを、最終的に５０ｍｌの０．１Ｘ　ＳＳＰＥ−１％ＳＤＳ中で洗浄する、請求の範囲第４項の方法。
７．前記交雑剤が、所定量のＲｅｃＡ蛋白質およびＳＳＢＤＮＡ結合蛋白質からなる、請求の範囲第１項の方法。
８．Ｎミリリッターの前記交雑剤が、４０ＮマイクログラムのＲｅｃＡ蛋白質、２８ＮマイクログラムのＳＳＢ　ＤＮＡ結合蛋白質、２８０Ｎマイクログラムのアデノシン５′トリフォスフェートの２ナトリウム塩、１００Ｎマイクログラムのボバインアルブミン、６Ｎマイクロモルのトリス（Ｔｒｉｓ）および４Ｎマイクモルの塩化マグネシウムからなる、請求の範囲第７項の方法。
９．工程（ｂ）が、１．０マイクログラムのラムダＤＮＡおよび５０マイクロＣｉのディオキシチジン−５′−［α−■２Ｐ］トリフォスフェートのニック翻訳を備える、請求の範囲第１項の方法。
１０．工程（ｅ）が、−７０℃で２４時間Ｘ線フイルムに露光されることを備える、請求の範囲第９項の方法。
１１．工程（ｅ）が、−７０℃で２４時間Ｘ線フイルムに露光されることを備える、請求の範囲第１項の方法。
１２．前記担体がプロッティングマトリックスを備える、請求の範囲第１項の方法。
１３．工程（ａ）がプロッティング法により前記プロッティングマトリックスに目的のＤＮＡ断片を移すことを備える、請求の範囲第１２項の方法。
１４．前記プロッティング法がサザン・プロッティング法である、請求の範囲第１３項の方法。
１５．前記工程（ｄ）が５０ｍｌの２Ｘ　ＳＳＰＥ−１％ＳＤＳ中で担体を最初洗浄することを備える、請求の範囲第１項の方法。
１６．前記工程（ｄ）が５０ｍｌの０．１Ｘ　ＳＳＰＥ−１％ＳＤＳ中で担体を最終的に洗浄することを備える、請求の範囲第１項の方法。
１７．４０ＮマイクログラムのＲｅｃＡ蛋白質と、２８ＮマイクログラムのＳＳＢ　ＤＮＡ結合蛋白質と、２８０Ｎマイクログラムのアデノシン５′トリフォスフェートの２ナトリウム塩と、１００Ｎマイクログラムのボバインアルブミンと、６Ｎマイクロモルのトリス（Ｔｒｉｓ）と、４Ｎマイクロモルの塩化マグネシウムからなり、ここでＮが交雑剤のミリリッター数である、酵素の交雑剤。