JP2002502606A - 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 - Google Patents
中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法Info
- Publication number
- JP2002502606A JP2002502606A JP2000530608A JP2000530608A JP2002502606A JP 2002502606 A JP2002502606 A JP 2002502606A JP 2000530608 A JP2000530608 A JP 2000530608A JP 2000530608 A JP2000530608 A JP 2000530608A JP 2002502606 A JP2002502606 A JP 2002502606A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- dna
- sequence
- dna marker
- marker sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
する。より具体的には本発明は、中型(intermediate)(5から7塩基)配列繰
り返し数の変化による長さの多形性現象を有するDNA、特にゲノムDNA中の
遺伝子座の特定を目的とする。本発明はまた、そのような多形性遺伝子座の検出
を目的とする。さらに本発明は、そのような遺伝子座のゲノムDNA増幅生成物
の主としてサイズの違いを基にそれらを個々に特定し識別する方法を目的とする
。この場合、中型縦列繰り返し配列の数はそれぞれ個々に異なっている。
受賞動物の血統を確認するために用いられる。DNA型分けはまた一般に、犯罪
現場で発見された血液、唾液、精液および他の組織の出所を特定するために利用
される。今日使用されるDNA型分け方法は、1つの集団内で少なくとも2つの
異なる形態で出現することが判明しているDNAの1つまたは2つ以上の領域の
長さおよび/または配列の違いを検出および分析できるようにデザインされてい
る。DNA型分けはまた、骨髄移植の成否および特定の癌性疾患の存在を決定す
るために臨床セッティングで用いられる。そのような長さおよび/または配列の
変化は“多形性現象”と称される。そのような変化が生じるDNAの任意の領域
(すなわち“遺伝子座”)は“多形性遺伝子座”と称される。ほとんどのDNA
型分け技術は、少なくとも1つのそのような多形性遺伝子座を含む少なくとも1
つの“マーカー”を利用する。個々のマーカーの各々は、最終的に1集団内のた
だ1つの個体に由来するゲノムDNAのただ1つの対立形質を含んでいる。本発
明の材料および方法は、全て、主として長さの変化を特徴とするDNAの特定の
種類の多形性の検出に使用するためにデザインされている。
(例えば実父確認検査および法廷での分析のために採集された組織サンプルの特
定)で使用するために長い間探し求められてきた。そのようなマーカーの発見お
よび開発、並びにそのようなマーカーを分析する方法はここ数年の間にいくつか
の進展段階を経てきた。最近、遺伝的マーカーとして多形性を有する短い縦列繰
り返し(STR)の発見および開発によって、連鎖マップの作製、病的遺伝子の
特定および性状決定、並びにDNA型分けの簡素化および精密さにおける進展が
促進された。本明細書で用いられるように“短い縦列繰り返し”または“TR”
という用語は、任意の生物のゲノム内で完璧にまたはほぼ完璧に縦並びに繰り返
される2から7ヌクレオチドの長さの全ての配列を指す。例えば、米国特許第5
364759号の4段目、58行目以下でヒトのゲノムDNAで用いられる“短
い縦列繰り返し”の定義を参照されたい。
多形性)で、これらは非常に頻繁にサザンハイブリダイゼーションアッセイで検
出された。そのようなマーカーの特定について述べている参考文献の例として以
下を参照されたい(それらアッセイは放射性プローブを用いて制限エンドヌクレ
アーゼ消化DNAを分析するために用いることができるようにデザインされてい
る):E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98(3):503-507(1975); Schumm et al., A
merican Journal of Human Genetics 42:143-159(1988); A. Wyman & R. White,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:6754-6758(1980))。
列繰り返し数の可変性”(VNTR)を示すマーカー(Y. Nakamura et al., Sci
ence 235:1616-1622(1987); 米国特許第4963663号(White et al.(1990)
;米国特許第5411859号(4963663号の継続特許、White et al.(1
995))、および“ミニサテライト”マーカー(Jeffreys et al., Nature 314:67
-73(1985a); Jeffreys et al., Nature 316:76-79(1985b);米国特許第5175
082号(Jeffreys))であった。VNTRおよびミニサテライトマーカーはとも
に、縦並びの態様で繰り返されるほとんど同一の配列の領域を含んでいる。コア
の繰り返し配列は長さが10から70塩基で、短いコア繰り返し配列(“ミニサ
テライト”繰り返しと称される)および長い繰り返し(VNTRと称される)を
もつ。人間の集団で個々の個体は異なる数のこれらの繰り返しを含む。これらの
マーカーは、塩基置換多形性よりもより強く多形性で、時には1つの遺伝子座で
40またはそれ以上の対立形質を提示する。しかしながら、だらだらと時間のか
かる制限酵素消化の過程およびそれに続くサザンハイブリダイゼーション分析が
、そのようなマーカーのほとんどの検出および分析に要求される。
Science 35(5):1196-1200(1990))に関してポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技
術(米国特許第4683202号(K.B. Mullis))が加わった。増幅可能なVN
TR遺伝子座が発見された。これはサザントランスファーの必要がなく検出する
ことができた。増幅生成物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲルで分離し
、増幅時の放射能の取り込みによって、または臭化銀またはエチジウムによる後
染色によって検出する。しかしながら、PCRは相対的に小さなDNAセグメン
トを信頼できる状態で増幅させるために用いることができる。すなわち、長さが
3000塩基以下のDNAセグメントが信頼できる状態で増幅可能である(M. P
once & L. Micol, NAR 20(3):623(1992); R. Decorte et al., DNA Cell Biol.
9(6):461-469(1990))。結果として、極めてわずかの増幅可能なVNTRしか得
られず、連鎖マップ作製にはそれらは実用的な種類ではない。
-605(1989); D. Tautz, NAR 17:64636471(1989); Weber & May, Am. J. Hum. Ge
net. 44:388-396(1989);ドイツ国特許第DE3834636C2号(D. Tautz);
米国特許第5582979号(L. Weber出願))および多形性の短い縦列繰り返し
(STR)(A. Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49:746-756(1991); H.A.
Hammond et al., Am. J. Hum. Genet. 55:175-189(1994); C.J. Fregeau & R.M
. Fourney, BioTechniques 15(1):100-119(1993); J.W. Schumm et al., "The F
ourth International Symposium on Human Identification 1993", pp.177-187;
および米国特許第5364759号(Caskey et al.); ドイツ国特許第DE38
34636C2号(D. Tautz))をもつ多形性マーカーの最近の進歩により、従来
の方法の欠点の多くが克服された。ジヌクレオチドまたはSTR繰り返し(定義
では2−7bp繰り返しを含む)を含む2つのタイプのマーカーは、一般に“ミ
クロサテライト”マーカーと称される。最も入手しやすいマーカーであるとしば
しば考えられるこのミクロサテライト遺伝子座では、それらの対立形質は長さが
変化するということで区別できるという点で増幅可能なVNTRと同様である。
しかしながらVNTRと異なり、これらの遺伝子座は、2、3、4、または稀に
5塩基の長さの完全または不完全な繰り返し配列を含んでいる。それらは、ただ
1つの遺伝子座でほんの数個の対立形質から40以上の対立形質を出現させる。
増幅プロトコルは小さな生成物(一般に長さが60から400塩基対)を製造す
るためにデザインすることが可能で、各遺伝子座の対立形質はしばしば50bp
未満の範囲内で含まれる。これは、いくつかの系を同じゲル上で同時に電気泳動
で分析することを可能にする(ただし、個々の系から得られる全ての潜在的増幅
生成物が同じゲル内で他の系の対立形質の領域と重ならないようにPCRプライ
マーを注意深くデザインする)。
スリップ増幅(stutter)人工生成物の存在、すなわち各対立形質を表した大きな
フラグメントの他に1つまたは2つ以上の小さなフラグメントがしばしば増幅後
に見出される。この欠陥は、トリまたはテトラヌクレオチド繰り返しマーカーよ
りもジヌクレオチド繰り返し遺伝子座ではるかに明瞭に提示される(Edwards et
al., Am. J. Hum. Genet. 49:746-756(1991); Edwards et al., Genomics 12:2
41-253(1992); Weber & May, Am. J. Hum. Genet. 44:388-396(1989))。これら
の人工生成物の存在(おそらくは繰り返しのスリップ現象(repeat slippage)(
Levinson & Gutman, Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221(1987); Schlotterer & Ta
utz, NAR 20:211-215(1992))と称されるDNAポリメラーゼ関連現象の結果と思
われる)は、この遺伝子座の対立形質の内容の解釈を複雑にする。全ての解釈が
複雑になる一方で、各対立形質を表している大きなフラグメントと小さなフラグ
メントの存在は、特に法定訴訟での分析の場合にこれらマーカーの有用性を制限
する(法廷訴訟分析では、2つ以上のDNAサンプルが存在するか否かをしばし
ば決定しなければならない)。本明細書の実験で述べるマーカーの多くは、既知
のマーカーに較べて極めてわずかしか短い人工生成物を生じない新規な種類のマ
ーカーである。
で多数の遺伝子座を分離することの困難さと関係がある。これは、DNAフラグ
メントの分離に当業者がもっとも一般的に用いるゲルの上部領域が異なるサイズ
のフラグメントで間隙的に圧縮されるためである。大きな繰り返し単位を基にす
る本実験で述べるマーカーの開発はこのゲル内の有用範囲を広げ、より多くの遺
伝子座の同時分析を可能にする。
座の各々で5から7塩基繰り返しの数の相違を基にする長さの多形性をもつほん
のわずかのDNA遺伝子座しか文献に記載されていないということである。例え
ば以下の文献を参照されたい:Edwards et al., Nucleic Acids Res. 19:4791(1
991); Chen et al., Genomics 15(3):621-5(1993); Harada et al., Am. J. Hum
. Genet. 55:175-189(1994); Comings et al., Genomics 29(2):390-6(1995); U
tah Marker Development Group, Am. J. Genet. 57:619-628(1995)。1995年
に、GenBankデータベースを用いて、霊長類ゲノム内の5量体および6量
体の縦列繰り返しの相対的豊富さおよび変動性を決定する実験が報告された(Ju
rka & Pethiyagoda, J. Mol. Evol. 40:120-126(1995))。しかしながら、変動性
は間接的に概算されただけで、個々の遺伝子座における多形性レベルは示されな
かった(上掲書)。我々は、5から7塩基繰り返し配列の高度に多形性である繰
り返しを含有するDNA遺伝子座を特定し分析する材料および方法を開発した。 本発明の材料および方法は、極めて多様な供給源の一本鎖および二本鎖DNA
を含む種々のDNAタイプの個々の多形性遺伝子座を特定し分析するために使用
できるようにデザインされている。本発明は現存の技術を顕著に改善し、遺伝子
連鎖分析、犯罪審判、実父確定検査並びに他の訴訟および医学的用途のためのD
NAプロフィール調査の性能および精密さを高める。
よび分析のための材料と方法を提供することである。ここで“中型縦列繰り返し
配列”とは、5、6または7塩基の配列から成る少なくとも1つの繰り返し単位
を含み、当該単位が少なくとも2回繰り返されているDNAの領域である。
遺伝子座を分析または検出するために用いる場合、わずかしか人工生成物を生じ
ない、中型縦列繰り返しDNAマーカーを特定する材料および方法を提供するこ
とである。本発明の材料および方法は、好ましくは、その各々が多形性を有する
中型縦列繰り返し配列を含むゲノムDNAの遺伝子座の特定および分析に用いら
れる。本発明の材料には、ヒトゲノムDNAのそのような遺伝子座に対するオリ
ゴヌクレオチドプライマーおよびDNAマーカーが含まれる。本発明の方法を用
いて検出される中型縦列繰り返し遺伝子座は、同様な方法を用いて検出される多
くの既知の遺伝子座(短いSTR(すなわち2、3または4塩基DNA配列の縦
列繰り返し)を含む)の場合よりも少ない人工生成物を生じる。
単位数の相違による主に長さの変化を基にした、多形性を有する個々の遺伝子座
の分析のための方法および材料を提供することである。本発明の固有の目的はま
た、中型縦列繰り返し多形性(5ヌクレオチド縦列繰り返し多形性を含む)を含
有する多形性ゲノムDNA遺伝子座の検出および分析のための方法、キットおよ
びプライマーを提供することである。
り返し配列を含むDNAフラグメントを単離する方法から成る:(a)少なくと
も1つのフラグメントは中型縦列繰り返し配列を含む、複数のDNAフラグメン
トを提供し;(b)中型縦列繰り返し配列の一部分と相補性を有するヌクレオチ
ド配列を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを結合させた支持手段(例え
ば固定支持手段)を提供し;さらに(c)前述の複数のDNAフラグメントとこ
の支持手段とを、中型繰り返し配列を含むDNAフラグメントおよび少なくとも
1つの他のDNAフラグメントが支持手段とハイブリダイズする条件下で混合す
る。
生じる傾向が低い多形性中型縦列繰り返し配列を検出する方法である;(a)少
なくとも1つの標的中型縦列繰り返し配列を有するDNAサンプルを提供し;さ
らに(b)DNAサンプル中の標的中型縦列繰り返し配列を検出する。この実施
態様では1.1%未満の平均スリップ増幅人工生成物が認められた。
ーを用い、DNAサンプル中の問題の中型縦列繰り返し配列(以下では“標的中
型縦列繰り返し配列”)を増幅させ、DNAサンプル中の標的中型縦列繰り返し
配列を検出する方法を提供する。ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは、中
型縦列繰り返し配列を含むDNAマーカーの領域と相補的でさらにこれと接する
配列(以下では“中型縦列繰り返し配列鋳型”)を含み、ここでこのDNAマー
カーは配列番号:1から43から成る配列群から選ばれる配列を有する。
列をDNAサンプル中型縦列繰り返し配列で検出するキットを提供する。このキ
ットは、少なくとも1つの標的中型縦列繰り返し配列を増幅させる少なくとも1
つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む容器を含み、このオリゴヌクレオチド
プライマーは、中型縦列繰り返し配列鋳型を含む二本鎖DNAマーカーの領域の
一部と相補的でこれと接するヌクレオチド配列を含み、このDNAマーカーは配
列番号:1から43から成る群から選ばれる配列を有する。 さらに別の実施態様では、本発明は、中型縦列繰り返し配列鋳型に接するマー
カー領域の二本鎖DNAマーカーの一方の鎖と相補的な配列を含むオリゴヌクレ
オチドプライマーを提供する。ここで、DNAマーカーは配列番号:1から6、
および配列番号:28から33から成る群から選ばれる配列を有する。
、実父確認、骨髄移植のモニタリング、遺伝子連鎖マップ作製および遺伝的疾患
および癌の検出の分野で固有の用途を有する。異なる個体の少量の組織間で正確
に識別する必要性は、法定訴訟での適用で特に緊急を要する。法廷訴訟では、多
くの有罪判決(無罪判決)がDNA型分け分析(STR遺伝子座の分析を含む)
で左右される。 本発明の更なる目的、特色および利点は、以下の本発明の最良の実施態様およ
び説明図から明らかであろう。
となく実施できることは当業者には明白であろう。 A.定義 本明細書で用いられるように、“中型縦列繰り返し”または“ITR”は、少
なくとも2回縦並びに繰り返される5から7塩基の配列を含むDNA配列の一領
域を指す。ITRという用語はまた、5から7塩基を含む2つ以上の配列が縦並
びに、または介在する塩基を伴って繰り返されるが、ただしこれら配列の少なく
とも1つが少なくとも2回縦並びに繰り返されることを条件とするDNAの一領
域を包含する。ITR内で少なくとも1回繰り返される各配列を本明細書では“
繰り返し単位”と称する。 “ITR多形性”とは、主として各染色体の同じ領域内の繰り返し単位の数が
異なるために、個体集団内においてある染色体と別の染色体で長さが異なるゲノ
ムDNA中のITRを指す。
的なカテゴリー(完全および不完全)に分類される。本明細書で用いられる“完
全な”ITRとは、少なくとも2回縦並びに繰り返される5から7塩基のただ1
つの繰り返し単位を含む二本鎖DNAの一領域を指す(例えば(AAAAT)12 )。本明細書で用いられるように、“不完全な”ITRとは、完全な繰り返し単
位の少なくとも2つの縦列繰り返しおよび不完全な繰り返し単位の少なくとも1
つの繰り返しを含むDNAの一領域を指し、この場合、不完全な繰り返し単位は
、完全な繰り返し単位の配列における1、2または3塩基の挿入、欠失または置
換から生じるDNA配列から成る(例えば(AAAAT)12(AAAAAT)5
AAT(AAATT)4)。不完全なITR配列はいずれも少なくとも1つの完 全なITR配列を含む。特に、ITR配列はいずれも完全であるか不完全である
かにかかわず、少なくとも2回縦並びに出現する、下記式(I)で表される少な
くとも1つの繰り返し単位配列を含む: (AwGxTyCz)n (I) 式中、A、G、TおよびCは任意の順序のヌクレオチドを表し、w、x、yおよ
びzは当該配列の各ヌクレオチドの数を示し、その範囲は0から7であるがw+
x+y+zの合計は5から7の間で、nは当該配列が縦並びに繰り返される数を
表し、少なくとも2である。
多形性のサブクラスを指す。また別に特定しないかぎり、“5ヌクレオチド縦列
繰り返し”は、繰り返し配列が5塩基の配列である完全なITR、および少なく
とも1つの繰り返し単位が5塩基の繰り返しである不完全ITRを包含する。 “DNAマーカー”とは、ITR配列、例えばゲノムDNAの一領域を増幅す
ることによって製造したITR配列を含むDNAフラグメントを指す。個々のマ
ーカーはそれぞれ、究極的に集団内のただ1つの個体に由来するゲノムDNAの
ただ1つの対立形質を含む。 “遺伝子座”という用語はDNAの特定の領域を指す。ゲノムDNAの一領域
を指すために用いられる場合は、“遺伝子座”は染色体の特定の場所を指す。同
じゲノムの遺伝子座は、集団内のいずれの個体についても相同染色体の各対上で
同一の部位に出現する。そのような染色体の各々の同じ遺伝子座に存在するDN
A配列、または同じそのような染色体から発生するDNAの同じ遺伝子座は、“
対立形質”と称される。
ノムDNAで見出される少なくとも2つの染色体で観察される遺伝子座の対立形
質における変動を指す。“多形性”という用語は、他の担体(例えばDNAベク
ターまたは別の生物体の染色体DNA)中にクローン化された染色体フラグメン
トの同じ遺伝子座から得られたDNA配列の変動を含む。 本明細書で用いられるように、“ITR隣接配列”とは、ITRを含むDNA
配列の鎖上でITRと隣合うヌクレオチド配列をいう。その完全な配列の一部分
としてITR隣接配列を含む配列はそれ自体隣接配列である。
より多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される分子と
定義される。各プライマー配列は鋳型の配列を正確に反映する必要はないが、当
該配列が鋳型との相補性をより正確に反映すればするほど、鋳型との結合性は良
好である。その正確な長さおよび配列は、当該オリゴヌクレオチドプライマーの
最終的な機能および用途に関係する多くの因子(温度、プライマーの配列、およ
び方法の有効性を含む)に左右されるであろう。本発明の各オリゴヌクレオチド
プライマーは、ITR配列に隣接するDNAマーカーの配列と相補的な核酸配列
を含む。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の1つの鎖と相補的な
プライマー伸長生成物の合成を誘発する条件下に置いた場合、合成の開始点とし
て機能することができる。当該条件には、ヌクレオチドおよび誘発剤の存在、例
えば適切な温度およびpH下でのDNAポリメラーゼの存在が含まれる。好まし
い実施態様では、当該プライマーは、誘発剤の存在下で特定の配列から伸長生成
物の合成を開始させるために十分な長さをもつ一本鎖オリゴデオキシリボヌクレ
オチドである。オリゴヌクレオチドプライマーの感受性および特異性は、プライ
マーの長さおよび与えられた鋳型DNAサンプル内の配列の固有性によって決定
される。本発明では、オリゴヌクレオチドプライマーは通常はおよそ15塩基よ
り大きく、好ましくは長さが約20から40塩基である。
は同じITRに隣接する二本鎖DNAの向き合う鎖と相補的なデオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチド配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチドプラ
イマーの各対は、好ましくはただ1つのITRを検出するために選別される。各
プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、当該配列が鋳型と
の相補性を正確に反映すればするほど、鋳型との結合は良好である。
、さらに当該オリゴヌクレオチドが結合している鎖と相補的であるヌクレオチド
配列を指す。 本明細書で用いられる“オリゴヌクレオチドプローブ”という用語は、標的配
列の一部分(例えばDNAサンプルの中型縦列繰り返し配列)と相補的な配列を
含むDNAまたはRNAの一本鎖分子を指し、ここで相補性を有する当該部分は
、プローブが標的配列とハイブリダイズするために十分な長さを有する。
的DNAの1つまたは2つ以上の分子を検出する場合に観察される固有のタイプ
の人工生成物を指す。この場合、標的DNAは同じ繰り返し単位配列(本発明に
したがって検出および分析される標的中型縦列繰り返し配列を含む)の縦列繰り
返しを含む。長さによるサンプル中の全DNAの分離後に任意のそのような標的
DNAを含むサンプルが検出される場合、標的DNA分子の各々はメジャーシグ
ナルを(例えばゲルのメジャーバンド)を生じるが、マイナーシグナルも各メジ
ャーシグナルの直ぐ近くに検出できる。一般に、このマイナーシグナルは、1つ
または2つ以上の繰り返し単位が標的DNA配列に付加または欠失したために標
的DNAと長さが異なるDNAフラグメントが検出されたために生じる。スリッ
プ増幅人工生成物は、DNAの複製中に(in vivoおよびin vitroの両方で)ス リップした鎖の対合形成の誤りによるものとされた(例えば以下の文献を参照さ
れたい:Levinson & Gutman(1987), Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221; Schlott
erer & Tauz(1992), Nucleic Acids Research 20(2):211-215)。そのような人 工生成物は、そのような任意の繰り返し配列を含むDNAがin vitroでポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)のような増幅方法を用いて増幅される場合に特に明瞭で
ある。なぜならば、サンプル中に存在するか、またはポリマー生成中に生産され
る一切のマイナーフラグメントがメジャーフラグメントともに増幅されるからで
ある。
1つの供給源(例えばただ1つの細菌コロニーまたはゲノムDNAのただ1つの
染色体)から得られたDNAサンプルで観察されるメジャー(すなわち標的)シ
グナルの大きさに対するマイナー(すなわち人工生成物)シグナルの大きさの比
較を指す。スリップ増幅人工生成物百分率は増幅されていないDNAで決定する
ことができるが、好ましくは少なくとも1つの標的中型縦列繰り返し配列の増幅
後に決定される。“スリップ増幅人工生成物平均百分率”という用語は、1つの
集団内で少なくとも20の対立形質を含む代表的サンプルで検出されたスリップ
増幅人工生成物百分率の測定値から得られたスリップ増幅人工生成物百分率の平
均を指す。
DNAに由来する一切のDNAを指す。この用語には、例えば異種生物のクロー
ン化DNA、完全ゲノムDNAおよび部分的ゲノムDNA(例えばただ1つの単
離染色体のDNA)が含まれる。 本発明によって検出または単離されるDNAは一本鎖でも二本鎖でもよい。例
えば、本発明での使用に適した一本鎖DNAは、細菌ファージ、細菌、またはゲ
ノムDNAのフラグメントから得ることができる。本発明での使用に適した二本
鎖DNAは、中型縦列繰り返し配列をもつDNAを含む多数の種々の供給源のい
ずれからも得ることができる。これらDNA供給源には、ファージライブラリー
、コスミドライブラリーおよび細菌ゲノムまたはプラスミドDNA、並びにいず
れかの真核細胞生物から単離されたDNA(ヒトゲノムDNAを含む)が含まれ
る。DNAは好ましくはヒトゲノムDNAから得られる。多数のヒトゲノムDN
A供給源のいずれも用いることができるが、これらには医療用または法廷訴訟用
サンプル、例えば血液、精液、膣スワブ、組織、毛髪、唾液、尿および体液混合
物が含まれる。そのようなサンプルは、新しいものでも古いものでも乾燥したも
のでも、および/または部分的に分解したものでもよい。サンプルは犯罪現場の
証拠物件から採集できる。
むDNAフラグメントを単離する方法である。本方法は以下の工程を含む:(a
)少なくとも1つのDNAフラグメントがITRを含む、複数のDNAフラグメ
ントを提供し;(b)中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的なヌクレオチド配
列を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを結合させた支持体手段を提供し
;(c)当該複数のDNAフラグメントと当該支持体手段とを、ITR配列を含
有するDNAフラグメントのいずれかを含むDNAフラグメントが支持体手段と
ハイブリダイズする条件下で混合する。
意のDNAサンプルをフラグメント化して得ることができるが、好ましくはゲノ
ムDNAをフラグメント化して得られる。例えば以下の文献を参照されたい:Cu
rrent Protocols in Human Genetics(1994), Chapter 2: Development of Genet
ic Markers, Construction of Small-Insert Libraries from Genomic DNA, p.2
.2.1およびそれ以降(これは参照により本明細書に含まれる))。工程(a)で使
用する複数のDNAフラグメントを調製する最も好ましい方法は以下を含む工程
にしたがう:サンプルDNAをフラグメント化し、それによって、少なくとも1
つのDNAフラグメントがITRを含むDNAフラグメント集団を作製し;当該
DNAフラグメント集団に各DNAフラグメントの少なくとも一方の末端にプラ
イミング配列を含むリンカーを連結し;さらに、プライミング配列と相補的な配
列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて各リンカー連結フラグメントを
増幅させる。異なるリンカーを各フラグメントの各々の末端に連結することがで
きる。しかしながら、リンカーのプライミング配列と相補的な配列を有するただ
1つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させることができるように、
好ましくはただ1つのリンカーを各末端に連結する。リンカー連結は、好ましく
はT4DNAリガーゼのようなリガーゼ酵素の存在化で実施する。
、多数の異なる手段のいずれも用いることができる。これらには、超音波処理ま
たは少なくとも1つの制限酵素によるフラグメント化が含まれるが、二本鎖DN
Aは制限酵素でのみフラグメント化できる。二本鎖DNAサンプルをフラグメン
ト化するために制限酵素を用いる場合は、好ましい制限酵素は一本鎖の突出部を
残す4塩基対認識配列をもち、さらに問題のITR領域内でDNAサンプルを切
断しない酵素である。二本鎖DNAサンプルのフラグメント化で使用する好まし
い制限酵素には、MboI、AciI、BfaI、DpnII、HhaI、Hi
nP1I、HpaII、MseI、MspI、NlaIII、Sau3AI、T
aqI、Csp6IおよびTaiIが含まれる。
を用いて増幅される。これらの増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(米国
特許第4683202号(K.B. Mullis))、核酸配列依存増幅(NASBA)(
Kievits et al.(1991) J. Virol. Methods 35(3):273-286)、連結仲介増幅(Vo
lloch et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22(13):2507-2511)、鎖置換増幅(Wa
lker et al.(1992) PNAC 89(1):392-396)、配列非依存性単一プライマー増幅(
SISPA)(Reyes(1991) Mol. Cell Probes 5(6):473-481)またはリガーゼ連
鎖反応(米国特許第5686272号(Marshall et al))である。
ヌクレオチドを結合させた固定支持体を含む。固定支持体は、好ましくはオリゴ
ヌクレオチドを直接または間接的にカップリングさせることができる物質を含む
。オリゴヌクレオチドを直接カップリングさせることができる適切な物質には、
ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリカ、およびラテックスが含まれる。
本方法の好ましい本実施態様で使用する適切な固定支持体の例には、ナイロン膜
、シリカ粒子を埋め込んだフィルター、ガラスビーズ、シリカ磁性粒子、または
シリカ含有樹脂が含まれる。オリゴヌクレオチドに結合させた第一のカップリン
グ剤および固定支持体表面に結合させた第二のカップリング剤によってオリゴヌ
クレオチドに間接的にカップリングさせることができる適切な物質には、アビジ
ンとストレプトアビジン、または抗原とそれに対する抗体が含まれる。
Aフラグメントの中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的なヌクレオチド配列が
含まれる。本明細書で用いる“部分”という用語は、前述の配列と相補的な配列
を有するオリゴヌクレオチドが、当該配列と接触するときにそれとハイブリダイ
ズすることができるように十分な長さを有するDNAフラグメントのITR領域
内のヌクレオチド配列を指す。この“部分”は、好ましくは長さが少なくとも2
0塩基、より好ましくは少なくとも40塩基の配列である。より好ましくは、標
的オリゴヌクレオチドは、式(AwGxTyCz)nによって示される式を有す
る。式中、A、G、TおよびCはヌクレオチドを表し、これらはどのような並び
方でもよく;w、x、yおよびzは配列内の各ヌクレオチド数を表し、その範囲
は0から7で、w+x+y+zの合計は5から7の間で;nは配列が縦並びに繰
り返される回数で、少なくとも約4回、より好ましくは少なくとも約8回、最も
好ましくは少なくとも15回である。
ラグメントが支持体手段とハイブリダイズする条件下で当該支持体手段と混合さ
れる。当該複数のフラグメントが複数の二本鎖DNAフラグメントである場合は
、当該DNAは支持体手段とのハイブリダイゼーションの前に変性させる。ハイ
ブリダイゼーションの前に二本鎖DNAフラグメントを変性させる適切な手段に
は、二本鎖DNAを変性させるために十分に高い温度にDNAを暴露するか、ま
たは変性溶液にDNAを暴露することが含まれる。DNAは好ましくは、変性剤
(例えば塩基(例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム))を含む変性溶液
を用いて変性させる。DNAフラグメントを変性させるために塩基が用いられる
場合は、得られる混合物のpHは、好ましくはpH約4.8から当該混合物のp
Hの緩衝液を添加することによってほぼ中性pHに調節される。
はこの支持体手段を洗浄して、DNAフラグメントを除去し、さらに支持体手段
が含まれる一切の溶液中に存在する一切の他の物質、またはハイブリダイズしな
かった支持体手段の表面に存在する一切の他の物質を除去する。使用されるいず
れの洗浄溶液も、好ましくは支持体手段とハイブリダイズしたDNAフラグメン
トを遊離させることなくそのような物質を除去するように構成される。
フラグメントとの結合の性質にしたがって熱または適切な遊離溶液を用いて、支
持体手段から遊離させることができる。例えば、水または低塩類水溶液(例えば
TE緩衝液(例えば10mMトリス−HCl(pH7.5)、1mMのEDTA
))を用いて、シリカ材料で構成された支持体手段とハイブリダイズしたDNAフ
ラグメントを遊離させることができる。支持体手段から一度遊離させたら、得ら
れた遊離DNAフラグメントの混合物に存在する他のDNAフラグメントからI
TR配列を含むDNAをさらに単離するためにDNAフラグメントを処理するこ
とができる。さらなる処理工程は、上記の本方法にしたがって再ハイブリダイゼ
ーションおよびスクリーニング、またはDNAベクターへのクローニングおよび
これらクローンによる形質転換体のスクリーニングを含むことができる。
を示す。この態様では、DNAフラグメント集団を調製し、支持体手段とハイブ
リダイズさせ、さらに増幅、クローニングおよびITR含有形質転換体をスクリ
ーニングする。図1に示す工程の各々はローマ数字で表示されている。工程Iは
二本鎖DNA分子(1)を示し、これは制限酵素(2)で消化され、サイズの異
なるDNAフラグメント集団(図には示されていない)を生じ、そのうちの少な
くとも1つは標的ITRを含む。工程IおよびIIの間の矢印はリンカー(3)
を示し、これはDNAフラグメント集団に添加され、異なる2種類のDNAフラ
グメント(標的ITR配列を含むフラグメント(6)と標的配列を含まないフラ
グメント(4))の各々の末端にリンカー(3)をもつリンカー連結フラグメント
(8)集団を生じる。各リンカー(3)のプライミング配列と相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチドプライマー(7)を工程IIIのDNAフラグメント(
8)集団に添加し、PCR反応により増幅し、それによって増幅DNAフラグメ
ント(9)の集団を製造する。工程増幅DNAフラグメント(9)の集団を容器
(15)にハイブリダイゼーション溶液(12)およびフィルター(10)とと
もに入れる。このフィルター(10)には、標的ITR配列の一部分と相補的な
配列を有する少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが結合されている。ハイブリ
ダイゼーション溶液は、ITR配列を含むDNAフラグメントのフィルターへの
ハイブリダイゼーションを促進する。工程Vでは、フィルター(10)を容器(
15)から取り出し、それにハイブリダイズしたDNAフラグメントを当該フィ
ルターから遊離させる。得られた遊離フラグメントの濃縮集団を、工程IIIの
増幅反応で用いたものと同じオリゴヌクレオチドプライマー(7)を用いて工程
VIで再度増幅させる。最後に、工程VIIで濃縮増幅DNAフラグメント集団
の各々のフラグメントをプラスミドベクターでクローニングする。標的ITR配
列(6)を含むフラグメントをクローニングしたベクターおよびITR配列を含
まないフラグメント(4)をクローニングしたベクターが工程VIIに示されて
いる。
的な実施態様で検出するとき、最小のスリップ増幅人工生成物が観察される。観
察された平均スリップ増幅人工生成物は好ましくは1.1%未満、より好ましく
は0.9%未満である。標的ITR配列は完全なITRでも、不完全なITR配
列でもよい。検出されるDNAサンプルは好ましくはゲノムDNAである。 平均スリップ増幅人工生成物は好ましくはDNAサンプルのITR配列の増幅
後に検出される。
カー、プライマー(各プライマーは、これら43配列の1つによって特定された
DNAマーカーの1つのITR領域に隣接する配列と相補的な配列を有する)、
およびプローブ(43マーカーの1つのITR領域内に含まれる配列と相補的な
配列を有する)を含む。下記の実施例で説明する実験で特定された特に好ましい
プライマーは表1に列挙する。 下記の実施例は説明のために提供され、本発明を全く制限しようとするもので
はない。実施例では、全ての百分率は、固体については重量により、液体につい
ては容積による。全ての温度は特に記載がなければ摂氏である。
ョン選別は、文献に記載された選別方法の改変様式である(J. Armor et al.(19
94) Hum. Mol. Genet. 3(4):599-605))。 ヒトゲノムDNAは、15人から得た全血プールから標準的フェノール:クロ
ロホルム抽出法("Current Protocols in Human Genetics"(1994), J. Gilber,
ed., Appendix)を用いて精製した。 DNA1μg当たり5単位のMboI制限酵素を用いて、約100μgのゲノ
ムDNAを16時間37℃で切断し、続いてフェノール:クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱で精製し、さらに100μlのTE緩衝液(10mMトリス−HC
l、1mMのEDTA(pH8.0))に最終濃度約1μg/mlでDNAを再懸
濁した。 サイズが250−600bpの範囲のDNAフラグメントを1%SeaKem
GTG(FMC Bio Products, Rockland, Maine)調製用アガロースゲル(15x2
0cm)上で100Vで1.25時間ゲル電気泳動を実施して単離し、電気溶出
(リファレンス)によって回収した。A260での吸収を測定してDNAを定量
し、滅菌したナノピュア純度の水で500ng/μlに希釈して−20℃で保存
した。
AAG CTT GG−3’)および5’燐酸化オリゴB(5’−GAT CC
C AAG CTT CCC GGG TAC CGC−3’)を最終濃度10
00ピコモル/μlでアニールして調製した。サイズ選別した挿入DNA(平均
サイズ425bpを3.5ピコモル)1μgを13μg(875ピコモル)のリ
ンカー(リンカー:挿入物モル比は250:1)と1−3単位のT4DNAリガ
ーゼを16時間15℃で用いて連結した。過剰なリンカーおよびリンカー二量体
はゲル電気泳動(1%SeaKem GTGアガロース、1.5時間、100V)で主要フ
ラグメントから分離した。リンカー連結DNAフラグメントを電気溶出によって
ゲルから回収し、50μlの滅菌水に再懸濁した。
500mMのKCl、100mMトリス−HCl(pH9.0)、15mMのM
gCl2、1%トリトンX−100および2mMの各dNTP)、1μlのTa qポリメラーゼ(5単位/μl)、および1μMのオリゴAプライマー(10ピ
コモル/μlのストックの10μl)を含む100μlの反応容積でPCRを用
いて増幅した。この反応でプライマーとして用いた“オリゴA”は、上記のよう
にMboIリンカーを集めるために用いた“オリゴA”と同じである。循環条件
は95℃1分、67℃1分、70℃2分で30サイクルであった。dNTP、プ
ライマーおよびプライマー二量体はセントリコン100による微小ろ過で除去し
た(2mlの滅菌水をサンプルに添加し、セントリコン−100に加え、200
0RPMで20分遠心し、セントリコンフィルターを逆にしてさらに2分200
0RPMで遠心してDNAを回収し、100μlの滅菌蒸留水に再懸濁した)。
得られたPCRライブラリーの5μlの部分標本を1%アガロースゲルで検査し
(100ボルトで1時間)、サイズ範囲が250から600bpであることを確
認した。
異なる繰り返しを含むDNAフラグメントを、固形支持体に結合させた種々のオ
リゴヌクレオチド混合物を用いてハイブリダイゼーションによって濃縮した。(
AAAAX)nの5ヌクレオチド繰り返しを含むフラグメントをハイブリダイゼ
ーション選別によって濃縮した。この工程は、先ずハイブリダイゼーション選別
で使用するオリゴヌクレオチドを構築することによって達成された。このオリゴ
ヌクレオチド構築物は、長さが1000bpの中に(AAAAC)n、(AAA
AG)nおよび(AAAAT)nが縦並びに並べられたものから成る。これらの
オリゴヌクレオチドを膜に固定し、完全ゲノムPCRライブラリーとハイブリダ
イズさせて(AAAAX)nの繰り返しを含むフラグメントを選別した。
量体オリゴヌクレオチドである〔AAAAC〕6、〔AAAAG〕6、および〔A
AAAT〕6並びにそれらの相補物、〔GTTTT〕6、〔CTTTT〕6および 〔ATTTT〕6を合成し、ナノピュアの純度の水に1000ピコモル/μlの 濃度で懸濁し、(b)相補配列をもつ等モル濃度(各々10μlまたは10ナノ
モルもしくは198μgを用いた)のオリゴヌクレオチドを混合し、65℃で1
5分加熱し、さらに数時間4℃に置いて互いにアニールさせ、(c)続いてDN
A1μgにつき1ワイス単位のT4DNAリガーゼを15℃で一晩用いてアニー
ルしたオリゴヌクレオチドを互いに連結し、(d)200bp以上の連鎖体を1
%SeaKemGTGアガロースでサイズ選別し、(e)連結DNAをプライマ
ー非含有PCRに付して縦列アレイを延長し、(f)見かけのサイズが1000
bpを越えるフラグメントを1%アガロースゲルから回収し、微小ろ過によって
精製した。A260での吸収を求め、ナノピュア純度の滅菌水で1μg/μlのス トックを作製した。
たは(AAAAT)200で4mmx4mm片のナイロン製ハイボンドNfp膜(A
mersham Life Sciences, Inc)フィルターにスポットを作製し、2回予備ハイブ リダイゼーション緩衝液で30分攪拌しながら洗浄して弱く結合したオリゴを除
去して風乾し、DNAを結合させるために1200μジュールでUV架橋連結を
施し、続いて−20℃で保存した。
持媒体との完全ゲノムPCRライブラリーのハイブリダイゼーション選別は、以
下のように実施した:(a)1mlの予備ハイブリダイゼーション緩衝液〔1%
BSA(Sigma B-4287)、1mMのEDTA(pH8.0)、7%(w/v)の
SDS、0.5MのMa2HPO4〕で、前述のフィルターを(AAAAC)nお
よび(AAAAG)nの配列を有するオリゴヌクレオチドを含むフィルターにつ
いては40℃で、さらに(AAAAT)nの配列を含むフィルターについては3
7℃で予備ハイブリダイズした。20分後に緩衝液を除去し、100μlの新し
い予備ハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、(b)完全ゲノムPCRライブ
ラリーDNA(20μg)をアルカリ(KOH、最終濃度150mM)で変性さ
せ、さらに0.25容の1Mトリス−HCl(pH4.8)を加えて中性にし、
フィルターを含む緩衝液に加えた。得られた反応混合物を予備ハイブリダイゼー
ション温度(37℃または40℃)で一晩保温し、(c)(AAAAC)200お よび(AAAAG)200フィルターを2回1mlの洗浄緩衝液#1(40mMの Na2HPO4(pH7.2)、0.1%SDS)で40℃で洗浄し、さらに1回
室温で15分攪拌しながら洗浄した。(AAAAT)200のフィルターは1ml の洗浄緩衝液#1で1回37℃で洗浄し、さらに1回室温で洗浄し、(d)各フ
ィルターに結合したDNAを95℃で5分、100μlのナノピュア純度の水の
中で加熱して遊離させた。再アニーリングを95℃で防止しながらサンプルを取
り出した。フィルターは、0.4MのNaOHで45℃30分保温し、続いて0
.1xSSC、0.1%SDS、0.2Mトリス(pH7.5)に移し、さらに
15分保温することによって清浄にし再使用した。膜にブロットを付け乾燥させ
、栓をした試験管に入れて−20℃で保存した。
リーのクローニング 実施例2のようにして5ヌクレオチド繰り返しが濃縮されたDNAフラグメン
ト集団をPCRによって再度増幅した。続いて再増幅フラグメントを下記に述べ
るようにプラスミドベクターpGEM−3Zf(+)でクローニングした。この
工程は、選別挿入物をpGEMベクターに連結し、続いて環状プラスミドでJM
109大腸菌ホストを形質転換することによって実施された。
ションで選別した5μlのDNAを100μlの反応容積で以下を用いて再増幅
した:1XSTR緩衝液(50mMのKCl、10mMトリス−HCl(pH9
.0)、1.5mMのMgCl2、0.1%トリトンX−100および各dNT Pを0.2mM)、1μlのTaqポリメラーゼ(5単位/μl)、および1μ
MのオリゴAプライマー(100ピコモル/μlのストックを1μl)。循環条
件は95℃1分、67℃1分、70℃2分で30サイクル。(b)11μlのプ
ロメガ制限酵素10X緩衝液Cおよび2μl(8単位/μl)のMboIを10
0μlのPCR反応に添加し、得られた反応混合物を37℃で一晩保温し、65
℃で20分混合物を保温して制限酵素を熱不活化することによって、再増幅した
DNAを消化した。(c)pGEM−3Zf(+)ベクター(約20μgまたは
10.6ピコモル)を、BamHI(5単位/μg)で16時間37℃で消化し
、続いて適切な量のウシ腸アルカリホスフェート(Calf Intestinal Alkaline P
hosphate, CIAP)10X緩衝液(Promega)および1 μlのCIAP(単位/μl
)を加え、さらに37℃で1時間保温してフラグメント挿入のために準備した。
この反応を0.5MのEDTAを0.02Mの最終濃度で添加して停止し、続い
てフェノール抽出しエタノールで沈澱させTE緩衝液に1μg/μlで再懸濁さ
せた。(d)最後に1μlまたは200ngの脱燐酸pGEM3Zf(+)(工
程c参照)および1μlのT4DNAリガーゼ(1から3単位/μl)とともに
、MboIで切断したDNA1μl(工程b参照)を2時間室温で保温して、2
0μlの挿入物−ベクター連結を実施した。 最後に、テクニカルブリテン#095に記載されたプロメガ形質転換プロトコ
ルを用いて、10μlの挿入物−ベクター連結反応物で100μlのJM109
コンピテント細胞を形質転換した。
イブラリークローンのコロニーハイブリダイゼーションによる選別 ライトスミスII試薬およびプロトコル(プロメガテクニカルブリテン#TM
227を参照)を用いてコロニーハイブリダイゼーションスクリーニングによっ
て、(AAAAX)n5ヌクレオチド繰り返しを含むクローンを選別し、アルカ
リホスファターゼ共役プローブとのハイブリダイゼーションにより可視化した。
on Separations, Inc. Westboro, MA)を静置し、3分間放置して膜にコロニーD
NAを移し、続いて乾燥濾紙にブロッティングした。次に、以下を含む一連のト
レーに膜を移した:10%SDSで3分、続いて変性溶液(5mlのNaOH+
30mlのNaCl+65mlの蒸留水から成る)で5分、続いて中和溶液(3
0mlの5MNaCl+25mlトリス−HCl(pH7.4)+45mlの蒸
留水から成る)で5分、最後に2XSSCで5分。続いて膜を室温で30分乾燥
させ、その後スタータリンカー(Statalinker(登録商標)、Stratagene, La Jol
la, CA)を用いて1200μジュールでUV架橋する。
プローブおよび化学発光を用いて実施した。AP共役プローブとハイブリダイズ
させたフィルターでX線フィルムを感光させることによって、所望のクローンを
含むコロニーが表示された。第二のハイブリダイゼーションは最初の結果を確認
するために実施した。
工程の詳細な説明はプロメガブリテン#TM227を参照のこと)。簡単に記せ
ば、使用した検出方法は以下の工程から成る:(a)フィルターをクォンタムイ
ールド(Quantum Yield(登録商標))封鎖溶液(プロメガカタログ番号F1021
)で45分56℃で激しく攪拌しながら保温し、(b)封鎖溶液を捨て、APプ
ローブを含む膜の単位cm2当たり0.05mlのクォンタムイールド(登録商 標)高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション溶液(プロメガカタログ番号
F1231)を加え、激しく震盪しながら56℃で45分保温し、(c)ハイブ
リダイゼーション溶液/プローブをフィルターから除き、フィルターを2回15
0−200mlの予め加温した洗浄溶液#1(2XSSC、0.1%SDS)で
56℃で10分洗浄し、(e)全てのフィルターを一緒にし、洗浄溶液#2(1
XSSC)で1回室温で10分洗浄し、(f)ブロットを200mlの100m
Mジエタノールアミン、1mMのMgCl2中で5分間平衡化させ、(f)十分 な0.25mMのCDP−スター基質(Tropix, Bedford, MA)を加えてフィルタ
ーを飽和させ、続いて少なくとも5分室温で保温し、(g)この基質飽和フィル
ターをハイブリダイゼーションホルダー内のポリスチレンプラスチックシートプ
ロテクター上に置き、ホルダーを閉じ、(h)フィルムカセットにフィルターを
含むハイブリダイゼーションホルダーを置き、その中のフィルターでX線フィル
ムを感光させ、(i)少なくとも1時間、フィルムを感光させた後フィルムを現
像する。
くとも1つの(AAAAX)n配列をもつ挿入物を多分に含むであろうと実施例
4で同定された多数のクローンの配列を決定した。この方法は以下の工程から成
る:陽性クローンをコロニーハイブリダイゼーションアッセイから200μlの
LB/Amp(100μg/ml)を含む滅菌96穴(ウェル)マイクロプレー
ト(Falcon Cat.#3072)に移し、一晩37℃で250rpmで保温する。次にこ
の一晩培養を分割し、以下の3つの異なる工程で用いた:細胞溶解物の作製、最
初の観察を確認するための第二のハイブリダイゼーション用レプリカフィルター
作製、またはクローンの長期保存用グリセロールストックの作製。
lmaer cat.#N801-0560)に入れた100μlのナノピュア純度の滅菌水に加え、
9600サーモサイクラーで4分100℃で加熱して作製した。これを冷却し氷
結させ、使用まで−20℃で保存した。 96ピンのレプリケーターを火炎滅菌し、このレプリケーターを一晩培養を含
む96穴プレートに浸漬し、LB/Amp(100μg/ml)プレート上の1
37mmの丸いナイロン膜(MagnaGraph, MSI)に押しつけ、この膜を一晩37℃
で保温して、第二のハイブリダイゼーションアッセイ用複製フィルターを作製し
た。 残りの一晩培養は、46μlの80%グリセロールを各ウェルに加えてグリセ
ロールストックにし、250rpmに設定した振盪培養機に数分間プレートを置
いて混合し、続いて−70℃で保存した。
ンを選別し、細胞溶解物プレートから得た対応するクローンをPCR増幅に用い
た。PCR反応生成物をキアゲンキアクイック(Qiagen QIAquick)96PCR精
製プレート(カタログ番号#28180)で精製し、配列決定のために鋳型を用
いた。2μlの細胞溶解物を50μlのPCR反応物で用いた。当該反応物は、
2μMのM13−47前進方向プライマー(プロメガカタログ番号#Q560A
)、2μMのM13逆方向プライマー(プロメガカタログ番号#Q542A)、
1XSTR緩衝液、および2.5単位のAmpliTaq(Perkin Elmer)を含
んでいた。以下の循環プロフィールをPE480サーモサイクラーで使用した:
96℃/2分で1サイクル、94℃/1分、56℃/1分、70℃/1.5分で
10サイクル;90℃/1分、56℃/1分、70℃/1.5分で20サイクル
;4℃で保持。PCR反応生成物は、キアゲンキアクイック96PCR精製プレ
ート(カタログ番号#28180)を用い製造元のプロトコルにしたがいクリー
ンアップし、70μlのトリス−HCl10mM(pH8.5)に最終濃度約3
5ng/μlで回収し、−20℃で保存した。
(ABI Dye Terminator Sequencing Chemistry)およびABI377シークェンサ
ーを用いて実施した。配列決定用鋳型はABIダイターミネーターキットおよび
製造元のプロトコル(プロトコルP/N402078)を用いて調製した。2μ
lまたは約30から90ngの精製PCR生成物(上記)を配列決定反応の鋳型
DNAとして用いた。配列決定反応物は、8μlのダイターミネーターミックス
、2μlの鋳型DNA(35ng/μl)、4μlのM13−21前進方向プラ
イマー(0.8μM)および6μlのナノピュア純度の滅菌水から成っていた。
ジーンアンプ(GeneAmp)PCRシステム9600でのサイクルシークェンシング
の循環プロフィールは以下のとおりであった:96℃/10秒、50℃/5秒、
60℃/4分で25サイクル;4℃で保持。伸長生成物は50μlの95%エタ
ノールおよび2μlの酢酸ナトリウム(3M)(pH4.6)を各試験管に添加
し、ボルテックスミキサーを用いて混合し、氷上に10分静置し、続いて最大速
度で30分遠心して精製した。ペレットを150μlの70%エタノールで洗浄
し、真空遠心で約3分乾燥させ、乾燥状態で使用まで−20℃で保存した。乾燥
ペレットは6−9μlのローディング緩衝液に再懸濁し、続いて2分95℃で変
性させ、ゲルに添加するまで氷上で保存した。
E)を製造元のプロトコルにしたがって調製し、2時間重合させた。ゲルを45分
1000ボルトで予備泳動した。ローディング緩衝液中の1.5μlの鋳型をゲ
ルに添加し、2Xまたは4Xの条件下でそれぞれ3.5時間または7時間泳動し
た。
pGEMベクター配列を除去し、続いてジネティクスコンピュータグループ=ウ
ィスコンシンパッケージソフト(バージョン9.0)(Madison, WI)を用いて作
製した、評価された全てのクローンの配列情報を含むローカルデータベースに入
れた。次に、5量体繰り返しの存在、長さおよび配列パターンについてクローン
を調べた。続いて5または6以上の繰り返しを含むものをBLAST配列比較プ
ログラム(Altschul et al., 1990)で比較し、複製されたクローンおよびGen
Bankデータベース(National Center for Biotechnology Information in B
esthesda, Maryland, USA)に既に存在するものを特定した。いったん固有のクロ
ーンが特定されたら、OLIGOプライマーアナリシスソフト(バージョン5.
0)(National Biosciences, Inc., Plymouth, MN)を用いてPCRのためのプ
ライマーをデザインした。
を決定する 多形性についての最初のスクリーニングは、2つのプールしたDNAサンプル
で実施した。このサンプルは一方は任意の15人のヒトゲノムDNAを含み、他
方はNIGMSヒューマンジネティックミュータントセルレポジトリから得られ
た54人のCEPH(CEPH Collection DNA Pool, Cat.#NA13421, Coriell Cell
Repositories, Camden, NJ)を含む。蛍光で標識したPCRプライマーをゲノム
DNAの標的遺伝子座のPCR増幅のために用い、PCR生成物をポリアクリル
アミドゲルで分離し、蛍光スキャナーで可視化した。4つの対立形質および50
%のヘテロ接合性をもつ遺伝子座を16人のCEPHのDNA(102−1、1
02−2、884−1、884−2、1331−1、1331−2、1332−
1、1332−2、1347−1、1347−2、1362−1、1362−2
、1413−1、1413−2、1416−1、1416−2)とともに調べ、
予備的なヘテロ接合性値を求めた。続いて同じ遺伝子座のデータさらに分析し、
対立形質の数、対立形質の頻度およびヘテロ接合性値を求めた(表2参照)。
50%以上のヘテロ接合性の選別基準を満たす)をマッピングし、正確な染色体
上の位置を決定した(表2参照)。マッピングには3つの異なる方法を用いた:
(1)染色体上の起源を特定するために、ただ1つのヒト染色体を表す26の体
細胞ハイブリッド(Coriell Cell Repositories, Camden, NJ)のNIGMSパネ
ルを用いる体細胞ハイブリッドマッピング;(2)93RHクローン(Schuler
et al., 1996)のGeneBridge4RHパネルを用いる放射ハイブリッド
マッピング;および標準的減数分裂連鎖マッピングおよびCEPH血族リファレ
ンスパネル由来の8家族(K102、K884、K1347、1362、133
1、1332、1413、1416)のCRI−MAPマルチポイント連鎖プロ
グラム(Lander & Green, 1987)によるマッピング。
人種(アフリカ系アメリカ人、白人、アジア人およびスペイン語系アメリカ人を
含む)に由来する100人を越える個体を含むより大きな集団で遺伝型および対
立形質頻度について調べた。図10および11は、ある集団内の24の異なる個
体に由来するゲノムDNAサンプルの2つの異なる多形性ITR遺伝子座から増
幅させた対立形質の泳動は大きく変動することを示している(DNAサンプルS
02からS25)。この分析で用いたプライマー対の配列については上記の表1
を参照されたい。ゲル像は、蛍光標識プライマーを用いて各5ヌクレオチド繰り
返し遺伝子座を増幅し、続いてポリアクリルアミドゲルで分離し、FMBIOI
I蛍光スキャナー(Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Franci
sco, CA)で走査して可視化することによって作製した。各アッセイ遺伝子座につ
いて周知の対立形質を含む対立形質ラダーは、電気泳動ゲルの各々の端のレーン
(レーンS01およびレーンS26)に含まれている。各遺伝子座を増幅するた
めに用いたプライマー対は、上記の実施例で示したように、クローンS159ま
たはクローンG210から単離されたDNAマーカーの配列の少なくとも一部分
と相補的な配列を有する。このプライマー対の配列は、上記の表1でクローンS
159およびG210について列挙したプライマー対から選ばれた。
NA鋳型については約200ng、個々のCEPHのDNAについては25ng
、1XSTR緩衝液、1単位TaqDNAポリメラーゼおよび1μMの対応する
プライマー対を含む25μlの反応物。表2に挙げたクローンの各々を増幅する
ために用いた各プライマー対の配列は表1に提供されている。各プライマーは表
1に挙げた配列番号を割り当てられていることに留意されたい。パーキンエルマ
ージーンアンプPCRシステム9600サーマルサイクラー(Perkin Elmer, Fo
ster City, CA)のための循環条件は以下のとおりであった:96℃1分;続いて
94℃30秒、60℃への下降68秒、30秒維持、70℃への上昇50秒、4
5秒維持の10サイクル;続いて90℃30秒、60℃への下降60秒、30秒
維持、70℃への上昇50秒、45秒維持、60℃30分の20サイクル。PC
Rサンプルは、2.5μlの各サンプルと2.5μlの2Xブロモフェノールブ
ルーローディング溶液とを混合し、95℃で2分加熱して変性させ、氷冷して調
製し、続いて各サンプルの3μlを4%ポリアクリルアミドゲルで40Wで50
分泳動した。PCR生成物は、FMBIO蛍光スキャナー(Hitachi)で走査して
可視化し、添付のソフト(FMBIOアナリシスバージョン6.0)(Hitachi
Software Engineering, San Francisco, CA)で分析した。
無について米国立遺伝子工学情報センター(National Center for Biotechnolog
y Information(NCBI))のGenBankを検索することによって実施した。いく
つかの方法を用いたが、これらには以下が含まれる:CD−ROMによるGen
Bank登録をDNASTAR(Madison, WI)のレーザージーンソフトパッケー
ジを用いてバッチ検索する;ジネティクスコンピューターグループ=ウィスコン
シンパッケージソフト(バージョン9.0)(Madison, WI)を用いてGenBa
nkをバッチ検索する。 存在する可能性がある5量体の繰り返しを作製する場合、4文字のアルファベ
ット(A、C、GおよびT)から組み立てることができる5文字の言葉には45 =1024文字があり、6および7塩基の繰り返しでは6文字および7文字の言
葉で46=4096および47=16384の言葉が存在する。しかしながら、固
有の繰り返しモチーフの数は、2つの相補的な鎖の同等物のために(例えばAA
AATはATTTTと同等である)、さらに環状置換の同等物のために(例えば
AATAA...はATAAA...と同等である)顕著に減少する。5塩基繰
り返しの場合には、このことは、単ヌクレオチド繰り返し(A5/T5およびC5 /G5)を除外したとき5量体繰り返しでは102個の固有種が存在することを 意味する。
み合わせを全て用いてGenBankのヒトゲノムデータベースを検索した。3
つまたは4つ以上の繰り返しコピー(または時に塩基置換をもつコピー)を含む
全ての繰り返し領域を特定した。現今の配列データを用いて、繰り返し領域に隣
接するプライマーをデザインし、標的遺伝子座をPCR増幅し、実施例6で述べ
たように多形性の内容を評価した。
ライマーを用いて特定した配列を含有する各クローンを、実施例7で述べたよう
に繰り返し配列の内容についてスクリーニングした。ITR配列(すなわちIT
Rマーカー)を含むことが判明した各クローンの配列を配列番号:28から43
の1つに割り当てた。そのような各マーカーのITR領域に隣接する配列を含む
プライマーの配列については表1を参照されたい。そのようなITRマーカーの
各々の配列の特徴を分析した結果の要約については表2を参照されたい。
わちスリップ増幅百分率) 本明細書に記載したマーカーの多くは新規な種類のマーカーであり、これらで
は“スリップ増幅(Stutter)”として知られているPCR人工生成物の発生が少
ない(発明の詳細な説明の定義の項を参照されたい)。このような人工生成物の
発生はPCR増幅時に、おそらくは反復スリップと称されるDNAポリメラーゼ
関連現象の結果として生じる(Levinson & Gutman(1987), Mol. Biol. Evol. 4(
3):203-221; Schlotterer & Tautz(1992), NAR 20:211-215)。反復スリップの最
終的な結果は、本物の対立形質とは異なる数の繰り返し単位を含むPCR生成物
の発生である。PCR時に相当量の増幅スリップが発生すると、増幅生成物はメ
ジャーバンドおよびマイナーバンドとして可視化されるであろう。ここで、メジ
ャーバンドは本物の対立形質に対応し、マイナーバンドは、いくらかの繰り返し
配列を含む変型生成物に対応する。
遺伝子座(C221、G023、G025、G210、S159および本特許に
は記載されていない別のITR、S117)および17の5ヌクレオチド縦列繰
り返し遺伝子座(F13A01、THO1、TPOX、F13B、FESFPS
、D7S820、CSF1PO、D13S317、D8S1179、D16S5
39、LPL、FGA、D5S818、D3S1358、D18S51、vWA
およびD21S11)をABI377シークェンサーで泳動し、ジェンスキャン
(GenScan)ソフト(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて解析し
た。相対蛍光単位(FRU)で測定したピークの高さを全てのメジャーピーク、
および各遺伝子座で精査した25から40人のサンプルで観察されたマイナーピ
ークについて求めた。マイナーピーク(一般に5ヌクレオチドでは本物の対立形
質よりも5bp小さく、4ヌクレオチド繰り返しでは4bp小さい)で観察され
たRFUのメジャーな本物の対立形質のピークに対する百分率を計算した(表3
参照)。
ド繰り返し遺伝子座vWA(図4)およびD5S818(図5)のABI377
電気泳動図の結果は、ITR遺伝子座ではスリップ増幅が極めて少ないかまたは
存在せず、4ヌクレオチド繰り返し遺伝子座については明瞭にスリップ増幅が観
察されることを示している。特に、vWA4ヌクレオチド繰り返し遺伝子座の電
気泳動図の矢印14および15(図3に複写)、さらにD5S818の4ヌクレ
オチド繰り返し遺伝子座の電気泳動図の矢印16および17(図5に複写)によ
って表示されているスリップ増幅人工生成物を参照されたい。これらの明瞭な人
工生成物のピークを、図2に示すクローンS159(すなわち配列番号:34に
よって特定される配列をもつマーカー)から単離されたDNAマーカー、および
図4のクローンG210から単離されたDNAマーカー(すなわち配列番号:1
9によって特定された配列を有するマーカー)の5ヌクレオチド繰り返しの電気
泳動図の極めてわずかな人工生成物とを比較されたい。図2−5に複写した個々
の電気泳動図は遺伝子座の各々について観察されたスリップ増幅の最も高い発生
を示している。 スリップ増幅量のある程度の変動性は全ての遺伝子座で観察された。一般に、
最も高い繰り返し数を含む対立形質(塩基対によりそのサイズが表示されている
)は最も大きなスリップ増幅量を示す傾向があった。検査した25から40人の
各々の百分率スリップ増幅値をスキャタープロットとして示した(図6、7、8
および9)。
は、4ヌクレオチド縦列繰り返し遺伝子座と比較して、調べたITR遺伝子座の
ほとんどで顕著に低かった。現在知られているこのタイプのマーカーで最良のも
のである4ヌクレオチド遺伝子座でもこれは真実である。例えば、米連邦捜査局
(FBI)は国家の総合DNAインデックスシステム(CODIS)のための全
てのDNAサンプル分析で使用するものとして、そのような13個の4ヌクレオ
チドマーカー(高いスリップ増幅百分率を有すると下記の表3に報告した、記載
のようにアッセイした4ヌクレオチドのいくつかを含む)を選択している(I. M
acivee (1998) Profiles in DNA 1(3):2)。
る方法の工程模式図である。
プロットである。
プロットである。
タープロットである。
ロットである。
識増幅フラグメントの蛍光画像スキャンの結果をレーザープリントした画像であ
る。
識増幅フラグメントの蛍光画像スキャンの結果をレーザープリントした画像であ
る。 図の縮尺は必ずしも正確ではなく、さらに、明瞭さと簡潔さの観点から本発明
のある種の特色は縮尺が誇張されるか、または模式的に示されている。
Claims (34)
- 【請求項1】 以下の工程を含むハイブリダイゼーション選別を用いる中型
縦列繰り返し配列を含むDNAのフラグメントを単離する方法: (a)少なくとも1つのDNAフラグメントが中型縦列繰り返し配列を含む複数
のDNAフラグメントを提供し、ここで前記中型縦列繰り返し配列は、少なくと
も2回縦並びに繰り返される、5、6または7塩基の配列から成る少なくとも1
つの繰り返し単位を含むDNAフラグメントの一領域であって; (b)前記中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的であるヌクレオチド配列を含
む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを結合させた固定支持体を提供し;さら
に (c)前記複数のDNAフラグメントと前記支持体手段とを、前記中型縦列繰り
返し配列を含有するDNAフラグメントを含むDNAフラグメントが前記支持体
手段とハイブリダイズする条件下で混合する。 - 【請求項2】 工程(a)で提供される前記複数のDNAフラグメントが以
下のさらなる工程によって製造される濃縮DNAフラグメント集団である請求項
1の方法: DNAサンプルをフラグメント化し、それによって、少なくとも1つのDNA
フラグメントが前記中型縦列繰り返し配列を含むDNAフラグメント集団を製造
し; プライミング配列を含むリンカーをDNAフラグメント集団の各DNAフラグ
メントの少なくとも一方の末端に連結し;さらに 前記プライミング配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて、各リンカー連結フラグメントを増幅する。 - 【請求項3】 前記DNAサンプルが二本鎖で、さらに少なくとも1つの制
限エンドヌクレアーゼでフラグメント化される請求項2の方法。 - 【請求項4】 前記二本鎖DNAサンプルが制限酵素MboIでフラグメン
ト化され、前記リンカーが、MboI消化DNAフラグメントの各末端に存在す
る突出部配列と相補的な一本鎖突出部ヌクレオチド配列をもつ二本鎖DNA分子
を含むMboIリンカーである請求項3の方法。 - 【請求項5】 前記リンカーが下記式(I)の二本鎖DNA分子である請求
項4の方法: 5’−pGCGGTACCCGGGAAGCTTGG CGCCATGGGCCCTTCGAACCCTAG−5’(I) 式中、A、G、CおよびTはヌクレオチドを表し、pはDNA鎖の燐酸化5’末
端を示す。 - 【請求項6】 工程(c)の支持体手段とハイブリダイズしたDNAフラグ
メントを遊離させるさらなる工程を含む請求項1の方法。 - 【請求項7】 さらに以下の工程を含む請求項6の方法: 支持体手段から遊離させた各DNAフラグメントをDNAベクターにクローニ
ングし; ホスト細胞を前記クローン化ベクターで形質転換し; 中型縦列繰り返し配列を含む標的クローン化ベクターを含む形質転換体を特定
し;さらに 前記標的クローン化ベクターを形質転換体から遊離させる。 - 【請求項8】 前記工程(b)で提供される支持体手段が前記オリゴヌクレ
オチドと直接カップリングすることができる物質を含み、前記物質がニトロセル
ロース、ナイロン、ガラス、シリカおよびラテックスから成る群から選ばれる請
求項1の方法。 - 【請求項9】 前記工程(b)で提供される支持体手段が前記オリゴヌクレ
オチドと間接的にカップリングすることができる物質を含み、ここで第一のカッ
プリング剤は前記オリゴヌクレオチドと結合し、第二のカップリング剤は固定支
持体の表面と結合し、第一のカップリング剤および第二のカップリング剤がアビ
ジンおよびストレプトアビジンであるか、または抗体および抗原である請求項1
の方法。 - 【請求項10】 前記工程(b)で提供される支持体手段が少なくとも2つ
の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を含む請求項1の方法。 - 【請求項11】 前記中型縦列繰り返し配列が5ヌクレオチドの縦列繰り返
し配列である請求項1の方法。 - 【請求項12】 以下の工程を含む、ハイブリダイゼーション選別による5
ヌクレオチド縦列繰り返し配列を含むDNAフラグメントを単離する方法: (a)少なくとも1つのDNAフラグメントが5ヌクレオチド縦列繰り返し配列
を含む複数の二本鎖DNAフラグメントを提供し、ここで前記5ヌクレオチド縦
列繰り返し配列は、少なくとも2回縦並びに繰り返される5塩基の配列から成る
少なくとも1つの繰り返し単位を含むDNAフラグメントの一領域であって; (b)前記中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的であるヌクレオチド配列を含
む少なくとも1つのオリゴヌクレオチドを結合させた固定支持体を提供し;さら
に (c)前記複数のDNAフラグメントと前記支持体手段とを、前記5ヌクレオチ
ド縦列繰り返し配列を含有するDNAフラグメントおよび少なくとも1つの他の
DNAフラグメントが前記支持体手段とハイブリダイズする条件下で混合する。 - 【請求項13】 前記工程(a)で提供される複数のDNAフラグメントが
以下の工程で製造される請求項12の方法: 二本鎖DNAサンプルを制限酵素でフラグメント化し、それによって、少なく
とも1つのDNAフラグメントが5ヌクレオチド縦列繰り返し配列を含む複数の
DNAフラグメントを製造し; 前記複数のDNAフラグメントの各DNAフラグメントの少なくとも一方の末
端にプライミング配列を含有するリンカーを連結し;さらに プライミング配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用い
てリンカーと連結された各フラグメントを増幅させる。 - 【請求項14】 さらに以下の工程を含む請求項12の方法: 支持体手段とハイブリダイズしたDNAフラグメントを遊離させ;さらに 支持体手段とハイブリダイズさせる前に各リンカー連結フラグメントを増幅さ
せるために用いるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、支持体手段から遊
離させたフラグメントを増幅させる。 - 【請求項15】 さらに以下の工程を含む請求項14の方法: 支持体手段から遊離させた、増幅させた各DNAフラグメントをDNAベクタ
ーにクローニングし; ホスト細胞をクローン化ベクターで形質転換させ; 中型縦列繰り返し配列を含有する標的クローン化ベクターを含む形質転換体を
特定し;さらに、 標的クローン化ベクターを形質転換体から単離する。 - 【請求項16】 前記工程(b)で提供された支持体手段が少なくとも2つ
の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を含む請求項12の方法。 - 【請求項17】 以下の工程を含むスリップ増幅人工生成物の発生が少ない
標的中型縦列繰り返しDNA配列を検出する方法: (a)少なくとも2回縦並びに繰り返される5、6または7塩基対の配列から成
る少なくとも1つの繰り返し単位を含むDNAの一領域である少なくとも1つの
標的中型縦列繰り返し配列を有するDNAサンプルを提供し;さらに (b)観察される平均スリップ増幅人工生成物が2.4%未満である、サンプル
DNA中の前記標的中型縦列繰り返し配列を検出する。 - 【請求項18】 前記標的中型縦列繰り返し配列が完全な中型縦列繰り返し
配列である請求項17の方法。 - 【請求項19】 前記標的中型縦列繰り返し配列が不完全な中型縦列繰り返
し配列である請求項17の方法。 - 【請求項20】 前記工程(a)で提供されるDNAサンプルがヒトゲノム
DNAである請求項17の方法。 - 【請求項21】 前記工程(a)で提供されるDNAサンプルの標的中型縦
列繰り返し配列が工程(b)の前に増幅される請求項17の方法。 - 【請求項22】 鋳型中型縦列繰り返し配列を含む二本鎖DNAマーカーの
一領域に隣接し前記DNAマーカーと相補的な配列を含む少なくとも1つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて前記標的中型縦列繰り返し配列を増幅させる
請求項21の方法であって、前記鋳型中型縦列繰り返し配列が、少なくとも2回
縦並びに繰り返される繰り返し単位配列を含むDNAマーカーの一領域であり、
前記DNAマーカーが、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号
:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:
9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列
番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:1
8、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22、配列
番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26、配列番号:2
7、配列番号:28、配列番号:29、配列番号:30、配列番号:31、配列
番号:32、配列番号:33、配列番号:34、配列番号:35、配列番号:3
6、配列番号:37、配列番号:38、配列番号:39、配列番号:40、配列
番号:41、配列番号:42、配列番号:43から成る群から選ばれる配列を有
することを条件とする請求項21の方法。 - 【請求項23】 前記標的中型縦列繰り返し配列の増幅に用いられるオリゴ
ヌクレオチドプライマーが、それに共有結合によって付加された蛍光標識を有す
る請求項22の方法。 - 【請求項24】 前記スリップ増殖人工生成物が、検出される標的中型縦列
繰り返し配列をDNAサイズマーカーで既知の長さをもつフラグメントと比較す
ることによって工程(b)で観察される請求項17の方法。 - 【請求項25】 観察される平均スリップ増幅が1.1%未満である請求項
24の方法。 - 【請求項26】 以下の工程を含む、少なくとも2回縦並びに繰り返される
5、6または7塩基対の配列から成る少なくとも1つの繰り返し単位を含むDN
Aサンプルの一領域である標的中型縦列繰り返し配列の少なくとも1つをDNA
サンプルで検出する方法: (a)鋳型中型縦列繰り返し配列を含む二本鎖DNAマーカーの一領域に隣接し
前記DNAマーカーと相補的な核酸配列を含む少なくとも1つのオリゴヌクレオ
チドプライマーを提供し、ここで前記DNAマーカーは配列番号:1、配列番号
:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:
7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号
:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:16、
配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、配列番号
:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号:25、
配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、配列番号
:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号:34、
配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、配列番号
:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号:43か
ら成る群から選ばれる配列を有し; (b)前記標的中型縦列繰り返し配列を含むDNAサンプルを提供し; (c)少なくとも1つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記DNAサ
ンプルの標的中型繰り返し配列を増幅し;さらに、 (d)前記増幅標的中型縦列繰り返し配列における多形性を検出する。 - 【請求項27】 前記工程(b)で提供されるDNAサンプルがヒトゲノム
DNAサンプルである請求項26の方法。 - 【請求項28】 前記標的中型縦列繰り返し配列が完全な中型縦列繰り返し
である請求項26の方法。 - 【請求項29】 前記標的中型縦列繰り返し配列が不完全な中型縦列繰り返
しである請求項26の方法。 - 【請求項30】 前記工程(a)で提供されるオリゴヌクレオチドプライマ
ーが以下から成る配列群の1つから選択される配列を含む請求項26の方法: 前記DNAマーカー配列が配列番号:1である場合は、配列番号:44および
配列番号:45; 前記DNAマーカー配列が配列番号:2である場合は、配列番号:46、配列
番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:5
1、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列
番号:56、配列番号:57、配列番号:58; 前記DNAマーカー配列が配列番号:3である場合は、配列番号:59および
配列番号:60; 前記DNAマーカー配列が配列番号:4である場合は、配列番号:61および
配列番号:62; 前記DNAマーカー配列が配列番号:5である場合は、配列番号:63および
配列番号:64; 前記DNAマーカー配列が配列番号:6である場合は、配列番号:65および
配列番号:66; 前記DNAマーカー配列が配列番号:7である場合は、配列番号:67および
配列番号:68; 前記DNAマーカー配列が配列番号:8である場合は、配列番号:69および
配列番号:70; 前記DNAマーカー配列が配列番号:9である場合は、配列番号:71および
配列番号:72; 前記DNAマーカー配列が配列番号:10である場合は、配列番号:73およ
び配列番号:74; 前記DNAマーカー配列が配列番号:11である場合は、配列番号:75およ
び配列番号:76; 前記DNAマーカー配列が配列番号:12である場合は、配列番号:77およ
び配列番号:78; 前記DNAマーカー配列が配列番号:13である場合は、配列番号:79およ
び配列番号:80; 前記DNAマーカー配列が配列番号:14である場合は、配列番号:81およ
び配列番号:82; 前記DNAマーカー配列が配列番号:15である場合は、配列番号:83およ
び配列番号:84; 前記DNAマーカー配列が配列番号:16である場合は、配列番号:85およ
び配列番号:86; 前記DNAマーカー配列が配列番号:17である場合は、配列番号:87およ
び配列番号:88; 前記DNAマーカー配列が配列番号:18である場合は、配列番号:89およ
び配列番号:90; 前記DNAマーカー配列が配列番号:19である場合は、配列番号:91、配
列番号:92、配列番号:93および配列番号:94; 前記DNAマーカー配列が配列番号:20である場合は、配列番号:95およ
び配列番号:96; 前記DNAマーカー配列が配列番号:21である場合は、配列番号:97およ
び配列番号:98; 前記DNAマーカー配列が配列番号:22である場合は、配列番号:99およ
び配列番号:100; 前記DNAマーカー配列が配列番号:23である場合は、配列番号:101お
よび配列番号:102; 前記DNAマーカー配列が配列番号:24である場合は、配列番号:103お
よび配列番号:104; 前記DNAマーカー配列が配列番号:25である場合は、配列番号:105お
よび配列番号:106; 前記DNAマーカー配列が配列番号:26である場合は、配列番号:107、
配列番号:108、配列番号:109、配列番号:110および配列番号:11
1; 前記DNAマーカー配列が配列番号:27である場合は、配列番号:112、
配列番号:113、配列番号:114および配列番号:115; 前記DNAマーカー配列が配列番号:28である場合は、配列番号:116お
よび配列番号:117; 前記DNAマーカー配列が配列番号:29である場合は、配列番号:118お
よび配列番号:119; 前記DNAマーカー配列が配列番号:30である場合は、配列番号:120お
よび配列番号:121; 前記DNAマーカー配列が配列番号:31である場合は、配列番号:122お
よび配列番号:123; 前記DNAマーカー配列が配列番号:32である場合は、配列番号:124お
よび配列番号:125; 前記DNAマーカー配列が配列番号:33である場合は、配列番号:126お
よび配列番号:127; 前記DNAマーカー配列が配列番号:34である場合は、配列番号:128お
よび配列番号:129; 前記DNAマーカー配列が配列番号:35である場合は、配列番号:130お
よび配列番号:131; 前記DNAマーカー配列が配列番号:36である場合は、配列番号:132お
よび配列番号:133; 前記DNAマーカー配列が配列番号:37である場合は、配列番号:134お
よび配列番号:135; 前記DNAマーカー配列が配列番号:38である場合は、配列番号:136お
よび配列番号:137; 前記DNAマーカー配列が配列番号:39である場合は、配列番号:138お
よび配列番号:139; 前記DNAマーカー配列が配列番号:40である場合は、配列番号:140お
よび配列番号:141; 前記DNAマーカー配列が配列番号:41である場合は、配列番号:142お
よび配列番号:143; 前記DNAマーカー配列が配列番号:42である場合は、配列番号:144お
よび配列番号:145; 前記DNAマーカー配列が配列番号:43である場合は、配列番号:146お
よび配列番号:147。 - 【請求項31】 標的中型縦列繰り返し配列が、少なくとも2回縦並びに繰
り返される5、6または7塩基対の配列から成る少なくとも1つの繰り返し単位
を含むDNAサンプルの一領域である、DNAサンプル中の標的中型縦列繰り返
し配列の少なくとも1つをDNAサンプルで検出するキットであって: 少なくとも1つの標的中型縦列繰り返し配列を増幅させる少なくとも1つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを有する容器であって、前記オリゴヌクレオチドプ
ライマーが、少なくとも2回縦並びに繰り返される繰り返し単位を含む鋳型中型
縦列繰り返し配列を含む二本鎖DNAマーカーの一領域に隣接し前記DNAマー
カーと相補的な核酸配列を含み、さらに前記DNAマーカーが、配列番号:1、
配列番号:2、配列番号:3、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配
列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、
配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号
:16、配列番号:17、配列番号:18、配列番号:19、配列番号:20、
配列番号:21、配列番号:22、配列番号:23、配列番号:24、配列番号
:25、配列番号:26、配列番号:27、配列番号:28、配列番号:29、
配列番号:30、配列番号:31、配列番号:32、配列番号:33、配列番号
:34、配列番号:35、配列番号:36、配列番号:37、配列番号:38、
配列番号:39、配列番号:40、配列番号:41、配列番号:42、配列番号
:43から成る群から選ばれる配列を有する前記検出用キット。 - 【請求項32】 さらにDNAマーカーを含む請求項31のキット。
- 【請求項33】 少なくとも2回縦並びに繰り返される5、6または7塩基
対の配列から成る少なくとも1つの繰り返し単位を含む二本鎖DNAマーカーの
一領域である鋳型中型縦列繰り返し配列と隣接する二本鎖DNAマーカーの一方
の鎖と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記二本鎖
DNAマーカー配列が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:3、配列番号
:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:
9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、配列番号:13、配列
番号:14、配列番号:15、配列番号:16、配列番号:17、配列番号:1
8、配列番号:19、配列番号:20、配列番号:21、配列番号:22、配列
番号:23、配列番号:24、配列番号:25、配列番号:26および配列番号
:27から成る群から選ばれる前記オリゴヌクレオチドプライマー。 - 【請求項34】 前記オリゴヌクレオチドプライマーが以下から成る群から
選ばれる配列を含む請求項33のオリゴヌクレオチドプライマー: 前記DNAマーカー配列が配列番号:1である場合は、配列番号:44および
配列番号:45; 前記DNAマーカー配列が配列番号:2である場合は、配列番号:46、配列
番号:47、配列番号:48、配列番号:49、配列番号:50、配列番号:5
1、配列番号:52、配列番号:53、配列番号:54、配列番号:55、配列
番号:56、配列番号:57および配列番号:58; 前記DNAマーカー配列が配列番号:3である場合は、配列番号:59および
配列番号:60; 前記DNAマーカー配列が配列番号:4である場合は、配列番号:61および
配列番号:62; 前記DNAマーカー配列が配列番号:5である場合は、配列番号:63および
配列番号:64; 前記DNAマーカー配列が配列番号:6である場合は、配列番号:65および
配列番号:66; 前記DNAマーカー配列が配列番号:7である場合は、配列番号:67および
配列番号:68; 前記DNAマーカー配列が配列番号:8である場合は、配列番号:69および
配列番号:70; 前記DNAマーカー配列が配列番号:9である場合は、配列番号:71および
配列番号:72; 前記DNAマーカー配列が配列番号:10である場合は、配列番号:73およ
び配列番号:74; 前記DNAマーカー配列が配列番号:11である場合は、配列番号:75およ
び配列番号:76; 前記DNAマーカー配列が配列番号:12である場合は、配列番号:77およ
び配列番号:78; 前記DNAマーカー配列が配列番号:13である場合は、配列番号:79およ
び配列番号:80; 前記DNAマーカー配列が配列番号:14である場合は、配列番号:81およ
び配列番号:82; 前記DNAマーカー配列が配列番号:15である場合は、配列番号:83およ
び配列番号:84; 前記DNAマーカー配列が配列番号:16である場合は、配列番号:85およ
び配列番号:86; 前記DNAマーカー配列が配列番号:17である場合は、配列番号:87およ
び配列番号:88; 前記DNAマーカー配列が配列番号:18である場合は、配列番号:89およ
び配列番号:90; 前記DNAマーカー配列が配列番号:19である場合は、配列番号:91、配
列番号:92、配列番号:93および配列番号:94; 前記DNAマーカー配列が配列番号:20である場合は、配列番号:95およ
び配列番号:96; 前記DNAマーカー配列が配列番号:21である場合は、配列番号:97およ
び配列番号:98; 前記DNAマーカー配列が配列番号:22である場合は、配列番号:99およ
び配列番号:100; 前記DNAマーカー配列が配列番号:23である場合は、配列番号:101お
よび配列番号:102; 前記DNAマーカー配列が配列番号:24である場合は、配列番号:103お
よび配列番号:104; 前記DNAマーカー配列が配列番号:25である場合は、配列番号:105お
よび配列番号:106; 前記DNAマーカー配列が配列番号:26である場合は、配列番号:107、
配列番号:108、配列番号:109、配列番号:110および配列番号:11
1;および 前記DNAマーカー配列が配列番号:27である場合は、配列番号:112、
配列番号:113、配列番号:114および配列番号:115。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US09/018,584 | 1998-02-04 | ||
US09/018,584 US6238863B1 (en) | 1998-02-04 | 1998-02-04 | Materials and methods for indentifying and analyzing intermediate tandem repeat DNA markers |
PCT/US1999/002345 WO1999040194A1 (en) | 1998-02-04 | 1999-02-04 | Materials and methods for identifying and analyzing intermediate tandem repeat dna markers |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009185861A Division JP5898829B2 (ja) | 1998-02-04 | 2009-08-10 | 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002502606A true JP2002502606A (ja) | 2002-01-29 |
JP4494630B2 JP4494630B2 (ja) | 2010-06-30 |
Family
ID=21788699
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000530608A Expired - Lifetime JP4494630B2 (ja) | 1998-02-04 | 1999-02-04 | 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 |
JP2009185861A Expired - Lifetime JP5898829B2 (ja) | 1998-02-04 | 2009-08-10 | 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 |
JP2013092789A Pending JP2013143965A (ja) | 1998-02-04 | 2013-04-25 | 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009185861A Expired - Lifetime JP5898829B2 (ja) | 1998-02-04 | 2009-08-10 | 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 |
JP2013092789A Pending JP2013143965A (ja) | 1998-02-04 | 2013-04-25 | 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6238863B1 (ja) |
EP (3) | EP2287307B1 (ja) |
JP (3) | JP4494630B2 (ja) |
KR (1) | KR100691195B1 (ja) |
CN (2) | CN101857895A (ja) |
AT (1) | ATE486129T1 (ja) |
AU (1) | AU758639B2 (ja) |
CA (1) | CA2319111A1 (ja) |
DE (1) | DE69942891D1 (ja) |
ES (2) | ES2475416T3 (ja) |
WO (1) | WO1999040194A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005527206A (ja) * | 2002-04-08 | 2005-09-15 | ピッグ インプルーブメント カンパニー ユーケイ リミテッド | 動物生産物を追跡するためのシステム |
JP2017099361A (ja) * | 2015-12-04 | 2017-06-08 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6251691B1 (en) | 1996-04-25 | 2001-06-26 | Bioarray Solutions, Llc | Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces |
JP2004524801A (ja) * | 2000-04-12 | 2004-08-19 | ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション | Are含有遺伝子の発現を同定および分析するための方法 |
US6531282B1 (en) * | 2000-05-30 | 2003-03-11 | Oligotrail, Llc | Multiplex amplification and analysis of selected STR loci |
US9709559B2 (en) | 2000-06-21 | 2017-07-18 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays |
WO2001098765A1 (en) | 2000-06-21 | 2001-12-27 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multianalyte molecular analysis |
DE10119468A1 (de) * | 2001-04-12 | 2002-10-24 | Epigenomics Ag | Mikroarray-Verfahren zur Anreicherung von DNA-Fragmenten aus komplexen Mischungen |
US20020172948A1 (en) * | 2001-05-04 | 2002-11-21 | Perlin Mark W. | Method and system for nucleic acid sequencing |
US7262063B2 (en) | 2001-06-21 | 2007-08-28 | Bio Array Solutions, Ltd. | Directed assembly of functional heterostructures |
WO2003034029A2 (en) | 2001-10-15 | 2003-04-24 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection |
US20070264641A1 (en) * | 2001-10-15 | 2007-11-15 | Li Alice X | Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection |
US7157228B2 (en) * | 2002-09-09 | 2007-01-02 | Bioarray Solutions Ltd. | Genetic analysis and authentication |
US7526114B2 (en) | 2002-11-15 | 2009-04-28 | Bioarray Solutions Ltd. | Analysis, secure access to, and transmission of array images |
AU2003902299A0 (en) * | 2003-05-13 | 2003-05-29 | Flinders Medical Centre | A method of analysing a marker nucleic acid molecule |
US7927796B2 (en) | 2003-09-18 | 2011-04-19 | Bioarray Solutions, Ltd. | Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers |
ES2375962T3 (es) | 2003-09-22 | 2012-03-07 | Bioarray Solutions Ltd | Polielectrolito inmovilizado en superficie con múltiples grupos funcionales capaces de unirse covalentemente a biomoléculas. |
AU2004286252A1 (en) | 2003-10-28 | 2005-05-12 | Bioarray Solutions Ltd. | Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes |
WO2005045060A2 (en) | 2003-10-29 | 2005-05-19 | Bioarray Solutions, Ltd. | Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna |
US7848889B2 (en) | 2004-08-02 | 2010-12-07 | Bioarray Solutions, Ltd. | Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification |
US7867703B2 (en) * | 2004-08-26 | 2011-01-11 | Agilent Technologies, Inc. | Element defined sequence complexity reduction |
US8486629B2 (en) | 2005-06-01 | 2013-07-16 | Bioarray Solutions, Ltd. | Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation |
US7772390B1 (en) | 2006-07-18 | 2010-08-10 | The Regents Of The University Of California | Lipid mediated nucleic acid synthesis |
US8163480B2 (en) * | 2006-10-05 | 2012-04-24 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Nucleic acid size detection method |
US20090004662A1 (en) | 2007-06-18 | 2009-01-01 | Applera Corporation | Method and compositions for nucleic acid amplification |
EP2173909A1 (en) | 2007-07-26 | 2010-04-14 | Roche Diagnostics GmbH | Target preparation for parallel sequencing of complex genomes |
EP2294225B8 (en) * | 2008-06-30 | 2015-02-18 | Life Technologies Corporation | Method for direct amplification from crude nucleic acid samples |
US20120183953A1 (en) * | 2011-01-14 | 2012-07-19 | Opgen, Inc. | Genome assembly |
WO2016044233A1 (en) * | 2014-09-18 | 2016-03-24 | Illumina, Inc. | Methods and systems for analyzing nucleic acid sequencing data |
CN104408331A (zh) * | 2014-11-10 | 2015-03-11 | 南京工程学院 | 鉴别dna基因序列中编码区域与非编码区域的系统 |
EP4055162A1 (en) * | 2019-11-05 | 2022-09-14 | Florida State University Research Foundation, Inc. | Evaluating genomic variation using repetitive nucleic acid sequences |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5364759A (en) * | 1991-01-31 | 1994-11-15 | Baylor College Of Medicine | DNA typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats |
WO1995017522A2 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-29 | University Of Leicester | Identification of simple tandem repeats |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IS1355B6 (is) | 1984-11-12 | 1989-04-19 | Lister Institute Of Preventive Medicine | Fjölkjarna kannar |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
GB8606719D0 (en) | 1986-03-19 | 1986-04-23 | Lister Preventive Med | Genetic probes |
US4963663A (en) | 1988-12-23 | 1990-10-16 | University Of Utah | Genetic identification employing DNA probes of variable number tandem repeat loci |
DE68929070T2 (de) | 1988-02-18 | 2000-05-25 | The University Of Utah, Salt Lake City | Verwendung von dna-proben mit variabler anzahl von tandem-repetitiven stellen zur genetischen identifizierung |
DE3834636A1 (de) | 1988-10-11 | 1990-04-19 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur analyse von laengenpolymorphismen in dna-bereichen |
US5582979A (en) | 1989-04-21 | 1996-12-10 | Marshfield Clinic | Length polymorphisms in (dC-dA)n.(dG-dT)n sequences and method of using the same |
US5075217A (en) | 1989-04-21 | 1991-12-24 | Marshfield Clinic | Length polymorphisms in (dC-dA)n ·(dG-dT)n sequences |
JPH08503600A (ja) | 1992-05-29 | 1996-04-23 | アボツト・ラボラトリーズ | Rna配列で開始させるリガーゼ連鎖反応 |
US5599666A (en) | 1994-03-28 | 1997-02-04 | Promega Corporation | Allelic ladders for short tandem repeat loci |
US6479235B1 (en) * | 1994-09-30 | 2002-11-12 | Promega Corporation | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
US5843660A (en) * | 1994-09-30 | 1998-12-01 | Promega Corporation | Multiplex amplification of short tandem repeat loci |
-
1998
- 1998-02-04 US US09/018,584 patent/US6238863B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-02-04 AT AT99906720T patent/ATE486129T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-02-04 CN CN200910164448A patent/CN101857895A/zh active Pending
- 1999-02-04 CA CA002319111A patent/CA2319111A1/en not_active Abandoned
- 1999-02-04 ES ES10011439.6T patent/ES2475416T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 KR KR20007008495A patent/KR100691195B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-02-04 AU AU26565/99A patent/AU758639B2/en not_active Ceased
- 1999-02-04 EP EP10011439.6A patent/EP2287307B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 DE DE69942891T patent/DE69942891D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 EP EP99906720A patent/EP1058727B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 JP JP2000530608A patent/JP4494630B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 EP EP10011440.4A patent/EP2287308B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 CN CNB998026964A patent/CN100545265C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-02-04 WO PCT/US1999/002345 patent/WO1999040194A1/en active IP Right Grant
- 1999-02-04 ES ES10011440.4T patent/ES2476266T3/es not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-02-15 US US09/784,423 patent/US6767703B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-08-10 JP JP2009185861A patent/JP5898829B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-04-25 JP JP2013092789A patent/JP2013143965A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5364759A (en) * | 1991-01-31 | 1994-11-15 | Baylor College Of Medicine | DNA typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats |
US5364759B1 (en) * | 1991-01-31 | 1997-11-18 | Baylor College Medicine | Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and indentification of polymorphic short tandem repeats |
US5364759B2 (en) * | 1991-01-31 | 1999-07-20 | Baylor College Medicine | Dna typing with short tandem repeat polymorphisms and identification of polymorphic short tandem repeats |
WO1995017522A2 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-29 | University Of Leicester | Identification of simple tandem repeats |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005527206A (ja) * | 2002-04-08 | 2005-09-15 | ピッグ インプルーブメント カンパニー ユーケイ リミテッド | 動物生産物を追跡するためのシステム |
JP2017099361A (ja) * | 2015-12-04 | 2017-06-08 | 東洋紡株式会社 | 核酸増幅法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN100545265C (zh) | 2009-09-30 |
CN1290298A (zh) | 2001-04-04 |
AU2656599A (en) | 1999-08-23 |
ES2475416T3 (es) | 2014-07-10 |
AU758639B2 (en) | 2003-03-27 |
JP2009254388A (ja) | 2009-11-05 |
KR100691195B1 (ko) | 2007-03-08 |
DE69942891D1 (de) | 2010-12-09 |
EP2287308A3 (en) | 2011-06-29 |
EP2287307B1 (en) | 2014-04-09 |
CA2319111A1 (en) | 1999-08-12 |
JP5898829B2 (ja) | 2016-04-06 |
EP1058727A1 (en) | 2000-12-13 |
US6238863B1 (en) | 2001-05-29 |
ES2476266T3 (es) | 2014-07-14 |
EP2287307A2 (en) | 2011-02-23 |
ATE486129T1 (de) | 2010-11-15 |
EP2287308B1 (en) | 2014-04-09 |
EP1058727A4 (en) | 2003-03-26 |
US6767703B2 (en) | 2004-07-27 |
JP2013143965A (ja) | 2013-07-25 |
CN101857895A (zh) | 2010-10-13 |
JP4494630B2 (ja) | 2010-06-30 |
EP2287307A3 (en) | 2011-06-29 |
EP2287308A2 (en) | 2011-02-23 |
WO1999040194A1 (en) | 1999-08-12 |
KR20010040624A (ko) | 2001-05-15 |
US20020012924A1 (en) | 2002-01-31 |
EP1058727B1 (en) | 2010-10-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5898829B2 (ja) | 中型縦列繰り返しdnaマーカーを特定し分析するための材料と方法 | |
JP3715657B2 (ja) | 差引きハイブリダイゼーションおよび差異分析の方法 | |
Lagerström et al. | Capture PCR: efficient amplification of DNA fragments adjacent to a known sequence in human and YAC DNA. | |
EP2121977B1 (en) | Circular chromosome conformation capture (4c) | |
EP0327429B1 (en) | Labeling by simultaneous ligation and restriction | |
US5981190A (en) | Analysis of gene expression, methods and reagents therefor | |
US5866337A (en) | Method to detect mutations in a nucleic acid using a hybridization-ligation procedure | |
JP3535159B2 (ja) | Dna分析への選択的アプローチ | |
JP2004535162A (ja) | Rna配列の増幅のための方法および組成物 | |
US20120179384A1 (en) | Method for analyzing nucleic acid mutation using array comparative genomic hybridization technique | |
JPH08505535A (ja) | 一本鎖dna分子の生成方法 | |
WO2000031306A9 (en) | Multiplex amplification of short tandem repeat loci | |
AU1449799A (en) | Probe arrays and methods of using probe arrays for distinguishing dna | |
EP1151136A1 (en) | Method for detecting variant nucleotides using arms multiplex amplification | |
WO2013192292A1 (en) | Massively-parallel multiplex locus-specific nucleic acid sequence analysis | |
US20040229221A1 (en) | Method to detect mutations in a nucleic acid using a hybridization-ligation procedure | |
US20070148636A1 (en) | Method, compositions and kits for preparation of nucleic acids | |
WO2019023243A1 (en) | METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING AND AMPLIFYING DNA TARGETS IN A SINGLE REACTION MIXTURE | |
KR20230124636A (ko) | 멀티플렉스 반응에서 표적 서열의 고 감응성 검출을위한 조성물 및 방법 | |
US20060240431A1 (en) | Oligonucletide guided analysis of gene expression | |
Lagerström et al. | Capture PCR: efficient amplification of DNA fragments adjacent to | |
Parik et al. | Capture PCR: Efficient amplification of DNA fragments adjacent to a known sequence in human and YAC DNA | |
JPH07500244A (ja) | 多型遺伝子座 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060202 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090209 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090508 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090515 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090810 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090910 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100112 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100225 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100302 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100325 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100408 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130416 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140416 Year of fee payment: 4 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |