JP2002502606A

JP2002502606A - 中型縦列繰り返しｄｎａマーカーを特定し分析するための材料と方法

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Publication number: JP2002502606A
Application number: JP2000530608A
Authority: JP
Inventors: ジェームズダブリューシューム; ジェフリーダブリューバッチャー
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 2002-01-29
Anticipated expiration: 2019-02-04
Also published as: CN100545265C; CN1290298A; AU2656599A; ES2475416T3; AU758639B2; JP2009254388A; KR100691195B1; DE69942891D1; EP2287308A3; EP2287307B1; CA2319111A1; JP5898829B2; EP1058727A1; US6238863B1; ES2476266T3; EP2287307A2; ATE486129T1; EP2287308B1; EP1058727A4; US6767703B2

Abstract

(57)【要約】本発明の目的は、ＤＮＡの中型縦列繰り返し配列の特定および解析のための材料および方法である。ここで中型縦列繰り返し（ＩＴＲ）配列とは、少なくとも２回縦並びに出現する、５から７塩基の少なくとも１つの繰り返し単位を含むＤＮＡ配列の一領域である。本発明の材料および方法の特に好ましい実施態様を用いて、ヒトゲノム内の高度に多形性のＩＴＲ遺伝子座に対するＤＮＡマーカーが特定され、解析される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、一般にゲノム系における遺伝的マーカーの特定および分析を目的と
する。より具体的には本発明は、中型（intermediate）（５から７塩基）配列繰
り返し数の変化による長さの多形性現象を有するＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡ中の
遺伝子座の特定を目的とする。本発明はまた、そのような多形性遺伝子座の検出
を目的とする。さらに本発明は、そのような遺伝子座のゲノムＤＮＡ増幅生成物
の主としてサイズの違いを基にそれらを個々に特定し識別する方法を目的とする
。この場合、中型縦列繰り返し配列の数はそれぞれ個々に異なっている。

【０００２】

【従来技術】

ＤＮＡの型分けは、小児の出生を特定するために、さらに馬、犬、および他の
受賞動物の血統を確認するために用いられる。ＤＮＡ型分けはまた一般に、犯罪
現場で発見された血液、唾液、精液および他の組織の出所を特定するために利用
される。今日使用されるＤＮＡ型分け方法は、１つの集団内で少なくとも２つの
異なる形態で出現することが判明しているＤＮＡの１つまたは２つ以上の領域の
長さおよび／または配列の違いを検出および分析できるようにデザインされてい
る。ＤＮＡ型分けはまた、骨髄移植の成否および特定の癌性疾患の存在を決定す
るために臨床セッティングで用いられる。そのような長さおよび／または配列の
変化は“多形性現象”と称される。そのような変化が生じるＤＮＡの任意の領域
（すなわち“遺伝子座”）は“多形性遺伝子座”と称される。ほとんどのＤＮＡ
型分け技術は、少なくとも１つのそのような多形性遺伝子座を含む少なくとも１
つの“マーカー”を利用する。個々のマーカーの各々は、最終的に１集団内のた
だ１つの個体に由来するゲノムＤＮＡのただ１つの対立形質を含んでいる。本発
明の材料および方法は、全て、主として長さの変化を特徴とするＤＮＡの特定の
種類の多形性の検出に使用するためにデザインされている。

【０００３】長さまたは配列に関して十分に多形性である遺伝的マーカーは、出所確認用途
（例えば実父確認検査および法廷での分析のために採集された組織サンプルの特
定）で使用するために長い間探し求められてきた。そのようなマーカーの発見お
よび開発、並びにそのようなマーカーを分析する方法はここ数年の間にいくつか
の進展段階を経てきた。最近、遺伝的マーカーとして多形性を有する短い縦列繰
り返し（ＳＴＲ）の発見および開発によって、連鎖マップの作製、病的遺伝子の
特定および性状決定、並びにＤＮＡ型分けの簡素化および精密さにおける進展が
促進された。本明細書で用いられるように“短い縦列繰り返し”または“ＴＲ”
という用語は、任意の生物のゲノム内で完璧にまたはほぼ完璧に縦並びに繰り返
される２から７ヌクレオチドの長さの全ての配列を指す。例えば、米国特許第５
３６４７５９号の４段目、５８行目以下でヒトのゲノムＤＮＡで用いられる“短
い縦列繰り返し”の定義を参照されたい。

【０００４】最初に特定されたＤＮＡ変種マーカーは単純な塩基置換（すなわち単純な配列
多形性）で、これらは非常に頻繁にサザンハイブリダイゼーションアッセイで検
出された。そのようなマーカーの特定について述べている参考文献の例として以
下を参照されたい（それらアッセイは放射性プローブを用いて制限エンドヌクレ
アーゼ消化ＤＮＡを分析するために用いることができるようにデザインされてい
る）：E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98(3):503-507(1975); Schumm et al., A
merican Journal of Human Genetics 42:143-159(1988); A. Wyman & R. White,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:6754-6758(1980))。

【０００５】その次の世代のマーカーはサイズの変種、すなわち長さの多形性で、特に“縦
列繰り返し数の可変性”（ＶＮＴＲ）を示すマーカー(Y. Nakamura et al., Sci
ence 235:1616-1622(1987); 米国特許第４９６３６６３号（White et al.(1990)
；米国特許第５４１１８５９号（４９６３６６３号の継続特許、White et al.(1
995)）、および“ミニサテライト”マーカー（Jeffreys et al., Nature 314:67
-73(1985a); Jeffreys et al., Nature 316:76-79(1985b)；米国特許第５１７５
０８２号（Jeffreys))であった。ＶＮＴＲおよびミニサテライトマーカーはとも
に、縦並びの態様で繰り返されるほとんど同一の配列の領域を含んでいる。コア
の繰り返し配列は長さが１０から７０塩基で、短いコア繰り返し配列（“ミニサ
テライト”繰り返しと称される）および長い繰り返し（ＶＮＴＲと称される）を
もつ。人間の集団で個々の個体は異なる数のこれらの繰り返しを含む。これらの
マーカーは、塩基置換多形性よりもより強く多形性で、時には１つの遺伝子座で
４０またはそれ以上の対立形質を提示する。しかしながら、だらだらと時間のか
かる制限酵素消化の過程およびそれに続くサザンハイブリダイゼーション分析が
、そのようなマーカーのほとんどの検出および分析に要求される。

【０００６】次の進展では、ＶＮＴＲ遺伝子座の分析（K. Kasai et al., Journal Fornsic
Science 35(5):1196-1200(1990)）に関してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技
術（米国特許第４６８３２０２号（K.B. Mullis)）が加わった。増幅可能なＶＮ
ＴＲ遺伝子座が発見された。これはサザントランスファーの必要がなく検出する
ことができた。増幅生成物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲルで分離し
、増幅時の放射能の取り込みによって、または臭化銀またはエチジウムによる後
染色によって検出する。しかしながら、ＰＣＲは相対的に小さなＤＮＡセグメン
トを信頼できる状態で増幅させるために用いることができる。すなわち、長さが
３０００塩基以下のＤＮＡセグメントが信頼できる状態で増幅可能である（M. P
once & L. Micol, NAR 20(3):623(1992); R. Decorte et al., DNA Cell Biol.
9(6):461-469(1990)）。結果として、極めてわずかの増幅可能なＶＮＴＲしか得
られず、連鎖マップ作製にはそれらは実用的な種類ではない。

【０００７】多形性ジヌクレオチド繰り返し（Litt & Luty, Am. J. Hum. Genet. 3(4):599
-605(1989); D. Tautz, NAR 17:64636471(1989); Weber & May, Am. J. Hum. Ge
net. 44:388-396(1989);ドイツ国特許第ＤＥ３８３４６３６Ｃ２号（D. Tautz);
米国特許第５５８２９７９号（L. Weber出願))および多形性の短い縦列繰り返し
（ＳＴＲ）（A. Edwards et al., Am. J. Hum. Genet. 49:746-756(1991); H.A.
Hammond et al., Am. J. Hum. Genet. 55:175-189(1994); C.J. Fregeau & R.M
. Fourney, BioTechniques 15(1):100-119(1993); J.W. Schumm et al., "The F
ourth International Symposium on Human Identification 1993", pp.177-187;
および米国特許第５３６４７５９号（Caskey et al.); ドイツ国特許第ＤＥ３８
３４６３６Ｃ２号（D. Tautz))をもつ多形性マーカーの最近の進歩により、従来
の方法の欠点の多くが克服された。ジヌクレオチドまたはＳＴＲ繰り返し（定義
では２−７ｂｐ繰り返しを含む）を含む２つのタイプのマーカーは、一般に“ミ
クロサテライト”マーカーと称される。最も入手しやすいマーカーであるとしば
しば考えられるこのミクロサテライト遺伝子座では、それらの対立形質は長さが
変化するということで区別できるという点で増幅可能なＶＮＴＲと同様である。
しかしながらＶＮＴＲと異なり、これらの遺伝子座は、２、３、４、または稀に
５塩基の長さの完全または不完全な繰り返し配列を含んでいる。それらは、ただ
１つの遺伝子座でほんの数個の対立形質から４０以上の対立形質を出現させる。
増幅プロトコルは小さな生成物（一般に長さが６０から４００塩基対）を製造す
るためにデザインすることが可能で、各遺伝子座の対立形質はしばしば５０ｂｐ
未満の範囲内で含まれる。これは、いくつかの系を同じゲル上で同時に電気泳動
で分析することを可能にする（ただし、個々の系から得られる全ての潜在的増幅
生成物が同じゲル内で他の系の対立形質の領域と重ならないようにＰＣＲプライ
マーを注意深くデザインする）。

【０００８】ミクロサテライト遺伝子座の使用では大きな３つの欠点が存在する。第一は、
スリップ増幅（stutter)人工生成物の存在、すなわち各対立形質を表した大きな
フラグメントの他に１つまたは２つ以上の小さなフラグメントがしばしば増幅後
に見出される。この欠陥は、トリまたはテトラヌクレオチド繰り返しマーカーよ
りもジヌクレオチド繰り返し遺伝子座ではるかに明瞭に提示される（Edwards et
al., Am. J. Hum. Genet. 49:746-756(1991); Edwards et al., Genomics 12:2
41-253(1992); Weber & May, Am. J. Hum. Genet. 44:388-396(1989)）。これら
の人工生成物の存在（おそらくは繰り返しのスリップ現象（repeat slippage)（
Levinson & Gutman, Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221(1987); Schlotterer & Ta
utz, NAR 20:211-215(1992))と称されるＤＮＡポリメラーゼ関連現象の結果と思
われる）は、この遺伝子座の対立形質の内容の解釈を複雑にする。全ての解釈が
複雑になる一方で、各対立形質を表している大きなフラグメントと小さなフラグ
メントの存在は、特に法定訴訟での分析の場合にこれらマーカーの有用性を制限
する（法廷訴訟分析では、２つ以上のＤＮＡサンプルが存在するか否かをしばし
ば決定しなければならない）。本明細書の実験で述べるマーカーの多くは、既知
のマーカーに較べて極めてわずかしか短い人工生成物を生じない新規な種類のマ
ーカーである。

【０００９】現今のＳＴＲおよびミクロサテライトマーカー系の第二の欠点は、単一ゲル内
で多数の遺伝子座を分離することの困難さと関係がある。これは、ＤＮＡフラグ
メントの分離に当業者がもっとも一般的に用いるゲルの上部領域が異なるサイズ
のフラグメントで間隙的に圧縮されるためである。大きな繰り返し単位を基にす
る本実験で述べるマーカーの開発はこのゲル内の有用範囲を広げ、より多くの遺
伝子座の同時分析を可能にする。

【００１０】第三の欠点は、本明細書で開示する発明以前には、ヒトゲノムＤＮＡの遺伝子
座の各々で５から７塩基繰り返しの数の相違を基にする長さの多形性をもつほん
のわずかのＤＮＡ遺伝子座しか文献に記載されていないということである。例え
ば以下の文献を参照されたい：Edwards et al., Nucleic Acids Res. 19:4791(1
991); Chen et al., Genomics 15(3):621-5(1993); Harada et al., Am. J. Hum
. Genet. 55:175-189(1994); Comings et al., Genomics 29(2):390-6(1995); U
tah Marker Development Group, Am. J. Genet. 57:619-628(1995)。１９９５年
に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いて、霊長類ゲノム内の５量体および６量
体の縦列繰り返しの相対的豊富さおよび変動性を決定する実験が報告された（Ju
rka & Pethiyagoda, J. Mol. Evol. 40:120-126(1995))。しかしながら、変動性
は間接的に概算されただけで、個々の遺伝子座における多形性レベルは示されな
かった（上掲書）。我々は、５から７塩基繰り返し配列の高度に多形性である繰
り返しを含有するＤＮＡ遺伝子座を特定し分析する材料および方法を開発した。本発明の材料および方法は、極めて多様な供給源の一本鎖および二本鎖ＤＮＡ
を含む種々のＤＮＡタイプの個々の多形性遺伝子座を特定し分析するために使用
できるようにデザインされている。本発明は現存の技術を顕著に改善し、遺伝子
連鎖分析、犯罪審判、実父確定検査並びに他の訴訟および医学的用途のためのＤ
ＮＡプロフィール調査の性能および精密さを高める。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】

したがって、本発明の目的は、中型縦列繰り返し配列をもつ遺伝子座の特定お
よび分析のための材料と方法を提供することである。ここで“中型縦列繰り返し
配列”とは、５、６または７塩基の配列から成る少なくとも１つの繰り返し単位
を含み、当該単位が少なくとも２回繰り返されているＤＮＡの領域である。

【００１２】本発明の別の目的は、中型縦列繰り返しを含むＤＮＡの１つまたは２つ以上の
遺伝子座を分析または検出するために用いる場合、わずかしか人工生成物を生じ
ない、中型縦列繰り返しＤＮＡマーカーを特定する材料および方法を提供するこ
とである。本発明の材料および方法は、好ましくは、その各々が多形性を有する
中型縦列繰り返し配列を含むゲノムＤＮＡの遺伝子座の特定および分析に用いら
れる。本発明の材料には、ヒトゲノムＤＮＡのそのような遺伝子座に対するオリ
ゴヌクレオチドプライマーおよびＤＮＡマーカーが含まれる。本発明の方法を用
いて検出される中型縦列繰り返し遺伝子座は、同様な方法を用いて検出される多
くの既知の遺伝子座（短いＳＴＲ（すなわち２、３または４塩基ＤＮＡ配列の縦
列繰り返し）を含む）の場合よりも少ない人工生成物を生じる。

【００１３】本発明の具体的な目的は、中型縦列繰り返し領域における核酸の主に繰り返し
単位数の相違による主に長さの変化を基にした、多形性を有する個々の遺伝子座
の分析のための方法および材料を提供することである。本発明の固有の目的はま
た、中型縦列繰り返し多形性（５ヌクレオチド縦列繰り返し多形性を含む）を含
有する多形性ゲノムＤＮＡ遺伝子座の検出および分析のための方法、キットおよ
びプライマーを提供することである。

【００１４】本発明の実施態様の１つは、以下の工程を含む、ゲノムＤＮＡから中型縦列繰
り返し配列を含むＤＮＡフラグメントを単離する方法から成る：（ａ）少なくと
も１つのフラグメントは中型縦列繰り返し配列を含む、複数のＤＮＡフラグメン
トを提供し；（ｂ）中型縦列繰り返し配列の一部分と相補性を有するヌクレオチ
ド配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを結合させた支持手段（例え
ば固定支持手段）を提供し；さらに（ｃ）前述の複数のＤＮＡフラグメントとこ
の支持手段とを、中型繰り返し配列を含むＤＮＡフラグメントおよび少なくとも
１つの他のＤＮＡフラグメントが支持手段とハイブリダイズする条件下で混合す
る。

【００１５】本発明のまた別の実施態様は、以下の工程を含む、スリップ増幅人工生成物を
生じる傾向が低い多形性中型縦列繰り返し配列を検出する方法である；（ａ）少
なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列を有するＤＮＡサンプルを提供し；さ
らに（ｂ）ＤＮＡサンプル中の標的中型縦列繰り返し配列を検出する。この実施
態様では１．１％未満の平均スリップ増幅人工生成物が認められた。

【００１６】本発明のまた別の実施態様は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマ
ーを用い、ＤＮＡサンプル中の問題の中型縦列繰り返し配列（以下では“標的中
型縦列繰り返し配列”）を増幅させ、ＤＮＡサンプル中の標的中型縦列繰り返し
配列を検出する方法を提供する。ここで、オリゴヌクレオチドプライマーは、中
型縦列繰り返し配列を含むＤＮＡマーカーの領域と相補的でさらにこれと接する
配列（以下では“中型縦列繰り返し配列鋳型”）を含み、ここでこのＤＮＡマー
カーは配列番号：１から４３から成る配列群から選ばれる配列を有する。

【００１７】また別の実施態様では、本発明は、少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配
列をＤＮＡサンプル中型縦列繰り返し配列で検出するキットを提供する。このキ
ットは、少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列を増幅させる少なくとも１
つのオリゴヌクレオチドプライマーを含む容器を含み、このオリゴヌクレオチド
プライマーは、中型縦列繰り返し配列鋳型を含む二本鎖ＤＮＡマーカーの領域の
一部と相補的でこれと接するヌクレオチド配列を含み、このＤＮＡマーカーは配
列番号：１から４３から成る群から選ばれる配列を有する。さらに別の実施態様では、本発明は、中型縦列繰り返し配列鋳型に接するマー
カー領域の二本鎖ＤＮＡマーカーの一方の鎖と相補的な配列を含むオリゴヌクレ
オチドプライマーを提供する。ここで、ＤＮＡマーカーは配列番号：１から６、
および配列番号：２８から３３から成る群から選ばれる配列を有する。

【００１８】本発明の種々の実施態様の各々は、人間および他の動物の特定、法廷訴訟分析
、実父確認、骨髄移植のモニタリング、遺伝子連鎖マップ作製および遺伝的疾患
および癌の検出の分野で固有の用途を有する。異なる個体の少量の組織間で正確
に識別する必要性は、法定訴訟での適用で特に緊急を要する。法廷訴訟では、多
くの有罪判決（無罪判決）がＤＮＡ型分け分析（ＳＴＲ遺伝子座の分析を含む）
で左右される。本発明の更なる目的、特色および利点は、以下の本発明の最良の実施態様およ
び説明図から明らかであろう。

【００１９】

【課題を解決するための手段】

本明細書に開示した発明で種々の置換および改変が本発明の範囲を逸脱するこ
となく実施できることは当業者には明白であろう。Ａ．定義本明細書で用いられるように、“中型縦列繰り返し”または“ＩＴＲ”は、少
なくとも２回縦並びに繰り返される５から７塩基の配列を含むＤＮＡ配列の一領
域を指す。ＩＴＲという用語はまた、５から７塩基を含む２つ以上の配列が縦並
びに、または介在する塩基を伴って繰り返されるが、ただしこれら配列の少なく
とも１つが少なくとも２回縦並びに繰り返されることを条件とするＤＮＡの一領
域を包含する。ＩＴＲ内で少なくとも１回繰り返される各配列を本明細書では“
繰り返し単位”と称する。 “ＩＴＲ多形性”とは、主として各染色体の同じ領域内の繰り返し単位の数が
異なるために、個体集団内においてある染色体と別の染色体で長さが異なるゲノ
ムＤＮＡ中のＩＴＲを指す。

【００２０】本発明にしたがって特定および分析される中型縦列繰り返し配列は２つの一般
的なカテゴリー（完全および不完全）に分類される。本明細書で用いられる“完
全な”ＩＴＲとは、少なくとも２回縦並びに繰り返される５から７塩基のただ１
つの繰り返し単位を含む二本鎖ＤＮＡの一領域を指す（例えば（ＡＡＡＡＴ）₁₂ ）。本明細書で用いられるように、“不完全な”ＩＴＲとは、完全な繰り返し単
位の少なくとも２つの縦列繰り返しおよび不完全な繰り返し単位の少なくとも１
つの繰り返しを含むＤＮＡの一領域を指し、この場合、不完全な繰り返し単位は
、完全な繰り返し単位の配列における１、２または３塩基の挿入、欠失または置
換から生じるＤＮＡ配列から成る（例えば（ＡＡＡＡＴ）₁₂（ＡＡＡＡＡＴ）₅
ＡＡＴ（ＡＡＡＴＴ）₄）。不完全なＩＴＲ配列はいずれも少なくとも１つの完全なＩＴＲ配列を含む。特に、ＩＴＲ配列はいずれも完全であるか不完全である
かにかかわず、少なくとも２回縦並びに出現する、下記式（Ｉ）で表される少な
くとも１つの繰り返し単位配列を含む：（ＡｗＧｘＴｙＣｚ）ｎ（Ｉ）式中、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣは任意の順序のヌクレオチドを表し、ｗ、ｘ、ｙおよ
びｚは当該配列の各ヌクレオチドの数を示し、その範囲は０から７であるがｗ＋
ｘ＋ｙ＋ｚの合計は５から７の間で、ｎは当該配列が縦並びに繰り返される数を
表し、少なくとも２である。

【００２１】 “５ヌクレオチド縦列繰り返し”とは、上記に定義した“中型縦列繰り返し”
多形性のサブクラスを指す。また別に特定しないかぎり、“５ヌクレオチド縦列
繰り返し”は、繰り返し配列が５塩基の配列である完全なＩＴＲ、および少なく
とも１つの繰り返し単位が５塩基の繰り返しである不完全ＩＴＲを包含する。 “ＤＮＡマーカー”とは、ＩＴＲ配列、例えばゲノムＤＮＡの一領域を増幅す
ることによって製造したＩＴＲ配列を含むＤＮＡフラグメントを指す。個々のマ
ーカーはそれぞれ、究極的に集団内のただ１つの個体に由来するゲノムＤＮＡの
ただ１つの対立形質を含む。 “遺伝子座”という用語はＤＮＡの特定の領域を指す。ゲノムＤＮＡの一領域
を指すために用いられる場合は、“遺伝子座”は染色体の特定の場所を指す。同
じゲノムの遺伝子座は、集団内のいずれの個体についても相同染色体の各対上で
同一の部位に出現する。そのような染色体の各々の同じ遺伝子座に存在するＤＮ
Ａ配列、または同じそのような染色体から発生するＤＮＡの同じ遺伝子座は、“
対立形質”と称される。

【００２２】本明細書で用いられる“多形性”という用語は、同じ種の個々の生物集団のゲ
ノムＤＮＡで見出される少なくとも２つの染色体で観察される遺伝子座の対立形
質における変動を指す。“多形性”という用語は、他の担体（例えばＤＮＡベク
ターまたは別の生物体の染色体ＤＮＡ）中にクローン化された染色体フラグメン
トの同じ遺伝子座から得られたＤＮＡ配列の変動を含む。本明細書で用いられるように、“ＩＴＲ隣接配列”とは、ＩＴＲを含むＤＮＡ
配列の鎖上でＩＴＲと隣合うヌクレオチド配列をいう。その完全な配列の一部分
としてＩＴＲ隣接配列を含む配列はそれ自体隣接配列である。

【００２３】本明細書で用いられる“オリゴヌクレオチドプライマー”という用語は、３つ
より多いデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドで構成される分子と
定義される。各プライマー配列は鋳型の配列を正確に反映する必要はないが、当
該配列が鋳型との相補性をより正確に反映すればするほど、鋳型との結合性は良
好である。その正確な長さおよび配列は、当該オリゴヌクレオチドプライマーの
最終的な機能および用途に関係する多くの因子（温度、プライマーの配列、およ
び方法の有効性を含む）に左右されるであろう。本発明の各オリゴヌクレオチド
プライマーは、ＩＴＲ配列に隣接するＤＮＡマーカーの配列と相補的な核酸配列
を含む。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸の１つの鎖と相補的な
プライマー伸長生成物の合成を誘発する条件下に置いた場合、合成の開始点とし
て機能することができる。当該条件には、ヌクレオチドおよび誘発剤の存在、例
えば適切な温度およびｐＨ下でのＤＮＡポリメラーゼの存在が含まれる。好まし
い実施態様では、当該プライマーは、誘発剤の存在下で特定の配列から伸長生成
物の合成を開始させるために十分な長さをもつ一本鎖オリゴデオキシリボヌクレ
オチドである。オリゴヌクレオチドプライマーの感受性および特異性は、プライ
マーの長さおよび与えられた鋳型ＤＮＡサンプル内の配列の固有性によって決定
される。本発明では、オリゴヌクレオチドプライマーは通常はおよそ１５塩基よ
り大きく、好ましくは長さが約２０から４０塩基である。

【００２４】 “オリゴヌクレオチドプライマー対”という用語はプライマー対を指し、各々
は同じＩＴＲに隣接する二本鎖ＤＮＡの向き合う鎖と相補的なデオキシリボヌク
レオチドまたはリボヌクレオチド配列を含む。本発明のオリゴヌクレオチドプラ
イマーの各対は、好ましくはただ１つのＩＴＲを検出するために選別される。各
プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、当該配列が鋳型と
の相補性を正確に反映すればするほど、鋳型との結合は良好である。

【００２５】 “伸長生成物”とは、オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端から合成され
、さらに当該オリゴヌクレオチドが結合している鎖と相補的であるヌクレオチド
配列を指す。本明細書で用いられる“オリゴヌクレオチドプローブ”という用語は、標的配
列の一部分（例えばＤＮＡサンプルの中型縦列繰り返し配列）と相補的な配列を
含むＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子を指し、ここで相補性を有する当該部分は
、プローブが標的配列とハイブリダイズするために十分な長さを有する。

【００２６】本明細書で用いられるように、“スリップ増幅人工生成物”という用語は、標
的ＤＮＡの１つまたは２つ以上の分子を検出する場合に観察される固有のタイプ
の人工生成物を指す。この場合、標的ＤＮＡは同じ繰り返し単位配列（本発明に
したがって検出および分析される標的中型縦列繰り返し配列を含む）の縦列繰り
返しを含む。長さによるサンプル中の全ＤＮＡの分離後に任意のそのような標的
ＤＮＡを含むサンプルが検出される場合、標的ＤＮＡ分子の各々はメジャーシグ
ナルを（例えばゲルのメジャーバンド）を生じるが、マイナーシグナルも各メジ
ャーシグナルの直ぐ近くに検出できる。一般に、このマイナーシグナルは、１つ
または２つ以上の繰り返し単位が標的ＤＮＡ配列に付加または欠失したために標
的ＤＮＡと長さが異なるＤＮＡフラグメントが検出されたために生じる。スリッ
プ増幅人工生成物は、ＤＮＡの複製中に（in vivoおよびin vitroの両方で）スリップした鎖の対合形成の誤りによるものとされた（例えば以下の文献を参照さ
れたい：Levinson & Gutman(1987), Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221; Schlｏtt
erer & Tauz(1992), Nucleic Acids Research 20(2):211-215）。そのような人工生成物は、そのような任意の繰り返し配列を含むＤＮＡがin vitroでポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅方法を用いて増幅される場合に特に明瞭で
ある。なぜならば、サンプル中に存在するか、またはポリマー生成中に生産され
る一切のマイナーフラグメントがメジャーフラグメントともに増幅されるからで
ある。

【００２７】本明細書で用いられる“スリップ増幅人工生成物百分率”という用語は、ただ
１つの供給源（例えばただ１つの細菌コロニーまたはゲノムＤＮＡのただ１つの
染色体）から得られたＤＮＡサンプルで観察されるメジャー（すなわち標的）シ
グナルの大きさに対するマイナー（すなわち人工生成物）シグナルの大きさの比
較を指す。スリップ増幅人工生成物百分率は増幅されていないＤＮＡで決定する
ことができるが、好ましくは少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列の増幅
後に決定される。“スリップ増幅人工生成物平均百分率”という用語は、１つの
集団内で少なくとも２０の対立形質を含む代表的サンプルで検出されたスリップ
増幅人工生成物百分率の測定値から得られたスリップ増幅人工生成物百分率の平
均を指す。

【００２８】本明細書で用いられるように“ゲノムＤＮＡ”という用語は、基本的にゲノム
ＤＮＡに由来する一切のＤＮＡを指す。この用語には、例えば異種生物のクロー
ン化ＤＮＡ、完全ゲノムＤＮＡおよび部分的ゲノムＤＮＡ（例えばただ１つの単
離染色体のＤＮＡ）が含まれる。本発明によって検出または単離されるＤＮＡは一本鎖でも二本鎖でもよい。例
えば、本発明での使用に適した一本鎖ＤＮＡは、細菌ファージ、細菌、またはゲ
ノムＤＮＡのフラグメントから得ることができる。本発明での使用に適した二本
鎖ＤＮＡは、中型縦列繰り返し配列をもつＤＮＡを含む多数の種々の供給源のい
ずれからも得ることができる。これらＤＮＡ供給源には、ファージライブラリー
、コスミドライブラリーおよび細菌ゲノムまたはプラスミドＤＮＡ、並びにいず
れかの真核細胞生物から単離されたＤＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡを含む）が含まれ
る。ＤＮＡは好ましくはヒトゲノムＤＮＡから得られる。多数のヒトゲノムＤＮ
Ａ供給源のいずれも用いることができるが、これらには医療用または法廷訴訟用
サンプル、例えば血液、精液、膣スワブ、組織、毛髪、唾液、尿および体液混合
物が含まれる。そのようなサンプルは、新しいものでも古いものでも乾燥したも
のでも、および／または部分的に分解したものでもよい。サンプルは犯罪現場の
証拠物件から採集できる。

【００２９】Ｂ．ＩＴＲを含む多形性ＤＮＡマーカーを単離する方法：本発明の実施態様の１つは、ハイブリダイゼーション選別を用いてＩＴＲを含
むＤＮＡフラグメントを単離する方法である。本方法は以下の工程を含む：（ａ
）少なくとも１つのＤＮＡフラグメントがＩＴＲを含む、複数のＤＮＡフラグメ
ントを提供し；（ｂ）中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的なヌクレオチド配
列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを結合させた支持体手段を提供し
；（ｃ）当該複数のＤＮＡフラグメントと当該支持体手段とを、ＩＴＲ配列を含
有するＤＮＡフラグメントのいずれかを含むＤＮＡフラグメントが支持体手段と
ハイブリダイズする条件下で混合する。

【００３０】本方法の工程（ａ）で提供される複数のＤＮＡフラグメントはＩＴＲを含む任
意のＤＮＡサンプルをフラグメント化して得ることができるが、好ましくはゲノ
ムＤＮＡをフラグメント化して得られる。例えば以下の文献を参照されたい：Cu
rrent Protocols in Human Genetics(1994), Chapter 2: Development of Genet
ic Markers, Construction of Small-Insert Libraries from Genomic DNA, p.2
.2.1およびそれ以降（これは参照により本明細書に含まれる))。工程（ａ）で使
用する複数のＤＮＡフラグメントを調製する最も好ましい方法は以下を含む工程
にしたがう：サンプルＤＮＡをフラグメント化し、それによって、少なくとも１
つのＤＮＡフラグメントがＩＴＲを含むＤＮＡフラグメント集団を作製し；当該
ＤＮＡフラグメント集団に各ＤＮＡフラグメントの少なくとも一方の末端にプラ
イミング配列を含むリンカーを連結し；さらに、プライミング配列と相補的な配
列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて各リンカー連結フラグメントを
増幅させる。異なるリンカーを各フラグメントの各々の末端に連結することがで
きる。しかしながら、リンカーのプライミング配列と相補的な配列を有するただ
１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅させることができるように、
好ましくはただ１つのリンカーを各末端に連結する。リンカー連結は、好ましく
はＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼ酵素の存在化で実施する。

【００３１】本方法の工程（ａ）で供給される複数のＤＮＡフラグメントを製造するために
、多数の異なる手段のいずれも用いることができる。これらには、超音波処理ま
たは少なくとも１つの制限酵素によるフラグメント化が含まれるが、二本鎖ＤＮ
Ａは制限酵素でのみフラグメント化できる。二本鎖ＤＮＡサンプルをフラグメン
ト化するために制限酵素を用いる場合は、好ましい制限酵素は一本鎖の突出部を
残す４塩基対認識配列をもち、さらに問題のＩＴＲ領域内でＤＮＡサンプルを切
断しない酵素である。二本鎖ＤＮＡサンプルのフラグメント化で使用する好まし
い制限酵素には、ＭｂｏＩ、ＡｃｉＩ、ＢｆａＩ、ＤｐｎＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉ
ｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｐＩ、ＮｌａＩＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔ
ａｑＩ、Ｃｓｐ６ＩおよびＴａｉＩが含まれる。

【００３２】上記のように製造されたリンカー連結ＤＮＡフラグメントは、続いて増幅反応
を用いて増幅される。これらの増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（米国
特許第４６８３２０２号（K.B. Mullis)）、核酸配列依存増幅（ＮＡＳＢＡ）（
Kievits et al.(1991) J. Virol. Methods 35(3):273-286）、連結仲介増幅（Vo
lloch et al.(1994) Nucleic Acids Res. 22(13):2507-2511）、鎖置換増幅（Wa
lker et al.(1992) PNAC 89(1):392-396）、配列非依存性単一プライマー増幅（
ＳＩＳＰＡ）（Reyes(1991) Mol. Cell Probes 5(6):473-481)またはリガーゼ連
鎖反応（米国特許第５６８６２７２号（Marshall et al))である。

【００３３】本方法の工程（ｂ）で提供される支持体手段は、少なくとも１つの標的オリゴ
ヌクレオチドを結合させた固定支持体を含む。固定支持体は、好ましくはオリゴ
ヌクレオチドを直接または間接的にカップリングさせることができる物質を含む
。オリゴヌクレオチドを直接カップリングさせることができる適切な物質には、
ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリカ、およびラテックスが含まれる。
本方法の好ましい本実施態様で使用する適切な固定支持体の例には、ナイロン膜
、シリカ粒子を埋め込んだフィルター、ガラスビーズ、シリカ磁性粒子、または
シリカ含有樹脂が含まれる。オリゴヌクレオチドに結合させた第一のカップリン
グ剤および固定支持体表面に結合させた第二のカップリング剤によってオリゴヌ
クレオチドに間接的にカップリングさせることができる適切な物質には、アビジ
ンとストレプトアビジン、または抗原とそれに対する抗体が含まれる。

【００３４】固定支持体に結合させる少なくとも１つの標的オリゴヌクレオチドには、ＤＮ
Ａフラグメントの中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的なヌクレオチド配列が
含まれる。本明細書で用いる“部分”という用語は、前述の配列と相補的な配列
を有するオリゴヌクレオチドが、当該配列と接触するときにそれとハイブリダイ
ズすることができるように十分な長さを有するＤＮＡフラグメントのＩＴＲ領域
内のヌクレオチド配列を指す。この“部分”は、好ましくは長さが少なくとも２
０塩基、より好ましくは少なくとも４０塩基の配列である。より好ましくは、標
的オリゴヌクレオチドは、式（ＡｗＧｘＴｙＣｚ）ｎによって示される式を有す
る。式中、Ａ、Ｇ、ＴおよびＣはヌクレオチドを表し、これらはどのような並び
方でもよく；ｗ、ｘ、ｙおよびｚは配列内の各ヌクレオチド数を表し、その範囲
は０から７で、ｗ＋ｘ＋ｙ＋ｚの合計は５から７の間で；ｎは配列が縦並びに繰
り返される回数で、少なくとも約４回、より好ましくは少なくとも約８回、最も
好ましくは少なくとも１５回である。

【００３５】本方法の工程（ｃ）では、複数のＤＮＡフラグメントは、ＩＴＲ含有ＤＮＡフ
ラグメントが支持体手段とハイブリダイズする条件下で当該支持体手段と混合さ
れる。当該複数のフラグメントが複数の二本鎖ＤＮＡフラグメントである場合は
、当該ＤＮＡは支持体手段とのハイブリダイゼーションの前に変性させる。ハイ
ブリダイゼーションの前に二本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させる適切な手段に
は、二本鎖ＤＮＡを変性させるために十分に高い温度にＤＮＡを暴露するか、ま
たは変性溶液にＤＮＡを暴露することが含まれる。ＤＮＡは好ましくは、変性剤
（例えば塩基（例えば水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウム))を含む変性溶液
を用いて変性させる。ＤＮＡフラグメントを変性させるために塩基が用いられる
場合は、得られる混合物のｐＨは、好ましくはｐＨ約４．８から当該混合物のｐ
Ｈの緩衝液を添加することによってほぼ中性ｐＨに調節される。

【００３６】いったんＤＮＡフラグメントが支持体手段にハイブリダイズしたら、好ましく
はこの支持体手段を洗浄して、ＤＮＡフラグメントを除去し、さらに支持体手段
が含まれる一切の溶液中に存在する一切の他の物質、またはハイブリダイズしな
かった支持体手段の表面に存在する一切の他の物質を除去する。使用されるいず
れの洗浄溶液も、好ましくは支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフラグメン
トを遊離させることなくそのような物質を除去するように構成される。

【００３７】支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントは、支持体手段とＤＮＡ
フラグメントとの結合の性質にしたがって熱または適切な遊離溶液を用いて、支
持体手段から遊離させることができる。例えば、水または低塩類水溶液（例えば
ＴＥ緩衝液（例えば１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ
))を用いて、シリカ材料で構成された支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフ
ラグメントを遊離させることができる。支持体手段から一度遊離させたら、得ら
れた遊離ＤＮＡフラグメントの混合物に存在する他のＤＮＡフラグメントからＩ
ＴＲ配列を含むＤＮＡをさらに単離するためにＤＮＡフラグメントを処理するこ
とができる。さらなる処理工程は、上記の本方法にしたがって再ハイブリダイゼ
ーションおよびスクリーニング、またはＤＮＡベクターへのクローニングおよび
これらクローンによる形質転換体のスクリーニングを含むことができる。

【００３８】図１は、ＩＴＲを含むＤＮＡフラグメントを単離する方法の好ましい実施態様
を示す。この態様では、ＤＮＡフラグメント集団を調製し、支持体手段とハイブ
リダイズさせ、さらに増幅、クローニングおよびＩＴＲ含有形質転換体をスクリ
ーニングする。図１に示す工程の各々はローマ数字で表示されている。工程Ｉは
二本鎖ＤＮＡ分子（１）を示し、これは制限酵素（２）で消化され、サイズの異
なるＤＮＡフラグメント集団（図には示されていない）を生じ、そのうちの少な
くとも１つは標的ＩＴＲを含む。工程ＩおよびＩＩの間の矢印はリンカー（３）
を示し、これはＤＮＡフラグメント集団に添加され、異なる２種類のＤＮＡフラ
グメント（標的ＩＴＲ配列を含むフラグメント（６）と標的配列を含まないフラ
グメント（４))の各々の末端にリンカー（３）をもつリンカー連結フラグメント
（８）集団を生じる。各リンカー（３）のプライミング配列と相補的な配列を有
するオリゴヌクレオチドプライマー（７）を工程ＩＩＩのＤＮＡフラグメント（
８）集団に添加し、ＰＣＲ反応により増幅し、それによって増幅ＤＮＡフラグメ
ント（９）の集団を製造する。工程増幅ＤＮＡフラグメント（９）の集団を容器
（１５）にハイブリダイゼーション溶液（１２）およびフィルター（１０）とと
もに入れる。このフィルター（１０）には、標的ＩＴＲ配列の一部分と相補的な
配列を有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが結合されている。ハイブリ
ダイゼーション溶液は、ＩＴＲ配列を含むＤＮＡフラグメントのフィルターへの
ハイブリダイゼーションを促進する。工程Ｖでは、フィルター（１０）を容器（
１５）から取り出し、それにハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを当該フィ
ルターから遊離させる。得られた遊離フラグメントの濃縮集団を、工程ＩＩＩの
増幅反応で用いたものと同じオリゴヌクレオチドプライマー（７）を用いて工程
ＶＩで再度増幅させる。最後に、工程ＶＩＩで濃縮増幅ＤＮＡフラグメント集団
の各々のフラグメントをプラスミドベクターでクローニングする。標的ＩＴＲ配
列（６）を含むフラグメントをクローニングしたベクターおよびＩＴＲ配列を含
まないフラグメント（４）をクローニングしたベクターが工程ＶＩＩに示されて
いる。

【００３９】Ｃ．スリップ増幅が低い多形性ＩＴＲを検出する方法：標的ＩＴＲ配列を有するＤＮＡサンプルの標的ＩＴＲ配列を本方法のこの具体
的な実施態様で検出するとき、最小のスリップ増幅人工生成物が観察される。観
察された平均スリップ増幅人工生成物は好ましくは１．１％未満、より好ましく
は０．９％未満である。標的ＩＴＲ配列は完全なＩＴＲでも、不完全なＩＴＲ配
列でもよい。検出されるＤＮＡサンプルは好ましくはゲノムＤＮＡである。平均スリップ増幅人工生成物は好ましくはＤＮＡサンプルのＩＴＲ配列の増幅
後に検出される。

【００４０】Ｄ．プライマー、プローブおよびマーカー本発明はまた、配列番号：１−４３として下記の配列表で特定したＤＮＡマー
カー、プライマー（各プライマーは、これら４３配列の１つによって特定された
ＤＮＡマーカーの１つのＩＴＲ領域に隣接する配列と相補的な配列を有する）、
およびプローブ（４３マーカーの１つのＩＴＲ領域内に含まれる配列と相補的な
配列を有する）を含む。下記の実施例で説明する実験で特定された特に好ましい
プライマーは表１に列挙する。下記の実施例は説明のために提供され、本発明を全く制限しようとするもので
はない。実施例では、全ての百分率は、固体については重量により、液体につい
ては容積による。全ての温度は特に記載がなければ摂氏である。

【００４１】

【表１】

【００４２】

【表２】

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【００４５】

【表５】

【００４６】

【表６】

【００４７】実施例１：完全ゲノムＰＣＲライブラリーの構築本実施例および下記の実施例２で用いる個々の増幅およびハイブリダイゼーシ
ョン選別は、文献に記載された選別方法の改変様式である（J. Armor et al.(19
94) Hum. Mol. Genet. 3(4):599-605)）。ヒトゲノムＤＮＡは、１５人から得た全血プールから標準的フェノール：クロ
ロホルム抽出法（"Current Protocols in Human Genetics"(1994), J. Gilber,
ed., Appendix)を用いて精製した。ＤＮＡ１μｇ当たり５単位のＭｂｏＩ制限酵素を用いて、約１００μｇのゲノ
ムＤＮＡを１６時間３７℃で切断し、続いてフェノール：クロロホルム抽出、エ
タノール沈澱で精製し、さらに１００μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０))に最終濃度約１μｇ／ｍｌでＤＮＡを再懸
濁した。サイズが２５０−６００ｂｐの範囲のＤＮＡフラグメントを１％ＳｅａＫｅｍ
ＧＴＧ（FMC Bio Products, Rockland, Maine)調製用アガロースゲル（１５ｘ２
０ｃｍ）上で１００Ｖで１．２５時間ゲル電気泳動を実施して単離し、電気溶出
（リファレンス）によって回収した。Ａ２６０での吸収を測定してＤＮＡを定量
し、滅菌したナノピュア純度の水で５００ｎｇ／μｌに希釈して−２０℃で保存
した。

【００４８】リンカーは、等モル量のオリゴＡ（５’−ＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧ
ＡＡＧＣＴＴＧＧ−３’）および５’燐酸化オリゴＢ（５’−ＧＡＴＣＣ
ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＣ−３’）を最終濃度１０
００ピコモル／μｌでアニールして調製した。サイズ選別した挿入ＤＮＡ（平均
サイズ４２５ｂｐを３．５ピコモル）１μｇを１３μｇ（８７５ピコモル）のリ
ンカー（リンカー：挿入物モル比は２５０：１）と１−３単位のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを１６時間１５℃で用いて連結した。過剰なリンカーおよびリンカー二量体
はゲル電気泳動（１％SeaKem GTGアガロース、１．５時間、１００Ｖ）で主要フ
ラグメントから分離した。リンカー連結ＤＮＡフラグメントを電気溶出によって
ゲルから回収し、５０μｌの滅菌水に再懸濁した。

【００４９】連結リンカーをもつＤＮＡ（５０ｎｇ）を、１０μｌの１０ＸＳＴＲ緩衝液（
５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１５ｍＭのＭ
ｇＣｌ₂、１％トリトンＸ−１００および２ｍＭの各ｄＮＴＰ）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（５単位／μｌ）、および１μＭのオリゴＡプライマー（１０ピ
コモル／μｌのストックの１０μｌ）を含む１００μｌの反応容積でＰＣＲを用
いて増幅した。この反応でプライマーとして用いた“オリゴＡ”は、上記のよう
にＭｂｏＩリンカーを集めるために用いた“オリゴＡ”と同じである。循環条件
は９５℃１分、６７℃１分、７０℃２分で３０サイクルであった。ｄＮＴＰ、プ
ライマーおよびプライマー二量体はセントリコン１００による微小ろ過で除去し
た（２ｍｌの滅菌水をサンプルに添加し、セントリコン−１００に加え、２００
０ＲＰＭで２０分遠心し、セントリコンフィルターを逆にしてさらに２分２００
０ＲＰＭで遠心してＤＮＡを回収し、１００μｌの滅菌蒸留水に再懸濁した）。
得られたＰＣＲライブラリーの５μｌの部分標本を１％アガロースゲルで検査し
（１００ボルトで１時間）、サイズ範囲が２５０から６００ｂｐであることを確
認した。

【００５０】実施例２：ハイブリダイゼーション選別による５ヌクレオチド繰り返しの濃縮実施例１にしたがって製造した完全ゲノムＰＣＲライブラリーから得た種々の
異なる繰り返しを含むＤＮＡフラグメントを、固形支持体に結合させた種々のオ
リゴヌクレオチド混合物を用いてハイブリダイゼーションによって濃縮した。（
ＡＡＡＡＸ）ｎの５ヌクレオチド繰り返しを含むフラグメントをハイブリダイゼ
ーション選別によって濃縮した。この工程は、先ずハイブリダイゼーション選別
で使用するオリゴヌクレオチドを構築することによって達成された。このオリゴ
ヌクレオチド構築物は、長さが１０００ｂｐの中に（ＡＡＡＡＣ）ｎ、（ＡＡＡ
ＡＧ）ｎおよび（ＡＡＡＡＴ）ｎが縦並びに並べられたものから成る。これらの
オリゴヌクレオチドを膜に固定し、完全ゲノムＰＣＲライブラリーとハイブリダ
イズさせて（ＡＡＡＡＸ）ｎの繰り返しを含むフラグメントを選別した。

【００５１】オリゴヌクレオチドアレイは以下のように構築した：（ａ）５’−燐酸化３０
量体オリゴヌクレオチドである〔ＡＡＡＡＣ〕₆、〔ＡＡＡＡＧ〕₆、および〔Ａ
ＡＡＡＴ〕₆並びにそれらの相補物、〔ＧＴＴＴＴ〕₆、〔ＣＴＴＴＴ〕₆および〔ＡＴＴＴＴ〕₆を合成し、ナノピュアの純度の水に１０００ピコモル／μｌの濃度で懸濁し、（ｂ）相補配列をもつ等モル濃度（各々１０μｌまたは１０ナノ
モルもしくは１９８μｇを用いた）のオリゴヌクレオチドを混合し、６５℃で１
５分加熱し、さらに数時間４℃に置いて互いにアニールさせ、（ｃ）続いてＤＮ
Ａ１μｇにつき１ワイス単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを１５℃で一晩用いてアニー
ルしたオリゴヌクレオチドを互いに連結し、（ｄ）２００ｂｐ以上の連鎖体を１
％ＳｅａＫｅｍＧＴＧアガロースでサイズ選別し、（ｅ）連結ＤＮＡをプライマ
ー非含有ＰＣＲに付して縦列アレイを延長し、（ｆ）見かけのサイズが１０００
ｂｐを越えるフラグメントを１％アガロースゲルから回収し、微小ろ過によって
精製した。Ａ₂₆₀での吸収を求め、ナノピュア純度の滅菌水で１μｇ／μｌのストックを作製した。

【００５２】合計１μｇのオリゴヌクレオチド、（ＡＡＡＡＣ）₂₀₀、（ＡＡＡＡＧ）₂₀₀ま
たは（ＡＡＡＡＴ）₂₀₀で４ｍｍｘ４ｍｍ片のナイロン製ハイボンドＮｆｐ膜（A
mersham Life Sciences, Inc)フィルターにスポットを作製し、２回予備ハイブリダイゼーション緩衝液で３０分攪拌しながら洗浄して弱く結合したオリゴを除
去して風乾し、ＤＮＡを結合させるために１２００μジュールでＵＶ架橋連結を
施し、続いて−２０℃で保存した。

【００５３】上記のようにナイロンフィルターに結合させたオリゴヌクレオチドを有する支
持媒体との完全ゲノムＰＣＲライブラリーのハイブリダイゼーション選別は、以
下のように実施した：（ａ）１ｍｌの予備ハイブリダイゼーション緩衝液〔１％
ＢＳＡ（Sigma B-4287）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、７％（ｗ／ｖ）の
ＳＤＳ、０．５ＭのＭａ₂ＨＰＯ₄〕で、前述のフィルターを（ＡＡＡＡＣ）ｎお
よび（ＡＡＡＡＧ）ｎの配列を有するオリゴヌクレオチドを含むフィルターにつ
いては４０℃で、さらに（ＡＡＡＡＴ）ｎの配列を含むフィルターについては３
７℃で予備ハイブリダイズした。２０分後に緩衝液を除去し、１００μｌの新し
い予備ハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、（ｂ）完全ゲノムＰＣＲライブ
ラリーＤＮＡ（２０μｇ）をアルカリ（ＫＯＨ、最終濃度１５０ｍＭ）で変性さ
せ、さらに０．２５容の１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ４．８）を加えて中性にし、
フィルターを含む緩衝液に加えた。得られた反応混合物を予備ハイブリダイゼー
ション温度（３７℃または４０℃）で一晩保温し、（ｃ）（ＡＡＡＡＣ）₂₀₀および（ＡＡＡＡＧ）₂₀₀フィルターを２回１ｍｌの洗浄緩衝液＃１（４０ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．２）、０．１％ＳＤＳ）で４０℃で洗浄し、さらに１回
室温で１５分攪拌しながら洗浄した。（ＡＡＡＡＴ）₂₀₀のフィルターは１ｍｌの洗浄緩衝液＃１で１回３７℃で洗浄し、さらに１回室温で洗浄し、（ｄ）各フ
ィルターに結合したＤＮＡを９５℃で５分、１００μｌのナノピュア純度の水の
中で加熱して遊離させた。再アニーリングを９５℃で防止しながらサンプルを取
り出した。フィルターは、０．４ＭのＮａＯＨで４５℃３０分保温し、続いて０
．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２Ｍトリス（ｐＨ７．５）に移し、さらに
１５分保温することによって清浄にし再使用した。膜にブロットを付け乾燥させ
、栓をした試験管に入れて−２０℃で保存した。

【００５４】実施例３：５ヌクレオチド繰り返しが濃縮されたＤＮＡフラグメントライブラ
リーのクローニング実施例２のようにして５ヌクレオチド繰り返しが濃縮されたＤＮＡフラグメン
ト集団をＰＣＲによって再度増幅した。続いて再増幅フラグメントを下記に述べ
るようにプラスミドベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）でクローニングした。この
工程は、選別挿入物をｐＧＥＭベクターに連結し、続いて環状プラスミドでＪＭ
１０９大腸菌ホストを形質転換することによって実施された。

【００５５】挿入物とベクターとの連結は以下のように実施した：（ａ）ハイブリダイゼー
ションで選別した５μｌのＤＮＡを１００μｌの反応容積で以下を用いて再増幅
した：１ＸＳＴＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９
．０）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．１％トリトンＸ−１００および各ｄＮＴＰを０．２ｍＭ）、１μｌのＴａｑポリメラーゼ（５単位／μｌ）、および１μ
ＭのオリゴＡプライマー（１００ピコモル／μｌのストックを１μｌ）。循環条
件は９５℃１分、６７℃１分、７０℃２分で３０サイクル。（ｂ）１１μｌのプ
ロメガ制限酵素１０Ｘ緩衝液Ｃおよび２μｌ（８単位／μｌ）のＭｂｏＩを１０
０μｌのＰＣＲ反応に添加し、得られた反応混合物を３７℃で一晩保温し、６５
℃で２０分混合物を保温して制限酵素を熱不活化することによって、再増幅した
ＤＮＡを消化した。（ｃ）ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）ベクター（約２０μｇまたは
１０．６ピコモル）を、ＢａｍＨＩ（５単位／μｇ）で１６時間３７℃で消化し
、続いて適切な量のウシ腸アルカリホスフェート（Calf Intestinal Alkaline P
hosphate, CIAP）１０Ｘ緩衝液（Promega)および1 μｌのＣＩＡＰ（単位／μｌ
）を加え、さらに３７℃で１時間保温してフラグメント挿入のために準備した。
この反応を０．５ＭのＥＤＴＡを０．０２Ｍの最終濃度で添加して停止し、続い
てフェノール抽出しエタノールで沈澱させＴＥ緩衝液に１μｇ／μｌで再懸濁さ
せた。（ｄ）最後に１μｌまたは２００ｎｇの脱燐酸ｐＧＥＭ３Ｚｆ（＋）（工
程ｃ参照）および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（１から３単位／μｌ）とともに
、ＭｂｏＩで切断したＤＮＡ１μｌ（工程ｂ参照）を２時間室温で保温して、２
０μｌの挿入物−ベクター連結を実施した。最後に、テクニカルブリテン＃０９５に記載されたプロメガ形質転換プロトコ
ルを用いて、１０μｌの挿入物−ベクター連結反応物で１００μｌのＪＭ１０９
コンピテント細胞を形質転換した。

【００５６】実施例４：（ＡＡＡＡＸ）ｎ５ヌクレオチド繰り返しを含む小挿入物ゲノムラ
イブラリークローンのコロニーハイブリダイゼーションによる選別ライトスミスＩＩ試薬およびプロトコル（プロメガテクニカルブリテン＃ＴＭ
２２７を参照）を用いてコロニーハイブリダイゼーションスクリーニングによっ
て、（ＡＡＡＡＸ）ｎ５ヌクレオチド繰り返しを含むクローンを選別し、アルカ
リホスファターゼ共役プローブとのハイブリダイゼーションにより可視化した。

【００５７】細菌のコロニーを含む平板上にマグナグラフ（MagnaGraph）ナイロン膜（Micr
on Separations, Inc. Westboro, MA)を静置し、３分間放置して膜にコロニーＤ
ＮＡを移し、続いて乾燥濾紙にブロッティングした。次に、以下を含む一連のト
レーに膜を移した：１０％ＳＤＳで３分、続いて変性溶液（５ｍｌのＮａＯＨ＋
３０ｍｌのＮａＣｌ＋６５ｍｌの蒸留水から成る）で５分、続いて中和溶液（３
０ｍｌの５ＭＮａＣｌ＋２５ｍｌトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋４５ｍｌの蒸
留水から成る）で５分、最後に２ＸＳＳＣで５分。続いて膜を室温で３０分乾燥
させ、その後スタータリンカー（Statalinker(登録商標）、Stratagene, La Jol
la, CA）を用いて１２００μジュールでＵＶ架橋する。

【００５８】（ＡＡＡＡＸ）ｎ繰り返しをもつクローンを含むコロニーの検出は、ＡＰ共役
プローブおよび化学発光を用いて実施した。ＡＰ共役プローブとハイブリダイズ
させたフィルターでＸ線フィルムを感光させることによって、所望のクローンを
含むコロニーが表示された。第二のハイブリダイゼーションは最初の結果を確認
するために実施した。

【００５９】この検出工程はプロメガ（Promega)のライトスミスＩＩキットを用いた（この
工程の詳細な説明はプロメガブリテン＃ＴＭ２２７を参照のこと）。簡単に記せ
ば、使用した検出方法は以下の工程から成る：（ａ）フィルターをクォンタムイ
ールド（Quantum Yield(登録商標))封鎖溶液（プロメガカタログ番号Ｆ１０２１
）で４５分５６℃で激しく攪拌しながら保温し、（ｂ）封鎖溶液を捨て、ＡＰプ
ローブを含む膜の単位ｃｍ²当たり０．０５ｍｌのクォンタムイールド（登録商標）高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション溶液（プロメガカタログ番号
Ｆ１２３１）を加え、激しく震盪しながら５６℃で４５分保温し、（ｃ）ハイブ
リダイゼーション溶液／プローブをフィルターから除き、フィルターを２回１５
０−２００ｍｌの予め加温した洗浄溶液＃１（２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）で
５６℃で１０分洗浄し、（ｅ）全てのフィルターを一緒にし、洗浄溶液＃２（１
ＸＳＳＣ）で１回室温で１０分洗浄し、（ｆ）ブロットを２００ｍｌの１００ｍ
Ｍジエタノールアミン、１ｍＭのＭｇＣｌ₂中で５分間平衡化させ、（ｆ）十分な０．２５ｍＭのＣＤＰ−スター基質（Tropix, Bedford, MA)を加えてフィルタ
ーを飽和させ、続いて少なくとも５分室温で保温し、（ｇ）この基質飽和フィル
ターをハイブリダイゼーションホルダー内のポリスチレンプラスチックシートプ
ロテクター上に置き、ホルダーを閉じ、（ｈ）フィルムカセットにフィルターを
含むハイブリダイゼーションホルダーを置き、その中のフィルターでＸ線フィル
ムを感光させ、（ｉ）少なくとも１時間、フィルムを感光させた後フィルムを現
像する。

【００６０】実施例５：ＤＮＡの配列決定および解析細胞溶解物を用いる配列決定用鋳型を調製する単純化した方法を開発し、少な
くとも１つの（ＡＡＡＡＸ）ｎ配列をもつ挿入物を多分に含むであろうと実施例
４で同定された多数のクローンの配列を決定した。この方法は以下の工程から成
る：陽性クローンをコロニーハイブリダイゼーションアッセイから２００μｌの
ＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）を含む滅菌９６穴（ウェル）マイクロプレー
ト（Falcon Cat.#3072）に移し、一晩３７℃で２５０ｒｐｍで保温する。次にこ
の一晩培養を分割し、以下の３つの異なる工程で用いた：細胞溶解物の作製、最
初の観察を確認するための第二のハイブリダイゼーション用レプリカフィルター
作製、またはクローンの長期保存用グリセロールストックの作製。

【００６１】細胞溶解物は２μｌの一晩培養を取り、これを９６穴反応プレート（Perkin E
lmaer cat.#N801-0560）に入れた１００μｌのナノピュア純度の滅菌水に加え、
９６００サーモサイクラーで４分１００℃で加熱して作製した。これを冷却し氷
結させ、使用まで−２０℃で保存した。９６ピンのレプリケーターを火炎滅菌し、このレプリケーターを一晩培養を含
む９６穴プレートに浸漬し、ＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）プレート上の１
３７ｍｍの丸いナイロン膜（MagnaGraph, MSI)に押しつけ、この膜を一晩３７℃
で保温して、第二のハイブリダイゼーションアッセイ用複製フィルターを作製し
た。残りの一晩培養は、４６μｌの８０％グリセロールを各ウェルに加えてグリセ
ロールストックにし、２５０ｒｐｍに設定した振盪培養機に数分間プレートを置
いて混合し、続いて−７０℃で保存した。

【００６２】２つのコロニーハイブリダイゼーションアッセイで陽性であった全てのクロー
ンを選別し、細胞溶解物プレートから得た対応するクローンをＰＣＲ増幅に用い
た。ＰＣＲ反応生成物をキアゲンキアクイック（Qiagen QIAquick)９６ＰＣＲ精
製プレート（カタログ番号＃２８１８０）で精製し、配列決定のために鋳型を用
いた。２μｌの細胞溶解物を５０μｌのＰＣＲ反応物で用いた。当該反応物は、
２μＭのＭ１３−４７前進方向プライマー（プロメガカタログ番号＃Ｑ５６０Ａ
）、２μＭのＭ１３逆方向プライマー（プロメガカタログ番号＃Ｑ５４２Ａ）、
１ＸＳＴＲ緩衝液、および２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（Perkin Elmer）を含
んでいた。以下の循環プロフィールをＰＥ４８０サーモサイクラーで使用した：
９６℃／２分で１サイクル、９４℃／１分、５６℃／１分、７０℃／１．５分で
１０サイクル；９０℃／１分、５６℃／１分、７０℃／１．５分で２０サイクル
；４℃で保持。ＰＣＲ反応生成物は、キアゲンキアクイック９６ＰＣＲ精製プレ
ート（カタログ番号＃２８１８０）を用い製造元のプロトコルにしたがいクリー
ンアップし、７０μｌのトリス−ＨＣｌ１０ｍＭ（ｐＨ８．５）に最終濃度約３
５ｎｇ／μｌで回収し、−２０℃で保存した。

【００６３】ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩダイターミネーターシークェンシングケミストリー
（ABI Dye Terminator Sequencing Chemistry)およびＡＢＩ３７７シークェンサ
ーを用いて実施した。配列決定用鋳型はＡＢＩダイターミネーターキットおよび
製造元のプロトコル（プロトコルＰ／Ｎ４０２０７８）を用いて調製した。２μ
ｌまたは約３０から９０ｎｇの精製ＰＣＲ生成物（上記）を配列決定反応の鋳型
ＤＮＡとして用いた。配列決定反応物は、８μｌのダイターミネーターミックス
、２μｌの鋳型ＤＮＡ（３５ｎｇ／μｌ）、４μｌのＭ１３−２１前進方向プラ
イマー（０．８μＭ）および６μｌのナノピュア純度の滅菌水から成っていた。
ジーンアンプ（GeneAmp)ＰＣＲシステム９６００でのサイクルシークェンシング
の循環プロフィールは以下のとおりであった：９６℃／１０秒、５０℃／５秒、
６０℃／４分で２５サイクル；４℃で保持。伸長生成物は５０μｌの９５％エタ
ノールおよび２μｌの酢酸ナトリウム（３Ｍ）（ｐＨ４．６）を各試験管に添加
し、ボルテックスミキサーを用いて混合し、氷上に１０分静置し、続いて最大速
度で３０分遠心して精製した。ペレットを１５０μｌの７０％エタノールで洗浄
し、真空遠心で約３分乾燥させ、乾燥状態で使用まで−２０℃で保存した。乾燥
ペレットは６−９μｌのローディング緩衝液に再懸濁し、続いて２分９５℃で変
性させ、ゲルに添加するまで氷上で保存した。

【００６４】５％のロングレンジャー（Long Ranger)ゲル（FMC BioProducts, Rockland, M
E)を製造元のプロトコルにしたがって調製し、２時間重合させた。ゲルを４５分
１０００ボルトで予備泳動した。ローディング緩衝液中の１．５μｌの鋳型をゲ
ルに添加し、２Ｘまたは４Ｘの条件下でそれぞれ３．５時間または７時間泳動し
た。

【００６５】ＡＢＩ３７７シークェンサーから得られたＤＮＡ配列データを整理して一切の
ｐＧＥＭベクター配列を除去し、続いてジネティクスコンピュータグループ＝ウ
ィスコンシンパッケージソフト（バージョン９．０）（Madison, WI)を用いて作
製した、評価された全てのクローンの配列情報を含むローカルデータベースに入
れた。次に、５量体繰り返しの存在、長さおよび配列パターンについてクローン
を調べた。続いて５または６以上の繰り返しを含むものをＢＬＡＳＴ配列比較プ
ログラム（Altschul et al., 1990)で比較し、複製されたクローンおよびＧｅｎ
Ｂａｎｋデータベース（National Center for Biotechnology Information in B
esthesda, Maryland, USA)に既に存在するものを特定した。いったん固有のクロ
ーンが特定されたら、ＯＬＩＧＯプライマーアナリシスソフト（バージョン５．
０）（National Biosciences, Inc., Plymouth, MN）を用いてＰＣＲのためのプ
ライマーをデザインした。

【００６６】実施例６：多形性レベルについてクローンをスクリーニングし染色体上の位置
を決定する多形性についての最初のスクリーニングは、２つのプールしたＤＮＡサンプル
で実施した。このサンプルは一方は任意の１５人のヒトゲノムＤＮＡを含み、他
方はＮＩＧＭＳヒューマンジネティックミュータントセルレポジトリから得られ
た５４人のＣＥＰＨ（CEPH Collection DNA Pool, Cat.#NA13421, Coriell Cell
Repositories, Camden, NJ)を含む。蛍光で標識したＰＣＲプライマーをゲノム
ＤＮＡの標的遺伝子座のＰＣＲ増幅のために用い、ＰＣＲ生成物をポリアクリル
アミドゲルで分離し、蛍光スキャナーで可視化した。４つの対立形質および５０
％のヘテロ接合性をもつ遺伝子座を１６人のＣＥＰＨのＤＮＡ（１０２−１、１
０２−２、８８４−１、８８４−２、１３３１−１、１３３１−２、１３３２−
１、１３３２−２、１３４７−１、１３４７−２、１３６２−１、１３６２−２
、１４１３−１、１４１３−２、１４１６−１、１４１６−２）とともに調べ、
予備的なヘテロ接合性値を求めた。続いて同じ遺伝子座のデータさらに分析し、
対立形質の数、対立形質の頻度およびヘテロ接合性値を求めた（表２参照）。

【００６７】５量体繰り返し配列を含むことが分かったクローン（４以上の対立形質および
５０％以上のヘテロ接合性の選別基準を満たす）をマッピングし、正確な染色体
上の位置を決定した（表２参照）。マッピングには３つの異なる方法を用いた：
（１）染色体上の起源を特定するために、ただ１つのヒト染色体を表す２６の体
細胞ハイブリッド（Coriell Cell Repositories, Camden, NJ)のＮＩＧＭＳパネ
ルを用いる体細胞ハイブリッドマッピング；（２）９３ＲＨクローン（Schuler
et al., 1996）のＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅ４ＲＨパネルを用いる放射ハイブリッド
マッピング；および標準的減数分裂連鎖マッピングおよびＣＥＰＨ血族リファレ
ンスパネル由来の８家族（Ｋ１０２、Ｋ８８４、Ｋ１３４７、１３６２、１３３
１、１３３２、１４１３、１４１６）のＣＲＩ−ＭＡＰマルチポイント連鎖プロ
グラム（Lander & Green, 1987）によるマッピング。

【００６８】１６人のＣＥＰＨで７０％を越えるヘテロ接合性をもつクローンを、主要な四
人種（アフリカ系アメリカ人、白人、アジア人およびスペイン語系アメリカ人を
含む）に由来する１００人を越える個体を含むより大きな集団で遺伝型および対
立形質頻度について調べた。図１０および１１は、ある集団内の２４の異なる個
体に由来するゲノムＤＮＡサンプルの２つの異なる多形性ＩＴＲ遺伝子座から増
幅させた対立形質の泳動は大きく変動することを示している（ＤＮＡサンプルＳ
０２からＳ２５）。この分析で用いたプライマー対の配列については上記の表１
を参照されたい。ゲル像は、蛍光標識プライマーを用いて各５ヌクレオチド繰り
返し遺伝子座を増幅し、続いてポリアクリルアミドゲルで分離し、ＦＭＢＩＯＩ
Ｉ蛍光スキャナー（Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Franci
sco, CA)で走査して可視化することによって作製した。各アッセイ遺伝子座につ
いて周知の対立形質を含む対立形質ラダーは、電気泳動ゲルの各々の端のレーン
（レーンＳ０１およびレーンＳ２６）に含まれている。各遺伝子座を増幅するた
めに用いたプライマー対は、上記の実施例で示したように、クローンＳ１５９ま
たはクローンＧ２１０から単離されたＤＮＡマーカーの配列の少なくとも一部分
と相補的な配列を有する。このプライマー対の配列は、上記の表１でクローンＳ
１５９およびＧ２１０について列挙したプライマー対から選ばれた。

【００６９】多形性スクリーンのためのＰＣＲ条件は以下のとおりであった：プールしたＤ
ＮＡ鋳型については約２００ｎｇ、個々のＣＥＰＨのＤＮＡについては２５ｎｇ
、１ＸＳＴＲ緩衝液、１単位ＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび１μＭの対応する
プライマー対を含む２５μｌの反応物。表２に挙げたクローンの各々を増幅する
ために用いた各プライマー対の配列は表１に提供されている。各プライマーは表
１に挙げた配列番号を割り当てられていることに留意されたい。パーキンエルマ
ージーンアンプＰＣＲシステム９６００サーマルサイクラー（Perkin Elmer, Fo
ster City, CA)のための循環条件は以下のとおりであった：９６℃１分；続いて
９４℃３０秒、６０℃への下降６８秒、３０秒維持、７０℃への上昇５０秒、４
５秒維持の１０サイクル；続いて９０℃３０秒、６０℃への下降６０秒、３０秒
維持、７０℃への上昇５０秒、４５秒維持、６０℃３０分の２０サイクル。ＰＣ
Ｒサンプルは、２．５μｌの各サンプルと２．５μｌの２Ｘブロモフェノールブ
ルーローディング溶液とを混合し、９５℃で２分加熱して変性させ、氷冷して調
製し、続いて各サンプルの３μｌを４％ポリアクリルアミドゲルで４０Ｗで５０
分泳動した。ＰＣＲ生成物は、ＦＭＢＩＯ蛍光スキャナー（Hitachi)で走査して
可視化し、添付のソフト（ＦＭＢＩＯアナリシスバージョン６．０）（Hitachi
Software Engineering, San Francisco, CA)で分析した。

【００７０】

【表７】

【００７１】

【表８】

【００７２】

【表９】

【００７３】実施例７：ＧｅｎＢａｎｋ検索による短い縦列繰り返しの特定縦並びに繰り返される配列を特定するまた別の方法は、中型縦列繰り返しの有
無について米国立遺伝子工学情報センター（National Center for Biotechnolog
y Information(NCBI))のＧｅｎＢａｎｋを検索することによって実施した。いく
つかの方法を用いたが、これらには以下が含まれる：ＣＤ−ＲＯＭによるＧｅｎ
Ｂａｎｋ登録をＤＮＡＳＴＡＲ（Madison, WI)のレーザージーンソフトパッケー
ジを用いてバッチ検索する；ジネティクスコンピューターグループ＝ウィスコン
シンパッケージソフト（バージョン９．０）（Madison, WI)を用いてＧｅｎＢａ
ｎｋをバッチ検索する。存在する可能性がある５量体の繰り返しを作製する場合、４文字のアルファベ
ット（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）から組み立てることができる５文字の言葉には４⁵ ＝１０２４文字があり、６および７塩基の繰り返しでは６文字および７文字の言
葉で４⁶＝４０９６および４⁷＝１６３８４の言葉が存在する。しかしながら、固
有の繰り返しモチーフの数は、２つの相補的な鎖の同等物のために（例えばＡＡ
ＡＡＴはＡＴＴＴＴと同等である）、さらに環状置換の同等物のために（例えば
ＡＡＴＡＡ．．．はＡＴＡＡＡ．．．と同等である）顕著に減少する。５塩基繰
り返しの場合には、このことは、単ヌクレオチド繰り返し（Ａ₅／Ｔ₅およびＣ₅ ／Ｇ₅）を除外したとき５量体繰り返しでは１０２個の固有種が存在することを意味する。

【００７４】少なくとも３つの連続コピーをもつ５，６および７塩基の繰り返しの固有の組
み合わせを全て用いてＧｅｎＢａｎｋのヒトゲノムデータベースを検索した。３
つまたは４つ以上の繰り返しコピー（または時に塩基置換をもつコピー）を含む
全ての繰り返し領域を特定した。現今の配列データを用いて、繰り返し領域に隣
接するプライマーをデザインし、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅し、実施例６で述べ
たように多形性の内容を評価した。

【００７５】続いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから得られた情報を用いて組み立てたプ
ライマーを用いて特定した配列を含有する各クローンを、実施例７で述べたよう
に繰り返し配列の内容についてスクリーニングした。ＩＴＲ配列（すなわちＩＴ
Ｒマーカー）を含むことが判明した各クローンの配列を配列番号：２８から４３
の１つに割り当てた。そのような各マーカーのＩＴＲ領域に隣接する配列を含む
プライマーの配列については表１を参照されたい。そのようなＩＴＲマーカーの
各々の配列の特徴を分析した結果の要約については表２を参照されたい。

【００７６】実施例８：ＰＣＲ人工生成物に対する中型縦列繰り返し遺伝子座の評価（すな
わちスリップ増幅百分率）本明細書に記載したマーカーの多くは新規な種類のマーカーであり、これらで
は“スリップ増幅（Stutter)”として知られているＰＣＲ人工生成物の発生が少
ない（発明の詳細な説明の定義の項を参照されたい）。このような人工生成物の
発生はＰＣＲ増幅時に、おそらくは反復スリップと称されるＤＮＡポリメラーゼ
関連現象の結果として生じる（Levinson & Gutman(1987), Mol. Biol. Evol. 4(
3):203-221; Schlotterer & Tautz(1992), NAR 20:211-215)。反復スリップの最
終的な結果は、本物の対立形質とは異なる数の繰り返し単位を含むＰＣＲ生成物
の発生である。ＰＣＲ時に相当量の増幅スリップが発生すると、増幅生成物はメ
ジャーバンドおよびマイナーバンドとして可視化されるであろう。ここで、メジ
ャーバンドは本物の対立形質に対応し、マイナーバンドは、いくらかの繰り返し
配列を含む変型生成物に対応する。

【００７７】異なる遺伝子座に存在するスリップ増幅の量を定量するために、６つのＩＴＲ
遺伝子座（Ｃ２２１、Ｇ０２３、Ｇ０２５、Ｇ２１０、Ｓ１５９および本特許に
は記載されていない別のＩＴＲ、Ｓ１１７）および１７の５ヌクレオチド縦列繰
り返し遺伝子座（Ｆ１３Ａ０１、ＴＨＯ１、ＴＰＯＸ、Ｆ１３Ｂ、ＦＥＳＦＰＳ
、Ｄ７Ｓ８２０、ＣＳＦ１ＰＯ、Ｄ１３Ｓ３１７、Ｄ８Ｓ１１７９、Ｄ１６Ｓ５
３９、ＬＰＬ、ＦＧＡ、Ｄ５Ｓ８１８、Ｄ３Ｓ１３５８、Ｄ１８Ｓ５１、ｖＷＡ
およびＤ２１Ｓ１１）をＡＢＩ３７７シークェンサーで泳動し、ジェンスキャン
（GenScan)ソフト（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて解析し
た。相対蛍光単位（ＦＲＵ）で測定したピークの高さを全てのメジャーピーク、
および各遺伝子座で精査した２５から４０人のサンプルで観察されたマイナーピ
ークについて求めた。マイナーピーク（一般に５ヌクレオチドでは本物の対立形
質よりも５ｂｐ小さく、４ヌクレオチド繰り返しでは４ｂｐ小さい）で観察され
たＲＦＵのメジャーな本物の対立形質のピークに対する百分率を計算した（表３
参照）。

【００７８】ＩＴＲ遺伝子座Ｓ１５９（図２）およびＧ２１０（図３）並びに４ヌクレオチ
ド繰り返し遺伝子座ｖＷＡ（図４）およびＤ５Ｓ８１８（図５）のＡＢＩ３７７
電気泳動図の結果は、ＩＴＲ遺伝子座ではスリップ増幅が極めて少ないかまたは
存在せず、４ヌクレオチド繰り返し遺伝子座については明瞭にスリップ増幅が観
察されることを示している。特に、ｖＷＡ４ヌクレオチド繰り返し遺伝子座の電
気泳動図の矢印１４および１５（図３に複写）、さらにＤ５Ｓ８１８の４ヌクレ
オチド繰り返し遺伝子座の電気泳動図の矢印１６および１７（図５に複写）によ
って表示されているスリップ増幅人工生成物を参照されたい。これらの明瞭な人
工生成物のピークを、図２に示すクローンＳ１５９（すなわち配列番号：３４に
よって特定される配列をもつマーカー）から単離されたＤＮＡマーカー、および
図４のクローンＧ２１０から単離されたＤＮＡマーカー（すなわち配列番号：１
９によって特定された配列を有するマーカー）の５ヌクレオチド繰り返しの電気
泳動図の極めてわずかな人工生成物とを比較されたい。図２−５に複写した個々
の電気泳動図は遺伝子座の各々について観察されたスリップ増幅の最も高い発生
を示している。スリップ増幅量のある程度の変動性は全ての遺伝子座で観察された。一般に、
最も高い繰り返し数を含む対立形質（塩基対によりそのサイズが表示されている
）は最も大きなスリップ増幅量を示す傾向があった。検査した２５から４０人の
各々の百分率スリップ増幅値をスキャタープロットとして示した（図６、７、８
および９）。

【００７９】要約すれば、本物の対立形質バンドに対する“スリップ増幅”バンドの百分率
は、４ヌクレオチド縦列繰り返し遺伝子座と比較して、調べたＩＴＲ遺伝子座の
ほとんどで顕著に低かった。現在知られているこのタイプのマーカーで最良のも
のである４ヌクレオチド遺伝子座でもこれは真実である。例えば、米連邦捜査局
（ＦＢＩ）は国家の総合ＤＮＡインデックスシステム（ＣＯＤＩＳ）のための全
てのＤＮＡサンプル分析で使用するものとして、そのような１３個の４ヌクレオ
チドマーカー（高いスリップ増幅百分率を有すると下記の表３に報告した、記載
のようにアッセイした４ヌクレオチドのいくつかを含む）を選択している（I. M
acivee (1998) Profiles in DNA 1(3):2)。

【００８０】

【表１０】

【００８１】

【表１１】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、フィルターハイブリダイゼーションによる中型縦列繰り返しを濃縮す
る方法の工程模式図である。

【図２】図２は、５ヌクレオチド繰り返しＳ１５９の電気泳動図である。

【図３】図３は、４ヌクレオチド繰り返しｖＷＡの電気泳動図である。

【図４】図４は、５ヌクレオチド繰り返しＧ２１０の電気泳動図である。

【図５】図５は、４ヌクレオチド繰り返しＤ５Ｓ８１８の電気泳動図である。

【図６】図６は、５ヌクレオチド繰り返しＳ１５９のスリップ増幅百分率のスキャター
プロットである。

【図７】図７は、５ヌクレオチド繰り返しＧ２１０のスリップ増幅百分率のスキャター
プロットである。

【図８】図８は、４ヌクレオチド繰り返しＤ５Ｓ８１８のスリップ増幅百分率のスキャ
タープロットである。

【図９】図９は、４ヌクレオチド繰り返しｖＷＡのスリップ増幅百分率のスキャタープ
ロットである。

【図１０】図１０は、ゲル電気泳動分離後の、５ヌクレオチド繰り返しＳ１５９の蛍光標
識増幅フラグメントの蛍光画像スキャンの結果をレーザープリントした画像であ
る。

【図１１】図１１は、ゲル電気泳動分離後の、５ヌクレオチド繰り返しＧ２１０の蛍光標
識増幅フラグメントの蛍光画像スキャンの結果をレーザープリントした画像であ
る。図の縮尺は必ずしも正確ではなく、さらに、明瞭さと簡潔さの観点から本発明
のある種の特色は縮尺が誇張されるか、または模式的に示されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者バッチャージェフリーダブリューアメリカ合衆国ウィスコンシン州 53705 マディソンチェインバーレイアベニューアベニュー 2633 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA80 CA01 HA11 4B063 QA01 QA17 QQ01 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR56 QR62 QS25 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程を含むハイブリダイゼーション選別を用いる中型
縦列繰り返し配列を含むＤＮＡのフラグメントを単離する方法：（ａ）少なくとも１つのＤＮＡフラグメントが中型縦列繰り返し配列を含む複数
のＤＮＡフラグメントを提供し、ここで前記中型縦列繰り返し配列は、少なくと
も２回縦並びに繰り返される、５、６または７塩基の配列から成る少なくとも１
つの繰り返し単位を含むＤＮＡフラグメントの一領域であって；（ｂ）前記中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的であるヌクレオチド配列を含
む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを結合させた固定支持体を提供し；さら
に（ｃ）前記複数のＤＮＡフラグメントと前記支持体手段とを、前記中型縦列繰り
返し配列を含有するＤＮＡフラグメントを含むＤＮＡフラグメントが前記支持体
手段とハイブリダイズする条件下で混合する。
【請求項２】工程（ａ）で提供される前記複数のＤＮＡフラグメントが以
下のさらなる工程によって製造される濃縮ＤＮＡフラグメント集団である請求項
１の方法：ＤＮＡサンプルをフラグメント化し、それによって、少なくとも１つのＤＮＡ
フラグメントが前記中型縦列繰り返し配列を含むＤＮＡフラグメント集団を製造
し；プライミング配列を含むリンカーをＤＮＡフラグメント集団の各ＤＮＡフラグ
メントの少なくとも一方の末端に連結し；さらに前記プライミング配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて、各リンカー連結フラグメントを増幅する。
【請求項３】前記ＤＮＡサンプルが二本鎖で、さらに少なくとも１つの制
限エンドヌクレアーゼでフラグメント化される請求項２の方法。
【請求項４】前記二本鎖ＤＮＡサンプルが制限酵素ＭｂｏＩでフラグメン
ト化され、前記リンカーが、ＭｂｏＩ消化ＤＮＡフラグメントの各末端に存在す
る突出部配列と相補的な一本鎖突出部ヌクレオチド配列をもつ二本鎖ＤＮＡ分子
を含むＭｂｏＩリンカーである請求項３の方法。
【請求項５】前記リンカーが下記式（Ｉ）の二本鎖ＤＮＡ分子である請求
項４の方法：５’−ｐＧＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＣＧＡＡＣＣＣＴＡＧ−５’（Ｉ）式中、Ａ、Ｇ、ＣおよびＴはヌクレオチドを表し、ｐはＤＮＡ鎖の燐酸化５’末
端を示す。
【請求項６】工程（ｃ）の支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフラグ
メントを遊離させるさらなる工程を含む請求項１の方法。
【請求項７】さらに以下の工程を含む請求項６の方法：支持体手段から遊離させた各ＤＮＡフラグメントをＤＮＡベクターにクローニ
ングし；ホスト細胞を前記クローン化ベクターで形質転換し；中型縦列繰り返し配列を含む標的クローン化ベクターを含む形質転換体を特定
し；さらに前記標的クローン化ベクターを形質転換体から遊離させる。
【請求項８】前記工程（ｂ）で提供される支持体手段が前記オリゴヌクレ
オチドと直接カップリングすることができる物質を含み、前記物質がニトロセル
ロース、ナイロン、ガラス、シリカおよびラテックスから成る群から選ばれる請
求項１の方法。
【請求項９】前記工程（ｂ）で提供される支持体手段が前記オリゴヌクレ
オチドと間接的にカップリングすることができる物質を含み、ここで第一のカッ
プリング剤は前記オリゴヌクレオチドと結合し、第二のカップリング剤は固定支
持体の表面と結合し、第一のカップリング剤および第二のカップリング剤がアビ
ジンおよびストレプトアビジンであるか、または抗体および抗原である請求項１
の方法。
【請求項１０】前記工程（ｂ）で提供される支持体手段が少なくとも２つ
の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を含む請求項１の方法。
【請求項１１】前記中型縦列繰り返し配列が５ヌクレオチドの縦列繰り返
し配列である請求項１の方法。
【請求項１２】以下の工程を含む、ハイブリダイゼーション選別による５
ヌクレオチド縦列繰り返し配列を含むＤＮＡフラグメントを単離する方法：（ａ）少なくとも１つのＤＮＡフラグメントが５ヌクレオチド縦列繰り返し配列
を含む複数の二本鎖ＤＮＡフラグメントを提供し、ここで前記５ヌクレオチド縦
列繰り返し配列は、少なくとも２回縦並びに繰り返される５塩基の配列から成る
少なくとも１つの繰り返し単位を含むＤＮＡフラグメントの一領域であって；（ｂ）前記中型縦列繰り返し配列の一部分と相補的であるヌクレオチド配列を含
む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを結合させた固定支持体を提供し；さら
に（ｃ）前記複数のＤＮＡフラグメントと前記支持体手段とを、前記５ヌクレオチ
ド縦列繰り返し配列を含有するＤＮＡフラグメントおよび少なくとも１つの他の
ＤＮＡフラグメントが前記支持体手段とハイブリダイズする条件下で混合する。
【請求項１３】前記工程（ａ）で提供される複数のＤＮＡフラグメントが
以下の工程で製造される請求項１２の方法：二本鎖ＤＮＡサンプルを制限酵素でフラグメント化し、それによって、少なく
とも１つのＤＮＡフラグメントが５ヌクレオチド縦列繰り返し配列を含む複数の
ＤＮＡフラグメントを製造し；前記複数のＤＮＡフラグメントの各ＤＮＡフラグメントの少なくとも一方の末
端にプライミング配列を含有するリンカーを連結し；さらにプライミング配列と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用い
てリンカーと連結された各フラグメントを増幅させる。
【請求項１４】さらに以下の工程を含む請求項１２の方法：支持体手段とハイブリダイズしたＤＮＡフラグメントを遊離させ；さらに支持体手段とハイブリダイズさせる前に各リンカー連結フラグメントを増幅さ
せるために用いるオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、支持体手段から遊
離させたフラグメントを増幅させる。
【請求項１５】さらに以下の工程を含む請求項１４の方法：支持体手段から遊離させた、増幅させた各ＤＮＡフラグメントをＤＮＡベクタ
ーにクローニングし；ホスト細胞をクローン化ベクターで形質転換させ；中型縦列繰り返し配列を含有する標的クローン化ベクターを含む形質転換体を
特定し；さらに、標的クローン化ベクターを形質転換体から単離する。
【請求項１６】前記工程（ｂ）で提供された支持体手段が少なくとも２つ
の異なるオリゴヌクレオチドの混合物を含む請求項１２の方法。
【請求項１７】以下の工程を含むスリップ増幅人工生成物の発生が少ない
標的中型縦列繰り返しＤＮＡ配列を検出する方法：（ａ）少なくとも２回縦並びに繰り返される５、６または７塩基対の配列から成
る少なくとも１つの繰り返し単位を含むＤＮＡの一領域である少なくとも１つの
標的中型縦列繰り返し配列を有するＤＮＡサンプルを提供し；さらに（ｂ）観察される平均スリップ増幅人工生成物が２．４％未満である、サンプル
ＤＮＡ中の前記標的中型縦列繰り返し配列を検出する。
【請求項１８】前記標的中型縦列繰り返し配列が完全な中型縦列繰り返し
配列である請求項１７の方法。
【請求項１９】前記標的中型縦列繰り返し配列が不完全な中型縦列繰り返
し配列である請求項１７の方法。
【請求項２０】前記工程（ａ）で提供されるＤＮＡサンプルがヒトゲノム
ＤＮＡである請求項１７の方法。
【請求項２１】前記工程（ａ）で提供されるＤＮＡサンプルの標的中型縦
列繰り返し配列が工程（ｂ）の前に増幅される請求項１７の方法。
【請求項２２】鋳型中型縦列繰り返し配列を含む二本鎖ＤＮＡマーカーの
一領域に隣接し前記ＤＮＡマーカーと相補的な配列を含む少なくとも１つのオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて前記標的中型縦列繰り返し配列を増幅させる
請求項２１の方法であって、前記鋳型中型縦列繰り返し配列が、少なくとも２回
縦並びに繰り返される繰り返し単位配列を含むＤＮＡマーカーの一領域であり、
前記ＤＮＡマーカーが、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号
：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：
９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列
番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１
８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列
番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６、配列番号：２
７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３１、配列
番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、配列番号：３５、配列番号：３
６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列
番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３から成る群から選ばれる配列を有
することを条件とする請求項２１の方法。
【請求項２３】前記標的中型縦列繰り返し配列の増幅に用いられるオリゴ
ヌクレオチドプライマーが、それに共有結合によって付加された蛍光標識を有す
る請求項２２の方法。
【請求項２４】前記スリップ増殖人工生成物が、検出される標的中型縦列
繰り返し配列をＤＮＡサイズマーカーで既知の長さをもつフラグメントと比較す
ることによって工程（ｂ）で観察される請求項１７の方法。
【請求項２５】観察される平均スリップ増幅が１．１％未満である請求項
２４の方法。
【請求項２６】以下の工程を含む、少なくとも２回縦並びに繰り返される
５、６または７塩基対の配列から成る少なくとも１つの繰り返し単位を含むＤＮ
Ａサンプルの一領域である標的中型縦列繰り返し配列の少なくとも１つをＤＮＡ
サンプルで検出する方法：（ａ）鋳型中型縦列繰り返し配列を含む二本鎖ＤＮＡマーカーの一領域に隣接し
前記ＤＮＡマーカーと相補的な核酸配列を含む少なくとも１つのオリゴヌクレオ
チドプライマーを提供し、ここで前記ＤＮＡマーカーは配列番号：１、配列番号
：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：
７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号
：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、
配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号
：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、
配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、配列番号
：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号：３４、
配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、配列番号
：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４３か
ら成る群から選ばれる配列を有し；（ｂ）前記標的中型縦列繰り返し配列を含むＤＮＡサンプルを提供し；（ｃ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、前記ＤＮＡサ
ンプルの標的中型繰り返し配列を増幅し；さらに、（ｄ）前記増幅標的中型縦列繰り返し配列における多形性を検出する。
【請求項２７】前記工程（ｂ）で提供されるＤＮＡサンプルがヒトゲノム
ＤＮＡサンプルである請求項２６の方法。
【請求項２８】前記標的中型縦列繰り返し配列が完全な中型縦列繰り返し
である請求項２６の方法。
【請求項２９】前記標的中型縦列繰り返し配列が不完全な中型縦列繰り返
しである請求項２６の方法。
【請求項３０】前記工程（ａ）で提供されるオリゴヌクレオチドプライマ
ーが以下から成る配列群の１つから選択される配列を含む請求項２６の方法：前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１である場合は、配列番号：４４および
配列番号：４５；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２である場合は、配列番号：４６、配列
番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５
１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列
番号：５６、配列番号：５７、配列番号：５８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３である場合は、配列番号：５９および
配列番号：６０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：４である場合は、配列番号：６１および
配列番号：６２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：５である場合は、配列番号：６３および
配列番号：６４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：６である場合は、配列番号：６５および
配列番号：６６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：７である場合は、配列番号：６７および
配列番号：６８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：８である場合は、配列番号：６９および
配列番号：７０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：９である場合は、配列番号：７１および
配列番号：７２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１０である場合は、配列番号：７３およ
び配列番号：７４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１１である場合は、配列番号：７５およ
び配列番号：７６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１２である場合は、配列番号：７７およ
び配列番号：７８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１３である場合は、配列番号：７９およ
び配列番号：８０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１４である場合は、配列番号：８１およ
び配列番号：８２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１５である場合は、配列番号：８３およ
び配列番号：８４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１６である場合は、配列番号：８５およ
び配列番号：８６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１７である場合は、配列番号：８７およ
び配列番号：８８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１８である場合は、配列番号：８９およ
び配列番号：９０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１９である場合は、配列番号：９１、配
列番号：９２、配列番号：９３および配列番号：９４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２０である場合は、配列番号：９５およ
び配列番号：９６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２１である場合は、配列番号：９７およ
び配列番号：９８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２２である場合は、配列番号：９９およ
び配列番号：１００；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２３である場合は、配列番号：１０１お
よび配列番号：１０２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２４である場合は、配列番号：１０３お
よび配列番号：１０４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２５である場合は、配列番号：１０５お
よび配列番号：１０６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２６である場合は、配列番号：１０７、
配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０および配列番号：１１
１；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２７である場合は、配列番号：１１２、
配列番号：１１３、配列番号：１１４および配列番号：１１５；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２８である場合は、配列番号：１１６お
よび配列番号：１１７；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２９である場合は、配列番号：１１８お
よび配列番号：１１９；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３０である場合は、配列番号：１２０お
よび配列番号：１２１；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３１である場合は、配列番号：１２２お
よび配列番号：１２３；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３２である場合は、配列番号：１２４お
よび配列番号：１２５；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３３である場合は、配列番号：１２６お
よび配列番号：１２７；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３４である場合は、配列番号：１２８お
よび配列番号：１２９；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３５である場合は、配列番号：１３０お
よび配列番号：１３１；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３６である場合は、配列番号：１３２お
よび配列番号：１３３；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３７である場合は、配列番号：１３４お
よび配列番号：１３５；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３８である場合は、配列番号：１３６お
よび配列番号：１３７；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３９である場合は、配列番号：１３８お
よび配列番号：１３９；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：４０である場合は、配列番号：１４０お
よび配列番号：１４１；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：４１である場合は、配列番号：１４２お
よび配列番号：１４３；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：４２である場合は、配列番号：１４４お
よび配列番号：１４５；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：４３である場合は、配列番号：１４６お
よび配列番号：１４７。
【請求項３１】標的中型縦列繰り返し配列が、少なくとも２回縦並びに繰
り返される５、６または７塩基対の配列から成る少なくとも１つの繰り返し単位
を含むＤＮＡサンプルの一領域である、ＤＮＡサンプル中の標的中型縦列繰り返
し配列の少なくとも１つをＤＮＡサンプルで検出するキットであって：少なくとも１つの標的中型縦列繰り返し配列を増幅させる少なくとも１つのオ
リゴヌクレオチドプライマーを有する容器であって、前記オリゴヌクレオチドプ
ライマーが、少なくとも２回縦並びに繰り返される繰り返し単位を含む鋳型中型
縦列繰り返し配列を含む二本鎖ＤＮＡマーカーの一領域に隣接し前記ＤＮＡマー
カーと相補的な核酸配列を含み、さらに前記ＤＮＡマーカーが、配列番号：１、
配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配
列番号：７、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、
配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号
：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、
配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、配列番号：２４、配列番号
：２５、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、
配列番号：３０、配列番号：３１、配列番号：３２、配列番号：３３、配列番号
：３４、配列番号：３５、配列番号：３６、配列番号：３７、配列番号：３８、
配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号
：４３から成る群から選ばれる配列を有する前記検出用キット。
【請求項３２】さらにＤＮＡマーカーを含む請求項３１のキット。
【請求項３３】少なくとも２回縦並びに繰り返される５、６または７塩基
対の配列から成る少なくとも１つの繰り返し単位を含む二本鎖ＤＮＡマーカーの
一領域である鋳型中型縦列繰り返し配列と隣接する二本鎖ＤＮＡマーカーの一方
の鎖と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記二本鎖
ＤＮＡマーカー配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号
：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：
９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列
番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１
８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列
番号：２３、配列番号：２４、配列番号：２５、配列番号：２６および配列番号
：２７から成る群から選ばれる前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項３４】前記オリゴヌクレオチドプライマーが以下から成る群から
選ばれる配列を含む請求項３３のオリゴヌクレオチドプライマー：前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１である場合は、配列番号：４４および
配列番号：４５；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２である場合は、配列番号：４６、配列
番号：４７、配列番号：４８、配列番号：４９、配列番号：５０、配列番号：５
１、配列番号：５２、配列番号：５３、配列番号：５４、配列番号：５５、配列
番号：５６、配列番号：５７および配列番号：５８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：３である場合は、配列番号：５９および
配列番号：６０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：４である場合は、配列番号：６１および
配列番号：６２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：５である場合は、配列番号：６３および
配列番号：６４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：６である場合は、配列番号：６５および
配列番号：６６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：７である場合は、配列番号：６７および
配列番号：６８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：８である場合は、配列番号：６９および
配列番号：７０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：９である場合は、配列番号：７１および
配列番号：７２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１０である場合は、配列番号：７３およ
び配列番号：７４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１１である場合は、配列番号：７５およ
び配列番号：７６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１２である場合は、配列番号：７７およ
び配列番号：７８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１３である場合は、配列番号：７９およ
び配列番号：８０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１４である場合は、配列番号：８１およ
び配列番号：８２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１５である場合は、配列番号：８３およ
び配列番号：８４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１６である場合は、配列番号：８５およ
び配列番号：８６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１７である場合は、配列番号：８７およ
び配列番号：８８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１８である場合は、配列番号：８９およ
び配列番号：９０；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：１９である場合は、配列番号：９１、配
列番号：９２、配列番号：９３および配列番号：９４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２０である場合は、配列番号：９５およ
び配列番号：９６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２１である場合は、配列番号：９７およ
び配列番号：９８；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２２である場合は、配列番号：９９およ
び配列番号：１００；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２３である場合は、配列番号：１０１お
よび配列番号：１０２；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２４である場合は、配列番号：１０３お
よび配列番号：１０４；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２５である場合は、配列番号：１０５お
よび配列番号：１０６；前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２６である場合は、配列番号：１０７、
配列番号：１０８、配列番号：１０９、配列番号：１１０および配列番号：１１
１；および前記ＤＮＡマーカー配列が配列番号：２７である場合は、配列番号：１１２、
配列番号：１１３、配列番号：１１４および配列番号：１１５。