ES2476266T3

ES2476266T3 - Materiales y métodos para identificar y analizar marcadores de ADN de repeticiones intermedias en t�ndem

Info

Publication number: ES2476266T3
Application number: ES10011440.4T
Authority: ES
Inventors: James W. Schumm; Jeffrey W. Bacher
Original assignee: Promega Corp
Current assignee: Promega Corp
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 2014-07-14
Anticipated expiration: 2019-02-04
Also published as: EP2287308B1; KR20010040624A; ATE486129T1; CN100545265C; CA2319111A1; DE69942891D1; US6767703B2; EP1058727A1; WO1999040194A1; EP1058727B1; US6238863B1; EP2287307A3; JP5898829B2; CN1290298A; EP2287307A2; JP2002502606A; EP2287308A2; JP2013143965A; AU2656599A; CN101857895A

Abstract

Un método para detectar una secuencia de ADN objetivo de repeticiones intermedias en tándem que tiene una incidencia baja de artefactos por tartamudeo, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra de ADN que tiene al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem es una región del ADN que contiene al menos una unidad de repetición que consiste en una secuencia de cinco (5), seis (6), o siete (7) pares de bases repetidas en tándem al menos dos (2) veces; y (b) detectar la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem en la muestra de ADN, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem de la muestra de ADN proporcionada en la etapa (a) se amplifica antes de la etapa (b), y en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en tándem se amplifica mediante el uso de al menos un cebador oligonucleotídico, que comprende una secuencia que es complementaria y que flanquea a una región de un marcador de ADN bicatenario que contiene una secuencia molde de repeticiones intermedias en tándem, en la que la secuencia molde de repeticiones intermedias en tándem es una región del marcador de ADN que contiene la secuencia de unidades de repetición repetidas en tándem al menos dos (2) veces, con tal de que el marcador de ADN tenga la secuencia SEQ ID Nº:2.

Description

Materiales y métodos para identificar y analizar marcadores de ADN de repeticiones intermedias en t�ndem.

Campo de la invención

En la presente memoria se describe la identificación y el análisis de marcadores genéticos en un sistema gen�mico. De manera más específica, en la presente memoria se describe la identificación de loci en el ADN, en particular en el ADN gen�mico, que contienen polimorfismos de longitud debido a variaciones en el número de repeticiones de secuencias intermedias (5 a 7 bases). En la presente memoria se describe la detección de tales loci polim�rficos. En la presente memoria se describen métodos para identificar y distinguir individuos basándose principalmente en las diferencias de tamaños de los productos de amplificación del ADN gen�mico en tal locus, en los que el número de secuencias de repeticiones intermedias en t�ndem varían de un individuo a otro.

Antecedentes de la invención

La tipificaci�n del ADN se utiliza habitualmente para identificar la ascendencia de niños humanos, y para confirmar el linaje de caballos, perros, y otros animales de competición. La tipificaci�n del ADN también se emplea habitualmente para identificar el origen de la sangre, saliva, semen y otros tejidos hallados en la escena de un crimen. Los métodos de tipificaci�n del ADN actualmente en uso est�n diseñados para detectar y analizar diferencias de longitud y/o de secuencia de una o más regiones del ADN que se sabe que aparecen en al menos dos formas diferentes en una población. La tipificaci�n del ADN se emplea también en el ámbito cl�nico para determinar el éxito o el fracaso del transplante de médula ósea y la presencia de tejidos cancerosos particulares. Tal variación de longitud y/o secuencia se denomina "polimorfismo". Cualquier región (es decir, "locus") de ADN en la que se da tal variación se denomina "locus polim�rfico". La mayoría de las técnicas de tipificaci�n del ADN emplean al menos un "marcador" que contiene al menos dicho locus polim�rfico. Cada marcador individual contiene un único alelo de ADN gen�mico derivado en última instancia de un único individuo de una población. Los métodos y materiales de la presente invención est�n diseñados para el uso en la detección de una clase particular de polimorfismos en el ADN caracterizados principalmente por la variación de la longitud.

Durante mucho tiempo se han buscado marcadores genéticos que sean suficientemente polim�rficos con respecto a la longitud o la secuencia para el uso en las aplicaciones de identificación, tales como pruebas de paternidad e identificación de muestras de tejidos recogidas para el análisis forense. El descubrimiento y el desarrollo de tales marcadores y métodos para analizar tales marcadores ha atravesado varias fases de desarrollo a lo largo de los últimos años. En años recientes, el descubrimiento y el desarrollo de las repeticiones cortas en t�ndem (STRs) polim�rficas como marcadores genéticos ha estimulado el progreso en el desarrollo de la cartografía de ligamiento, la identificación y la caracterización de genes afectados por enfermedades, y la simplificación y precisión de la tipificaci�n del ADN. La expresión "repetición corta en t�ndem" o "STR", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a todas las secuencias con una longitud de entre dos y siete nucleótidos que est�n repetidas perfectamente,

o casi perfectamente en t�ndem en el ADN gen�mico de cualquier organismo. Véase, por ejemplo, la definición de "repetición corta en t�ndem" aplicada al ADN gen�mico humano en la pat. de EE.UU. N� 5.364.759, columna 4, línea 58 y sigs.

Los primeros marcadores de variantes del ADN identificados fueron sustituciones de bases simples, es decir, polimorfismos de secuencias simples, que se detectaban la mayor parte de las veces mediante ensayos de hibridación de Southern. Para ejemplos de referencias que describen la identificación de tales marcadores, diseñados para ser usados para analizar el ADN digerido con endonucleasas de restricción con sondas radioactivas, véase: Southern, E. M. (1975), J. Mol. Biol. 98(3):503-507; Schumm, et al. (1988), American Journal of Human Genetics 42:143-159; y Wyman, A. y White, R. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. 77:6754-6758.

La siguiente generación de marcadores fueron variantes de tamaño, es decir, polimorfismos de longitud, específicamente marcadores de "repeticiones en t�ndem de número variable" (VNTR) (Nakamura Y., et al. (1987), Science 235: 1616-1622; y Pat. de EE.UU. N� 4.963.663 expedida a White et al. (1990); Pat. de EE.UU. N� 5.411.859, continuación del documento 4.963.663 expedido a White et al. (1995)) y los marcadores de "minisat�lites" (Jeffreys et al. (1985a), Nature 314:67-73; Jeffreys et al. (1985b) Nature 316:76-79., Pat. de EE.UU. N� 5.175.082 para una invención de Jeffreys). Las VNTR y los marcadores de minisat�lites contienen regiones de secuencias casi idénticas repetidas en t�ndem. La secuencia de repetición central tiene una longitud de 10 a 70 bases, y las secuencias de repeticiones centrales más cortas se denominan repeticiones "minisat�lites" y las repeticiones más largas se denominan VNTRs. Los diferentes individuos de una población humana contienen números diferentes de estas repeticiones. Estos marcadores son más polim�rficos que los polimorfismos por sustitución de bases, y a veces exhiben hasta cuarenta o más alelos en un único locus genético. Sin embargo, el proceso tedioso de digestión con enzimas de restricción y el análisis de hibridación de Southern posterior todavía son necesarios para detectar y analizar la mayoría de tales marcadores.

El siguiente avance implicó la unión de la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Pat. de EE.UU. N� 4.683.202 de Mullis, K.B.) con los análisis de loci de VNTR (Kasai K, et al. (1990) Journal Forensic Science 35(5):1196-1200). Se descubrieron loci de VNTR amplificables, que se podrían detectar sin necesidad de la

transferencia de Southern. Los productos amplificados se separan por medio de geles de agarosa o poliacrilamida y se detectan mediante la incorporación de radiactividad durante la amplificación o mediante tinción posterior con plata

o bromuro de etidio. Sin embargo, la PCR se puede usar solamente para amplificar de manera fiable segmentos de ADN relativamente pequeños, es decir, para amplificar de manera fiable solamente segmentos de ADN con una longitud inferior a 3.000 bases, Ponce, M. y Micol, L. (1992) NAR 20(3):623; Decorte R, et al. (1990) DNA Cell Biol. 9(6):461-469). Por lo tanto, se han desarrollado muy pocas VNTRs amplificables, lo que las hace, como clase, poco prácticas para la cartografía de ligamiento.

Con el desarrollo reciente de marcadores polim�rficos con repeticiones polim�rficas de dinucle�tidos (Litt y Luty (1989) Am J. Hum Genet 3(4):599-605; Tautz, D (1989) NAR 17:6463-6471; Weber y May (1989) Am J Hum Genet 44:388-396; Pat. alemana N� DE 38 34 636 C2, inventor Tautz, D; Pat. de EE.UU. N� 5.582.979 presentada por Weber, L.) y con repeticiones cortas en t�ndem polim�rficas (STR) (Edwards, A., et al. (1991) Am. J. Hum. Genet.

49: 746-756.; Hammond, H.A., et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 55: 175-189; Fregeau, C.J.; y Fourney, R.M. (1993) BioTechniques 15(1): 100-119.; Schumm, J.W. et al. (1994) en The Fourth International Symposium on Human Identification 1993, p�gs. 177-187; y la Pat. de EE.UU. N� 5.364.759 de Caskey et al.; Pat. alemana N� DE 38 34 636 C2 de Tautz, D.) se han superado muchas de las deficiencias de los métodos previos. Los dos tipos de marcadores, los que contienen repeticiones de dinucle�tidos o STR (que por definición incluyen repeticiones de 2-7 pb), se denominan en general marcadores de "microsat�lites". A menudo considerados como los mejores marcadores disponibles, los loci de los microsat�lites son similares a las VNTRs amplificables, ya que sus alelos se pueden diferenciar basándose en la variación de la longitud. Sin embargo, a diferencia de las VNTRs, estos loci contienen secuencias de repeticiones perfectas o imperfectas de una longitud de dos, tres, cuatro, o raramente, cinco bases. Exhiben desde solamente unos cuantos alelos a más de cuarenta en un único locus. Se pueden diseñar protocolos de amplificación para producir productos pequeños, en general de una longitud de 60 a 400 pares de bases, y los alelos de cada locus a menudo est�n contenidos dentro de un intervalo de menos de 50 pb. Esto permite el análisis electrofor�tico simultáneo de varios sistemas en el mismo gel mediante el diseño cuidadoso de los cebadores de PCR de forma que todos los productos de la amplificación potencial a partir de un sistema individual no solapan con el intervalo de alelos de otros sistemas en el mismo gel.

Existen tres desventajas significativas relacionadas con el uso de los loci de microsat�lites. En primer lugar, a menudo se observa tras la amplificación la presencia de artefactos por tartamudeo, es decir, uno o más fragmentos secundarios además del fragmento principal que representa cada alelo. Esta deficiencia se manifiesta de manera mucho más grave con los loci de repeticiones de dinucle�tidos que con los marcadores de repeticiones de tri-o tetranucle�tidos (Edwards et al., 1991. Am J Hum Genet 49;746-756; Edwards et al., 1992. Genomics 12:241-253; Weber y May, 1989. Am J Hum Genet 44:388-396). La presencia de estos artefactos, que se supone que son el resultado de un fenómeno relacionado con las ADN polimerasas denominado deslizamiento (Levinson y Gutman, 1987. Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221; Schlotterer y Tautz, 1992. NAR 20:211-215), complica la interpretación del contenido al�lico de los loci. A la vez que complica todas las interpretaciones, la presencia de fragmentos principales y secundarios para representar cada alelo limita especialmente la utilidad de estos marcadores en el análisis forense que a menudo requiere la determinación de si hay presente más de una fuente de ADN en la muestra. Muchos de los marcadores descritos en este trabajo representan una clase nueva de marcadores que producen significativamente menos artefacto por tartamudeo que los marcadores conocidos.

Una segunda desventaja de los sistemas de marcadores de STR y microsat�lites actuales est� relacionada con la dificultad de separar múltiples loci en un único gel. Esto ocurre debido a que existe una comprensión espacial de los fragmentos de tamaños diferentes en las regiones superiores de los geles usados más habitualmente para la separación de los fragmentos de ADN por los expertos en la técnica. El desarrollo de los marcadores descritos en este trabajo, basados en unidades de repetición mayores, amplía el intervalo útil en estos geles, lo que permite el análisis simultáneo de más loci.

Una tercera desventaja es que, antes de la invención descrita en la presente memoria, se habían descrito solamente unos cuantos loci de ADN del ADN gen�mico humano en la bibliografía con los polimorfismos de longitud basados en variaciones de un número de cinco a siete repeticiones de bases en cada locus. Véase, p.ej., Edwards et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4791; Chen et al. (1993) Genomics 15(3): 621-5; Harada et al. (1994) Am. J. Hum. Genet. 55: 175-189; Comings et al. (1995), Genomics 29(2):390-6; y Utah Marker Development Group (1995), Am. J. Genet. 57:619-628. En 1995, Jurka y Pethiyagoda publicaron un artículo que describía un estudio en el que habían usado la base de datos GenBank para determinar la abundancia relativa y la variabilidad de repeticiones en t�ndem pentam�ricas y hexam�ricas en el genoma de primates (Jurka y Pethiyagoda (1995) J. Mol. Evol. 40:120-126). Sin embargo, la variabilidad se estim� solamente de manera indirecta, y no se demostraron los niveles de polimorfismo en loci individuales. Id. Se han desarrollado materiales y métodos para identificar y analizar loci de ADN que contienen repeticiones sumamente polim�rficas de cinco a siete bases.

El documento WO95/17522 describe un método para la identificación de ADN de un fragmento que comprende un locus de repeticiones simples en t�ndem que comprende las etapas de: i) poner en contacto una biblioteca de ADN con al menos una sonda de hibridación para identificar una población de fragmentos de ADN enriquecida en repeticiones simples en t�ndem; ii) aislar y clonar dicha población; y iii) cribar la biblioteca de ADN resultante para identificar un fragmento individual que comprende un locus de repeticiones simples en t�ndem. También se discuten las repeticiones simples en t�ndem aisladas mediante el método, caracterizadas porque se pueden amplificar al

menos en parte mediante PCR con el uso de un par de cebadores especificados, junto con cebadores de amplificación y sondas específicas para las repeticiones simples en t�ndem as� aisladas. También se discuten métodos de caracterización genética mediante el uso de las repeticiones simples en t�ndem, los cebadores y las sondas.

El documento US5364759 describe un ensayo de identificación de ADN para detectar polimorfismos en una repetición corta en t�ndem. El método incluye las etapas de extraer el ADN a partir de una muestra a ensayar, amplificar el ADN extraído e identificar los productos de extensión amplificados para cada secuencia diferente. Cada secuencia diferente se marca de manera diferencial. En el método, también se pueden usar patrones internos y externos. El método es aplicable a una amplia diversidad de muestras forenses y m�dicas, que incluyen sangre, semen, muestras vaginales, tejido, pelo, saliva, orina y mezclas de fluidos corporales.

Comings et al. 1995, Genomics, vol. 29, páginas 390-396 describe la secuenciaci�n de las regiones reguladoras, intr�nicas, y ex�nicas del gen TDO2 humano que se han secuenciado. Se identificaron doce exones. La secuencia de amino�cidos de la enzima fue un 88% homóloga a la de rata.

Bacher et al. 1998, Human identification symposium proceedings: The ninth international symposium on human identification, 8-10 de octubre de 1998, páginas 24-37, describe repeticiones de pentanucle�tidos como marcadores genéticos sumamente polim�rficos que exhiben un artefacto por tartamudeo mínimo.

El documento WO00/31306 describe métodos y materiales para el uso en la amplificación simultánea de al menos trece loci de ADN gen�mico en una única reacción multiplex, junto con métodos y materiales para el uso en el análisis de los productos de tales reacciones.

El documento WO97/30139 describe la amplificación simultánea de múltiples loci genéticos diferentes mediante el uso de PCR u otros sistemas de amplificación para determinar en una reacción multiplex los alelos de cada uno de los loci contenidos en la reacción multiplex. Los loci genéticos analizados comprenden los siguientes: HUMvWFA31, HUMLIPOL, HUMBFXIII, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMTHOI, HUMTPOX, HUMCSFIPO, D22S683, D20S481, DI9S253, D17SI299, DI7SI298, DI6S753, D16S539, D16S490, D14S562, I4S548, DI4S118, D13S317, DIOS1239, D9S930, D7S820, D5S818, D4S2368, D3S1539.

Mohan et al. 1992, Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, Vol. 9(6), páginas 1195-1211 describe cálculos de mecánica molecular llevados a cabo en todas las etapas de diez pares de bases (d�meros de moléculas bicatenarias) y también varias moléculas bicatenarias trim�ricas y tetram�ricas que los comprenden, en un intento de examinar sistemáticamente los posibles efectos de las secuencias de bases en las magnitudes de los giros de las hélices de los pares de bases en una etapa dada.

Los materiales y métodos del presente método est�n diseñados para el uso en la identificación y el análisis de loci polim�rficos particulares de ADN de diversos tipos, que incluyen el ADN monocatenario y bicatenario de una diversidad de fuentes diferentes. La presente invención representa una mejora significativa sobre la tecnología existente, que proporciona una potencia y precisión incrementadas a la identificación de ADN para el análisis de ligamiento, la justicia penal, las pruebas de paternidad, y otros usos forenses y m�dicos.

Sumario breve de la descripción

Por lo tanto, un objetivo es proporcionar materiales y métodos para la identificación y el análisis de loci de ADN con secuencias de repeticiones intermedias en t�ndem, en el que una "secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem" es una región de ADN que contiene al menos una unidad de repetición que consiste en una secuencia de cinco (5), seis (6), o siete (7) bases repetidas en t�ndem al menos dos (2) veces.

Otro objetivo es proporcionar materiales y métodos para identificar marcadores de ADN de repeticiones intermedias en t�ndem, que producen menos artefactos cuando se usan para analizar o detectar uno o más loci de una muestra de ADN que contiene una repetición intermedia en t�ndem. Los métodos y materiales descritos en la presente memoria se usan preferiblemente para identificar y analizar loci de ADN gen�mico, cada uno de los cuales contiene una secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem polim�rficas. Los materiales incluyen cebadores oligonucleot�dicos y marcadores de ADN para tales loci de ADN gen�mico humano. Los loci de repeticiones intermedias en t�ndem detectados mediante el uso de los métodos de la presente invención exhiben menos artefactos que los que exhiben muchos loci conocidos detectados mediante el uso de métodos similares, que incluyen las STRs cortas (es decir, repeticiones en t�ndem de una secuencia de ADN de dos, tres o cuatro bases).

Un objetivo particular es proporcionar un método y materiales para el análisis de loci genéticos polim�rficos individuales basado principalmente en la variación de la longitud debida principalmente a diferencias en el número de unidades de repetición del ácido nucleico en una región de repeticiones intermedias en t�ndem del ácido nucleico. También es un objetivo específico proporcionar un método, un equipo, y cebadores para la detección y el análisis de loci polim�rficos de ADN gen�mico, que contienen polimorfismos de repeticiones intermedias en t�ndem, que incluyen los polimorfismos de repeticiones en t�ndem de pentanucle�tidos.

Una realización consiste en un método para aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia de repeticiones

intermedias en t�ndem a partir de ADN gen�mico, que comprende: (a) proporcionar una diversidad de fragmentos de ADN en los que al menos un fragmento contiene una secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem; (b) proporcionar un medio de soporte, p.ej. un medio de soporte estacionario, que tiene asociado a él al menos un oligonucle�tido que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de la secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem; y (c) combinar la diversidad de fragmentos de ADN con el medio de soporte en condiciones en las que el fragmento de ADN que contiene la secuencia de repeticiones intermedias y al menos otro fragmento de ADN se hibrida con el medio de soporte.

Una realización alternativa es un método para detectar una secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem polim�rficas que tiene una baja incidencia de artefactos por tartamudeo en el ADN gen�mico, que comprende: (a) proporcionar una muestra de ADN que tiene al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem, y (b) detectar la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem en la muestra de ADN, en la que se observa un artefacto por tartamudeo medio como máximo de un 1,1 %.

Una realización adicional es un método para detectar una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem en una muestra de ADN mediante el uso de al menos un cebador oligonucleot�dico para amplificar una secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem de interés (más adelante en la presente memoria, la "secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem") en el ADN de la muestra, en el que el cebador oligonucleot�dico comprende una secuencia que es complementaria y que flanquea a una región de un marcador de ADN que contiene una secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem (más adelante en la presente memoria, la "secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem") en la secuencia del marcador de ADN, en la que el marcador de ADN tiene una secuencia seleccionada del grupo de secuencias que consiste en SEQ ID N�s: 1 a 43.

En otra realización, se describe un equipo para la detección de al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem en una muestra de ADN, y el equipo comprende un recipiente que tiene al menos un cebador oligonucleot�dico para amplificar la al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem, en el que el cebador oligonucleot�dico comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria y que flanquea a una porción de una región de un marcador de ADN bicatenario que contiene una secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem, en el que el marcador de ADN tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N�s: 1 a 43.

En otra realización, se describe un cebador oligonucleot�dico que comprende una secuencia complementaria a una cadena de un marcador de ADN bicatenario en una región del marcador que flanquea a una secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem, en el que el marcador de ADN tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID N�s: 1 a 6, y SEQ ID N�s: 28 a 33.

Cada una de las diversas realizaciones tienen un uso específico en los campos de la identificación de seres humanos y otros organismos, el análisis forense, la determinación de la paternidad, la monitorización del trasplante de médula ósea, la cartografía de ligamientos, y la detección de enfermedades genéticas y del cáncer. La necesidad de distinguir con exactitud entre cantidades pequeñas de tejido de diferentes individuos es especialmente importante en las aplicaciones forenses, en las que muchas condenas (y exculpaciones) dependen del análisis de identificación de ADN, lo que incluye los análisis de los loci de STR.

Los objetivos, características, y ventajas adicionales ser�n evidentes a partir del siguiente mejor modo y de los dibujos ilustrativos.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama de flujo de un método de enriquecimiento de repeticiones intermedias en t�ndem mediante hibridación en filtro.

La FIG. 2 es un electroferograma de una repetición de pentanucle�tidos S159.

La FIG. 3 es un electroferograma de una repetición de tetranucle�tidos vWA.

La FIG. 4 es un electroferograma de una repetición de pentanucle�tidos G210.

La FIG. 5 es un electroferograma de una repetición de tetranucle�tidos D5S818.

La FIG. 6 es un diagrama de dispersi�n del % de tartamudeo de la repetición de pentanucle�tidos S159.

La FIG. 7 es un diagrama de dispersi�n del % de tartamudeo de la repetición de pentanucle�tidos G210.

La FIG. 8 es un diagrama de dispersi�n del % de tartamudeo de la repetición de tetranucle�tidos D5S818.

La FIG. 9 es un diagrama de dispersi�n del % de tartamudeo de la repetición de tetranucle�tidos vWA.

La FIG. 10 es una imagen imprimida por láser de los resultados del barrido mediante Fluorimager de fragmentos amplificados marcados con fluorescencia de una repetición de pentanucle�tidos S159, tras la separación mediante

electroforesis en gel.

La FIG. 11 es una imagen imprimida por láser de los resultados del barrido mediante Fluorimager de fragmentos amplificados marcados con fluorescencia de una repetición de pentanucle�tidos G210, tras la separación mediante electroforesis en gel.

Los dibujos y las figuras no est�n necesariamente a escala, y ciertas características pueden estar exageradas en la escala o se pueden mostrar de forma esquemática por motivos de claridad y concisión.

Descripci�n detallada

A. Definiciones:

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "repetición intermedia en t�ndem" o "ITR" se refiere a una región de una secuencia de ADN que comprende una secuencia de cinco a siete bases repetida en t�ndem al menos dos veces. El término ITR abarca también una región de ADN en la que est� repetida más de una única secuencia de cinco a siete bases en t�ndem o con bases interpuestas, con tal de que al menos una de las secuencias est� repetida al menos dos veces en t�ndem. Cada secuencia repetida al menos una vez dentro de una ITR se denomina en la presente memoria una "unidad de repetición".

Un "polimorfismo de ITR" se refiere a una ITR en el ADN gen�mico que varía de longitud de un cromosoma a otro en una población de individuos, debido principalmente a diferencias en el número de unidades de repetición en la misma región de cada cromosoma.

Las secuencias de repeticiones intermedias en t�ndem identificadas y analizadas se pueden dividir en dos categorías generales, perfectas e imperfectas. La expresión ITR "perfecta", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una región de ADN bicatenario que contiene una única unidad de repetición de cinco a siete bases repetida en t�ndem al menos dos veces, p.ej. (AAAAT)12. La expresión ITR "imperfecta", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una región de ADN que contiene al menos dos repeticiones en t�ndem de una unidad de repetición perfecta y al menos una repetición de una unidad de repetición imperfecta, en la que la unidad de repetición imperfecta consiste en una secuencia de ADN que podría dar como resultado una, dos, o tres inserciones, deleciones, o sustituciones de bases en la secuencia de la unidad de repetición perfecta, p.ej. (AAAAT)12(AAAAAT)5AAT(AAATT)4. Cada secuencia de ITR imperfecta contiene al menos una secuencia de ITR perfecta. De manera específica, cada secuencia de ITR, ya sea perfecta o imperfecta, incluye al menos una secuencia de unidad de repetición que aparece al menos dos veces en t�ndem, una secuencia de unidad de repetición que se puede representar mediante la fórmula (I):

(AwGxTYCz)n (I)

en la que A, G, T, y C representan los nucleótidos que pueden estar en cualquier orden; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido en la secuencia, y oscilan de 0 a 7 y la suma de w + x + y + z oscila entre 5 y 7; y n representa el número de veces que la secuencia est� repetida en t�ndem, y es al menos 2.

"Repetición en t�ndem de pentanucle�tidos" se refiere a una subclase de los polimorfismos de "repeticiones intermedias en t�ndem" definidas anteriormente. A menos que se especifique de otra manera, la expresión "repetición en t�ndem de pentanucle�tidos" abarca ITRs perfectas en las que la unidad de repetición es una secuencia de cinco bases, e ITRs imperfectas en las que al menos una unidad de repetición es una repetición de cinco bases.

"Marcador de ADN" se refiere a un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ITR tal como un fragmento de ADN que contiene una secuencia de ITR producida mediante la amplificación de una región de ADN gen�mico. Cada marcador individual contiene un único alelo de ADN gen�mico derivado en última instancia de un único individuo de una población.

El término "locus" se refiere a una región específica del ADN. Cuando se usa para describir una región del ADN gen�mico, "locus" se refiere a una posición particular en un cromosoma. El mismo locus gen�mico aparece en sitios idénticos en cada par de cromosomas homólogos para cualquier individuo de una población. La secuencia de ADN en el mismo locus en dicho cromosoma, o en el mismo locus de ADN que se origina de dicho cromosoma, se denomina "alelo".

El término "polimorfismo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a las variaciones de los alelos en un locus observado en al menos dos cromosomas hallados en el ADN gen�mico de una población de organismos individuales de la misma especie. El término "polimorfismo" incluye las variaciones de la secuencia de ADN obtenidas del mismo locus de fragmentos de cromosomas clonados en otros vehículos, tales como vectores de ADN

o el ADN cromos�mico de otro organismo.

Tal como se usa en la presente memoria, "secuencia flanqueante de ITR" se refiere a la secuencia nucleot�dica adyacente a una ITR en una cadena de la secuencia de ADN que contiene una ITR. Las secuencias que incluyen la

secuencia flanqueante de ITR como parte de su secuencia completa son ellas mismas secuencias flanqueantes.

La expresión "cebador oligonucleot�dico", tal como se usa en la presente memoria, define una molécula compuesta de más de tres desoxirribonucle�tidos o ribonucle�tidos. Aunque cada secuencia cebadora no necesita reflejar la secuencia exacta del molde, cuanto mejor refleje la secuencia la complementariedad hacia un molde, mejor ser� la unión al molde. Su longitud y secuencia exactas dependerán de muchos factores relacionados con la función principal y el uso del cebador oligonucleot�dico, que incluye la temperatura, la secuencia del cebador, y el uso del método. Cada cebador oligonucleot�dico descrito en la presente memoria comprende una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a la secuencia de un marcador de ADN que flanquea a una secuencia de ITR. Los cebadores oligonucleot�dicos son capaces de actuar como punto de inicio para la síntesis cuando se colocan en condiciones que inducen la síntesis de un producto de extensión de los cebadores complementario a una cadena de ácido nucleico. Las condiciones pueden incluir la presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como una ADN polimerasa a una temperatura y pH adecuados. En la realización preferida, el cebador es un oligodesoxirribonucle�tido monocatenario de longitud suficiente para actuar como cebador en la síntesis de un producto de extensión de una secuencia específica en presencia de un agente inductor. La sensibilidad y especificidad de los cebadores oligonucleot�dicos est�n determinadas por la longitud del cebador y la singularidad de la secuencia dentro de una muestra dada de ADN molde. Los cebadores oligonucleot�dicos tienen normalmente una longitud de alrededor de más de 15 bases, y preferiblemente alrededor de 20 a 40 bases.

La expresión "par de cebadores oligonucleot�dicos" se refiere a un par de cebadores, y cada uno comprende una secuencia de bases desoxirribonucleot�dicas o ribonucleot�dicas complementaria a las cadenas opuestas del ADN bicatenario que flanquean a la misma ITR. Cada par de cebadores oligonucleot�dicos se selecciona preferiblemente para detectar una única ITR. Aunque cada secuencia cebadora no necesita reflejar la secuencia exacta del molde, cuanto mejor refleje la secuencia la complementariedad hacia un molde, mejor ser� la unión al molde.

La expresión "producto de extensión" se refiere a la secuencia nucleot�dica que se sintetiza desde el extremo 3' del cebador oligonucleot�dico y que es complementaria a la cadena a la que est� unido el oligonucle�tido.

La expresión "sonda oligonucleot�dica", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula monocatenaria de ADN o ARN que comprende una secuencia que es complementaria a una porción de una secuencia objetivo, tal como la secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem de una muestra de ADN, en la que la porción de complementariedad es de una longitud suficiente para permitir que la sonda se hibride a la secuencia objetivo.

La expresión "artefacto por tartamudeo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un tipo particular de artefacto observado al detectar una o más moléculas de ADN objetivo, en las que el ADN objetivo contiene repeticiones en t�ndem de la misma secuencia de unidad de repetición, lo que incluye las secuencias objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem detectadas y analizadas. Cuando se detecta una muestra que contiene dicho ADN objetivo tras la separación de todo el ADN de la muestra por la longitud, p.ej. mediante el uso de electroforesis en gel, cada molécula de ADN objetivo produce una señal principal (p.ej. una banda principal en un gel); pero se puede detectar una señal secundaria próxima a cada señal principal. La señal secundaria se produce en general por la detección de fragmentos de ADN que difieren en su longitud del ADN objetivo debido a la adición o deleci�n de una o más unidades de repetición de la secuencia de ADN objetivo. Los artefactos por tartamudeo se han atribuido a un emparejamiento incorrecto de cadenas por deslizamiento durante la replicaci�n del ADN, tanto in vivo como in vitro. Véase, p.ej., Levinson y Gutman (1987), Mol. Biol. Evol, 4(3):203-221; y Schl�tterer y Tautz (1992), Nucleic Acids Research 20(2):211-215. Tales artefactos son especialmente evidentes cuando se amplifica ADN que contiene cualquiera de tales secuencias de repetición in vitro, mediante el uso de un método de amplificación tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ya que cualquier fragmento secundario presente en una muestra o producido durante la polimerizaci�n se amplifica junto con los fragmentos principales.

La expresión "% de artefacto por tartamudeo", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una comparación de la amplitud de una señal secundaria (es decir, artefacto) respecto de la amplitud de una señal principal (es decir, del objetivo) observadas en una muestra de ADN obtenida de una única fuente, tal como una única colonia de bacterias o un único cromosoma de ADN gen�mico. El % de artefacto por tartamudeo se puede determinar en un ADN que no se ha amplificado; pero preferiblemente se determina tras la amplificación de al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem. La expresión "% medio de artefacto por tartamudeo" se refiere a una media del % de artefactos por tartamudeo obtenida a partir de las medidas de % de artefacto por tartamudeo detectadas a partir de una muestra representativa de al menos veinte alelos en una población.

La expresión "ADN gen�mico", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier ADN derivado en última instancia del ADN de un genoma. La expresión incluye, por ejemplo, el ADN clonado en un organismo heter�logo, el ADN gen�mico completo, y el ADN gen�mico parcial (p.ej., el ADN de un único cromosoma aislado).

El ADN detectado o aislado puede ser monocatenario o bicatenario. Por ejemplo, se puede obtener ADN monocatenario adecuado para el uso a partir de bacteri�fagos, bacterias, o fragmentos de ADN gen�mico. Se puede obtener ADN bicatenario adecuado para el uso a partir de cualquiera de varias fuentes diferentes que contienen ADN con secuencias de repeticiones intermedias en t�ndem, lo que incluye bibliotecas de fagos, bibliotecas de

c�smidos, y ADN gen�mico o plasm�dico bacteriano, y ADN aislado de cualquier organismo eucari�tico, lo que incluye el ADN gen�mico humano. El ADN se obtiene preferiblemente del ADN gen�mico humano. Se puede usar cualquiera de varias fuentes diferentes de ADN gen�mico humano, que incluyen muestras m�dicas o forenses, tales como sangre, semen, muestras vaginales, tejido, pelo, saliva, orina, y mezclas de fluidos corporales. Tales muestras pueden ser recientes, antiguas, secas, y/o parcialmente degradadas. Las muestras se pueden recoger de pruebas en el escenario de un crimen.

B. Método de Aislamiento de Marcadores de ADN Polim�rficos que Contienen una ITR:

Una realización es un método para aislar un fragmento de ADN que contiene una ITR, mediante el uso de la selección por hibridación. El método comprende las etapas de: (a) proporcionar una diversidad de fragmentos de ADN, en los que al menos un fragmento de ADN contiene una ITR; (b) proporcionar un medio de soporte que tiene al menos un oligonucle�tido asociado con él, en el que el oligonucle�tido incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de la secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem; y (c) combinar la diversidad de fragmentos de ADN con el medio de soporte en condiciones en las que los fragmentos de ADN, que incluyen cualquier fragmento de ADN que contiene la secuencia de ITR, se hibridan al medio de soporte.

La diversidad de fragmentos de ADN proporcionados en la etapa (a) del método se puede obtener mediante fragmentación de cualquier muestra de ADN que contenga una ITR, pero se obtienen preferiblemente mediante fragmentación del ADN gen�mico. Véase, p.ej. Current Protocols in Human Genetics (1994), capítulo 2: Development of Genetic Markers, Construction of Small-Insert Libraries from ADN gen�mico, pág. 2.2.1 y sigs., que se incorpora en la presente memoria como referencia. El método más preferido para preparar una diversidad de fragmentos de ADN para el uso en la etapa (a) es según las etapas que comprenden: fragmentar una muestra de ADN, por lo que se produce una población de fragmentos de ADN en la que al menos un fragmento de ADN contiene la ITR; unir un ligante que contiene una secuencia de cebado a al menos un extremo de cada fragmento de ADN en la población de fragmentos de ADN; y amplificar cada fragmento unido al ligante mediante el uso de un cebador oligonucleot�dico que comprende una secuencia que es complementaria a la secuencia de cebado. Se puede unir un ligante diferente a cada extremo de cada fragmento. Sin embargo, se une preferiblemente un único ligante a cada extremo para permitir la amplificación mediante el uso de un único cebador oligonucleot�dico que tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia de cebado del ligante. La unión del ligante se lleva a cabo preferiblemente en presencia de una enzima ligasa, tal como la ADN ligasa de T4.

Se puede usar cualquiera de varios medios diferentes para producir la diversidad de fragmentos de ADN proporcionados en la etapa (a) del método, que incluyen sonicaci�n o fragmentación con al menos una enzima de restricción, aunque solamente el ADN bicatenario se puede fragmentar con una enzima de restricción. Cuando se usa una enzima de restricción para fragmentar una muestra de ADN bicatenario, preferiblemente es una enzima de restricción con una secuencia de reconocimiento de cuatro pares de bases, que deja salientes monocatenarios, y que no corta la muestra de ADN dentro de la región de ITR de interés. Las enzimas de restricción preferidas para el uso en la fragmentación de una muestra de ADN bicatenario incluyen Mbo I, Aci I, Bfa I, Dpn II, Hha I, Hin P1I, Hpa II, Mse I, Msp I, Nla III, Sau 3Al, Taq I, Csp 6I, y Tai I.

Los fragmentos de ADN unidos a un ligante producidos como se describió anteriormente se amplifican posteriormente, mediante el uso de una reacción de amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa, (Pat. de EE.UU. N� 4.683.202 de Mullis, K.B), amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) (Kievits et al. (1991) J Virol Methods 35(3):273-286), amplificación mediada por ligadura (Volloch et al. (1994) Nucleic Acids Res 22(13):2507-2511), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) (Walker et al. (1992) PNAC 89(1):392-396), amplificación con un único cebador independiente de la secuencia (SISPA) (Reyes (1991) Mol Cell Probes 5(6):473-481), o reacción en cadena de la ligasa (Pat. de EE.UU. N� 5.686.272 expedida a Marshall et al.).

El medio de soporte proporcionado en la etapa (b) del presente método comprende un soporte estacionario con al menos un oligonucle�tido objetivo asociado a él. El soporte estacionario comprende preferiblemente un material capaz de acoplarse con el oligonucle�tido directamente o indirectamente. El material adecuado capaz de acoplarse directamente con el oligonucle�tido incluye nitrocelulosa, nailon, vidrio, sílice, y l�tex. Los ejemplos de soportes estacionarios adecuados para el uso en esta realización preferida del presente método incluyen una membrana de nailon, un filtro incrustado con partículas de sílice, esferas de vidrio, partículas magnéticas de sílice, o una resina que contiene sílice. El material adecuado capaz de acoplarse indirectamente al oligonucle�tido por medio de un primer agente de acoplamiento unido al oligonucle�tido y un segundo agente de acoplamiento unido a la superficie del soporte estacionario incluye avidina y estreptavidina, o un ant�geno y anticuerpo hacia él.

El al menos un oligonucle�tido objetivo asociado con el soporte estacionario incluye una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una porción de la secuencia de repeticiones intermedias en t�ndem del fragmento de ADN. El término "porción", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de nucleótidos dentro de la región de ITR del fragmento de ADN de longitud suficiente para que un oligonucle�tido que tenga una secuencia complementaria a la secuencia se hibride con ella cuando se ponga en contacto con ella. La "porción" es preferiblemente una secuencia de una longitud de al menos 20 bases, y más preferiblemente una secuencia de al menos 40 bases. El oligonucle�tido objetivo tiene más preferiblemente una secuencia caracterizada por la fórmula

(AwGxTyCz)n, en la que A, G, T, y C representan los nucleótidos que pueden estar en cualquier orden; w, x, y y z representan el número de cada nucleótido en la secuencia, y oscilan de 0 a 7 y la suma de w + x + y + z oscila entre 5 y 7; y n representa el número de veces que la secuencia est� repetida en t�ndem, y es al menos alrededor de 4 veces, más preferiblemente al menos alrededor de 8 veces, y lo más preferiblemente al menos alrededor de 15 veces.

En la etapa (c) del método, la diversidad de fragmentos de ADN se combina con el medio de soporte en condiciones en las que el fragmento de ADN que contiene la ITR se hibrida al medio de soporte. Cuando la diversidad de fragmentos es una diversidad de fragmentos de ADN bicatenario, el ADN se desnaturaliza antes de la hibridación al medio de soporte. Los medios adecuados para desnaturalizar los fragmentos de ADN bicatenarios antes de la hibridación al medio de soporte incluyen la exposición del ADN a una temperatura que es lo suficientemente elevada como para desnaturalizar el ADN bicatenario, o la suspensión del ADN en una disolución desnaturalizante. El ADN se desnaturaliza preferiblemente mediante el uso de una disolución desnaturalizante que contiene un agente desnaturalizante, tal como una base (p.ej., hidróxido sádico o hidróxido pot�sico). Cuando se usa una base para desnaturalizar los fragmentos de ADN, el pH de la mezcla resultante se ajusta preferiblemente a alrededor de un pH neutro, preferiblemente mediante la adición de un tampón a un pH de alrededor de 4,8 a la mezcla.

Una vez que los fragmentos de ADN se han hibridado al medio de soporte, el medio de soporte se lava preferiblemente para eliminar los fragmentos de ADN y cualquier otro material presente en cualquier disolución en la que est� contenido el medio de soporte o sobre la superficie del medio de soporte que no se hayan hibridado a él. Cualquier disolución de lavado usada est� configurada preferiblemente para eliminar tales materiales sin liberar los fragmentos de ADN hibridados al medio de soporte.

Los fragmentos de ADN hibridados al medio de soporte se pueden liberar del medio de soporte mediante el uso de calor o una disolución de liberación adecuada, dependiendo de la naturaleza de la asociación entre el medio de soporte y los fragmentos de ADN. Por ejemplo, se puede usar agua o una disolución acuosa de salinidad baja tal como un tampón TE (p.ej. Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM) para liberar los fragmentos de ADN hibridados a un medio de soporte que consta de un material de sílice. Una vez liberados del medio de soporte, los fragmentos de ADN se pueden procesar para aislar adicionalmente el ADN que contiene la secuencia de ITR de otros fragmentos de ADN presentes en la mezcla resultante de los fragmentos de ADN liberados. Las etapas de procesamiento adicionales podrían incluir la rehibridaci�n y el cribado según el método descrito anteriormente, o la clonaci�n en un vector de ADN y el cribado de los transformantes de los clones.

La Figura 1 ilustra una realización preferida del método de aislamiento de un fragmento de ADN que contiene una ITR, en el que se prepara una población de fragmentos de ADN, se hibrida a un medio de soporte, se amplifica, se clona, y se criba en busca de los transformantes que contienen la ITR. Cada una de las etapas ilustradas en la Figura 1 est� indicada con un número romano. La Etapa I muestra una molécula de ADN bicatenario (1) que se digiere con una enzima de restricción (2), lo que produce una población de fragmentos de ADN (no mostrados) que varían en tamaño, al menos uno de los cuales incluye la ITR objetivo. La flecha entre las Etapas I y II ilustran un ligante (3) que se añade a la población de fragmentos de ADN para producir una población de fragmentos (8) unidos al ligante con un ligante (3) en el extremo de cada una de dos clases diferentes de fragmentos de ADN, fragmentos con la secuencia objetivo de ITR (6) y fragmentos sin la secuencia objetivo (4). Se añade un cebador oligonucleot�dico (7) que tiene una secuencia complementaria a una secuencia de cebado de cada ligante (3) a la población de fragmentos de ADN (8) en la Etapa III, y la población se amplifica por medio de una reacción de PCR, por lo que se produce una población de fragmentos de ADN amplificados (9). En la Etapa IV, la población de fragmentos de ADN amplificados (9) se coloca en un recipiente (15) con una disolución de hibridación (12) y un filtro

(10): con al menos un oligonucle�tido que tiene una secuencia complementaria a una porción de la secuencia objetivo de ITR asociada a él. La disolución de hibridación favorece la hibridación de los fragmentos de ADN que contienen la secuencia de ITR al filtro. En la Etapa V, el filtro (10) se extrae del recipiente (15), y se liberan los fragmentos de ADN hibridados en él. La población enriquecida resultante de fragmentos liberados se re-amplifica en la Etapa VI, mediante el uso del mismo cebador oligonucleot�dico (7) usado en la reacción de amplificación de la Etapa III. Finalmente, cada fragmento de la población amplificada enriquecida en fragmentos de ADN se clona en un vector plasm�dico (18) en la Etapa VII. Los vectores se muestran en la Etapa VII clonados con fragmentos con la secuencia objetivo de ITR (6) y clonados con fragmentos sin la secuencia de ITR (4).

C.: M�todo para Detectar una ITR Polim�rfica que Tiene un Tartamudeo Bajo:

Se observa un artefacto por tartamudeo mínimo cuando se detecta una secuencia objetivo de ITR de una muestra de ADN que tiene tal secuencia según esta realización particular del método. El artefacto por tartamudeo medio observado es preferiblemente como máximo un 1,1%, más preferiblemente como máximo un 0,9%. La secuencia objetivo de ITR puede ser una secuencia de ITR perfecta o una ITR imperfecta. La muestra de ADN detectada es preferiblemente ADN gen�mico.

El artefacto por tartamudeo medio se observa preferiblemente tras la amplificación de la secuencia de ITR en la muestra de ADN.

D. Cebadores, Sondas, y Marcadores

La presente descripción describe los marcadores de ADN identificados en la Lista de Secuencias más adelante como SEQ ID N�s: 1-43, cebadores en los que cada cebador tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia que flanquea a una región de ITR de uno de los marcadores de ADN identificados mediante una de esas 43 secuencias, y sondas que tienen una secuencia que es complementaria a una secuencia contenida dentro de la región de ITR de uno de los 43 marcadores. Los cebadores preferidos específicos identificados en los experimentos ilustrados en los Ejemplos se enumeran a continuación en la Tabla 1.

TABLA 1

Marcador, SEQ ID N�: Número de Clon Cebadores, SEQ ID N� Cebador Superior y Cebador Inferior

1: C074 44 TGGCTCAGACACCTCATTG

45: CACCACTGTATTCCCAGTTTG

2: C221 46 CACTTGCCATCCCTGCCACACA

47: AGCGCACCCCCAATTTCCGGTAT

C221: 48 TGGGGACATGAACACACTTTGC

49: GAGGCCCAGGACCAGATGAAAT

C221: 50 CACCTGTCAGGCAAGGCTTAAAC

51: CAACACTGAGCGCTTTTAGGGACT

C221: 52 TCAGGCAAGGCTTAAACAGGGATA

53: ACACTGAGCGCTTCTAGGGACTTC

C221: 52 TCAGGCAAGGCTTAAACAGGGATA

54: TGAGCGCTTCTAGGGACTTCTTCA

C221: 55 CCCTGCCCTACCCACTTG

56: AGGCCCAGGACCAGATGA

C221: 57 GCACCTGTCAGGCAAGGCTTAAAC

58: CCAGCCATGAAGTGGCTGTGAG

3: C240 59 CCCGCTTCAAAGTTCCCAGTTC

60: CCTCCCATTTCAGCCTCCTGA

4: C331 61 GTCTGCCACAGTGCTGGAAACTAA

62: GCACCCCAGCCTAAGGCAATA

5: C362 63 GCATGGCGGAAGAAACAA

64: TGGCAACAGAGCGAGACTC

6: C390 65 CCTGGGTGACAGCGAGAATCT

66: TGTCCCTTGCCTTGTCTCACTAAA

7: G022 67 CAGCCTTGGTGACAGAGCAAA

68: TGTGTTGAGGGTGGGGTACAT

8: G023 69 CCTGGGCAAGAGAGCAAG

70: CACATCCCAAAACCACCCTAC

9: G025 71 GCATTTCCCCTGCTTGTACT

72: GATCACATTTGCTAACCACTTCTC

10: G047 73 GGCAACATATCAAGACCCCCATCTCT

74: GAAGCTGCCCCTCACCACTACATTTT

11: G065 75 GATCACATTTGCTAACCACTTCTC

76: TATAAATTACCCAGTCTCAGGAAG

12: G085 77 GTGATACAGCAAGCCTCATC

78: AGAGACTCCTGGAAAGATAAAAGT

13: G132 79 GTCTGGAGAACAGTGGCCCTTGT

80: CAGGAAGCTGAGGCAGGAGAATCT

14: G145 81 AAGGCTCCAGTGGGGTAT

82: AAAACAAGGCAGTAGTCAATAAAG

15: G152 83 GGCATGAGAATCGCTTGAACCTG

84: GGCCTCCATGATGTTTCCAATGAT

16: G153 85 TCAGGAGGCATGAGAATCGCTTGA

86: GGCCTCCATGATGTTTCCCAATGA

17: G158 87 CTCGCCCTCTCCTATAAGCAGTTT

88: GCAGAGATAATTTGGAGTGGGATG

18: G181 89 CTTGGGTGCCTGTAATCC

90: GGTAGAGCTCCCCCATCT

19: G210 91 GCAGAATATTGGGGCTCATCAC

92: AAACAAGGAAAGGAGAGGAGAGGA

G210: 93 AAGGTTGTGGGATGACTACTACA

94: TGGTCAACACAGCAAGACATT

20: G212 95 TCCTGCCACCTGCTTGCTTTCT

96: ATTGCACTCCAGCCTGGGTGATAC

21: G233 97 CGCTTGAGCCTTGGAGATTG

98: GAGCAGTCAGAATTCAGGAGTTGT

22: G234 99 TGGGCAACAAGAGCAAAACTCCAT

100: GGGACTTGGGCTGAGGGCTTTAC

23: G235 101 ATATCAATATCAGGCAGCCACAGG

102: CCGTTTCAGAGCAGAGGTTTAGC

24: G331 103 TCTCATTGGTTTCAAAGAACTTA

104: AGACTCCATCTCAAACAAAAGA

25: G405 105 TCATGTGCATGGAGCCTGGTTCAT

106: CCCAGCCTTGGCAAGAGTGAGGT

26: G475 107 GGCGACTGAGCAAGACTC

108: TTAAGCAAAGTAGCCTCAAACA

G475: 109 GGGCGACTGAGCAAGACTC

110: ACTCATTACCTTGCATGCATGATA

G475: 107 GGCGACTGAGCAAGACTC

111: CATTACCTTGCATGCATGATA

27: G539 112 TGGGCAACAGAGTAAGACTCA

113: GTTCAGTACCGTTCACCTCTTTA

G539: 114 GTAAGACTCAGTCTCCAAAAAAAAAAAAAG

115: AGGAATGGTTTCTCTGTTAGTAAATGGT

28: S023 116 CAGCCTGGGCAACAAGAATGAAAC

117: TGGCCCCTGCAGCGGAGTC

29: S071 118 GAATTCATTTGCGGAAAGATT

119: CTAGGGAGGCTGGAGTATTCA

30: S085 120 AGAGCAAGACCCCGTCTCAT

121: AGTCCATGGGCCTTTTAACA

31: S125 122 GAGAATCACTTGAACCCAGGAAG

123: AGAACCAGCTGTTAGTTTCGTTGA

32: S132 124 GGTTGCAGTGAGCCGAGATAAGAGT

125: TGTGCCAGGAACCAGAAATTTACAG

33: S136 126 GGCCCAAGGTTACTTTTCAC

127: GGGCCACTGCACTCCT

34: S159 128 CATGGTGAGGCTGAAGTAGGAT

129: GTGGCGTGTCTTTTTACTTTCTTTA

35: S176 130 AGGCAGCCCAGGAACAAT

131: CCAAGATAGCGGCCAAGATAGT

36: S189 132 GAGGGCAGCTGGGATGTTACTCTT

133: TGCCCTGTTTGGAGAACTGTAGGT

37: S199 134 CTCCCCAGAAACAGATGTA

135: GTGAGCCGAGATTGTATCAT

38: S040 136 TCGGGGACAGGGCTTACTC

137: ATCATTGTCGCTGCTACTTTATCG

39: S066 138 CTACTCTACCCCATTTCATTC

139: GTAGAGTGGAGTGGATGAGA

40: S077 140 ATCAGGCAAAAACGAACAAAC

141: CGGCATCCCAAAGTGAC

41: S097 142 CAGAGAGGGCAGCACCTTGGACAG

143: GGCTTCACCTGCTCCCGTTTCAG

42: S103 144 TCTGCCCATTCCCCAGCCTCTC

145: TACCGCGTGGCATTCAAGCATAGC

43: S110 146 TCCAGTCTGGGTGACAAA

147: CAATCCACTCCACTCCTCTA

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración, y no pretenden limitar la descripción de ninguna manera. En los ejemplos, todos los porcentajes son en peso si es para sólidos y en volumen si es para líquidos, y todas las temperaturas est�n en grados Celsius a menos que se indique de otra manera.

Ejemplo 1 Construcción de una biblioteca de PCR del genoma completo.

Las técnicas de selección mediante amplificación e hibridación particulares usadas en este Ejemplo, y en el Ejemplo 2, más adelante, son formas modificadas de un método de selección descrito en Armor, J. et al. (1994) Hum Mol Genet 3(4):599-605.

Se purificó ADN gen�mico humano a partir de sangre completa mezclada de 15 individuos mediante el uso de procedimientos de extracción con fenol:cloroformo habituales (Current Protocols in Human Genetics (1994), Gilber,

J. ed., Apéndice).

Se cortaron aproximadamente 100 μg de ADN gen�mico con 5 unidades de enzima de restricción Mbo I por μg de ADN durante 16 h a 37 �C, seguido de purificación mediante extracción con fenol:cloroformo, precipitación con etanol y se resuspendieron en 100 μl de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) para una concentración final de alrededor de 1 μg/μl de ADN.

Los fragmentos de ADN que se hallaban en un intervalo de tamaños de 250-600 pb se aislaron mediante electroforesis en gel con un gel de agarosa preparativa del 1% de SeaKem GTG (FMC Bio Products, Rockland, Maine) (15x20 cm) durante 1,25 horas a 100 voltios y se recuperaron mediante electroeluci�n (referencia). El ADN se cuantific� midiendo la absorbancia a A260 y se diluyó a 500 ng/μl en agua nanopura estéril y se almacen� a -20 �C.

Los ligantes se prepararon hibridando cantidades equimolares de oligo A (5'-GCG GTA CCC GGG AAG CTT GG-3') y 5' oligo B fosforilado (5'-GAT CCC AAG CTT CCC GGG TAC CGC-3') para una concentración final de 1.000 pmol/μl. Un μg de inserto de ADN seleccionado por tamaño (3,5 pmoles con un tamaño medio de 425 pb) se unió a 13 μg (875 pmoles) de ligantes (proporción molar 250:1 de ligante:inserto), mediante el uso de 1-3 unidades de ADN ligasa de T4 durante 16 hr a 15 �C. Los ligantes en exceso y los d�meros de ligante se separaron de los fragmentos principales mediante electroforesis en gel (agarosa del 1% de SeaKem GTG, 1,5 h a 100 voltios). Los fragmentos de ADN unidos al ligante se recuperaron del gel mediante electroeluci�n, y se resuspendieron en 50 μl de agua estéril.

El ADN (50 ng) con los ligantes unidos se amplificó mediante el uso de una PCR en un volumen de reacción de 100 μl que contenía 10 μl de un tampón STR 10X (KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, MgCl2 15 mM, 1 % de Triton X-100, y 2 mM de cada dNTP), 1 μl de Taq polimerasa (5 U/μl), y 1 μM de cebador oligo A (10 μl de una disolución de reserva de 10 pmol/μl). El "oligo A" usado como cebador en esta reacción es el mismo "oligo A" usado para ensamblar el ligante de Mbo I, como se describió anteriormente. Las condiciones de los ciclos fueron 95�C 1 min, 67�C 1 min, 70�C 2 min; durante 30 ciclos. Los dNTPs, cebadores y d�meros de cebadores se eliminaron mediante microfiltraci�n con Centricon-100s (añadir 2 ml de agua estéril a la muestra y cargar el Centricon-100, centrifugar 20 min a 2.000 RPM, invertir el filtro Centricon y centrifugar durante 2 min a 2.000 RPM para recuperar el ADN, resuspender en 100 μl de dH2O estéril). Se comprob� una alícuota de 5 μl de la biblioteca de PCR resultante en un gel de agarosa del 1% (1 hr a 100 voltios) para confirmar que el intervalo de tamaños estuvo entre 250 y 600 pb.

Ejemplo 2 Enriquecimiento de repeticiones de pentanucle�tidos mediante selección por hibridación.

Los fragmentos de ADN de la biblioteca de PCR del genoma completo producidos según el Ejemplo 1 que contenían diversas repeticiones diferentes se enriquecieron mediante hibridación con el uso de diferentes mezclas de oligonucle�tidos asociados a un soporte sólido. Los fragmentos que contenían repeticiones de pentanucle�tidos (AAAAX)n se enriquecieron mediante selección por hibridación. Este proceso se llev� a cabo construyendo primero los oligonucle�tidos para el uso en la selección por hibridación que consistieron en matrices en t�ndem de (AAAAC)n, (AAAAG)n y (AAAAT)n con una longitud de alrededor de 1000 pb. Estos oligonucle�tidos se fijaron a membranas y se hibridaron con la biblioteca de PCR del genoma completo para seleccionar los fragmentos que contenían las repeticiones (AAAAX)n.

La matriz de oligonucle�tidos se construyó como sigue: (a) se sintetizaron oligonucle�tidos de 30 unidades monom�ricas fosforilados en 5' de [AAAAC]6, [AAAAG]6 y [AAAAT]6 y sus complementos [GTTTT]6, [CTTTT]6 y [ATTTT]6 y se suspendieron en agua nanopura a una concentración de 1.000 pmol/μl, (b) se combin� una concentración equimolar (se usaron 10 μl o 10 nmol o 198 μg de cada uno) de oligonucle�tidos que tenían secuencias complementarias, se calentó a 65�C durante 15 minutos y se dej� a 4�C durante unas horas para que hibridasen entre s�, (c) los oligonucle�tidos hibridados se ligaron después entre s� mediante el uso de 1 Unidad Weiss de ADN ligasa de T4 por μg de ADN a 15�C durante la noche, (d) los concat�meros ≥200 pb se seleccionaron por tamaño en agarosa del 1% de SeaKem GTG, (e) el ADN ligado se sometió a una PCR sin cebadores para alargar las matrices en t�ndem, (f) los fragmentos de tamaño aparente de más de 1000 pb se recuperaron de los geles de agarosa del 1% y se purificaron mediante microfiltraci�n. Se determin� la absorbancia a A260 y se hizo una disolución de reserva de un μg/μl en agua nanopura estéril.

Despu�s se transfirió un total de un μg de oligonucle�tido (AAAAC)200, (AAAAG)200, o (AAAAT)200 a trozos de 4 mm x 4 mm de filtro de membrana de nailon Hybond-Nfp (Amersham Life Sciences, Inc.), se lav� dos veces en tampón de prehibridaci�n durante 30 minutos con agitaci�n para eliminar los oligonucle�tidos unidos débilmente, se dejaron secar al aire, se reticularon con luz UV a 1200 μJulios para unir el ADN, y después se almacenaron a -20 �C.

La selección por hibridación de la biblioteca de PCR del genoma completo al medio de soporte resultante de oligonucle�tidos asociados con el filtro de nailon descrito anteriormente se llev� a cabo como sigue: (a) los filtros se prehibridaron en 1 ml de Tampón de Prehibridaci�n [1% de BSA (Sigma B-4287), EDTA 1 mM, pH 8,0, 7% (p/v) de SDS, Na2HPO4 0,5 M] a 40�C para los filtros que contenían oligonucle�tidos que tenían las secuencias de (AAAAC)n y (AAAAG), y a 37�C para los que contenían las secuencias (AAAAT)n. Después de 20 minutos, el tampón se elimina y se añaden 100 μl de Tampón de Prehibridaci�n reciente, (b) se desnaturaliz� el ADN de la biblioteca de PCR del genoma completo (20 μg) con álcali (KOH, concentración final 150 mM) y se neutralizó mediante la adición de 0,25 volúmenes de Tris-HCl 1 M de pH 4,8 y se a�adi� al tampón que contenía los filtros. La mezcla de reacción resultante se incub� durante la noche a temperaturas de prehibridaci�n de 37�C o 40 �C, (c) los filtros con (AAAAC)200 y (AAAAG)200 se lavan 2X con 1 ml de Tampón de Lavado n� 1 (Na2HPO4 40 mM, pH 7,2, 0,1 % de SDS) a 40�C y 1X a temperatura ambiente durante 15 minutos con agitaci�n. Los filtros con (AAAAT)200 se lavan 1X con 1 ml de Tampón de Lavado n� 1 a 37�C y 1X a temperatura ambiente, (d) el ADN unido a cada filtro se liber� mediante calentamiento a 95�C durante 5 minutos en 100 μl de agua nanopura estéril. La muestra se extrajo mientras estaba a 95�C para prevenir la re-hibridación. Los filtros se retiraron y se reutilizaron mediante incubaci�n en NaOH 0,4 M durante 30 minutos a 45 �C, después se transfirieron a SSC 0,1X, 0,1 % de SDS, Tris 0,2 M de pH 7,5 y se incubaron otros 15 minutos. Las membranas se secaron y se almacenaron en tubos sellados a -20 �C.

Ejemplo 3 Clonaci�n de una biblioteca enriquecida en repeticiones de pentanucle�tidos de fragmentos de ADN.

La población de fragmentos de ADN enriquecidos en repeticiones de pentanucle�tidos según el Ejemplo 2 se re-amplificó mediante PCR. Los fragmentos reamplificados se clonaron después en el vector plasm�dico pGEM-3Zf(+), como se describe más adelante. Este proceso se llev� a cabo ligando los insertos seleccionados en el vector pGEM y después transformando el pl�smido circularizado en un hospedador de E. coli JM109.

Las ligaduras inserto-vector se llevaron a cabo como sigue: (a) 5 μl del ADN seleccionado por hibridación se reamplificaron en un volumen de reacción de 100 μl, mediante el uso de un tampón STR 1X (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 9,0, MgCl2 1,5 mM, 0,1 % de Triton X-100, y 0,2 mM de cada dNTP), 1 μl de Taq polimerasa (5 U/μl), y 1 μM de cebador oligo A (1 μl de disolución de reserva de 100 pmol/μl). Las condiciones de los ciclos fueron 95�C 1 min, 67�C 1 min, 70�C 2 min; durante 30 ciclos. (b) El ADN reamplificado se digirió con Mbo I añadiendo 11 μl de Tampón C 10X de enzima de restricción de Promega y 2 μl (8 U/μl) de Mbo I a los 100 μl de reacción de PCR, incubando la mezcla de reacción resultante durante la noche a 37 �C, e inactivando térmicamente la enzima de restricción incubando la mezcla a 65�C durante 20 minutos. (c) El vector pGEM-3Zf(+) (20 μg o 10,6 pmol) se prepar� para la inserción del fragmento mediante digestión con BamH I (5 U/μg) durante 16 horas a 37 �C, seguido de la adición de cantidades adecuadas de tampón de fosfatasa alcalina intestinal bovina 10X (Promega) y 1 μl de CIAP (Unidades/μl) e incubaci�n durante 1 hora a 37 �C. Esta reacción se detuvo mediante la adición de EDTA 0,5 M a una concentración final de 0,02 M y después se extrajo con fenol, se precipit� con etanol y se resuspendi� en tampón TE a 1 μg/μl. (d) Finalmente, se llevaron a cabo ligaduras inserto-vector de 20 μl mediante la incubaci�n de 1 μl de ADN cortado con MboI (véase la etapa b) junto con 1 μl o 200 ng de pGEM 3Zf(+) desfosforilado (véase la etapa c) y 1 μl de ADN ligasa de T4 (1 a 3 U/μl) durante 2 horas a temperatura ambiente.

Finalmente, se transformaron 10 μl de la reacción de ligadura inserto-vector en 100 μl de células JM109 competentes mediante el uso del protocolo de transformación de Promega descrito en el Boletín Técnico n� 095.

Ejemplo 4 Selección de clones de la biblioteca gen�mica de insertos pequeños que contienen repeticiones de pentanucle�tidos (AAAAX)n mediante hibridación de colonias.

Los clones que contenían repeticiones de pentanucle�tidos (AAAAX)n se seleccionaron mediante cribado de hibridación de colonias con el uso de los reactivos y protocolos Lightsmith II (véase el Boletín Técnico de Promega n� TM227), y se visualizaron mediante hibridación con sondas conjugadas a fosfatasa alcalina.

El ADN de las colonias se transfirió a membranas colocando membranas de nailon MagnaGraph (Micron Separations, Inc. Westboro, MA) en placas que contenían las colonias bacterianas, dejándolas en reposo durante 3 minutos, y después transfiri�ndolas a papel de filtro seco. A continuación, las membranas se transfirieron a una serie de bandejas que contenían un 10% de SDS durante 3 minutos, después disolución desnaturalizante que consistía en 5 ml de NaOH + 30 ml de NaCl 5 M + 65 ml de dH2O durante 5 minutos, después disolución neutralizante que consistía en 30 ml de NaCl 5 M + 25 ml de M Tris-HCl, pH 7,4 + 45 ml de dH2O durante 5 minutos, y finalmente SSC 2X durante 5 minutos. Las membranas se secaron después a temperatura ambiente durante 30 minutos seguido de reticulación mediante luz UV con 1200 μjulios, con el uso de un Stratalinker� (Stratagene, La Jolla, CA).

La detección de las colonias que contenían clones con repeticiones (AAAAX)n se llev� a cabo con la ayuda de sondas conjugadas a AP y quimioluminiscencia. La exposición de los filtros hibridados a sondas conjugadas con AP a una película de rayos X indicó las colonias que contenían los clones deseados. Se llev� a cabo una segunda hibridación para confirmar los resultados iniciales.

El procedimiento de detección utilizó el equipo Lightsmith II de Promega (véase el boletín de Promega n� TM227 para una descripción detallada del procedimiento). Brevemente, el procedimiento de detección usado consistió en las etapas de: (a) Incubar los filtros en una Disolución de Bloqueo Quantum Yield� (N� de cat. de Promega F1021) durante 45 minutos a 56�C con agitaci�n enérgica, (b) desechar la Disolución de Bloqueo y añadir 0,05 ml de Disolución de Hibridación de Rigurosidad Alta Quantum Yield� (N� de cat. de Promega F1231) por cm2 de membrana que contenía la sonda de AP e incubar 45 minutos a 56�C con agitaci�n enérgica, (c) desechar la disolución de hibridación/sonda de los filtros y lavar los filtros dos veces con 150-200 ml de Disolución de Lavado n� 1 precalentada (SSC 2X, 0,1 % de SDS) durante 10 minutos a 56 �C, (e) combinar todos los filtros y lavar una vez con Disolución de Lavado n� 2 (SSC 1X) durante 10 minutos a temperatura ambiente, (f) equilibrar las transferencias durante 5 minutos en 200 ml de dietanolamina 100 mM, MgCl2 1 mM, (f) añadir suficiente sustrato CDP-Star 0,25 mM (Tropix, Bedford, MA) a filtros saturados y después incubar durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente, (g) colocar los filtros saturados de sustrato sobre un protector de láminas de plástico de poliestireno en una carpeta de hibridación y cerrar la carpeta, (h) colocar la carpeta de hibridación que contiene los filtros en un casete de películas y exponer los filtros contenidos en él a una película de rayos X, y (I) revelar la película después de un periodo de al menos 1 hora de exposición a la película.

Ejemplo 5 Secuenciaci�n de ADN y análisis.

Se desarroll� un método simplificado para preparar moldes de secuenciaci�n mediante la utilización de lisados celulares para secuenciar el gran número de clones identificados en el Ejemplo 4 que posiblemente contenían insertos con al menos una secuencia (AAAAX)n. Este procedimiento consistió en transferir los clones positivos de los ensayos de hibridación de colonias a placas de microtitulaci�n de 96 pocillos estériles (n� de cat. de Falcon 3072) que contenían 200 μl de LB/Amp (100 μg/ml) e incubarlos durante la noche a 37�C a 250 rpm. A continuación, el cultivo de la noche se dividió y se us� en tres procedimientos diferentes que implicaron crear los lisados celulares, producir filtros replicados para segundas hibridaciones para confirmar los hallazgos iniciales o hacer disoluciones de reserva en glicerol para el almacenamiento a largo plazo de los clones.

Los lisados celulares se hicieron tomando 2 μl del cultivo de la noche y a�adi�ndolos a 100 μl de agua nanopura estéril en placas de reacción de 96 pocillos (n� de cat. de Perkin Elmer N801-0560) y calentando a 100�C durante 4 minutos en un termociclador 9600. Esto se dej� enfriar, se congel�, y se almacen� a -20�C hasta que estuvo listo para su uso.

Los filtros replicados se hicieron para segundos ensayos de hibridación esterilizando en llama el replicador de 96 clavijas, sumergiendo el replicador en una placa de 96 pocillos que contenía el cultivo de la noche y estamp�ndolo en una membrana de nailon circular de 137 mm (MagnaGraph, MSI) sobre una placa LB / Amp (100 μg/ml) e incubando la membrana durante la noche a 37 �C.

El cultivo de la noche restante se convirtió en disoluciones de reserva en glicerol añadiendo 46 μl de glicerol al 80% a cada pocillo y colocando las placas en un agitador -incubador ajustado a 250 rpm durante unos minutos para mezclarlo, y después se almacenaron a -70 �C.

Se seleccionaron todos los clones que fueron positivos en dos ensayos de hibridación de colonias, y los clones correspondientes de las placas de lisado celular se usaron para la amplificación mediante PCR. Los productos de

reacci�n de PCR se purificaron con placas de purificación Qiagen QIAquick 96 PCR (n� de cat. 28180) y se usaron como moldes para la secuenciaci�n. Se usaron dos microlitros del lisado celular en una reacción de PCR de 50 μl que contenía el cebador directo M13 -47 a 2 μM (n� de cat. de Promega Q560A), el cebador inverso M13 (n� de cat. de Promega Q542A) a 2 μM, tampón STR 1X y 2,5 unidades de AmpliTaq (Perkin Elmer). Se us� el siguiente perfil de ciclos en un termociclador PE 480: 1 ciclo a 96�C / 2 min, 10 ciclos a 94�C / 1 min, 56�C / 1 min, 70�C / 1,5 min; 20 ciclos a 90�C / 1 min, 56�C / 1 min, 70�C / 1,5 min; mantener a 4 �C. Los productos de la reacción de PCR se lavaron con placas de purificación Qiagen QIAquick 96 PCR (n� de cat. 28180) siguiendo el protocolo del fabricante y se recuperaron en 70 μl de Tris-HCl 10 mM de pH 8,5 a una concentración final de alrededor de 35 ng/μl y se almacenaron a -20 �C.

La secuenciaci�n del ADN se llev� a cabo mediante el uso de la química de secuenciaci�n con terminadores marcados ABI y el secuenciador ABI 377. Los moldes de secuenciaci�n se prepararon mediante el uso del equipo de terminadores marcados ABI y el protocolo del fabricante (Protocolo P/N 402078). Se usaron dos μl o aproximadamente 30 a 90 ng de producto de PCR purificado (descrito anteriormente) como ADN molde para la reacción de secuenciaci�n. La reacción de secuenciaci�n consistió en 8 μl de mezcla de terminadores marcados, 2 μl de ADN molde (35 ng/μl), 4 μl de cebador directo M13 -21 a 0,8 μM, y 6 μl de agua nanopura estéril. El perfil de ciclos en la secuenciaci�n cíclica en el GeneAmp PCR System 9600 fue: 25 ciclos a 96�C / 10 s, 50�C / 5 s, 60�C / 4 minutos; mantener a 4�C. Los productos de extensión se purificaron mediante la adición de 50 μl de etanol del 95% y 2 μl de acetato sádico 3 M, pH 4,6 a cada tubo, se mezclaron mediante el uso de un v�rtex, se colocaron sobre hielo durante 10 minutos, y después se centrifugaron durante 30 minutos a velocidad máxima. El sedimento se lav� con 250 μl de etanol del 70%, se secó en una centrífuga de vacío durante alrededor de 3 minutos y se almacen� seco a -20�C hasta que estuvo listo para su uso. El sedimento seco se resuspendi� en 6-9 μl de tampón de carga y después se desnaturaliz� durante 2 minutos a 95�C y se almacen� en hielo hasta que se cargó en el gel.

Se prepararon geles Long Ranger del cinco por ciento (FMC BioProducts, Rockland, ME) según el protocolo del fabricante y se polimerizaron durante 2 horas. El gel se pre-utilizó durante 45 minutos a 1000 voltios. Se cargaron 1,5 μl de molde en tampón de carga en el gel y se hizo funcionar en condiciones 2X o 4X durante 3,5 h o 7 h, respectivamente.

Los datos de la secuencia de ADN generados en el secuenciador ABI 377 se editaron para eliminar cualquier secuencia del vector pGEM y después se colocaron en la base de datos local creada mediante el uso del paquete inform�tico del Genetics Computer Group Wisconsin, versión 9.0 (Madison, WI) que contiene información de secuencias para todos los clones que se estaban estudiando. A continuación, los clones se examinaron en busca de la presencia, longitud y patrones de secuencias de las repeticiones de pent�meros. Los que contenían 5 o más repeticiones se compararon después con el programa de comparación de secuencias BLAST (Altschul et al., 1990) para identificar los clones duplicados y aquellos que ya existían en la base de datos GenBank en el National Center for Biotechnology Information en Besthesda, Maryland, EE.UU. Una vez que se identificaron los clones únicos, se diseñaron cebadores para PCR con la ayuda del programa OLIGO Primer Analysis Software versión 5.0 (National Biosciences, Inc., Plymouth, MN).

Ejemplo 6 Cribado de clones en busca de los niveles de polimorfismo y determinación de la localización cromos�mica.

El cribado inicial de polimorfismos se llev� a cabo en dos muestras de ADN mezcladas, una que contenía ADN gen�mico humano de 15 individuos aleatorios y la otra que contenía 54 individuos del CEPH del NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository (mezcla de ADN de la colección CEPH, n� de cat. NA13421, Coriell Cell Repositories, Camden, NJ). Se usaron cebadores de PCR marcados con fluorescencia para la amplificación mediante PCR del locus objetivo a partir de ADN gen�mico, y los productos de PCR se separaron en geles de poliacrilamida y se visualizaron en un escáner de fluorescencia. Esos loci con 4 alelos y un 50% de heterocigosidad se ensayaron posteriormente con 16 ADNs del CEPH individuales (102-1, 102-2, 884-1, 884-2, 1331-1, 1331-2, 1332-1, 1332-2, 1347-1, 1347-2, 1362-1, 1362-2, 1413-1, 1413-2, 1416-1, 1416-2) para determinar los valores de heterocigosidad preliminares. Los datos para los mismos loci se analizaron después adicionalmente para determinar el número de alelos, las frecuencias de los alelos y los valores de heterocigosidad (véase la TABLA 2).

Los clones que se descubrió que contenían secuencias de repeticiones pentam�ricas que cumplieron los criterios de selección de ≥4 alelos y ≥50% de heterocigosidad se cartografiaron para determinar la localización cromos�mica exacta (véase la TABLA 2). Se usaron tres métodos diferentes para la cartografía: (1) La cartografía de híbridos de células somáticas mediante el uso del panel NIGMS de 26 híbridos de células somáticas (Coriell Cell Repositories, Camden, NJ) que representan cromosomas humanos únicos para identificar el origen cromos�mico, (2) técnicas de cartografía de híbridos con radiación que utilizan el panel GeneBridge 4 RH de 93 clones RH (Schuler et al., 1996), y

(3) técnicas de cartografía de ligamiento mei�tico estándar y ocho familias (K102, K884, K1347, 1362, 1331, 1332, 1413, 1416) del panel de referencia de familias del CEPH y cartografiado con el programa de ligamiento multi-punto CRI-MAP (Lander y Green, 1987).

Los clones con valores de heterocigosidad que superaron el 70% en los 16 individuos del CEPH se estudiaron en cuanto a su genotipo y las frecuencias de los alelos en estudios de población mayores que contenían más de 100 individuos de las cuatro razas principales, que incluyen afroamericanos, blancos, asiáticos, y latinoamericanos.

Las Figuras 10 y 11 ilustran la amplia variación de la migración de los alelos amplificados de dos loci de ITR polim�rficas diferentes en muestras de ADN gen�mico de 24 individuos diferentes en una población (muestras de ADN S02 a S25). Véase la Tabla 1 anterior para la secuencia de los pares de cebadores usados en estos análisis. Las imágenes del gel se generaron amplificando cada locus de repeticiones de pentanucle�tidos mediante el uso de 5 cebadores marcados con fluorescencia, seguido de separación en geles de poliacrilamida y visualización mediante barrido con el escáner de fluorescencia FMBIO II (Hitachi Software Engineering America, Ltd., San Francisco, CA). Se incluyó una escalera al�lica que contenía la mayoría de los alelos conocidos para cada locus ensayado en un carril a cada extremo del gel de electroforesis, en los carriles S01 y S26. Los pares de cebadores usados para amplificar cada locus tuvieron secuencias complementarias a al menos una porción de la secuencia de un marcador

10 de ADN aislado del clon S159 o del clon G210, tal como se ilustr� anteriormente en los Ejemplos. Las secuencias del par de cebadores se seleccionaron de los pares de cebadores enumerados para los Clones S159 y G210, Tabla 1, anteriormente.

Las condiciones de la PCR para los cribados de polimorfismos fueron las siguientes: reacciones de 25 μl que contenían aproximadamente 200 ng para un molde de ADN mezclado o 25 ng para ADNs del CEPH individuales, 15 Tampón STR 1X, 1 unidad de Taq ADN Polimerasa, y 1 μM del par de cebadores correspondiente. La secuencia de cada par de cebadores usado para amplificar cada uno de los clones enumerados en la Tabla 2 se proporciona en la Tabla 1. Obsérvese que a cada cebador se le ha asignado el SEQ ID N� enumerado en la Tabla 1. Las condiciones de los ciclos para el termociclador Perkin-Elmer GeneAmp PCR System 9600 (Perkin-Elmer, Foster City, CA) fueron: 96�C durante 1 minuto, después 10 ciclos a 94�C durante 30 segundos, rampa de 68 segundos hasta 60 �C, 20 mantenimiento durante 30 segundos, rampa de 50 segundos hasta 70 �C, mantenimiento durante 45 segundos; seguido por 20 ciclos de 90�C durante 30 segundos, rampa de 60 segundos hasta 60 �C, mantenimiento durante 30 segundos, rampa de 50 segundos hasta 70 �C, mantenimiento de 45 segundos, 60�C durante 30 minutos. Las muestras de PCR se prepararon mezclando 2,5 μl de cada muestra con 2,5 μl de Disolución de Carga de Azul de Bromofenol 2X, se desnaturalizaron mediante calentamiento a 95�C durante 2 minutos, se congelaron, después se

25 sometieron a electroforesis 3 μl de cada muestra en un gel de poliacrilamida del 4% durante 50 minutos a 40 vatios. Los productos de la PCR se visualizaron mediante barrido en un escáner de fluorescencia Hitachi FMBIO y se analizaron con el soporte inform�tico adjunto (FMBIO Analysis, versión 6.0, Hitachi Software Engineering, San Francisco, CA).

TABLA 2

SEQ ID N�: Número de Clon Número de Acceso a GenBank Secuencia de ITR más larga observada N� de Alelos Observados % de Heterocigosidad (blancos) Localización Cromos�mica

1: C074 ninguno [TTTTG]9 6 75
1

2: C221 ninguno [GTTTT]13 7 78 9p

3: C240 ninguno [CAAAA]7 4 42 NA

4: C331 ninguno [GTTTT]10 5 43 NA

5: C362 ninguno [GTTTT]5 4 62 4

6: C390 ninguno [CAAAA]7 5 56 NA

7: G022 ninguno [AAAAG]6 4 63 2p

8: G023 ninguno [AAAAG]10 12 71 16q

9: G025 ninguno [AAAAG]6 12 86 1

10: G047 ninguno [AAAAG]9 5 86 2p

11: G065 ninguno [TTTTC]6 13 100 1q

12: G085 ninguno [AAAAG]11 8 93 10q

13: G132 ninguno [CTTTT]15 12 100 4 qter

14: G145 ninguno [AAAAG]13 8 33 NA

15: G152 ninguno [AAAAG]6 5 87 8 qter

16: G153 ninguno [AAAAG]8 5 88 8 qter

17: G158 ninguno [AAAAG]5 8 75 5q

18: G181 ninguno [GAAAA]14 5 72 NA

19: G210 ninguno [CTTTT]6 9 56 8p

20: G212 ninguno [CTTTT]9 6 100 NA

21: G233 ninguno [AAAAG]8 12 50 10q

22: G234 ninguno [AAAAG]12 4 80 16 qter

23: G235 ninguno [TTTTC]6 4 56 2p

24: G331 ninguno [CTTTT]8 5 73 NA

25: G405 ninguno [CTTTT]6 10 80 NA

26: G475 ninguno [GAAAA]12 12 92 15q22.3

27: G539 ninguno [GAAAA]12 13 100 15q26.2

28: S023 X05367 [AAAAT]6 4 50 NA

29: S071 M90078 [AAAAT]8 4 56 6q26-27

30: S085 U07000 [AAAAT]5 7 44 22q11

31: S125 Z73416 [AAAAT]13 5 64 22q11.2-qter

32: S132 Z83847 [AAAAT]10 8 69 22

33: S136 Z82250 [TTTTC]6 11 94 22q12-qter

34: S159 AC00001 4 [GAAAA]9 12 72 21q22-qter

35: S176 AC00005 9 [GTTTT]9 4 56 7q21-7q22

36: S189 Z54073 [AAAAC]8 5 69 22q11.2-qter

37: S199 Z84475 [GTTTT]7 4 75 6q21

38: S040 X06583 [AGCCTGG]4 2 NA NA

39: S066 M68516 [ACTCC]6 3 NA NA

40: S077 M25718 [AATAC]12 6 NA NA

41: S097 Z21818 [CAGGCT]3 3 NA NA

42: S103 X15949 [ATCCC]8 3 NA NA

43: S110 X54108 [GGA(A/G)T]32 6 NA NA

Ejemplo 7 Identificación de repeticiones cortas en t�ndem por medio de búsquedas en GenBank.

Se llev� a cabo un método alternativo para identificar secuencias repetidas en t�ndem buscando en GenBank en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) la presencia de repeticiones intermedias en t�ndem. Se emplearon varios métodos, que incluyen la búsqueda por lotes de entradas de GenBank en CD-ROM con el paquete inform�tico Lasergene de DNASTAR (Madison, WI), la búsqueda por lotes en GenBank con la ayuda del paquete inform�tico del Genetics Computer Group Wisconsin, versión 9.0 (Madison, WI).

Existen 45 = 1024 palabras diferentes de cinco letras que se pueden construir a partir del alfabeto de cuatro letras (A, C, G, y T) para hacer todas las repeticiones pentam�ricas posibles, y 46 = 4096 y 47 = 16.384 palabras diferentes

de seis y siete letras para repeticiones de seis y siete bases. Sin embargo, el número de motivos de repeticiones únicas es considerablemente menor debido a la equivalencia de las dos cadenas complementarias (p.ej., AAAAT es equivalente a ATTTT), y debido a la equivalencia de permutaciones cíclicas (p.ej., AATAA... es equivalente a ATAAA...). En el caso de repeticiones de cinco bases, esto significa que existen 102 clases únicas de repeticiones pentam�ricas si se excluyen las repeticiones de mononucle�tidos A5/T5 y C5/G5.

Se usaron todas las combinaciones únicas de repeticiones de 5, 6 y 7 bases con al menos tres copias consecutivas para realizar búsquedas en la base de datos del genoma humano GenBank. Se identificaron todas las regiones de repeticiones que contenían tres o más copias de una repetición, o las copias con sustituciones de bases ocasionales. Mediante el uso de los datos de secuencias existentes, se diseñaron cebadores que flanqueaban a la región de repeticiones y se amplificó mediante PCR el locus objetivo y se determin� el contenido polim�rfico como se describió en el Ejemplo 6.

Cada clon que contenía una secuencia identificada mediante el uso de los cebadores ensamblados con el uso de la información de la base de datos GenBank se crib� después en función del contenido de secuencias de repeticiones como se describe en el Ejemplo 7. A la secuencia de cada clon que contenía una secuencia de ITR, es decir, un marcador de ITR, se le asign� uno de los SEQ ID N�s de 28 a 43. Véase la Tabla 1 para la secuencia de cebadores que comprenden las secuencias que flanquean a la región de ITR de cada marcador. Véase la Tabla 2 para un resumen de los resultados de analizar las características de la secuencia de cada marcador de ITR.

Ejemplo 8 Estudio de los loci de Repeticiones Intermedias en T�ndem en busca de artefactos de PCR (es decir, % de tartamudeo).

Muchos de los marcadores descritos en este trabajo representan una clase nueva de marcadores que producen menos artefactos de PCR conocidos como "tartamudeo" (véase la sección de Definiciones de la Descripción Detallada, anteriormente). La generación de estos artefactos se da durante la amplificación mediante PCR, supuestamente como resultado de un fenómeno relacionado con la ADN polimerasa denominado deslizamiento por repeticiones (Levinson y Gutman, 1987. Mol. Biol. Evol. 4(3):203-221; Schlotterer y Tautz, 1992. NAR 20:211-215). El resultado final del deslizamiento por repeticiones es la generación de productos de PCR que contienen diferentes números de unidades de repetición que el alelo auténtico. Si se da una cantidad suficiente de deslizamiento durante la PCR, el producto amplificado se visualizar� en forma de una banda principal y secundaria, y la banda principal corresponde al alelo auténtico y la banda secundaria corresponde al producto alterado que contiene más o menos unidades de repetición.

Para cuantificar la cantidad de la banda tartamuda presente en loci diferentes, se analizaron productos de amplificación mediante PCR de 6 loci de ITR (C221, G023, G025, G210, S159 y una ITR adicional no descrita en esta patente, S117) y 17 loci de repeticiones en t�ndem de tetranucle�tidos (F13A01, THO1, TPOX, F13B, FESFPS, D7S820, CSF1PO, D13S317, D8S1179, D16S539, LPL, FGA, D5S818, D3S1358, D18S51, vWA, y D21S11) en un secuenciador ABI 377 y se analizaron mediante el uso del programa GenScan (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Se determinaron las alturas de los picos medidas en unidades de fluorescencia relativas (UFR) para todos los picos principales y secundarios observados en las 25 a 40 muestras individuales investigadas en cada loci. Se calcul� el porcentaje de UFR observado en el pico secundario (en general 5 pb más pequeño que el alelo auténtico en los pentanucle�tidos o 4 pb más pequeño en las repeticiones de tetranucle�tidos) respecto del pico principal del alelo auténtico (véase la Tabla 3).

Los ejemplos de electroferogramas de ABI 377 para los loci de ITR S159 (Fig. 2) y G210 (Fig. 3) y los loci de repeticiones de tetranucle�tidos vWA (Fig. 4) y D5S818 (Fig. 5) muestran un tartamudeo mínimo o inexistente en los loci de ITR y un tartamudeo claramente observable para los loci de repeticiones de tetranucle�tidos. De manera específica, véanse los artefactos por tartamudeo indicados mediante las flechas 14 y 15 en el electroferograma del locus de repeticiones de tetranucle�tidos vWA reproducido en la Figura 3, y mediante las flechas 16 y 17 en el electroferograma del locus de repeticiones de tetranucle�tidos D5S818 reproducido en la Figura 5. Compárense esos picos de artefactos diferentes con los pequeños artefactos inapreciables en los electroferogramas de las repeticiones de pentanucle�tidos del ADN marcador aislado del Clon S159 (es decir, el marcador que tiene la secuencia identificada mediante SEQ ID N�:34) como se muestra en la Figura 2, y del ADN marcador aislado del Clon G210 (es decir, el marcador que tiene la secuencia identificada mediante SEQ ID N�: 19) en la Figura 4. Los electroferogramas específicos reproducidos en las Figuras 2 -5 son las incidencias más altas de tartamudeo observado para cada uno de los loci.

Se observ� cierta variabilidad en la cantidad de tartamudeo para todos los loci. En general, la tendencia fue para los alelos que contenían el número más alto de repeticiones (tal como se indica mediante su tamaño en pares de bases) para exhibir la cantidad más alta de tartamudeo. Los valores de tartamudeo en porcentaje para cada uno de los 25 a 40 individuos ensayados se muestran en gráficos de dispersi�n (Figuras 6, 7, 8 y 9).

En resumen, el porcentaje de la banda "tartamuda" respecto de la banda del alelo auténtico fue significativamente menor en la mayoría de los loci de ITR estudiados en comparación con los loci de repeticiones en t�ndem de tetranucle�tidos. Esto fue cierto a pesar de que los loci de tetranucle�tidos usados representasen el mejor de este tipo de marcador conocido actualmente. Por ejemplo, 13 de tales marcadores de tetranucle�tidos, que incluyen varios de los marcadores de tetranucle�tidos ensayados como se describió y se informa en la Tabla 3 siguiente por tener un % elevado de tartamudeo, han sido seleccionados por la Oficina Federal de Investigación de los EE.UU. para el uso en el análisis de todas las muestras de ADN para el Sistema de índice Combinado de ADN nacional (CODIS). (Macivee, I. (1998) Profiles in DNA 1(3):2).

TABLA 3

Nombre del Locus o Número de Clon: Longitud de la Unidad de Repetición en T�ndem Porcentaje Medio de Tartamudeo Porcentaje Máximo de Tartamudeo Porcentaje Mínimo de Tartamudeo Desviación Estándar Número de Alelos Analizados

Clon S159: 5 pb (ITR) 0,1 1,4 0,0 0,4 40,0

Clon G210: 5 pb (ITR) 0,6 3,2 0,0 0,9 30,0

Clon C221: 5 pb (ITR) 0,9 3,3 0,0 0,9 27,0

F13A01: 4 pb 1,2 9,7 0,0 2,5 34,0

TH01: 4 pb 1,7 5,2 0,0 1,7 34,0

Clon S117: 5 pb (ITR) 2,0 6,9 0,0 1,7 37,0

Clon G023: 5 pb (ITR) 2,3 6,6 0,0 1,7 39,0

TPOX: 4 pb 2,4 5,6 0,0 1,8 34,0

F13B: 4 pb 2,6 7,7 0,0 1,7 31,0

FESFPS: 4 pb 3,6 10,0 0,0 2,3 34,0

D7S820: 4 pb 3,8 8,2 1,6 1,6 28,0

CSF1 PO: 4 pb 4,1 9,5 0,0 2,5 31,0

Clon G025: 5 pb (ITR) 4,5 9,3 0,0 2,1 36,0

D13S317: 4 pb 4,7 7,5 1,7 1,5 26,0

D8S1179: 4 pb 5,0 8,3 2,4 1,6 27,0

D16S539: 4 pb 5,1 8,6 1,7 2,0 28,0

LPL: 4 pb 5,4 15,0 1,7 3,1 29,0

FGA: 4 pb 5,5 11,6 3,0 1,7 36,0

D5S818: 4 pb 6,1 9,0 0,0 1,9 28,0

D3S1358: 4 pb 6,1 12,5 0,9 2,1 25,0

D18S51: 4 pb 6,5 11,6 2,5 2,4 28,0

vWA: 4 pb 6,6 11,4 3,7 1,4 28,0

D21S11: 4 pb 7,5 15,7 1,9 3,5 30,0

LISTADO DE SECUENCIAS

(1): INFORMACI�N GENERAL:

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

5: (i) SOLICITANTE: Schumm, James W. Bacher, Jeffery W,

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MATERIALES Y MÉTODOS PARA IDENTIFICAR Y ANALIZAR MARCADORES DE ADN DE REPETICIONES INTERMEDIAS EN T�NDEM.

10: (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 147

15 20 25: (iv) (v) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) RECEPTOR: Promega Corporation (B) CALLE: 2800 Woods Hollow Road (C) CIUDAD: Madison (D) ESTADO: Wisconsin (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL: 53711-5399 FORMA LEIBLE POR ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete – 3,5 pulgadas, 1.44 Mb (B) ORDENADOR: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: Windows NT 4.0 (D) PROGRAMA INFORM�TICO: WordPerfect 7.0 (formato de texto DOS)

30: (viii) INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOMBRE: Grady J. Frenchick (B) NÚMERO DE REGISTRO: 29.018 (C) NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 8976.80

35: (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: (608) 257-2281 (B) NÚMERO DE FAX: (608) 257-7643 (C) CORREO ELECTRÓNICO: gfrenchick@mail.stroudlaw.com

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1

40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 44 5 pb (B) TIPO: ácido Nucleico (C) TIPO DE CADENA: Doble (D) TOPOLOGÍA: Circular

45: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

50: (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+) (B) CLON: C074

55: (viii) POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 1

60

65

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 411 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: C221

20

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 9p

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3

30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 354 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

35

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

40: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: C240

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 317 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: C331

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

25: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 387 pbTIPO: ácido Nucleico

30: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

35: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: C362

40

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 4

45

50

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

10: (A) (B) LONGITUD: 471 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

15: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

20: (A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: C390

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

30: (A) (B) LONGITUD: 367 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

35: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

40: (A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G022

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 2p

45

5

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

10: (A) (B) LONGITUD: 295 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf<+)

20: (B) CLON: G023

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 16q

25: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9

30

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 361 pbTIPO: ácido Nucleico

35: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

40

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G025

45: (viii) POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 1

50

5: (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 10

(i): SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LONGITUD: 318 pb(B) TIPO: ácido Nucleico

10: (C) TIPO DE CADENA: Doble (D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G047

20

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 2p

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11

30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 362 pb(B) TIPO: ácido Nucleico

(C) TIPO DE CADENA: Doble(D) TOPOLOGÍA: Circular

35

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

40: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G065

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

45: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 1q

50

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 297 pb(B) TIPO: ácido Nucleico

10: (C) TIPO DE CADENA: Doble (D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G085

20

(vii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 10q

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13

30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 372 pb(B) TIPO: ácido Nucleico

(C) TIPO DE CADENA: Doble(D) TOPOLOGÍA: Circular

35

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

40: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G132

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

45: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 4 qter

50

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 350 pb(B) TIPO: ácido Nucleico

10: (C) TIPO DE CADENA: Doble (D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G145.1

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

25: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 372 pb(B) TIPO: ácido Nucleico

30: (C) TIPO DE CADENA: Doble (D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

35: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G152

40

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 8 qter

45

50

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:16 5

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 361 pb

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Doble10 (D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii) HIPOTÉTICO: no 15

(iv) FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G153

20 (iv) POSICIÓN EN GENOMA:

(A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 8 qter

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 30 (A) LONGITUD: 447 pb

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Doble

(D): TOPOLOG�A: Circular

35 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA: 40 (A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G158

(viii) POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 5q 45

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 415 pb(B) TIPO: ácido Nucleico

10: (C) TIPO DE CADENA: Doble (D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B) CLON: G181

20

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A) CROMOSOMA/SEGMENTO:

(B) MAP POSITION:

(C) UNITS:

25

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 444 pb

(B) TIPO: ácido Nucleico 35 (C) TIPO DE CADENA: Doble

(D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

40 (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv) FUENTE INMEDIATA:

(A) BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G210 45

(iv): POSICI�N EN GENOMA:

(A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 8p

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 321 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(viii): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G212

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20

25: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 3 29 pbTIPO: ácido Nucleico

30: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

35: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G233

40

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: lOq

45

50

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:22

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:23

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:27

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 412 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G234

20

(iv): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 16 qter

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22

25

30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 359 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

35

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

40: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G235

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

45: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 2p

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 516 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G331

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

30: (A) (B) LONGITUD: 55S pbTIPO: ácido Nucleico

(A) (B): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

35

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

40: (B) CLON: G405

45

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 335pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G475

20

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 15q22.3

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26

25

30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 333 pb TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

35

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

40: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: G539

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

45: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 15q26.2

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 1011 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA: pl�smido, pGem3Zf(+)

(B): CLON: S023

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

30: (A) (B) LONGITUD: 1011 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

35

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA: ■ (B) CLON: S071

(viii): POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 6q26-27

5: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30

10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 1000 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

15

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

20: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(B): CLON: S085

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 22qll

25

30

35

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 1000 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA:

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA:

(B): CLON: S125

20

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 22q11.2-qter

(Xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 1000 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

10: (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

15: (B) CLON: S132

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 22

20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33 25

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1000 pb

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Doble 30 (D) TOPOLOGÍA: Circular

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: S136

5: (viii) (xi) POSICIÓN EN GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: 22q12-qter DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33

10: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 1000 TIPO: ácido Nucleico

15: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

20: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(B): CLON: S159

25: (viii) OSICI�N EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 21q22-qter

30

35

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 14 00 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(B): CLON: S176

20: (viii) POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 7q21-7q22

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35

(2): NFORMACI�N PARA SEQ ID NO:36

5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 1250 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

10

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

15: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(viii): (B) CLON: S189 POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 22q11.2-qter

20: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

5

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(B): CLON: S199

10

(viii): POSICIÓN EN GENOMA:

(A): CROMOSOMA/SEGMENTO: 6q21

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37

15

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38

20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 1000 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

25

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

(iii): HIPOTÉTICO: no

30: (iv) FUENTE INMEDIATA:

(B): LON: S040

35

40

(xi): ESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38

5: (2) NFORMACI�N PARA SEQ ID NO:39

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 1050 pbTIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA:

(B): CLON: S066

20

(xi): SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:39

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:40

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 4580 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

10

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA:

15: (B) CLON: S077

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:40

20

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:41

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

25: (A) (B) LONGITUD: 1000 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

30

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(A): BIBLIOTECA:

35: (B) CLON: S097

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:41

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:45

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:42

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD : 994 pb TIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

15: (iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(B): CLON: S103

20: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:42

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:43

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 13 66 pbTIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Doble TOPOLOGÍA: Circular

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN Gen�mico

10

(iii): HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA: (B) CLON: S110

15: (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:43

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:44

20

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 19 TIPO: ácido Nucleico

25: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:44

30

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:45

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

35: (A) (B) LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:46

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 22

(B): TIPO: ácido Nucleico 10 (C) TIPO DE CADENA: Sencilla

(D) TOPOLOGÍA: Lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:46

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:47

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:47

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:48

30

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 22 TIPO: ácido Nucleico

35: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:48

40

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:49

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45: (A) (B) LONGITUD: 22 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:49

50

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:50

55: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 23 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

60

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:50

5: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:51

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:51

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:52

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:52

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:53

30

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

35: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:53

40

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:54

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45: (A) (B) LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:54

50

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:55

55: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 18 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

60

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:55

5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:56

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 18

(B): TIPO: ácido Nucleico 10 (C) TIPO DE CADENA: Sencilla

(D) TOPOLOGÍA: Lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:56

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:57

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 20 (A) LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:57

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:58

30

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 22 TIPO: ácido Nucleico

35: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:58

40

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:59

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

45: (A) (B) LONGITUD: 22 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:59

50

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:60

55: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

60

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:60

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:61

5

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

10: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:62

15

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

20: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:62

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:63

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

30: (A) (B) LONGITUD: 18 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(Xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:63

35

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:64

40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 19 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

45

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:64

50: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:65

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:65

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:66

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:66

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:67

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:67

25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:68

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 21

(B): TIPO: ácido Nucleico 30 (C) TIPO DE CADENA: Sencilla

(D) TOPOLOGÍA: Lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:68

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:69

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 18

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) ESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 69 35

(2): NFORMACI�N PARA SEQ ID NO:70

50

(i): CACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): ESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70

(2): NFORMACI�N PARA SEQ ID NO:71

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 20 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.-71

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:72

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72

25: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:73

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 26 TIPO: ácido Nucleico

30: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:74

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 26

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74 35

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:75

50

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:75

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:76

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:76

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:77

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 20 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:77

25: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:78

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

30: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:78

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:79

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:79 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:83

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:80

50

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:80

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:81

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 18 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:81

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:82

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:82

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD:23

(B): TIPO: ácido Nucleico 30 (C) TIPO DE CADENA: Sencilla

(D) TOPOLOGÍA: Lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:83

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:84

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:84

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:85

50

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:85

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:86

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:86

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:87

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:87

25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:88

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:88

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:89

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:89

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:90

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:90

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:91

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 22 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:91

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:92

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:92

25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:93

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico 30 (C) TIPO DE CADENA: Sencilla

(D) TOPOLOGÍA: Lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:93

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:94

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 21

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:94 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:98

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:95

50

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 22 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:95

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:96

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 23 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:96

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:97

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 20 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:97

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico 30 (C) TIPO DE CADENA: Sencilla

(D) TOPOLOGÍA: Lineal

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:98

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:99

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:100

50

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 23 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:100

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:101

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:101

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:102

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:102

25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:103

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ.ID NO:103

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:104

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(A)

(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:104

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:105

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:105

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:106

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:106

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:107

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ IDNO:107

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:109

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19

(B): TIPO: Nucleic Acid

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:109

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:110

(i): SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:110

25

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:108

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 22 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:108

35

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:111

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:111

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:112

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:112

25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:113

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUDi 23

(B) TIPO: ácido Nucleico 30 (C) TIPO DE CADENA: Sencilla

(D) TOPOLOGÍA: Lineal

(Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:113

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:114

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 30

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:114 35

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:115

50

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 38 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:115

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:116

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5: (A) (B) LONGITUD: 24 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:116

10

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:117

15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD:' 19 TIPO: ácido Nucleico

(C) (D): TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

20

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:117

25: (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:118

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 21 TIPO: ácido Nucleico

30: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA: Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:118

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:119

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 21

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

45 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:119

(2): INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:120

50

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B): LONGITUD: 20 TIPO: ácido Nucleico

55: (C) (D) TIPO DE CADENA: Sencilla TOPOLOGÍA:. Lineal

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:120

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:121

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:121

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:122

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleotide ssDNA

(iii) HIPOTÉTICO: no

(iv): FUENTE INMEDIATA:

(B) CLON AMPLIFIED: S125

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:122

(2): NFORMACI�N PARA SEQ ID NO:123

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:123

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:124

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:124

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:125

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 25

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:125

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:126

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

a.: LONGITUD: 20

b.: TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:126

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:127

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 16

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:127

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:128

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:128

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:129

(i) SEQUENCE'CHARACTERISTICS:

(A): LONGITUD: 25

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:129

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:130

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:130

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO: 131

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:131

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:132

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:132

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:133

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:133

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:134

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:134

(2): INFORMATION FOR SEQ ID NO:135

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:135

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:136

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:136

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:137

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:137

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:138

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:138

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:139

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 19

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:139

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:140

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:140

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:141

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 17

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:141

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:142

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:142

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:143

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 23

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:143

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:144

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 22

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:144

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:145

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 24

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Linea

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:145

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:146

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 18

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:146

(2): INFORMACI�N PARA SEQ ID NO:147

(i): CARACTER�STICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20

(B): TIPO: ácido Nucleico

(C): TIPO DE CADENA: Sencilla

(D): TOPOLOG�A: Lineal

(xi): DESCRIPCI�N DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:147

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar una secuencia de ADN objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem que tiene una incidencia baja de artefactos por tartamudeo, que comprende las etapas de:

(a)

proporcionar una muestra de ADN que tiene al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem es una región del ADN que contiene al menos una unidad de repetición que consiste en una secuencia de cinco (5), seis (6), o siete (7) pares de bases repetidas en t�ndem al menos dos (2) veces; y

(b)

detectar la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem en la muestra de ADN, en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem de la muestra de ADN proporcionada en la etapa (a) se amplifica antes de la etapa (b), y en la que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem se amplifica mediante el uso de al menos un cebador oligonucleot�dico, que comprende una secuencia que es complementaria y que flanquea a una región de un marcador de ADN bicatenario que contiene una secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem, en la que la secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem es una región del marcador de ADN que contiene la secuencia de unidades de repetición repetidas en t�ndem al menos dos (2) veces,

con tal de que el marcador de ADN tenga la secuencia SEQ ID N�:2.
2.

El método de la reivindicación 1, en el que la muestra de ADN proporcionada en la etapa (a) es ADN gen�mico humano.
3.

El método de la reivindicación 2, en el que el cebador oligonucleot�dico usado en la amplificación de la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem tiene un marcador fluorescente unido de manera covalente a él.
4.

El método de la reivindicación 1, que comprende además detectar los polimorfismos en la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem amplificada.
5.

El método de la reivindicación 4, en el que el cebador oligonucleot�dico proporcionado en la etapa (b) comprende una secuencia seleccionada de uno de los grupos de secuencias que consisten en: SEQ ID N�:46, SEQ ID N�:47, SEQ ID N�:48, SEQ ID N�:49, SEQ ID N�:50, SEQ ID N�:51, SEQ ID N�:52, SEQ ID N�:53, SEQ ID N�:54, SEQ ID N�:55, SEQ ID N�:56, SEQ ID N�:57, y SEQ ID N�: 58.
6.

Un equipo para la detección de al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem en una muestra de ADN, en el que la secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem es una región de la muestra de ADN que contiene al menos una unidad de repetición que consiste en una secuencia de cinco (5), seis (6), o siete

(7) pares de bases repetidas en t�ndem al menos dos (2) veces, y el equipo comprende:

un recipiente que tiene un par de cebadores oligonucleot�dicos para amplificar la al menos una secuencia objetivo de repeticiones intermedias en t�ndem, en el que cada cebador oligonucleot�dico comprende una secuencia de ácidos nucleicos de una longitud mayor de 15 nucleótidos, cuyas secuencias son complementarias a las cadenas opuestas de un marcador de ADN bicatenario que flanquea a la secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem,

y en el que el marcador de ADN tiene la secuencia SEQ ID N�:2.
7.

El equipo de la reivindicación 6, que comprende además el marcador de ADN.
8.

Un cebador oligonucleot�dico que comprende una secuencia de una longitud mayor de 15 nucleótidos, cuya secuencia es complementaria a una cadena de un marcador de ADN bicatenario adyacente a una secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem, en el que la secuencia molde de repeticiones intermedias en t�ndem es una región del marcador de ADN bicatenario que contiene al menos una unidad de repetición que consiste en una secuencia de cinco (5), seis (6), o siete (7) pares de bases repetidas en t�ndem al menos dos (2) veces, en el que la secuencia del marcador de ADN bicatenario es SEQ ID N�:2.
9.

El cebador oligonucleot�dico de la reivindicación 8, en el que el cebador oligonucleot�dico comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID N�:46, SEQ ID N�:47, SEQ ID N�:48, SEQ ID N�:49, SEQ ID N�:50, SEQ ID N�:51, SEQ ID N�:52, SEQ ID N�:53, SEQ ID N�:54, SEQ ID N�:55, SEQ ID N�:56, SEQ ID N�:57, y SEQ ID N�: 58.
10.

Un equipo según la reivindicación 6, en el que al menos uno del par de cebadores oligonucleot�dicos es un cebador según la reivindicación 8 o la reivindicación 9.

Porcentaje de tartamudeo

Porcentaje de tartamudeo

Porcentaje de tartamudeo

Porcentaje de tartamudeo

REPETICI�N DE PENTANUCLE�TIDOS POLIM�RFICA G210