ES2288760T3 - Ensamblaje electrocinetico controlado por luz de particulas proximas a superficies. - Google Patents

Ensamblaje electrocinetico controlado por luz de particulas proximas a superficies. Download PDF

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Abstract

SE EXPONEN UN PROCEDIMIENTO Y APARATOS PARA LA MANIPULACION DE MATERIAL PARTICULADO COLOIDAL Y BIOMOLECULAS EN LA ZONA DE CONTACTO ENTRE UN ELECTRODO AISLANTE, COMO EL OXIDO DE SILICIO, Y UNA SOLUCION DE ELECTROLITO. EL CONJUNTO ELECTROCINETICO DE PARTICULAS CERCANAS A LA SUPERFICIE, CONTROLADO POR LA LUZ, SE BASA EN LA COMBINACION DE TRES ELEMENTOS FUNCIONALES: EL CONJUNTO DE AGREGADOS PLANOS INDUCIDO POR EL CAMPO ELECTRICO DE CA; LA CONFORMACION DE LA ZONA DE CONTACTO ENTRE ELECTROLITO/OXIDO DE SILICIO/SILICIO PARA EJERCER CONTROL ESPACIAL DEL PROCESO DE MONTAJE; Y EL CONTROL EN TIEMPO REAL DEL PROCESO DE MONTAJE A TRAVES DE ILUMINACION EXTERIOR. LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN CONJUNTO DE OPERACIONES FUNDAMENTALES QUE PERMITEN EL CONTROL INTERACTIVO DE LA CREACION Y COLOCACION DE SERIES PLANAS DE VARIOS TIPOS DE PARTICULAS Y BIOMOLECULAS Y LA MANIPULACION DE LA FORMA Y EL TAMAÑO DE LA SERIE. LA PRESENTE INVENCION PERMITE LA PREPARACION DE LAS MUESTRAS Y SU MANIPULACION PARA ENSAYOSDIAGNOSTICOS Y ENSAYOS BIOQUIMICOS EN FORMATO DE SERIE, ASI COMO LA INTEGRACION FUNCIONAL DE ESTAS OPERACIONES. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA LA CREACION DE SUPERFICIES DE MATERIAL CON PROPIEDADES DESEADAS Y PARA LA FABRICACION DE COMPONENTES OPTICOS MONTADOS EN SUPERFICIE.

Description

Ensamblaje electrocinético controlado por luz de partículas próximas a superficies.
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente al campo de la ciencia de materiales y química analítica, en particular a un procedimiento para manipular partículas y un aparato de clasificación.
La presente invención se refiere a la realización de un sistema completo funcionalmente integrado para la implementación de análisis bioquímicos en un formato miniaturizado plano sobre la superficie de un sustrato conductor y/o fotoconductor, con aplicaciones en el descubrimiento de fármacos farmacéuticos y agrícolas y en diagnosis in vitro o genómica. Además, el procedimiento y el aparato de la presente invención pueden usarse para crear superficies de materiales que presentan relieve topográfico deseable y funcionalidad química, y para fabricar elementos ópticos montados sobre superficies tales como matrices de lentes.
Antecedentes de la invención I - Iones, campos eléctricos y flujo de fluidos: formación de matrices planas de perlas inducida por campos
Electroquinesia se refiere a una clase de fenómenos provocados por la acción de un campo eléctrico en los iones móviles que rodean objetos cargados en una disolución de electrolito. Cuando un objeto de carga superficial dada se sumerge en una disolución que contiene iones se forma una nube difusa de iones para seleccionar la carga superficial del objeto. Esta disposición de una capa de cargas (inmóviles) asociadas con un objeto sumergido y la nube de selección de contraiones (móviles) en disolución se denomina en lo sucesivo una "doble capa". En esta región de espesor pequeño pero finito, el fluido no es eléctricamente neutro. Por consiguiente, los campos eléctricos que actúan en esta región pondrán en movimiento iones en la capa difusa, y éstos arrastrarán a su vez el fluido de alrededor. Los campos de flujo resultantes reflejan la distribución espacial de la corriente iónica en el fluido. La electroósmosis representa el ejemplo más sencillo de un fenómeno electrocinético. Se produce cuando un campo eléctrico se aplica paralelo a la superficie de un recipiente de muestra o electrodo que presenta cargas superficiales fijadas, como en el caso de un electrodo de óxido de silicio (en el intervalo de pH neutro). Como los contraiones se aceleran en la doble capa del electrodo por el campo eléctrico, arrastran moléculas de disolvente y establecen un flujo de fluidos aparente. Este efecto puede variar sustancialmente en capilares estrechos y puede usarse para favorecer la creación de sistemas de bombeo de fluidos.
La electroforesis es un fenómeno relacionado que se refiere al transporte inducido por campos de partículas cargadas sumergidas en un electrolito. Como con la electroósmosis, un campo eléctrico acelera iones móviles en la doble capa de la partícula. Si, a diferencia del caso anterior, la propia partícula es móvil, el movimiento en la dirección opuesta compensará este movimiento de iones inducido por el campo (y la corriente iónica resultante). La electroforesis desempeña un papel importante en los procedimientos de recubrimiento industrial y, junto con la electroósmosis, es de particular interés en relación con el desarrollo de la electroforesis capilar en un pilar principal de la moderna tecnología de separación bioanalítica.
En geometrías confinadas, tales como la de una cámara de experimentación poco profunda en forma de un "sándwich" de dos electrodos planos, la distribución de cargas superficiales y la topografía de las superficies limitantes del electrodo desempeñan un papel particularmente importante en la determinación de la naturaleza y la estructura espacial del flujo electroosmótico. Una celda electroquímica tipo "sándwich" tal puede formarse por un par de electrodos separados por un hueco poco profundo. Normalmente, el electrodo inferior estará formado por una oblea de silicio tapada con óxido, mientras que el electrodo está formado por óxido de estaño-indio (ITO) conductor ópticamente transparente. La oblea de silicio (Si) representa una fina rodaja de un monocristal de silicio que está dopada para conseguir niveles adecuados de conductividad eléctrica y se aísla de la disolución de electrolito mediante una fina capa de óxido de silicio (SiOx).
La agregación reversible de perlas en agregados planos adyacentes a una superficie de electrodo puede inducirse por un campo eléctrico (de CC o CA) que se aplica perpendicular a la superficie del electrodo. Aunque el fenómeno se ha observado previamente en una celda formada por un par de electrodos de FTO conductores (Richetti, Prost y Barois, J. Physique Lettr. 45, L-1137 a L-1143 (1984)), sólo se ha demostrado recientemente que la interacción atractiva esencial entre perlas está mediada por flujo electrocinético (Yeh, Seul y Shraiman, "Assembly of Ordered Colloidal Aggregates by Electric Field Induced Fluid Flow", Nature 386, 57-59 (1997), cuyos contenidos se incorporan en este documento como referencia. Este flujo refleja la acción de faltas de uniformidad lateral en la distribución espacial de la corriente en la proximidad del electrodo. En el caso más sencillo, tales faltas de uniformidad se introducen mediante la mismísima presencia de una perla coloidal próxima al electrodo como resultado del hecho de que cada perla interfiere con el movimiento de iones en el electrolito. Por tanto, se ha observado que una perla individual, cuando se coloca próxima a la superficie del electrodo, genera un flujo toroidal de fluido centrado sobre la perla. Las faltas de uniformidad espacial en las propiedades del electrodo también pueden introducirse deliberadamente mediante varios procedimientos para producir flujo de fluidos lateral hacia regiones de baja impedancia. Estos procedimientos se describen más adelante en posteriores secciones.
Las partículas incrustadas en el flujo electrocinético se transportan (advección) a pesar de su naturaleza química o biológica específica, mientras que simultáneamente se altera el campo de flujo. Como resultado, el montaje de agregados y matrices planas inducido por el campo eléctrico se aplica a tales diversas partículas como: estructuras reticulares de polímeros coloidales ("perlas de látex"), vesículas de lípidos, cromosomas completos, células y biomoléculas que incluyen proteínas y ADN, además de coloides y agrupaciones metálicas o semiconductoras.
Para las aplicaciones que van a describirse es importante el hecho de que la interacción atractiva mediada por flujo entre perlas se extiende hasta distancias muy por encima de la dimensión característica de la perla. Los agregados planos se forman en respuesta a un campo eléctrico externamente aplicado y se desmontan cuando se elimina el campo. La intensidad del campo aplicado determina la intensidad de la interacción atractiva que soporta el procedimiento de montaje de la matriz y así selecciona la disposición específica adoptada por las perlas dentro de la matriz. Es decir, como una función de voltaje aplicado de manera creciente, las perlas forman primero agregados planos en los que las partículas son móviles y están empaquetadas de manera suelta, a continuación adquieren un empaquetamiento más apretado y finalmente presentan una disposición espacial en forma de una matriz cristalina, u ordenada, similar a una balsa de burbujas. La secuencia de transiciones entre estados de orden interno creciente es reversible, incluyendo el desmontaje completo de agregados planos cuando se elimina el voltaje aplicado. En otra disposición, a baja concentración inicial, las perlas forman pequeñas agrupaciones que a su vez adquieren posiciones dentro de una "superestructura" ordenada.
II - Modelado de superficies de electrodos de óxido de silicio
El modelado de electrodos según un diseño predeterminado facilita la modificación casi permanente de la impedancia eléctrica de la estructura EIS (electrolito-aislante-semiconductor) de interés en este documento. Mediante la modulación espacial de la impedancia de EIS, el modelado de electrodos determina la corriente iónica en la proximidad del electrodo. Dependiendo de la frecuencia del campo eléctrico aplicado, las perlas buscan o evitan regiones de alta corriente iónica. Por tanto, el modelado espacial lleva el control externo explícito de la colocación y forma de matrices de perlas.
Aunque el modelado puede lograrse de muchas maneras, dos procedimientos ofrecen ventajas particulares. Primero, el recrecimiento mediado por UV de una capa de óxido fino sobre una superficie de silicio adecuadamente preparada es una metodología conveniente que evita el modelado fotolitográfico resistente y el ataque con ácido. En presencia de oxígeno, la iluminación con UV media la conversión de silicio expuesto a óxido. Específicamente, el espesor de la capa de óxido depende del tiempo de exposición y, por tanto, puede modularse espacialmente colocando máscaras modeladas en el paso de iluminación con UV. Esta modulación en el espesor, con variaciones típicas de aproximadamente 10 Angstrom, se traduce en modulaciones espaciales en la impedancia de la interfase Si/SiOx, a la vez que deja una superficie superior plana y químicamente homogénea expuesta a la disolución de electrolito. Segundo, las modulaciones espaciales en la distribución de la carga superficial del electrodo puede producirse mediante oxidación fotoquímica mediada por UV de una especie química adecuada que primero se deposita como una película monocapa sobre la superficie de SiOx. Este procedimiento permite un control excelente de características locales de la doble capa del electrodo y, por tanto, del flujo electrocinético.
Una variación de esta modulación fotoquímica es la creación de gradientes laterales en la impedancia de EIS y por tanto en la corriente generada en respuesta al campo eléctrico aplicado. Por ejemplo, esto se realiza fácilmente controlando la exposición de UV de manera que se introduce una lenta variación lateral en el espesor de óxido o en la densidad de carga superficial. Como se trata más adelante, el control de gradientes laterales sirve para introducir el transporte lateral de perlas y facilita la implementación de tales operaciones fundamentales como la captura y canalización de perlas a un destino predeterminado por conductos en forma de características de impedancia incrustadas en la interfase Si/SiOx. El modelado fotoquímico de capas superiores químicas funcionalizadas también se aplica a otros tipos de superficies de electrodos que incluyen ITO.
III - Modulación controlada por luz de la impedancia interfacial
La modulación espacial y temporal de la impedancia de EIS según un modelo de iluminación externa proporciona la base para controlar las fuerzas electrocinéticas que median la agregación de perlas. El montaje electrocinético modulado por luz de matrices coloidales planas facilita el control interactivo remoto de la formación, colocación y reorganización de matrices de perlas en respuesta a modelos de iluminación correspondientes y así ofrece un amplio intervalo de manipulaciones interactivas de perlas coloidales y biomoléculas.
Para entender el principio de esta metodología será práctico revisar brevemente propiedades fotoeléctricas relevantes de semiconductores, o más específicamente, aquellas de la estructura de EIS formada por la disolución de electrolito (E), la capa de SiOx aislante (I) y el semiconductor (S). Las características fotoeléctricas de esta estructura están íntimamente relacionadas con las de un metal-aislante-semiconductor (MIS) habitual o dispositivos de metal-óxido-semiconductor (MOS) que se describen en S.M. Sze, "The Physics of Semiconductors", 2ª edición, capítulo 7 (Wiley Interscience 1981).
La interfase entre el semiconductor y la capa de óxido aislante merece especial atención. Para el entendimiento de la respuesta eléctrica de la estructura de MOS a la luz es decisivo el concepto de una región de carga del aire de espesor pequeño pero finito que se forma en la interfase Si/SiOx en presencia de un potencial de sesgo. En el caso de la estructura de EIS, en condiciones casi muy especiales está presente un sesgo eficaz en forma de un potencial de unión. La región de carga del aire se forma en respuesta a la distorsión de la valencia del semiconductor y las bandas de conducción ("banda de deformación") en la proximidad de la interfase. Esta condición refleja a su vez el hecho de que, aunque a través de la interfase hay un potencial de sesgo, idealmente no hay transferencia de carga en presencia del óxido aislante. Es decir, en lenguaje electroquímica, la estructura de EIS elimina los efectos faradaicos. En cambio, las cargas de signo opuesto se acumulan a ambos lados de la capa de óxido aislante y generan una polarización finita.
En presencia de un sesgo inverso, los bordes de la banda de valencia y de conducción de un semiconductor dopado en n se doblan hacia arriba próximos a la interfase Si/SiOx y los electrones fluyen de la región interfacial en respuesta al gradiente de potencial correspondiente. Como resultado, en la proximidad de la interfase Si/SiOx se forma una capa de depleción de soportes mayoritarios. La absorción de luz en el semiconductor proporciona un mecanismo para crear pares electrón-hueco dentro de esta región. Siempre que no se recombinen instantáneamente, los pares electrón-hueco se dividen por el campo eléctrico que actúa localmente y fluye una corriente fotoeléctrica correspondiente. Este último efecto es el que proporciona el control del montaje electrocinético de perlas en la disolución de electrolito.
Para entender en más detalle la dependencia de la frecuencia relevante de la modulación inducida por luz de la impedancia de EIS, son de interés dos aspectos del circuito equivalente que representan la estructura de EIS. Primero, existen analogías directas entre las características eléctricas detalladas de la doble capa eléctrica en la interfase electrolito-óxido, y la capa de depleción en la interfase entre el semiconductor y el aislante. Como con la doble capa, la capa de depleción presenta características eléctricas similares a las de un condensador con una capacidad dependiente del voltaje. Como se trata, la iluminación sirve para reducir la impedancia de la capa de depleción. Segundo, dada su respuesta eléctrica capacitiva, la capa de óxido sólo pasará corriente por encima de una frecuencia característica ("umbral"). Por consiguiente, siempre que la frecuencia del voltaje aplicado exceda la umbral, la iluminación puede reducir la impedancia eficaz de toda la estructura de EIS.
Esta reducción eficaz de la impedancia de EIS también depende de la intensidad de la luz que determina la velocidad de generación de pares electrón-hueco. En ausencia de recombinación significativa, la mayoría de los electrones fotogenerados fluyen de la región de depleción y contribuyen a la corriente fotoeléctrica. La carga de los huecos restantes se acumula próxima a la interfase Si/SiOx y selecciona el campo eléctrico que actúa en la región de depleción. Como resultado, aumenta la velocidad de recombinación y la eficiencia de la separación electrón-hueco y, por tanto, disminuye la corriente fotoeléctrica. Por tanto, para valores de frecuencia y amplitud dados del voltaje aplicado se espera que, como la intensidad de iluminación aumenta, la corriente aumente inicialmente hasta un nivel máximo y a continuación disminuya. Similarmente, la impedancia disminuye inicialmente hasta un valor mínimo (a corriente máxima) y a continuación disminuye.
Esta dependencia de la intensidad puede usarse para favorecer la inducción del desplazamiento lateral de perlas entre regiones completamente expuestas y parcialmente enmascaradas de la interfase. Como aumenta la intensidad de iluminación, las regiones completamente expuestas se corresponderán con las regiones de la interfase de menor impedancia, y por tanto la mayor corriente, y las perlas se atraerán en estas regiones. Como las regiones completamente expuestas alcanzan el estado de corriente fotoeléctrica en disminución, la impedancia de EIS eficaz en aquellas regiones puede superar la de las regiones parcialmente enmascaradas, con una inversión resultante del gradiente lateral en la corriente. Entonces, las perlas se extraerán de las regiones completamente expuestas. Adicionalmente, los cambios que varían con el tiempo en el modelo de iluminación pueden usarse para efectuar el movimiento de perlas.
IV - Integración de análisis bioquímicos en un formato plano miniaturizado
La implementación de ensayos en un formato de matriz plana, particularmente en el contexto de la selección biomolecular y la diagnosis médica, tiene la ventaja de un alto grado de paralelismo y automatización de manera que se produzca un alto rendimiento en complejos protocolos analíticos de múltiples etapas. La miniaturización dará como resultado una disminución en los tiempos de mezclado relevantes que reflejan la pequeña escala espacial, además de una reducción de los volúmenes de muestra y reactivo requeridos, además de requisitos de potencia. La integración de técnicas analíticas bioquímicas en un sistema miniaturizado sobre la superficie de un sustrato plano ("chip") daría mejoras sustanciales en el rendimiento, y reducción en el coste, de procedimientos analíticos y diagnósticos.
Dentro del contexto de la manipulación y el análisis de ADN, las etapas iniciales se han tomado en esta dirección (es decir, miniaturización) mediante la combinación en un sustrato de vidrio, el tratamiento de la enzima de restricción de ADN y la posterior separación de los productos de digestión enzimática por electroforesis capilar, véase, por ejemplo, Ramsey, publicación PCT número WO96/04547, cuyos contenidos se incorporan en este documento por referencia, o la amplificación de secuencias ADN mediante aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con posterior separación electroforética, véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. número 5.498.392 y 5.587.128 concedidas a Wilding y col., cuyos contenidos se incorporan en este documento por referencia.
Aunque estos procedimientos de laboratorio habituales se han demostrado en un formato miniaturizado, no se han usado para formar un sistema completo. Un sistema completo requerirá manipulación adicional tal como procesamiento de muestras de entrada, ensayos de unión y funcionales y la detección de pequeñas señales, seguido por el procesamiento de la información. El reto real es el de la integración funcional completa ya que es aquí donde se manifestarán por sí mismas la arquitectura del sistema y las limitaciones del diseño en los componentes individuales. Por ejemplo, se requiere un procedimiento fluídico para concatenar etapas analíticas que requieren la separación espacial, y posterior transporte a nuevas localizaciones, de conjuntos de analitos. Se han considerado varias posibilidades que incluyen el bombeo electroosmótico y el transporte de gotitas mediante gradientes inducidos por la temperatura en la tensión superficial local. Aunque son factibles en experimentos de demostración, estas técnicas establecen bastantes requisitos estrictos al modelo de sistemas globales para manipular los voltajes de CC muy considerables requeridos para el mezclado electroosmótico eficiente o para limitar el calentamiento del sustrato cuando se generan gradientes de tensión superficial térmicamente generados de manera que se eviten efectos adversos en la proteína y otras muestras. El documento WO-96/07917 describe un sistema microelectrónico autodireccionable para manipular ADN.
Resumen de la invención
La presente invención combina tres elementos funcionales separados para proporcionar un procedimiento y aparato que facilita la manipulación espacial interactiva en tiempo real de partículas coloidales ("perlas") y moléculas en una interfase entre un electrodo sensible a la luz y una disolución de electrolito. Los tres elementos funcionales son: el montaje inducido por campo eléctrico de matrices planas de partículas en una interfase entre un electrodo aislante o uno conductor y una disolución de electrolito; la modulación espacial de la impedancia interfacial por medio del recrecimiento de óxido mediado por UV o modelado químico en la superficie; y, finalmente, el control interactivo en tiempo real del estado de la impedancia interfacial por luz. Las aptitudes de la presente invención se originan en el hecho de que la distribución espacial de corrientes iónicas, y por tanto del flujo de fluidos que media el montaje de la matriz, puede ajustarse mediante intervención externa. Es de particular interés la introducción de faltas de uniformidad espaciales en las propiedades de la estructura de EIS relevante. Como se describe en este documento, tales faltas de homogeneidad, de naturaleza permanente o temporal, pueden producirse aprovechándose de las propiedades físicas y químicas de la estructura de EIS.
La invención se refiere a la realización de un sistema completo funcionalmente integrado para la implementación de análisis bioquímicos en un formato miniaturizado plano sobre la superficie de una oblea de silicio o sustrato similar. Además, el procedimiento y aparato de la presente invención pueden usarse para crear superficies de materiales que presentan relieve topográfico deseable y funcionalidad química, y para fabricar elementos ópticos montados sobre superficies tales como matrices de lentes.
La combinación de tres elementos funcionales dota a la presente invención de un conjunto de aptitudes operacionales para manipular perlas y matrices de perlas en una geometría plana para permitir la implementación de técnicas analíticas bioquímicas. Estas operaciones fundamentales se aplican a agregados y matrices de partículas tales como: estructuras reticulares de polímeros coloidales, vesículas, cromosomas completos, células y biomoléculas que incluyen proteínas y ADN, además de coloides y agrupaciones metálicas o semiconductoras.
Los conjuntos de partículas coloidales pueden capturarse y pueden formarse matrices en áreas designadas sobre la superficie del electrodo (figuras 1a, 1b y figuras 2a-d). Las partículas, y las matrices que forman en respuesta al campo aplicado, pueden canalizarse a lo largo de conductos de cualquier configuración que están o incrustados en la interfase Si/SiOx mediante modelado de óxido por UV o delinearse mediante un modelo externo de iluminación. Esta canalización (figuras 1c, 1d, 1e, figuras 3c, 3d) en una dirección perpendicular a la del campo eléctrico aplicado se basa en gradientes laterales en la impedancia de la estructura de EIS y, por tanto, en la corriente inducida por el campo. Como se trata en este documento, tales gradientes pueden introducirse mediante modelos apropiados de iluminación, y esto proporciona los medios para implementar una versión controlada de translocalización (figura 1e). El flujo electrocinético que media el procedimiento de montaje de matrices también puede aprovecharse para el alineamiento de partículas alargadas, tales como ADN, próximas a la superficie del electrodo. Además, la presente invención permite la realización de procedimientos para clasificar y separar partículas.
Las matrices de partículas coloidales pueden colocarse en áreas designadas y confinarse allí hasta que se liberen o desmonten. La forma global de la matriz puede delinearse mediante modelado de óxido por UV o, en tiempo real, modelando el modelo de iluminación. Esta capacidad posibilita la definición de compartimentos funcionalmente distintos, permanentes o temporales, sobre la superficie del electrodo. Las matrices pueden someterse a cambios de forma impuestos en tiempo real, y pueden fusionarse con otras matrices (figura 1f) o dividirse en dos o más submatrices o agrupaciones (figura 1g, figuras 4a, 4b). Además, el estado local de orden de la matriz, además de la densidad de partícula lateral, puede ajustarse reversiblemente mediante el campo eléctrico externo o modificarse mediante la adición de un segundo componente de perlas químicamente inerte.
La presente invención también permite la combinación de operaciones fundamentales para desarrollar productos y procedimientos cada vez más complejos. Los ejemplos dados en este documento describen la implementación de procedimientos analíticos esenciales para una amplia variedad de problemas en la ciencia de materiales, descubrimiento de fármacos farmacéuticos, mapeo genómico y tecnología de secuenciación. Para la integración de estas y otras funcionalidades en una geometría plana es importante la capacidad, proporcionada por la presente invención, de imponer compartimentación temporal o permanente con el fin de aislar espacialmente procedimientos simultáneos o etapas secuenciales en un protocolo y la capacidad para manipular conjuntos de partículas de un modo que permita la concatenación de procedimientos analíticos que se realizan en diferentes áreas designadas sobre las superficies de sustratos.
Breve descripción de los dibujos
Otros objetos, características y ventajas de la invención tratada en la breve explicación anterior se entenderán más claramente cuando se tomen junto con la siguiente descripción detallada de una realización que solamente será entendida como ilustrativa, y los dibujos adjuntos que reflejan aspectos de esa realización, en la que:
Las figs. 1a-h son ilustraciones de las operaciones fundamentales para la manipulación de perlas;
las figs. 2a y 2b son fotografías que ilustran el procedimiento de captura de partículas en áreas designadas sobre la superficie del sustrato;
las figs. 2c y 2d son fotografías que ilustran el procedimiento de exclusión de partículas de áreas designadas sobre la superficie del sustrato;
las figs. 3a y 3b son ilustraciones del perfil de óxido de un electrodo de Si/SiOx;
las figs. 3c y 3d son fotografías de la canalización de partículas a lo largo de conductos;
las figs. 4a y 4b son fotografías de la división de un agregado existente en pequeñas agrupaciones;
la fig. 5 es una fotografía de la acción de lente de las perlas coloidales individuales;
las figs. 6a-c son ilustraciones en vista lateral de un procedimiento de transferencia para la conservación del diseño de una placa de microtitulación a una celda plana;
la fig. 7 es una fotografía de la inclusión de partículas espaciadoras dentro de agrupaciones de perlas;
la fig. 8 es una ilustración de variaciones de ensayos de unión;
las figs. 9a y 9b son ilustraciones de dos mecanismos de clasificación de partículas;
la fig. 10 es una ilustración de una matriz plana de complejos sonda-diana anclados a perlas; y
la fig. 11 es una ilustración de estiramiento de ADN según la presente invención.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
Los tres elementos funcionales de la presente invención pueden combinarse de manera que proporcionen un conjunto de operaciones fundamentales para la manipulación espacial interactiva de partículas coloidales y moléculas, montadas en agregados planos adyacentes a una superficie del electrodo. En la siguiente descripción, las operaciones fundamentales en este "juego de herramientas" se describen con el fin de aumentar la complejidad. Específicamente, es útil adoptar un esquema de clasificación basado en el número total de entradas y salidas, o "terminales", implicadas en una operación dada. Por ejemplo, la fusión de dos matrices separadas, o conjuntos de partículas, en una sería una operación "tri-terminal", que implica dos entradas y una salida. La operación tri-terminal opuesta, que implica una entrada y dos salidas, es la división de una matriz dada en dos submatrices.
Las condiciones experimentales que dan los fenómenos descritos en las diversas fotografías incluidas en este documento son del siguiente modo. Se forma una celda electroquímica mediante un par de electrodos de ITO planos, compuestos por una capa de ITO depositada sobre un sustrato de vidrio, o mediante un electrodo de Si/SiOx en la parte inferior y un electrodo de ITO electrodo en la parte superior, separados por una separación típica de 50 micrómetros o menos. Dada la dependencia de las propiedades fotoeléctricas de la interfase Si/SiOx, el control por luz se basa en el uso de un electrodo de Si/SiOx. Se unen emplomados, en forma de alambres de platino, al electrodo de ITO y al de silicio, que primero se ataca con ácido para eliminar el óxido aislante en la región de contacto, por medio de epoxi plata. La celda se monta primero y a continuación se llena, basándose en la acción capilar, con una suspensión de perlas coloidales, 1 ó 2 micrómetros de diámetro, a una concentración típica del 0,1% de sólidos en disolución de azida 0,1 mM, correspondiente a aproximadamente 2x10
\circun{1}
8 partículas por mililitro. El número se elige de manera que dé entre ½ y 1 monocapa completa de partículas sobre la superficie del electrodo. Se han usado aniónicas (por ejemplo, poliestireno carboxilado, sílice), catiónicas (por ejemplo, poliestireno aminado) o nominalmente neutras (por ejemplo, poliestireno) para demostrar los fenómenos básicos que soportan los tres elementos funcionales de la presente invención. El electrodo de silicio se fabricó a partir de una parte de 1 pulgada cuadrada (6,45 cm^{2}) de una oblea de Si (100), normalmente 200-250 micrómetros de espesor, dopada en n a normalmente 0,01 Ohm\cdotcm de resistividad, y tapada con un óxido fino de normalmente 30-40 Angstrom de espesor. Una capa de óxido gruesa de normalmente 6000-8000 Angstrom de espesor, crecida en condiciones habituales en un horno a 950 grados C, puede atacarse con ácido mediante fotolitografía habitual para definir las estructuras de interés. Alternativamente puede recrecerse una capa de óxido fino sobre una superficie previamente decapada de orientación (100) con iluminación UV. Dada su facilidad de implementación y ejecución, el recrecimiento de óxido mediado por UV es la técnica preferida: proporciona los medios para modelar la superficie colocando una máscara de cuarzo que representa el modelo deseado en el paso de iluminación UV y deja una superficie superior topográficamente plana, químicamente homogénea. Para evitar la adsorción de partículas no específicas en la superficie del electrodo deben mantenerse estrictas condiciones de limpieza, tales como aquellas que se exponen más adelante en Condiciones experimentales generales.
La operación fundamental de un solo terminal es una operación de "captura y retención" (figura 1a) que forma una matriz de partículas en un área designada de contorno arbitrario sobre la superficie que está delineada mediante modelado de óxido mediado por UV o mediante un modelo de iluminación correspondiente proyectado sobre una superficie de sustrato de Si/SiOx por lo demás uniforme. Las figuras 2a y 2b ilustran la captura de perlas sobre una superficie caracterizada por una región 22 de óxido muy fino (aproximadamente de 20-30 Angstrom de espesor) y consecuentemente de baja impedancia, mientras que la superficie restante está cubierta con el óxido grueso original con consecuentemente alta impedancia. En la figura 2a no hay campo aplicado y, por tanto, no se produce captura de perlas. A diferencia, en la figura 2b se aplica un campo eléctrico (fuente de 10 V p-p, 1 kHz) y la captura de perlas se produce dentro de la región 22 de óxido fino. En estas condiciones, una matriz empieza a crecer en el plazo de menos de un segundo y continúa creciendo durante aproximadamente los 10 segundos siguientes a medida que las perlas llegan de distancias cada vez más largas para añadirse al perímetro de crecimiento exterior de la región 22. El crecimiento se detiene cuando la matriz se aproxima al límite externo del área diana delineada, es decir, el área definida por el óxido fino que tiene una baja impedancia. El estado interno de orden del agregado de perlas capturado se determina mediante la intensidad del voltaje aplicado, favoreciendo valores más altos cada vez más un empaquetamiento más denso de perlas y la formación eventual de matrices ordenadas que muestran una configuración hexagonalmente cristalina en forma de una balsa de burbujas. La matriz permanece en su lugar mientas que esté presente el voltaje aplicado. La eliminación del voltaje aplicado da como resultado el desmontaje de la matriz.
La operación de "captura y retención" también puede implementarse con iluminación con luz visible o infrarroja, por ejemplo mediante la simple proyección de una máscara modelada con el diseño deseado sobre el electrodo de Si/SiOx. Para este fin se ha usado un iluminador de microscopio de cuarzo de 100 W a intervalos regulares en un microscopio de UEM Zeiss, con aperturas o máscaras insertadas en el plano medio de la imagen para proporcionar la forma requerida en el plano del electrodo (cuando se enfoca apropiadamente en condiciones de iluminación Koehler). Alternativamente, también se ha usado un diodo láser IR con salida de 3 mW a 650-680 nm. El uso de iluminación externa en lugar de modelado de óxido para el confinamiento espacial de partículas permite modificar fácilmente el modelo de confinamiento.
Relacionado con la "captura y retención", la operación de un solo terminal de "exclusión y retención" (figura 1b) es la que despeja partículas de un área designada sobre la superficie. El aumento de la frecuencia del voltaje aplicado hasta aproximadamente 100 kHz conduce a una inversión en la preferencia de partículas que se montan en la parte de óxido fino de la superficie (por ejemplo, región 22, figura 2b) y en su lugar forman estructuras que decoran el exterior del perímetro del área diana. En lugar de basarse en este efecto, la exclusión de partículas de las áreas deseadas también se realiza, en analogía a las operaciones "captura y retención" originales, mediante la simple incrustación de la estructura correspondiente en la interfase Si/SiOx mediante recrecimiento de óxido mediado por UV. En el ejemplo de las figuras 2c y 2d esto se logra, por lo demás en condiciones idénticas a las descritas anteriormente, con respecto a las figuras 2a y 2b, aplicando 20 V (pp) a 10 kHz. Aunque el espesor de óxido en las áreas 24 no designadas es aproximadamente 30 Angstrom, el valor en las áreas 26 cuadradas designadas es aproximadamente 40 Angstrom, que implica en consecuencia una mayor impedancia a la frecuencia aplicada.
La operación de "captura y retención" posibilita la compartimentación espacial de la superficie del sustrato en regiones funcionalmente distintas. Por ejemplo, las partículas de tipo químico distinto, introducidas en la celda electroquímica a diferentes tiempos o inyectadas en diferentes localizaciones, pueden mantenerse en localizaciones espacialmente aisladas utilizando esta operación.
La operación fundamental de dos terminales es la translocalización (figura 1c), o el transporte controlado de un conjunto de partículas de la localización O a la localización F sobre la superficie; en este documento, O y F son áreas diana a las que pueden aplicarse las operaciones de un solo terminal anteriormente descritas. El transporte lateral unidimensional de perlas usado en la translocalización se logra imponiendo una corriente lateral a lo largo de un conducto que conecta las áreas O y F, como se muestra en las figuras 3a y 3b, o proyectando un modelo lineal correspondiente de iluminación. En esta operación de canalización, las perlas se mueven en la dirección de menor impedancia en la dirección de la flecha mostrada en las figuras 3a y 3b, según el flujo electrocinético esencial.
El modelado de óxido puede utilizarse de dos formas para crear una corriente lateral a lo largo de la interfase Si/SiOx. El procedimiento más sencillo se representa en la figura 3c y muestra una gran área 32 de retención abierta alimentada por tres conductos 34 estrechos definidos mediante ataque con ácido de un óxido térmico. Las perlas se mueven hacia el área 32 de retención a lo largo de los conductos 34 estrechos para formar una matriz de perlas. La figura 3d es una vista a escala ampliada de la matriz de la figura 3c. El principio remitido en la creación del transporte es el de cambiar la relación de aspecto (conducto estrecho conectado a amplia área de retención) del modelo incrustado con valores constantes de espesor de óxido fino dentro y óxido grueso fuera, como se ilustra en la figura 3a. En las figuras 3c y 3d, el voltaje aplicado fue 10 V (pp) a 10 kHz. Una aproximación alternativa para crear el transporte de perlas, posibilitado por el recrecimiento de óxido mediado por UV, es variar el espesor de óxido a lo largo del conducto de un modo controlado. Esto se realiza fácilmente mediante exposición de UV a través de un filtro graduado. Las diferencias en el espesor de óxido entre O y F de tan sólo 5-10 Angstrom son suficientes para efectuar el transporte lateral. En esta situación no necesita alterarse la relación de aspecto del conducto y las áreas de retención. Esto se ilustra en la figura 3b.
El uso de iluminación externa para definir conductos, variando la intensidad de iluminación a lo largo del conducto para crear el gradiente de impedancia requerido, tiene la ventaja de que el conducto sólo es una estructura temporal, y que la dirección de movimiento puede modificarse o invertirse si así se desea. La presente invención proporciona mecanismos de transporte lineal activo mediado por luz de agregados planos de perlas con control interactivo. Esto se logra ajustando un modelo externo de iluminación en tiempo real, bien moviendo el modelo a través de la superficie del sustrato de forma que se arrastre la matriz de perlas iluminadas o bien modulando electrónicamente la forma del modelo para inducir movimiento de partículas.
Dos modos de transporte activo mediado por luz son:
i) Translocalización directa ("rayo tractor"), que es un procedimiento para translocar matrices y delinear su forma global ajustando parámetros de manera que se favorezca el montaje de partículas dentro de áreas iluminadas de la superficie, como se describe en este documento. Las matrices siguen simplemente el modelo impuesto. La velocidad de movimiento está limitada por la movilidad de las partículas en el fluido y, por tanto, depende del diámetro de partícula y la viscosidad del fluido.
ii) Limitación de la matriz transversal es un mecanismo de transporte de perlas relacionado con el bombeo peristáltico de fluidos a través de tuberías flexibles. El componente de control por luz de la presente invención puede usarse para una simple implementación de este concepto muy general. Un agregado plano multicomponente de perlas se confina en un canal rectangular, mediante modelado por UV si así se desea, o simplemente mediante luz. Las perlas son libres para moverse a lo largo del canal por difusión (en cualquier dirección). Se establece un modelo de iluminación que se corresponde con la dimensión transversal del canal y a continuación se varía en el tiempo de manera que se produce una onda de limitación transversal que se desplaza en una dirección a lo largo del canal. Una onda de limitación tal puede establecerse de varios modos. Un procedimiento conceptualmente sencillo es proyectar una máscara de limitación sobre la muestra y mover el modelo de máscara proyectado del modo deseado. Este procedimiento también puede implementarse electrónicamente controlando el modelo de iluminación de una matriz adecuada de fuentes de luz, obviándose así la necesidad de partes móviles en el tren óptico.
El control del transporte lateral de perlas cambiando o moviendo modelos de iluminación tiene la ventaja de que puede aplicarse cuándo y dónde se requiera (sobre una superficie de sustrato dada), sin la necesidad de imponer gradientes en impedancia mediante modelado de UV predefinido. Por otra parte, un modelo de impedancia predefinido puede proporcionar aptitudes adicionales conjuntamente con el control por luz. Por ejemplo, puede desearse transportar perlas en contra de un gradiente de impedancia incrustada en el sustrato para separar perlas basándose en la movilidad.
Los conductos que conectan O y F no necesitan ser rectos: como con pistas que dirigen el movimiento de trenes, los conductos pueden moldearse en cualquier modo deseable (figura 1d). Una versión controlada de la translocalización (figura 1e) permite el transporte de partículas de O a F sólo después de que se abra el conducto (o se forme en tiempo real) mediante una señal de control. Esta operación utiliza modelado de óxido por UV para establecer dos áreas de retención, O y F, y también control por luz para establecer temporalmente un conducto que conecta O y F. Una implementación alternativa se basa en un gradiente de impedancia incrustada en óxido. Una zona a lo largo del conducto se ilumina con intensidad suficientemente alta para no dejar entrar partículas, bloqueándose así el paso. La eliminación (o reducción en la intensidad) de la iluminación abre el conducto. En el primer caso, la luz posibilita el transporte de perlas, mientras que en el último caso la luz evita el transporte de perlas.
Las operaciones fundamentales tri-terminal son la fusión y la división de conjuntos o matrices de perlas (figuras 1f y 1g). La fusión de dos matrices (figura 1f) implica las dos operaciones fundamentales previas de "captura y retención", aplicadas a dos conjuntos espacialmente aislados de perlas en las localizaciones O1 y O2, y su canalización respectiva a lo largo de conductos fusionados en un área diana común, y su canalización eventual, posterior a la mezcla, o una reacción química, en el destino final, una tercera área de retención, F. Esto se realiza, en las condiciones establecidas anteriormente, remitiéndose a las operaciones de un solo terminal y dos terminales controlados.
La división de una matriz en dos submatrices (figura 1g) es un caso especial de una operación de clasificación generalmente más compleja. La clasificación implica la clasificación de perlas de un conjunto o matriz dado en uno de dos subconjuntos, por ejemplo según su intensidad de fluorescencia. En el caso especial más sencillo, una matriz dada, retenida en el área O, va a dividirse en dos submatrices a lo largo de una línea de demarcación, y las submatrices van a moverse a las áreas diana F1 y F2. En las condiciones establecidas anteriormente, esto se realiza aplicando la operación de "captura y retención" a la matriz en O. Los conductos conectan O con F1 y F2. La iluminación de alta intensidad a lo largo de una línea estrechamente enfocada sirve para dividir la matriz de un modo definido, basándose de nuevo en la translocalización controlada para controlar el transporte a lo largo de conductos lejos del área de retención O. Una versión incluso más sencilla, denominada división indiscriminada, asigna aleatoriamente partículas a F1 y F2 mediante translocalización controlada de la matriz en O en P1 y F2 después de que los conductos se abran como se describe anteriormente.
Las figuras 4a y 4b muestran una variante en la que las perlas en la región O (figura 4a) se dividen en múltiples regiones F1, F2, ... Fn (figura 4b). Esta división reversible de un agregado o matriz en n submatrices, o agrupaciones, se realiza, para esferas de poliestireno carboxilado de 2 micrómetros de diámetro a una concentración correspondiente a una cobertura de electrodo de una pequeña fracción de una monocapa, a una frecuencia de 500 Hz, subiendo el voltaje aplicado de normalmente 5 V (pp) a 20 V (pp). Esta fragmentación de una matriz en agrupaciones más pequeñas refleja el efecto de una polarización de partículas inducida por campo. La división es útil para distribuir partículas en una matriz por un área más amplia de sustrato para presentar a posibles analitos en disolución, y para el posterior barrido de las agrupaciones individuales con instrumentos analíticos para hacer lecturas individuales.
Los tres elementos funcionales de la presente invención descritos en este documento también pueden combinarse para dar operaciones fundamentales adicionales para controlar la orientación de objetos anisotrópicos incrustados en el flujo electroosmótico creado por el campo eléctrico aplicado en la superficie del electrodo. La dirección del flujo en el plano del sustrato está controlada por gradientes en la impedancia que están moldeados del modo descrito junto con la operación de canalización. Esto se usa para alinear de manera controlada objetos anisotrópicos como se ilustran en la figura 1h, y puede aplicarse para estirar y alinear biomoléculas, tales como ADN.
Una operación fundamental adicional que complementa el conjunto previo es la de anclar permanentemente una matriz al sustrato. Esto se realiza del mejor modo remitiéndose a químicas de anclaje análogas a aquellas en las que se basan los reticulantes heterobifuncionales que se remiten a proteínas de anclaje mediante la formación de enlaces amida. El reconocimiento molecular, por ejemplo entre partículas biotiniladas y estreptavidina anclada a la superficie, proporciona otra clase de químicas de acoplamiento para anclaje permanente.
Condiciones experimental generales
Los elementos funcionales, concretamente el montaje de matrices planas de partículas inducido por campo eléctrico, la modulación espacial de la impedancia interfacial por medio de modelado de óxido mediado por UV o químico de la superficie y, finalmente, el control del estado de la impedancia interfacial por la luz que se usa en la presente invención, se han demostrado en estudios experimentales: estos estudios emplearon obleas de silicio dopadas en n (resistividades en el intervalo de 0,01 Ohm\cdot cm), tapadas con o capas de óxidos crecidas térmicamente de varios miles de Angstrom de espesor, o con capas de óxido fino, recrecidas después de la eliminación del óxido "nativo" original en HF, con iluminación UV de una fuente de deuterio en presencia de oxígeno a espesores típicos entre 10 y 50 Angstrom. El modelado litográfico de óxido térmicamente crecido empleó procedimientos habituales implementados en una mesa de laboratorio (en lugar de en una sala limpia) para producir características en el intervalo de varios micrómetros.
Las superficies se limpiaron cuidadosamente con arreglo a los protocolos de limpieza de RCA y Piranha habituales en la industria. Los sustratos se almacenaron en agua producida por un sistema de limpieza Millipore antes de uso. Las superficies se caracterizaron midiendo el ángulo de contacto presentado por una gotita de agua de 20 microlitros situada sobre la superficie y se observó (desde un lado) con un telescopio. El ángulo de contacto se define como el ángulo subtendido por la superficie y la tangente al contorno de la gotita (en vista lateral) en el punto de contacto con la superficie. Por ejemplo, una forma de una gotita perfectamente semiesférica se correspondería con un ángulo de contacto de 90 grados. La derivatización química de la superficie con mercapto-propil-trimetoxisilano (2% en tolueno seco) produjo superficies que dan ángulos de contacto típicos de 70 grados. La oxidación de la funcionalidad tiol terminal con radiación UV en presencia de oxígeno redujo el ángulo de contacto a cero en menos de 10 min de exposición a UV de la fuente de deuterio. De un modo similar se usaron otros reactivos de silano para producir superficies hidrófobas, caracterizadas por ángulos de contacto superiores a 110 grados.
Se construyeron celdas electroquímicas tipo "sándwich" sencillas empleando película de kaptón como espaciador entre Si/SiOx y el óxido de estaño-indio (ITO) conductor depositada en un sustrato de vidrio fino. Los contactos a los emplomados de platino se hicieron con epoxi plata directamente a la parte superior del electrodo de ITO y a la parte trasera (decapada de óxido) del electrodo de Si. En esta configuración de dos electrodos, los campos de CA se produjeron mediante un generador de funciones, con voltajes aplicados que oscilaban hasta 20 V y frecuencias que variaban de CC a 1 MHz, favoreciendo las frecuencias altas la formación de cadenas de partículas que conectan los electrodos. Las corrientes se monitorizaron con un potenciostato y se mostraron en un osciloscopio. Por comodidad, la epi-fluorescencia, además de la microscopía de contraste por interferencia diferencial de la reflexión, empleó iluminación láser. Las modulaciones inducidas por luz en la impedancia de EIS también se produjeron con un sencillo iluminador de microscopio de 100 W, además de con un diodo láser de 3 mW que emite luz a 650-680 nm.
Se emplearon perlas coloidales, tanto aniónicas como catiónicas, además de nominalmente neutras, con un diámetro en el intervalo de varios miles de Angstrom a 20 micrómetros, almacenadas en una disolución de NaN_{2}.
Se prestó mucha atención a la estabilidad coloidal estabilidad para evitar interacciones no específicas entre partículas y entre partículas y la superficie del electrodo. Se evitó escrupulosamente la contaminación bacteriana de suspensiones coloidales.
Las condiciones de operación típicas, a menos que se indique lo contrario, que produjeron la mayoría de los resultados descritos en este documento fueron: disoluciones de NaN_{2} 0,2 mM (azida de sodio), que contienen partículas a una concentración de manera que no producen más de una monocapa completa de partículas cuando se depositan sobre el electrodo; se aplicaron potenciales de CC en el intervalo de 1-4 V, y potenciales de CA en el intervalo de 1-10 V (pico a pico) y 500 Hz-10 kHz, con una separación de electrodos de 50 micrómetros; perlas aniónicas (poliestireno carboxilado) de 2 micrómetros de diámetro, además de perlas de poliestireno (nominalmente neutras) de 2-20 micrómetros de diámetro.
El procedimiento y el aparato de la presente invención pueden usarse en varias áreas diferentes, cuyos ejemplos se tratan en detalle. Cada ejemplo incluye información previa seguida por la aplicación de la presente invención a esa aplicación particular.
Ejemplo I Fabricación de superficies y recubrimientos con propiedades diseñadas
La presente invención puede usarse para fabricar superficies y recubrimientos planos con propiedades diseñadas. Específicamente, los elementos funcionales de la presente invención posibilitan la formación de matrices compuestas por partículas de un amplio intervalo de tamaños (aproximadamente de 100 Angstrom a 10 micrómetros) y composición química o funcionalidad superficial en respuesta a campos eléctricos de CA o CC. Estas matrices pueden colocarse y delinearse en áreas designadas del sustrato, y la separación entre partículas y el estado interno de orden dentro de la matriz puede controlarse ajustando el campo aplicado antes de anclar la matriz al sustrato. Las superficies recientemente formadas muestran características mecánicas, ópticas y químicas previamente diseñadas y pueden someterse a otra modificación mediante tratamiento posterior tal como reticulamiento químico.
La modificación mecánica y/o química de superficies y recubrimientos determina principalmente la interacción entre materiales en un amplio intervalo de aplicaciones que dependen de la baja adhesión (por ejemplo, las conocidas superficies "antiadherentes" importantes en artículos de uso doméstico) o baja fricción (por ejemplo, para reducir el desgaste en discos duros de ordenador), hidrofobia (la tendencia a repeler el agua, por ejemplo, de ciertos materiales textiles), actividad catalítica o funcionalidad química específica para o suprimir las interacciones moleculares con superficies o para promoverlas. Esta última área es de particular importancia para el desarrollo de biosensores y dispositivos bioelectrónicos fiables y duraderos. Finalmente, un gran número de aplicaciones dependen de las superficies de topografía y/o funcionalidad química definida para actuar como moldes que controlan la morfología del crecimiento de materiales depositados o como "superficies de mando" que dirigen el alineamiento de moléculas ópticamente activas en películas orgánicas finas depositadas, como en aplicaciones de pantallas de cristal líquido.
Se ha dedicado una exhaustiva investigación a la formación de superficies mediante la adsorción de películas orgánicas finas de composición conocida a partir de la fase líquida o gaseosa mediante varios procedimientos. A pesar de su aparente simplicidad y uso generalizado, estos procedimientos pueden ser difíciles de manipular para producir resultados fiables y reproducibles. Además, las películas moleculares no están bien adaptadas para producir superficies que muestren una topografía regular.
Una aproximación alternativa al problema es la modificación de superficies conductoras mediante deposición electroforética de partículas suspendidas. Esta es una técnica ampliamente usada en entornos industriales para producir recubrimientos de pintura de partes metálicas, y para depositar fósforo para pantallas de visualización. El procedimiento de deposición activo mejora significativamente la cinética de formación (a diferencia de la adsorción pasiva de películas orgánicas a partir de disolución), una consideración importante en aplicaciones prácticas. La deposición electroforética requiere altos campos eléctricos de CC y produce capas en las que las partículas están permanentemente adsorbidas a la superficie. Aunque las partículas en monocapas así depositadas están normalmente distribuidas aleatoriamente, también se conoce la formación de monocapas policristalinas de pequeños coloides de oro (150 Angstrom) sobre rejillas de cobre recubiertas con carbono. Sin embargo, en la mayoría de las aplicaciones no se desea el uso de rejillas de cobre recubiertas con carbono como sustratos.
Los procedimientos de la técnica anterior se han descrito para la formación de matrices planas ordenadas de partículas en ciertas condiciones. Por ejemplo, se conoce la formación de matrices coloidales ordenadas en respuesta a campos eléctricos de CA sobre electrodos de óxido de estaño-indio (ITO) conductores. Sin embargo, las capas resultantes estaban compuestas de pequeños parches de matrices ordenadas, distribuidas aleatoriamente por la superficie del sustrato de ITO por lo demás descubierto. Las matrices de perlas coloidales monodispersas y proteínas globulares también se han fabricado previamente usando flujo convectivo y fuerzas capilares. Sin embargo, este último procedimiento tiene la desventaja de que deja depositadas matrices de partículas inmovilizadas y expuestas al aire, dificultando la modificación de matrices mediante posterior química en fase líquida.
La presente invención proporciona un procedimiento para formar matrices planas con control exacto de las propiedades mecánicas, ópticas y químicas de la capa recientemente creada. Este procedimiento tiene varias ventajas distintas respecto a la técnica anterior. Éstas resultan de la combinación de la formación de matrices inducidas por campos eléctricos de CA sobre electrodos aislantes (Si/SiOx) que se modelan mediante recrecimiento de óxido mediado por UV. El procedimiento de la presente invención posibilita la formación de matrices planas ordenadas a partir de la fase líquida (en la que las partículas están originariamente suspendidas) en posiciones designadas, y según un contorno global dado. Esto elimina las desventajas anteriormente indicadas de la técnica anterior, es decir, estado seco, irregular o sin topografía, colocación aleatoria dentro de un agregado, inmovilización de partículas y colocación aleatoria incontrolada de parches ordenados sobre el sustrato.
Una ventaja de la presente invención es que las matrices se mantienen por el campo eléctrico aplicado en un entorno líquido. El procedimiento deja la matriz en un estado que puede desmontarse fácilmente, someterse a otras modificaciones químicas tales como reticulación, o hacerse permanente mediante anclaje químico al sustrato. Además, el entorno líquido es favorable para garantizar el correcto funcionamiento de muchas proteínas y montajes supramoleculares de proteínas de los que pueden componerse las matrices. También facilita la posterior deposición en fase líquida de capas adicionales de moléculas (mediante unión química a perlas o proteínas en la capa depositada), el ciclado de matrices entre estados de diferente densidad y orden interno (incluyendo el completo desmontaje de la matriz) en respuesta a campos eléctricos y la reticulación química de partículas en capas bidimensionalmente conectadas, o geles, formados, por ejemplo, a partir de esferas de sílice químicamente funcionalizadas. La presente invención puede practicarse en electrodos aislantes tales como silicio tapado con óxido para minimizar los procedimientos faradaicos que pueden afectar adversamente las reacciones químicas implicadas en el procedimiento de gelificación o en el anclaje de la matriz al sustrato. El uso de electrodos de Si/SiOx también posibilita el control de la colocación de matrices mediante iluminación externa.
La formación de matrices coloidales compuestas por pequeñas partículas según la presente invención proporciona un camino para la fabricación de superficies con estructura en relieve a la escala del diámetro de partícula. Aparte de sus propiedades ópticas, tales superficies "microrrugosas" son de interés como sustratos para la deposición de ADN de tal manera que se suavizan las limitaciones estéricas y, por tanto, se facilita el acceso de la enzima.
Las partículas a las que se aplica la invención incluyen esferas de sílice, coloides poliméricos, vesículas de lípidos (y montajes relacionados) que contienen proteínas de membrana tales como bacteriorrodopsina (bR)^{-}, un bomba de protones activada por la luz que puede extraerse en forma de parches y discos de membrana o vesículas. Las superficies estructuradas y funcionalizadas compuestas por pigmentos fotoactivos son de interés en el contexto de proporcionar elementos de dispositivos ópticos planos para el desarrollo de tecnología innovadora de visualización y memoria. Otras áreas de potencial impacto de las superficies topográficamente estructuradas y químicamente funcionalizadas son la fabricación de superficies de moldes para la nucleación controlada del crecimiento de capas depositadas y superficies de mando para el alineamiento de cristal líquido. La presente invención también posibilita la fabricación de superficies compuestas aleatoriamente heterogéneas. Por ejemplo, la formación de matrices compuestas por una mezcla de perlas hidrófobas e hidrófilas del mismo tamaño crea una superficie cuyas características de humectación y lubricación pueden controlarse mediante la composición de la matriz de perlas mezcladas depositadas. De este modo, la localización de las perlas individuales es aleatoria, pero puede controlarse la proporción relativa de cada tipo de perla dentro de la matriz.
Ejemplo II Montaje de matrices de lentes y elementos de difracción óptica
La presente invención puede usarse para fabricar matrices de lentes y otros elementos ópticos montados sobre superficies tales como rejillas de difracción. Los elementos funcionales de la presente invención posibilitan la colocación y delineación de estos elementos sobre ITO, facilitando la integración con la tecnología de visualización plana existente, y sobre Si/SiOx, facilitando la integración con la tecnología de dispositivos basados en silicio exis-
tente.
La sílice y otras partículas de óxido, perlas de látex polimérico u otros objetos de alto índice de refracción suspendidos en una disolución acuosa, refractarán la luz. Las matrices planas de perlas ordenadas también difractan la luz visible, generando un modelo de difracción característica de puntos nítidos. Este efecto forma la base de las técnicas holográficas en las aplicaciones de procesamiento de la información óptica.
A. - La presente invención proporciona el uso de matrices de perlas coloidales refractivas como elementos de recogida de luz en formatos de matrices planas conjuntamente con detección de bajo nivel de luz y obtención de imágenes CCD. CCD y los esquemas de detección de áreas relacionadas se beneficiarán de la mejora de la eficiencia de recogida de luz en ensayos de unión de fluorescencia o luminiscencia en fase sólida.
Este formato de ensayo se basa en la detección de una señal de fluorescencia que indica la unión de sondas a dianas ancladas a perlas en la proximidad del detector. Para maximizar el rendimiento, se desea monitorizar simultáneamente tantos acontecimientos de unión como sea posible. Es aquí donde la formación de matrices por los procedimientos de la presente invención es particularmente valiosa ya que facilita la colocación y el estrecho empaquetamiento de perlas en el área diana monitorizada por el detector CCD, mientras que simultáneamente proporciona el beneficio adicional de la acción de lente y el aumento resultante en la eficiencia de recogida de luz.
El aumento de la eficiencia de recogida se ha demostrado en experimentos que emplean perlas de poliestireno individuales grandes (10 micrómetros de diámetro) como elementos de lente para obtener imágenes de pequeñas perlas de poliestireno fluorescentes (1 micrómetro de diámetro). En las condiciones experimentales expuestas anteriormente, un voltaje aplicado de 5 V (pp) a 300 Hz indujo la recogida de pequeñas partículas bajo perlas grandes individuales en el plazo de un segundo. Esto se muestra en la figura 5, en la que perlas pequeñas solas, por ejemplo, 52, aparecen poco iluminadas, mientras que perlas pequeñas, por ejemplo, 54, agrupadas bajo una perla 56 grande, aparecen más brillantes y ampliadas. Las perlas pequeñas se vuelven a dispersar cuando se desconecta el voltaje.
B. - Se conoce el uso de matrices de perlas coloidales como rejillas de difracción y, por tanto, como elementos holográficos. Las rejillas de difracción tienen la propiedad de difractar la luz en un estrecho intervalo de longitudes de onda de manera que, para el ángulo de incidencia y la longitud de onda dados de la luz de iluminación, la matriz sólo pasará una longitud de onda específica (o una banda estrecha de longitudes de onda centrada en el valor nominal) que se determina mediante la separación entre partículas. Las aplicaciones ampliamente tratadas de rejillas de difracción oscilan del simple filtrado de longitudes de onda a la realización más exigente de filtros espacial y elementos holográficos relacionados que son esenciales en el procesamiento de la información óptica.
La presente invención proporciona un procedimiento rápido y muy controlado para formar matrices planas en un estado de orden cristalino que funcionarán como elementos de difracción óptica montados sobre superficies. Además, las superficies resultantes pueden diseñarse para mostrar relieve topográfico para mejorar la reflectividad selectiva de longitudes de onda. Estas matrices pueden formarse en áreas designadas sobre una superficie del sustrato. A diferencia del lento e incómodo procedimiento de la técnica anterior para fabricar tales matrices mediante la formación de cristales en equilibrio en disoluciones acuosas de bajo contenido de sales, la presente invención proporciona una aproximación novedosa para fabricar rápidamente y de manera fiable matrices de partículas en una interfase sólido-líquido. Esta aproximación se basa en la formación de matrices inducidas por campos para desencadenar el procedimiento, y en el modelado mediado por UV o control por luz para poner y moldear las matrices. Además, la distancia entre partículas, y el estado interno de orden, y por tanto las características de difracción de la matriz, pueden ponerse a punto ajustando el campo eléctrico aplicado. Por ejemplo, una transición orden-desorden reversible inducida por un campo en la matriz alterará el modelo de difracción de uno compuesto por puntos nítidos a uno compuesto por un anillo difuso. El montaje de tales matrices sobre la superficie de obleas de silicio, como se describe en este documento, proporciona un procedimiento directo de integración en diseños microelectrónicos existentes. Las matrices pueden bloquearse in situ mediante acoplamiento químico a la superficie del sustrato, o basándose en atracción de van der Waals entre perlas y sustrato.
Ejemplo III Un mecanismo novedoso para la realización de una pantalla basada en partículas
La presente invención proporciona los elementos para implementar el movimiento lateral de partículas como una aproximación novedosa a la realización de una pantalla basada en partículas. Los elementos de la presente invención proporcionan el control del movimiento lateral de pequeñas partículas en presencia de una matriz de lentes previamente formada compuesta por grandes partículas refractivas.
Las partículas coloidales se han empleado previamente en tecnología de pantallas planas. El principio de funcionamiento de estos diseños se basa en el movimiento electroforético de pigmentos en un fluido coloreado confinado entre dos electrodos planos. En el estado APAGADO (oscuro), los pigmentos están suspendidos en el fluido y el color del fluido define el aspecto de la pantalla en ese estado. Para conseguir el estado ENCENDIDO (brillante), las partículas se montan próximas al electrodo frontal (transparente) bajo la acción de un campo eléctrico. En éste último estado, la luz incidente es reflejada por la capa de partículas montada próxima al electrodo, y la pantalla aparece brillante. Se conocen pantallas prototipo que emplean pequeñas partículas de reflexión según este diseño. Sin embargo, estas pantallas experimentan varios problemas graves que incluyen: degradación electroquímica y falta de estabilidad coloidal como resultado de exposición prolongada a los altos campos eléctricos de CC requeridos para lograr velocidades de conexión aceptables; y falta de uniformidad introducida por la migración de partículas en respuesta a gradientes de campos inherentes en el diseño del esquema de direccionamiento.
La presente invención proporciona un mecanismo novedoso para el diseño de una pantalla basada en partículas que se aprovecha de la formación de matrices inducidas por campos eléctricos, además de desplazamientos laterales de partículas controlados inducidos por campos. En primer lugar se forma una matriz de lentes compuesta por perlas coloidales. Esta matriz de lentes también sirve como una matriz espaciadora para mantener una separación bien definida entre el electrodo inferior y el electrodo superior que ahora puede colocarse sobre la matriz (previamente formada). Esto facilita la fabricación de pantallas planas uniformes con una estrecha separación que se determina por el diámetro de partícula.
A continuación, las partículas coloidales pequeñas se añaden a la disolución de electrolito en la separación. Éstas pueden ser fluorescentes, o pueden reflejar luz blanca incidente. Bajo la acción de un campo eléctrico de CA de frecuencia apropiada, estas partículas pequeñas pueden moverse lateralmente para montarse preferencialmente dentro de la huella de una perla mayor. Cuando se observa a través de una perla mayor, las perlas fluorescentes pequeñas montadas bajo una perla grande aparecen brillantes como resultado del aumento de la eficiencia de recogida de luz proporcionada por la acción de lente de la perla grande; este es el estado ENCENDIDO (figura 5). Cuando se mueven fuera de la huella de la perla mayor, las partículas aparecen poco iluminadas y pueden hacerse completamente invisibles mediante enmascaramiento apropiado; este es el estado APAGADO. El movimiento lateral de partículas requerido puede inducirse mediante un cambio en el voltaje aplicado o un cambio en la intensidad de la luz. Cada perla grande o de lente introduce una falta de uniformidad lateral en la distribución de corriente dentro del electrolito debido a que la corriente se perturba por la presencia de cada perla de lente.
A diferencia de las pantallas de la técnica anterior, la presente invención emplea campos de CA, no de CC, y electrodos aislantes (en lugar de conductores), minimizándose así la degradación electroquímica. Se desea la falta de uniformidad lateral introducida por la matriz de lentes ya que introduce gradientes laterales en la distribución de corriente dentro de la celda de la pantalla. Estos gradientes median el movimiento lateral de perlas pequeñas durante cortas distancias características establecidas por el diámetro de las perlas de lente mayores, para efectuar una conexión entre los estados ENCENDIDO y APAGADO. Por tanto, la presente invención se adapta fácilmente la tecnología existente para direccionar matrices activas.
Ejemplo IV Transferencia para la conservación del diseño de suspensiones de perlas de placas de microtitulación a celdas planas
La presente invención proporciona un procedimiento para transferir suspensiones de perlas o biomoléculas a la superficie del electrodo de forma que se conserve la codificación espacial en la disposición original de depósitos, más comúnmente la disposición de pocillos 8x12 convencional en una placa de microtilulación. Un esquema de transferencia de fluidos tal es de significativa importancia práctica dado que las bibliotecas de compuestos se manipulan y se envían comúnmente en 8x12 pocillos.
La presente invención utiliza modelado químico para definir los compartimentos individuales para cada uno de los conjuntos MxN de perlas y por consiguiente los confina. En el presente ejemplo, el modelado se logra mediante oxidación fotoquímica mediada por UV de una monocapa de alquilsilano terminado en tiol que está quimiosorbido al sustrato de Si/SiOx. La oxidación parcial de restos tiol produce restos sulfonato y la superficie expuesta se convierte cargada e hidrófila. Las partes hidrófilas de la superficie, en forma de una rejilla de cuadrados o círculos, servirán como áreas de retención.
Según la presente invención, la primera función del modelado químico de la superficie en secciones hidrófilas rodeadas por partes hidrófobas es garantizar que las gotitas, dispensadas de diferentes pocillos, no se fusionarán una vez que estén en contacto con el sustrato. Por consiguiente, las suspensiones de perlas respectivas permanecerán espacialmente aisladas y conservarán el diseño de la placa de MxN pocillos original. El segundo papel del modelado químico de la superficie de la presente invención es imponer una distribución de cargas superficiales, en forma del modelo de rejilla MxN, que garantice que las matrices de perlas individuales permanecerán confinadas en sus áreas de retención respectivas, incluso cuando la fase líquida llegue a estar contigua.
El procedimiento de transferencia implica las etapas ilustradas en las figuras 6a-c. En primer lugar, como se muestra en vista lateral en la figura 6a, la placa MxN de pocillos 62 está registrada con el modelo 64 sobre la superficie del sustrato plano. Los fondos 62 de los pocillos están perforados para permitir la formación de gotas colgantes de suspensión o, preferentemente, el procedimiento se facilita mediante una parte integrante (no mostrada) que proporciona MxN embudos eficaces para ajustarse a las dimensiones geométricas de la placa MxN en la parte superior y reducir el tamaño del extremo dispensador. Una parte integrante dispensadora tal también garantizará el control exacto de volúmenes de gotitas, ajustado de manera que el área de retención diana se llena ligeramente en exceso sobre la superficie del sustrato modelado. A continuación se deposita el conjunto de MxN gotas poniéndolas en contacto con las áreas de retención hidrófilas del sustrato modelado y basándose en la acción capilar.
A continuación, la placa se retira y el electrodo superior se baja cuidadosamente para formar la celda electroquímica, haciendo el contacto en primer lugar como se muestra en la figura 6b, con áreas de retención individuales llenas de líquido sobre el sustrato en el que están confinadas las suspensiones. El llenado en exceso garantiza que el contacto se hace con suspensiones individuales. Ahora se enciende el campo eléctrico para inducir la formación de matrices en las áreas de retención MxN y para garantizar la conservación de la configuración global de los conjuntos MxN de perlas, mientras que la separación se cierra más (o se llena con tampón adicional) para fusionar eventualmente las gotitas individuales de suspensión en una fase líquida contigua como se muestra en la figura 6c. En la celda completamente montada de la figura 6c, mientras que las gotitas están fusionadas juntas, las perlas de cada gotita se mantienen en y se aíslan en sus posiciones respectivas, reflejando la disposición MxN original de pocillos. Por tanto, la presente invención proporciona las operaciones requeridas en esta implementación de un procedimiento de transferencia para la conservación del diseño para cargar celdas electroquímicas planas.
Ejemplo V Preparación de paneles heterogéneos de partículas
La presente invención proporciona un procedimiento para producir un panel heterogéneo de perlas y potencialmente de biomoléculas para presentar a analitos en un líquido adyacente. Un panel heterogéneo contiene partículas o biomoléculas que difieren en la naturaleza de los sitios de unión químicos o bioquímicos que ofrecen a analitos en disolución. En caso de unión, el analito se identifica por las coordenadas de la perla, o agrupación de perlas, puntuando positivo. El presente procedimiento se basa en los elementos funcionales de la invención para montar una matriz plana de una mezcla multicomponente de perlas que llevan marcas químicas en forma de moléculas marcadas y así pueden identificarse posteriormente a la realización del ensayo.
Los ensayos de diagnóstico se implementan frecuentemente en un formato plano de un panel heterogéneo, compuesto por ligandos sencillos, proteínas y otras dianas biomoleculares. Por ejemplo, en un kit de prueba de diagnóstico, un panel heterogéneo facilita la rápida prueba de un analito dado añadido en disolución, frente a un conjunto entero de dianas. Los paneles heterogéneos de proteínas son de gran interés actual junto con el campo emergente de la investigación de proteomas. El objetivo de esta investigación es identificar, mediante barrido del panel con técnicas analíticas sensibles tales como espectrometría de masas, cada proteína en una mezcla multicomponente extraída de una célula y separada mediante electroforesis bidimensional en gel. Idealmente, la localización de cada punto se corresponde únicamente con una proteína particular. Este análisis permitiría, por ejemplo, la monitorización directa de niveles de expresión génica en una célula durante un punto particular en su ciclo o en un estado dado durante el desarrollo embrionario.
La fabricación de una matriz de dianas heterogéneas es fundamental para las estrategias recientemente propuestas de selección de fármacos y análisis de mutaciones de ADN en un formato plano. La colocación de ligandos en una configuración específica sobre la superficie de un sustrato plano sirve para mantener una clave con la identidad de una cualquiera en un gran conjunto de dianas presentadas simultáneamente a un analito en disolución para unirse o hibridarse. En un ensayo que se basa en fluorescencia, la unión a una diana específica creará puntos brillantes sobre el sustrato cuyas coordenadas espaciales indican directamente la identidad de la diana.
Previamente se han empleado tres estrategias principales para fabricar paneles heterogéneos. Primera, los paneles de proteínas pueden crearse mediante electroforesis bidimensional en gel, basándose en un campo eléctrico de CC para separar las proteínas, primero por carga y luego por tamaño (o peso molecular). Incluso después de muchos años de refinamiento, esta técnica da resultados de escasa reproducibilidad que generalmente se atribuyen a las propiedades escasamente definidas de la matriz de gel.
Segunda, las gotitas individuales, sacadas de un conjunto de depósitos que contienen disoluciones de las diferentes dianas, pueden dispensarse o bien a mano o empleando uno de los varios procedimientos para dispensar de manera automatizada (o "impresión"; véase, por ejemplo, Schena y col., Science 270, 467-470 (1995). La impresión se ha aplicado para crear paneles de oligonucleótidos previstos para ensayos de selección basados en hibridación. La impresión deja una muestra seca y, por tanto, no puede ser adecuada para proteínas que se desnaturalizarían en tales condiciones. Además, son enormes los problemas adicionales de manipulación del fluido inherentes al mantenimiento y al sacar muestras de un gran número de depósitos.
Tercera, los ligandos diana pueden crearse remitiéndose a una variante de síntesis en fase sólida basada en una estrategia combinatoria de reacciones de alargamiento fotoquímicamente activado. Esta aproximación se ha limitado por enormes problemas técnicos en la síntesis química de incluso los oligómeros lineales más sencillos. La síntesis de compuestos no lineales en esta geometría plana es extremadamente difícil.
La presente invención para formar paneles heterogéneos requiere la unión química de ligandos diana a perlas. Los ligandos pueden acoplarse a perlas "autónomas" mediante una variedad de reacciones de acoplamiento bien establecidas. Para los fines presentes, la identidad de las perlas debe estar químicamente codificada de tal manera que pueda determinarse cuando se necesite. Están disponibles varios procedimientos para codificar, o codificar en binario, perlas. Por ejemplo, los oligonucleótidos cortos pueden servir para identificar una perla mediante su secuencia, que puede determinarse mediante técnicas de secuenciación a microescala. Alternativamente pueden emplearse marcas moleculares químicamente inertes que se identifican fácilmente mediante técnicas analíticas habituales.
A diferencia de todos los procedimientos de la técnica anterior, la presente invención proporciona un procedimiento novedoso para crear paneles heterogéneos mediante formación reversible in situ de una matriz plana de perlas "codificadas" en disolución adyacente a un electrodo. La matriz puede ser aleatoria con respecto a la identidad química, pero está ordenada con respecto a la posición espacial. Este procedimiento ofrece varias ventajas. Primera, es reversible de manera que el panel puede desmontarse tras el ensayo de unión para descartar perlas que puntúan negativo. Las perlas positivas pueden someterse a análisis adicionales sin la necesidad de etapas intermedias de recuperación, purificación o transferencia de muestras entre recipientes. Segunda, el panel se forma cuando se necesite, es decir, o antes de realizarse el ensayo de unión actual, o posterior a la realización del ensayo sobre la superficie de perlas individuales en suspensión. Este último modo minimiza los efectos adversos potenciales que pueden producirse cuando las sondas se unen a superficies diana planas con una alta concentración de sitios diana. Tercera, para adaptar el análisis de sondas por barrido de perlas individuales, las distancias entre partículas dentro de la matriz pueden ajustarse mediante polarización inducida por campos o mediante la adición de partículas espaciadoras inertes que se diferencian en el tamaño de las perlas codificadas. La figura 7 muestra el uso de perlas 72 espaciadoras pequeñas para separar perlas 74 codificadas. Como se muestra, la separación de perlas 74 es mayor que la separación de perlas comparables en la figura 4b. Finalmente, el recrecimiento de óxido mediado por UV, como se proporciona por la presente invención, facilita fácilmente la incrustación de un modelo de rejilla de dimensión seleccionada dentro del sustrato para garantizar la formación de pequeñas submatrices para la conservación del diseño en los campos de baja impedancia de la rejilla.
Para crear el panel, entre los electrodos se coloca una mezcla multicomponente de perlas que lleva, por ejemplo, compuestos producidos mediante química combinatoria basada en perlas. Cada tipo de perla puede estar presente en múltiples copias. Las matrices se forman en respuesta a un campo externo en un área designada de la superficie del electrodo. Esta aproximación novedosa de montaje in situ de paneles se basa en perlas que llevan una única marca química, o código, para permitir su identificación posterior a la finalización de un ensayo de unión. Esta invención facilita el marcado en línea de perlas mediante un procedimiento fotoquímico de coloración de perlas. Las perlas seleccionadas en una matriz se iluminan individualmente mediante una fuente de luz enfocada para desencadenar una reacción de coloración en la superficie de la perla o en el interior de la perla para indicar una puntuación de ensayo positiva. Las perlas así marcadas pueden separarse posteriormente de las perlas sin marcar mediante un procedimiento de clasificación activado por luz descrito en este documento. Están disponibles numerosas reacciones activadas por UV para implementar este procedimiento de coloración de perlas.
La presente invención proporciona varios procedimientos para descartar perlas con puntuaciones negativas, normalmente la inmensa mayoría, mientras que se retienen aquellas con puntuaciones positivas. Este procedimiento aprovecha el hecho de que, a diferencia de todos los procedimientos de la técnica anterior, la matriz representa una configuración temporal de partículas que se mantiene mediante el campo eléctrico aplicado y puede reorganizarse o desmontarse a voluntad. Esta capacidad, junto con el hecho de que las biomoléculas nunca están expuestas al aire (como en el procedimiento de impresión de la técnica), facilita la concatenación in situ de procedimientos analíticos que requieren el panel heterogéneo conjuntamente con análisis posterior "aguas abajo".
En primer lugar, si las perlas positivas están agrupadas en una subsección de la matriz, puede remitirse a la operación de división de la matriz controlada por luz de la presente invención para examinar la matriz de manera que se descartan partes negativas de la matriz (o se recirculen para uso posterior). En segundo lugar, si las perlas positivas y negativas están aleatoriamente entremezcladas, puede remitirse a un procedimiento de clasificación activada por fluorescencia, implementado basándose en la presente invención en un formato plano, como se describe en este documento. En el caso de la clasificación activada por fluorescencia, las perlas positivas y negativas pueden identificarse como objetos brillantes y oscuros, respectivamente. En el caso especial de que sólo destaquen una pocas perlas positivas, éstas pueden eliminarse de la matriz acoplándolas con pinzas ópticas, una herramienta para atrapar y/o manipular partículas refractivas individuales con iluminación, y desmontar la matriz eliminando el campo, o sometiendo toda la matriz a desplazamiento lateral mediante las operaciones fundamentales de la presente invención.
La tarea típica en la selección de un gran conjunto de compuestos es la de buscar un número muy pequeño de acontecimientos positivos en un número inmenso de pruebas. El conjunto de perlas descartadas implicará normalmente la mayoría en cada etapa en el ensayo. Por tanto, el procedimiento de la presente invención minimiza el esfuerzo invertido en acontecimientos negativos, tales como la desafiante síntesis in situ de ligandos diana, independientemente de si mostrarán o no ser de interés mediante la unión a una sonda presentada en disolución.
El procedimiento para formar un panel heterogéneo según la presente invención contiene perlas de cada tipo en montaje generalmente aleatorio. Puede desearse la creación de un panel heterogéneo con cada posición en el panel que contiene una agrupación de perlas del mismo tipo, es decir, perlas que se originan en el mismo depósito (figura 6a), para garantizar un número suficientemente grande de acontecimientos positivos para facilitar la detección. Una solución práctica se deriva de la aplicación del esquema de transferencia fluídico para la conservación del diseño descrito en este documento. En este procedimiento, las perlas de una placa de MxN pocillos se transfieren de manera que se conserve el diseño a un sustrato químicamente modelado de forma que se conserve la codificación espacial de identidades de perlas.
Ejemplo VI Ensayos de unión y funcionales en formato de matriz plana de perlas
La presente invención puede usarse para implementar ensayos de unión de fases mixtas, además de ciertos ensayos funcionales en un formato de matriz plana. Son posibles varias combinaciones que reflejan la presencia de sonda o diana en disolución, sobre la superficie de perlas coloidales, o sobre la superficie del electrodo. Los procedimientos de la presente invención facilitan la formación de una matriz plana para presentar dianas a sondas en disolución antes de realizarse el ensayo de unión (matriz "previamente formada"; figura 8). Alternativamente, una matriz plana de perlas puede formarse delante de una superficie detectora después de realizarse el ensayo de unión en suspensión (matriz "posteriormente formada"; figura 8). La presente invención también proporciona los procedimientos para implementar ensayos funcionales permitiendo el montaje de ciertos tipos de celdas adyacentes a una superficie detectora o sensora plana para monitorizar los efectos de la exposición de las celdas a fármacos de molécula pequeña en disolución.
Los ensayos de unión, particularmente aquellos que implican proteínas tales como enzimas y anticuerpos, representan una herramienta principal de la diagnosis médica. Se basan en la interacción bioquímica específica entre una sonda, tal como una molécula pequeña, y una diana, tal como una proteína. Los ensayos facilitan la rápida detección de pequeñas cantidades de un analito en disolución con alta especificidad molecular. Se han diseñado muchos procedimientos para producir señales para indicar la unión, bien dando una respuesta cualitativa (unión o no unión) o resultados cuantitativos en forma de constantes de unión o asociación. Por ejemplo, cuando una enzima se une a un analito, la reacción catalítica resultante puede usarse para generar un simple cambio de color para indicar la unión, o puede acoplarse a otros procedimientos para producir señales químicas o eléctricas a partir de las que se determinan las constantes de unión. Los anticuerpos monoclonales, obtenidos de un único precursor común, pueden prepararse para reconocer prácticamente cualquier diana dada, y los inmunoensayos, basados en el reconocimiento y la unión anticuerpo-antígeno, han desarrollado una importante herramienta de diagnóstico. Como con la unión de enzimas, la unión de anticuerpos de un analito antigénico puede detectarse mediante una variedad de técnicas que incluyen el procedimiento clásico de inmunoensayos ligados a enzima (ELISA) en los que como indicador se aprovecha la reacción de una enzima acoplada a anticuerpo. Un esquema común y conceptualmente sencillo garantiza la detección de la unión de anticuerpos a un analito diana mediante el aporte de un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente que reconoce el primer anticuerpo (o primario).
Los ensayos de unión que implican proteínas globulares solubles se realizan frecuentemente en disolución para garantizar interacciones imparciales entre la proteína y la diana. Tales ensayos en fase líquida, especialmente cuando se realizan a bajas concentraciones de diana o sonda, minimizan las dificultades potenciales que puedan producirse cuando o la diana o la sonda están presentes en abundancia o muy próximas. De igual modo, la cinética tiende a ser lenta. Los efectos cooperativos, tales como aglomeración, que surgen de la gran proximidad de sondas deben controlarse cuidadosamente cuando o la sonda o la diana están químicamente ancladas a un sólido sustrato.
Sin embargo, este último formato de ensayos de unión en fase sólida también se emplea muy comúnmente siempre que la situación lo requiera. Por ejemplo, la presencia de una proteína sobre la superficie de una célula puede aprovecharse para "cribar" las células que expresan esta proteína en presencia de muchas otras células en un cultivo que no: une las células deseadas a la superficie de un recipiente que está previamente recubierto con una capa de un anticuerpo secundario dirigido contra un anticuerpo primario que decora la proteína de la superficie de la célula deseada. Similarmente, ciertos fagos pueden manipularse genéticamente para mostrar proteínas en su superficie, y éstas pueden identificarse mediante un ensayo de unión que implica una sonda de molécula pequeña tal como un antígeno si la proteína mostrada es un anticuerpo (Watson y col., "Recombinant DNA", 2ª edición (Scientific American Books, W.H. Freeman y Co., Nueva York, NY, 1983). Además, la geometría plana se adapta una variedad de esquemas de detección óptica y eléctrica implementados en transductores y sensores.
Puede desarrollarse una combinación del ensayo en fase líquida y en fase sólida usando perlas que están decoradas o con sonda o diana, como en los procedimientos que emplean perlas magnéticas decoradas para la preparación o purificación de muestras mediante el aislamiento de la unión de las moléculas de no unión en una mezcla multicomponente dada. Ejemplos recientes del uso de estas perlas incluyen la purificación de moldes para aplicaciones de secuenciación de ADN o la extracción de ARNm de células (lisadas) mediante hibridación a perlas que están decoradas con residuos de poliadenina (poliA).
Los ensayos funcionales que implican tipos adecuados de células se emplean para monitorizar efectos extracelulares de fármacos de pequeña molécula en el metabolismo celular. Las células se colocan en la proximidad inmediata de un sensor plano para maximizar la concentración local de agentes liberados por la célula o para monitorizar el pH local.
La presente invención proporciona los medios para implementar ensayos de unión de fases mixtas en una geometría plana con un grado de flexibilidad y control que no está disponible por los procedimientos de la técnica anterior. Por tanto, ofrece la flexibilidad de formar, in situ, de manera reversible y con control espacial externo, o un panel plano de sitios diana para la unión de analitos presentes en una fase líquida adyacente, o una matriz plana de complejos sonda-diana posterior a la realización de un ensayo de unión en disolución. La unión puede tener lugar en la superficie de perlas individuales suspendidas en disolución, en la superficie de perlas previamente montadas en matrices adyacentes a la superficie del electrodo, o en la superficie del propio electrodo. O la molécula diana o la sonda debe estar localizada en una perla para permitir un ensayo basado en perlas según la presente invención. Como se muestra en la figura 8, si la molécula sonda P está localizada sobre una perla, entonces la molécula diana T puede estar o en disolución, sobre una perla o sobre la superficie del electrodo. Lo contrario también es cierto.
Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden usarse para implementar el cribado, practicado para clonar receptores superficiales de la célula de un modo mucho más rápido y controlado de lo que es posible por el procedimiento de la técnica anterior. Dado un sustrato que se ha recubierto con una capa de anticuerpo dirigido contra la proteína reconocida de la superficie de la célula, la presente invención facilita el rápido montaje de una matriz plana de células o perlas decoradas en la proximidad de la capa de anticuerpos y el posterior desmontaje de la matriz para dejar sólo aquellas células o perlas que pueden formar un complejo con el anticuerpo unido a la superficie.
Otro ejemplo de interés en esta categoría pertenece a la expresión en fagos. Esta técnica puede emplearse para presentar una capa de dianas de proteínas a sondas ancladas a perlas. Las matrices de perlas pueden emplearse ahora para identificar una proteína de interés. Es decir, las perlas están decoradas con sondas de molécula pequeña y una matriz se forma adyacente a la expresión en fagos. La unión dará como resultado un complejo sonda-diana que retiene perlas, mientras que otros se eliminan cuando se desconecta el campo eléctrico, o cuando el control por luz se aplica para eliminar perlas de la expresión en fagos. Si las perlas están codificadas, pueden llevarse a cabo muchas pruebas de unión en paralelo debido a que las perlas retenidas pueden identificarse individualmente después de la unión.
Los procedimientos de la presente invención facilitan fácilmente ensayos de unión competitivos. Por ejemplo, después de la unión de una sonda fluorescente a una perla decorada con diana en disolución y la formación de una matriz plana de perlas adyacente al electrodo, las áreas fluorescentes dentro de la matriz indican la posición de dianas positivas, y estas pueden tratarse con más sondas sometiéndolas a unión competitiva. Es decir, mientras se monitoriza la fluorescencia de una sección seleccionada de la matriz plana, se añade un inhibidor (para ensayos enzimáticos) u otro antagonista (de constante de unión conocida) a la celda electroquímica y se mide la disminución en la fluorescencia que se origina de la región de interés como una función de la concentración de antagonista para determinar una constante de unión para la sonda original. Esto es un ejemplo de una concatenación de etapas analíticas que se facilita por los procedimientos de la presente invención.
El hecho de que un complejo sonda-diana esté fijado a un perla coloidal, como en los procedimientos de la presente invención, lleva ventajas prácticas ya que esto facilita la separación de acontecimientos positivos de negativos. Particularmente cuando los ensayos en fase sólida se realizan sobre un sustrato plano, una ventaja adicional de las matrices planas de perlas es la mejora de la eficiencia de recogida de luz proporcionada por las perlas, como se trata en este documento.
Si se desea, las perlas pueden servir estrictamente como vehículos de liberación para sondas de molécula pequeña. Es decir, una matriz de perlas decoradas con sondas se forma adyacente a una superficie decorada con diana según los procedimientos de la presente invención. La escisión activada por UV de la sonda del soporte de la perla garantizará que la sonda se libera muy próxima a la capa diana, mejorándose así la velocidad y eficiencia del ensayo. La identidad de la sonda particular que interacciona con la diana puede determinarse a partir de la localización posicional de la perla que libera la sonda.
Los procedimientos de la presente invención no sólo se aplican a perlas coloidales de una amplia variedad (que no necesitan procedimientos preparativos especial para hacerlas magnéticas, por ejemplo), sino también a vesículas de lípidos y células que están decoradas con, o contienen incrustadas en su pared externa, o sonda o diana. Por tanto, los procedimientos de la presente invención pueden aplicarse no sólo a proteínas solubles ancladas a perlas, sino potencialmente a receptores de membrana integral o a receptores de la superficie de la célula.
En particular, el rápido montaje de células en un área designada de la superficie del sustrato facilita la implementación de ensayos funcionales basados en células sumamente paralelos. La presente invención hace posible exponer células a candidatos de fármacos de molécula pequeña en disolución y montarlas rápidamente en la proximidad de un sensor incrustado en la superficie del electrodo, o exponer células previamente montadas a tales agentes que se liberan en la fase líquida adyacente. En el caso más sencillo, todas las células serán del mismo tipo y los agentes se administrarán secuencialmente. Incluso en esta versión secuencial, el mezclado electrocinético mejorará el rendimiento. Sin embargo, como se describe en este documento, los procedimientos de la presente invención también posibilitan la versión paralela de ensayos de unión y, por tanto, de ensayos funcionales en un formato plano mediante la codificación de la identidad de diferentes células mediante un procedimiento de "transferencia para la conservación del diseño" de una placa de 8x12 pocillos, como se trata en este documento, y para aislar células que puntúan positivas proporcionando retroalimentación de un procedimiento de obtención de imágenes o detección espacialmente resuelto para elegir como diana una localización específica en la matriz de células.
Ejemplo VII Separación y clasificación de perlas y partículas
La presente invención puede usarse para implementar varios procedimientos para la separación y clasificación de partículas coloidales y biomoléculas en una geometría plana. Específicamente, éstos incluyen técnicas de separación lateral de perlas en mezclas. Las perlas individuales pueden eliminarse de una matriz formada en respuesta a un campo eléctrico mediante la aplicación de pinzas ópticas.
La separación de componentes en una mezcla de compuestos químicos dados es una tarea fundamental de la química analítica. Similarmente, los análisis bioquímicos requieren frecuentemente la separación de biomoléculas, perlas o células según tamaño y/o carga superficial mediante técnicas electroforéticas, mientras que la clasificación (lo más común en exactamente dos subclases) de células o cromosomas completos suspendidos según propiedades ópticas tales como emisión de fluorescencia se realiza normalmente usando fraccionamiento campo-flujo, que incluye citometría de flujo y clasificación de células activada por fluorescencia.
En una geometría plana, las mezclas de perlas que experimentan difusión se han separado previamente según movilidad mediante la aplicación de un campo eléctrico de CA conjuntamente con modelado litográfico de la superficie del electrodo diseñado para promover el flujo direccional. Esencialmente, la CA o campo eléctrico pulsado se usa para mover pequeñas perlas en una dirección particular durante un periodo de tiempo. Se ha implementado la electroforesis capilar en una geometría plana, véase, por ejemplo, B.B. Haab y R.A. Mathies, Anal. Chem 67, 3253-3260 (1995).
Los procedimientos de la presente invención pueden aplicarse de varios modos para implementar la tarea de separación, clasificación o aislamiento en una geometría plana. A diferencia de las aproximaciones de la técnica anterior, la presente invención proporciona un grado significativo de flexibilidad en la selección de entre varios procedimientos disponibles del más adecuado para la tarea particular inmediata. En algunos casos puede aplicarse más de una separación técnica y esto proporciona la base para la implementación de la separación bidimensional. Es decir, las perlas pueden separarse según dos características físico-químicas diferentes. Por ejemplo, las perlas pueden separarse primero por tamaño y posteriormente, aumentando la frecuencia aplicada para inducir la formación de cadenas, por polarizabilidad. Esta flexibilidad ofrece ventajas particulares en el contexto de integrar funcionalidades analíticas en una geometría plana. Ahora se describen varias técnicas.
i) La presente invención puede usarse para implementar "tamizado" en flujo lateral inducido por campo eléctrico sobre superficies modeladas por recrecimiento de óxido mediado por UV para clasificar perlas en una mezcla por tamaño. Se remite a las operaciones fundamentales de la invención para establecer el movimiento lateral de partículas dirigido a lo largo de conductos trazados por recrecimiento de óxido mediado por UV. Los conductos están diseñados para contener limitaciones sucesivamente más estrechas a través de las cuales deben pasar las partículas. Las etapas sucesivamente más finas sólo permiten partículas sucesivamente más pequeñas para pasar en este mecanismo de "tamizado" (figura 9a). Como se muestra en la figura 9a, el flujo de partículas primarias es en la dirección de izquierda a derecha, mientras que un flujo transversal se establece en la dirección de arriba a abajo utilizando un perfil de óxido como se muestra. Adicionalmente, las filas de barreras 92 hechas de óxido grueso están situadas a lo largo del conducto con la separación entre las barreras disminuyendo en cada fila en la dirección transversal. Como las partículas se mueven a lo largo del conducto, las filas de barreras actúan para separar partículas más pequeñas en la dirección transversal. A diferencia de los procedimientos previos basados en separación electroforética, campos eléctricos de CC mayores y el problema potencial adicional de la electrólisis e interferencia del flujo electroosmótico en una dirección opuesta al transporte de partículas dirigido por el campo, la presente invención usa campos eléctricos de CA y gradientes laterales en impedancia interfacial para producir el transporte. El presente procedimiento tiene la ventaja de evitar la electrólisis y se aprovecha explícitamente del flujo electroosmótico para producir y controlar el transporte de partículas.
Además, el uso de electrodos de Si/SiOx posibilita el uso del componente de control por luz de la presente invención para modificar el transporte lateral de perlas en tiempo real. Por ejemplo, la iluminación externa puede emplearse para neutralizar localmente el gradiente de impedancia lateral inducido por el recrecimiento de óxido mediado por UV. Las partículas en estas "zonas" neutras no experimentarían ninguna fuerza neta más y se detendrían. Este principio puede usarse como una base para la implementación de un esquema para partículas localmente concentradas en bandas intensas y así mejorar la resolución en la posterior separación.
ii) La presente invención puede usarse para implementar el "refino de zonas", un procedimiento de exclusión de componentes minoritarios y de una mezcla por tamaño o forma de una matriz cristalina en crecimiento de componente mayoritario. Este procedimiento depende explícitamente de las aptitudes de la presente invención para inducir cristalización direccional.
El procedimiento de refino de zonas se emplea con gran éxito en la producción de monocristales grandes de silicio de pureza muy alta mediante exclusión de impurezas de la red cristalina huésped. El concepto es conocido del procedimiento químico habitual de purificación mediante recristalización, en el que los átomos o moléculas que son suficientemente diferentes en tamaño, forma o carga de las especies huésped, de manera que no se ajustan dentro de la red cristalina huésped formadora como una impureza sustitucional, se echan en disolución. Posibilitando el crecimiento de matrices planas, en una dirección dada y a una velocidad controlada, la presente invención facilita la implementación de un procedimiento de refino de zonas análogo para matrices planas. La geometría más básica es la geometría lineal. En primer lugar, una mezcla multicomponente de perlas de diferentes tamaños y/o formas se captura en un área de retención rectangular sobre la superficie, gastada por modelado por UV. A continuación se inicia la cristalización en un extremo del área de retención mediante iluminación y se permite avanzar lentamente a lo largo de todo el área de retención en respuesta a un modelo de iluminación en progreso. En general, diferencias de aproximadamente el 10% en el radio de perlas desencadenan la expulsión.
iii) La presente invención puede usarse para implementar el fraccionamiento en un flujo transversal de un modo que separe partículas según movilidad.
El fraccionamiento campo-flujo se refiere a una clase entera de técnicas que están en amplio uso para la separación de moléculas o partículas suspendidas. El principio es separar partículas sometidas a flujo de fluidos en un campo que actúa transversal al flujo. Una categoría de tales técnicas se subsume en el encabezamiento de fraccionamiento campo eléctrico-flujo del que la electroforesis de flujo libre es un ejemplo que guarda relación ya que es compatible con una geometría plana. La electroforesis de flujo libre emplea el flujo continuo de un tampón repuesto entre dos placas estrechamente separadas en presencia de un campo eléctrico de CC que se aplica en el plano de las placas limitantes transversales a la dirección del flujo de fluidos. Como atraviesan el campo eléctrico, las partículas cargadas son desviadas proporcionalmente a su movilidad electroforética y se recogen en salidas separadas para posterior análisis. A diferencia de la electroforesis convencional, la electroforesis de flujo libre es un procedimiento continuo con alto rendimiento y no requiere medio de soporte tal como un gel.
La presente invención posibilita la implementación de fraccionamiento campo-flujo en una geometría plana. Como se trata previamente este documento, los gradientes de impedancia impuestos por el perfilado de óxido por UV sirven para mediar el movimiento de partículas a lo largo de la superficie del electrodo en respuesta al campo eléctrico externo. En una celda con una estrecha separación, el flujo electrocinético resultante tiene un perfil de "pistón" y éste tiene la ventaja de que expone todas las partículas a valores idénticos del campo de velocidad de flujo, minimizándose así las distorsiones de bandas introducidas por el perfil de velocidad parabólica del flujo laminar normalmente empleado en la electroforesis de flujo libre.
Puede emplearse un segundo campo de flujo, transversal a la dirección de flujo primaria, para mediar la separación de partículas. Este flujo deflector puede generarse en respuesta a un segundo gradiente de impedancia. Un procedimiento conveniente para imponer este segundo gradiente es aprovecharse del modelado de óxido por UV para diseñar campos de flujo apropiados. Ambos flujos longitudinales y transversales se recircularían y así permitirían la operación continua incluso en una celda cerrada, a diferencia de cualquier técnica anterior de la técnica referida.
La flexibilidad adicional se proporciona remitiéndose al componente de control por luz de la presente invención para iluminar el sustrato con un modelo estacionario cuyo perfil de intensidad en la dirección transversal al flujo de fluidos primario está diseñado para inducir el gradiente de impedancia deseado y, por tanto, producir un flujo de fluidos transversal. (figura 9b). Esto tiene la ventaja significativa de permitir la activación selectiva del flujo transversal en respuesta a la detección de una perla fluorescente que atraviesa aguas arriba una ventana de monitorización. Las perlas no fluorescentes no activarían el flujo transversal y no serían desviadas. Este procedimiento representa un análogo plano de citometría de flujo, o clasificación de células activada por fluorescencia.
iv) La invención pueden usarse para inducir la formación de cadenas de partículas en la dirección perpendicular al plano del electrodo. Las cadenas representan conductos para el transporte de corriente entre los electrodos y su formación puede reflejar una polarización inducida por campo. Las cadenas son mucho menos móviles en flujo transversal que las partículas individuales de manera que este efecto puede usarse para separar partículas según las propiedades superficiales que contribuyen a la polarización neta. El efecto de la formación reversible de cadenas se ha demostrado en las condiciones experimentales establecidas en este documento. Por ejemplo, la formación reversible de cadenas se produce, para perlas de poliestireno carboxilado de 1 micrómetro de diámetro, a un voltaje de 15 V (pp) a frecuencias superiores a 1 MHz.
v) La invención puede usarse para aislar perlas individuales de una matriz plana.
Los ensayos de unión de fluorescencia en un formato de matriz plana, como se describen en este documento, pueden producir perlas brillantes singulares dentro de una gran matriz, que indica unión particularmente fuerte. Para aislar y recuperar las perlas correspondientes pueden emplearse pinzas ópticas en forma de un punto láser claramente enfocado para acoplar una perla individual de interés. El componente de control por luz de la presente invención puede usarse conjuntamente con las pinzas ópticas para recuperar una perla individual tal moviendo la matriz respecto a la perla, o viceversa, o desmontando la matriz y recuperando sólo la perla marcada. Esta es una capacidad bastante única que será particularmente útil en el contexto de aislar perlas en ciertos ensayos de unión. La instrumentación comercial está disponible para situar pinzas ópticas en el campo de un microscopio. Se facilita mayor movimiento a escala mediante la translocación de la matriz in situ o simplemente moviendo la parte integrante de la muestra externa. Este procedimiento se presta a la automatización conjuntamente con el uso de software de análisis de imágenes para la búsqueda de picos y control por retroalimentación.
vi) La invención puede usarse para implementar una operación de seccionamiento de matriz inducido por luz ("cizalladura") para separar partes fluorescentes, o delineadas de otras manera, de una matriz del resto. Esta operación hace posible segmentar una matriz dada y aislar las perlas correspondientes para análisis aguas abajo.
La base para la implementación de esta segmentación de matriz es el componente de control por luz de la presente invención, en el modo de partículas motoras de un área de una interfase Si/SiOx que está iluminada con alta intensidad. Se enfatiza en este documento que este efecto no guarda completamente ninguna relación con la fuerza inducida por luz sobre perlas que soportan la acción de pinzas ópticas. El presente efecto, que opera en grandes conjuntos de partículas, se demostró en las condiciones experimentales establecidas en este documento usando un iluminador de 100 W en un microscopio de UEM Zeiss operado en epi-iluminación. Una simple implementación es superponer, sobre el modelo de iluminación uniforme aplicado a toda la matriz, un haz de luz enfocado en una línea que se coloca mediante manipulación de elementos de orientación del haz de luz externos al microscopio. Las perlas son expulsadas de la parte lineal iluminada. Otras implementaciones se aprovechan de dos haces de luz controlados por separado que están parcialmente superpuestos. El seccionamiento lineal puede repetirse en diferentes orientaciones relativas de cizalladura y matriz.
Ejemplo VIII Selección para el descubrimiento de fármacos en geometría plana
Los elementos funcionales de la presente invención pueden combinarse para implementar procedimientos para manipular y seleccionar librerías de compuestos y combinatorias en un formato plano. Los principales elementos requeridos de esta tarea son: liberación de muestra y reactivo del conjunto de depósitos de muestra original, comúnmente en un formato de 8x12 pocillos en una placa de microtilulación, en una celda plana; fabricación de matrices planas de dianas o de complejos sonda-diana adyacentes a la superficie del electrodo plano antes o después de realizar un ensayo de unión; evaluación del ensayo de unión mediante la obtención de imágenes de la distribución espacial de fluorescencia o radioactividad de marcadores, opcionalmente seguido por mediciones farmacocinéticas cuantitativas de constantes de afinidad o unión; aislamiento de perlas que puntúan positivas, y eliminación del procesamiento adicional de otras perlas; y recogida de perlas específicas para análisis aguas abajo adicional. La presente invención se refiere a todos estos elementos, y las operaciones fundamentales de la invención proporcionan los medios para concatenar estos procedimientos en un formato plano.
Una cuestión central en la implementación de estrategias rentables para el moderno descubrimiento de fármacos terapéuticos es el diseño y la implementación de ensayos de selección de una manera que se facilite un alto rendimiento, a la vez que proporcionan datos farmacocinéticos como una base para seleccionar pistas de fármacos prometedores de una biblioteca normalmente muy extensa compuestos. Es decir, la especificidad molecular para la diana, caracterizada por una constante de unión, es un factor importante en la evaluación de un nuevo compuesto como potencial agente terapéutico. Dianas comunes incluyen enzimas y receptores, además de ligandos de ácidos nucleicos que muestran estructura secundaria característica.
El paradigma emergente para guiar el descubrimiento en las industrias farmacéuticas y relacionadas tales como biotecnología agrícola es el montaje de novedosas bibliotecas de compuestos sintéticos mediante una amplia variedad de nuevos procedimientos de síntesis "combinatoria" en estado sólido. La química combinatoria se refiere a una categoría de estrategias para la síntesis y prueba paralela de múltiple compuestos o mezclas de compuestos en disolución o en soportes sólidos. Por ejemplo, una síntesis combinatoria de un oligopéptido lineal que contiene n aminoácidos crearía simultáneamente todos los compuestos que representan las posibles permutaciones de la secuencia de n aminoácidos. La implementación más comúnmente empleada de síntesis combinatoria se basa en soportes de perlas coloidales para codificar las etapas de reacción y, por tanto, la identidad de cada compuesto. Las perlas preferidas en la práctica habitual tienden a ser grandes (hasta 500 micrómetros de diámetro) y porosas para maximizar su capacidad de almacenamiento de compuesto, y deben codificarse para conservar la identidad del compuesto que llevan.
Están disponibles varios procedimientos de codificación, o codificación binaria, de perlas. Dos ejemplos son del siguiente modo. Primero, las perlas pueden marcarse con oligonucleótidos cortos tales como los 17-meros normalmente empleados en experimentos de hibridación. La secuencia de tales sondas cortas puede determinarse mediante técnicas de secuenciación a microescala tales como secuenciación directa de Maxam-Gilbert o espectrometría de masas. Este esquema de codificación es adecuado cuando la tarea requiere la selección de bibliotecas de ligandos de ácidos nucleicos u oligopéptidos. Segundo, los miembros de una biblioteca combinatoria pueden asociarse con marcas moleculares químicamente inertes. A diferencia del caso anterior, estas moléculas de marca no están enlazadas secuencialmente. En su lugar, la secuencia de etapas de reacción se codifica mediante la asignación formal de un código binario para moléculas de marca individuales y sus mezclas que están unidas a la perla en cada etapa de reacción sucesiva. Las marcas se identifican fácilmente mediante técnicas analíticas habituales tales como cromatografía de gases. Esta estrategia de codificación general se emplea actualmente en la síntesis de bibliotecas combinatorias sobre perlas
coloidales.
Las bibliotecas de compuestos comerciales son amplias, dado que incluso para el 17-mero anteriormente mencionado, el número de permutaciones de secuencia es 4
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17, o aproximadamente 10
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10. Sin embargo, la alta especificidad de las interacciones sustrato-diana biológicas típicas implica que la gran mayoría de los compuestos en la colección serán inactivos para cualquier diana particular. La tarea de selección es para seleccionar de este gran conjunto los pocos compuestos guía potenciales que muestran actividad en ensayos de unión o en funcionales. La principal estrategia para el descubrimiento de fármacos ampliamente aplicada a bibliotecas de compuestos naturales en la industria farmacéutica es seleccionar al azar compuestos individuales de la biblioteca y someterlos a una serie de pruebas. Por tanto, se requieren procedimientos de selección sistemática para implementar la rápida selección y puntuación de un biblioteca entera de compuestos sintéticos, que en la práctica contiene frecuentemente del orden de 10
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7 artículos.
En la práctica habitual, los compuestos se escinden primero y se eluyen de sus soportes sólidos y se almacenan en placas de microtilulación. Otra manipulación de muestras en el transcurso de la selección se basa fundamentalmente en el pipeteo robotizado y la transferencia entre diferentes recipientes, normalmente pocillos en placas de microtilulación. Aunque las estaciones de trabajo robotizadas representan una etapa en la dirección de automatizar el procedimiento, se basan en el formato tradicional de placas de microtilulación que contienen 8x12 pocillos y la manipulación de muestras mediante pipeteo y, por tanto, simplemente representan un incremento en la mejora operacional. Una consideración adicional significativa es la necesidad de conservar el reactivo y la muestra reduciendo la escala espacial de los procedimientos analíticos.
La presente invención proporciona un conjunto de operaciones para realizar procedimientos de manipulación y selección de muestras integrados para bibliotecas de compuestos basadas en perlas en un formato plano. Esto reducirá significativamente tiempo y costes debido a los volúmenes de reactivo y muestra. La ventaja principal de los procedimientos de la presente invención es que proporcionan un gran conjunto de operaciones fundamentales para manipular conjuntos de perlas en un formato plano, permitiendo la manipulación de perlas entre estaciones en un procedimiento analítico de múltiples etapas.
En particular, como se describe previamente en este documento, los procedimientos de la presente invención facilitan la implementación de los siguientes procedimientos relevantes: transferencia de muestras de placas de microtilulación a una celda electroquímica plana; formación de paneles heterogéneos de sitios diana adyacentes a la superficie del sustrato; ensayos de unión en fase sólida; y aislamiento de perlas específicas de una matriz. Además, las operaciones fundamentales de la presente invención proporcionan los medios para concatenar estos procedimientos sobre la superficie de un electrodo plano.
Como se describe en este documento para los ensayos de hibridación, son posibles varias variantes. Es decir, los ensayos de unión pueden realizarse permitiendo a dianas de proteínas, tales como enzimas, que se unan a compuestos sobre la superficie de una perla, bien en suspensión o dispuestas en una matriz plana. La práctica común de la química combinatoria basada en grandes perlas de soporte poroso adapta la manipulación simultánea de perlas más pequeñas a aquellos compuestos de superficie externa que están anclados mediante separadores químicos inertes. Tales perlas pequeñas (hasta 10 micrómetros de diámetro) se manipulan fácilmente mediante los procedimientos de la presente invención. Las perlas grandes se usan como recipientes de almacenamiento de compuestos marcados.
Alternativamente, la unión entre diana y una sonda marcada radioactivamente o de otra manera puede producirse en disolución, dentro de pocillos de placas de microtilulación, si los compuestos ya se han escindido de su soporte de síntesis. En ese caso, los complejos sonda-diana pueden capturarse mediante complejación a perlas codificadas en cada pocillo, por ejemplo mediante el procedimiento de anticuerpos secundarios de acoplar la diana de proteína a un anticuerpo anclado a la perla. Entonces, los complejos sonda-diana capturados por las perlas se transfieren a la celda plana para análisis de proximidad y otro procesamiento como se ilustra en la figura 10. Como se muestra en la figura 10, se deja que los complejos 102 sonda-diana se formen en disolución. Las perlas 104 recubiertas con anticuerpos se añaden a la disolución, resultando un complejo 106 anclado a perlas. Los complejos 106 anclados a perlas se depositan sobre el electrodo 108 de los pocillos 110 y se forma una matriz plana de complejos anclados a perlas. Cuando se usan sondas 114 fluorescentes, éstas confieren fluorescencia al complejo anclado a perlas, facilitando la detección.
Los procedimientos y aparatos de la presente invención son muy adecuados para la tarea de identificar un número pequeño de acontecimientos positivos en un gran conjunto. La obtención de imágenes de una matriz entera de complejos sonda-diana se mejora adicionalmente mediante la proximidad a un detector de área, y mediante la acción de lente de las perlas. El aislamiento de un número pequeño de puntuaciones positivas de la matriz se logra fácilmente, por ejemplo aplicando pinzas ópticas, como se describe en este documento. Entonces puede desecharse el gran resto de la matriz. Esto reduce considerablemente a su vez la complejidad de aplicar pruebas más estrictas, tales como la determinación de constantes de unión, ya que éstas pueden restringirse a las pocas perlas retenidas. Estas pruebas pueden aplicarse directamente, sin la necesidad de transferencia de muestras adicionales a nuevos recipientes, a las muestras que sobreviven el primer paso de selección.
Ejemplo IX Ensayos de hibridación en formato de matriz plana
La presente invención puede usarse para implementar ensayos de hibridación en fase sólida en un formato de matriz plana en una configuración relacionada con la de un ensayo de unión a proteína en el que las moléculas diana están químicamente unidas a perlas coloidales. Los procedimientos de la presente invención facilitan la formación de una matriz plana de diferentes oligonucleótidos diana para la presentación a una mezcla de cadenas en disolución. Alternativamente, la matriz puede formarse posterior a la hibridación en disolución para facilitar la detección y el análisis de la distribución espacial de fluorescencia o radioactividad en la matriz.
Actualmente se está invirtiendo una considerable investigación y desarrollo en un esfuerzo por desarrollar instrumentación miniaturizada para la extracción y preparación de muestras de ADN que incluye amplificación, transcripción, marcado y fragmentación, con posterior análisis basado en ensayos de hibridación, además de separación electroforética. Los ensayos de hibridación en formato de matriz plana están desarrollándose como una herramienta de diagnóstico para la rápida detección de mutaciones de pares de bases individuales específicas en un segmento conocido de ADN, y para la determinación de niveles de expresión de genes celulares mediante el análisis de los niveles de ARNm o ADNc correspondientes. La hibridación de dos cadenas sencillas complementarias de ADN implica el reconocimiento molecular y la posterior formación de enlaces de hidrógeno entre bases nucleotídicas correspondientes en las dos cadenas opuestas según las reglas A-T y G-C; en este caso, A, T, G y C representan respectivamente las cuatro bases nucleotídicas adenina, timina, guanosina y citosina encontradas en el ADN; en ARN, la timina se sustituye por uracilo. La formación de ADN de cadenas dobles, o dúplex, requiere el apareamiento de dos cadenas sumamente cargadas de manera negativa de ADN, y la fuerza iónica del tampón, junto con la temperatura, desempeña un papel decisivo.
Como se trata previamente en este documento, dos procedimientos principales para preparar matrices heterogéneas de cadenas diana sobre la superficie de un sustrato plano son microdistribución ("impresión") y la síntesis espacialmente codificada in situ de oligonucleótidos que representan todas las permutaciones de secuencias posibles para una longitud total dada de cadena. En este contexto, la hibridación debe producirse necesariamente muy próxima a una superficie de sustrato plano y esta condición requiere atención si deben evitarse complicaciones de impedimento estérico y de unión no específica de cadenas al sustrato. La adsorción no específica puede ser un serio problema, especialmente en presencia de campos eléctricos de CC empleados en diseños comerciales habituales que se basan en deposición electroforética para acelerar la cinética de hibridación sobre la superficie. Además, hay dificultades técnicas, previamente tratadas en este documento, resultantes del impedimento estérico y de efectos colectivos que reflejan la aglomeración de cadenas de sondas próximas a la superficie.
En el contexto del análisis de ADN se usan comúnmente perlas (magnéticas) coloidales. Por ejemplo, se emplean para capturar ADN en un procedimiento de selección ampliamente usado para seleccionar ADNc de bibliotecas de clones. Específicamente, los ADNc se dejan hibridar a secuencias dentro de ADN genómico largo que posteriormente se ancla a perlas magnéticas para extraer el ADNc hibridado de la mezcla.
La presente invención facilita la formación de matrices planas de perlas coloidales decoradas con oligonucleótidos, o antes o después de la hibridación de una cadena de sonda de fluorescencia a la cadena de diana anclada a la perla, o posterior a la hibridación en disolución libre y captura de perlas de la cadena de diana funcionalizada en el extremo. A diferencia de los procedimientos de la técnica anterior, la presente invención no requiere que la hibridación se produzca en la proximidad de la superficie del sustrato plano, aunque esto es una opción si las cadenas de sondas ancladas a perlas van a liberarse a cadenas de dianas ancladas al sustrato.
La capacidad para realizar la hibridación o en disolución, sobre la superficie de perlas individuales, o en la superficie del sustrato, proporciona un grado de flexibilidad sin precedentes. Además, las ventajas de matrices de perlas, como se describen en este documento, hacen factible la selección y el aislamiento de perlas individuales, o grupos de perlas, de una matriz mayor basándose en la puntuación en un ensayo de hibridación. Este aislamiento facilita la implementación de ensayos posteriores en las cadenas de interés. El hecho de que las perlas permanezcan móviles también significa que las perlas de interés pueden recogerse en áreas de retención designadas para la microsecuenciación, o pueden moverse a un área de sustrato designada para la amplificación por PCR.
Los procedimientos de la presente invención pueden usarse para implementar un ensayo de hibridación en un formato de matriz plana en una de dos variaciones principales. Todas implican la presencia del repertorio entero de perlas en la matriz o panel plano formado adyacente a la superficie del electrodo para lectura en paralelo. Como con los paneles heterogéneos en general, la disposición de perlas dentro de la matriz es o al azar (con respecto a la identidad química), y la identidad de perlas que puntúan alto en el ensayo de unión debe determinarse posteriormente, o está codificada espacialmente remitiéndose al procedimiento de "transferencia para la conservación del diseño" de carga de muestras descrito en este documento.
La primera variante se implementa fácilmente y se adapta a la formación de matrices o antes o después de realizar el ensayo de unión. Por ejemplo, la unión puede realizarse en suspensión antes de que las perlas se monten dentro de la matriz. Como con el procedimiento de selección de ADNc anteriormente mencionado, el procedimiento de la presente invención también se adapta al uso de perlas como elementos de captura para el ADN diana funcionalizado en el extremo, por ejemplo, mediante complejación de biotina-estreptavidina. En este último caso, las perlas sirven como un vehículo de liberación para recoger todos los complejos sonda-diana en la superficie del electrodo en la que se montan dentro de una matriz para facilitar el análisis. En particular, la detección CCD de proximidad de perlas sobre electrodos se beneficiará de la acción de lente de las perlas en la matriz. Esta versión del ensayo se usa preferentemente si sólo se espera un pequeño número de puntuaciones positivas.
La hibridación a una matriz de perlas previamente formada puede aprovecharse de una variante del ensayo que conserva la codificación espacial. Una matriz de agrupaciones de perlas se forma mediante el procedimiento de "transferencia para la conservación del diseño" previamente descrito en este documento, y se expone a una mezcla de ADNc. La distribución espacial resultante de intensidad de fluorescencia o radioactividad refleja la abundancia relativa de ADNc en la mezcla. Este procedimiento se basa en la detección de una fluorescencia característica u otra señal del complejo sonda-diana sobre la superficie de una única perla. Dado el hecho de que la matriz se mantiene fácilmente estacionaria por los procedimientos de la presente invención, la adquisición de imágenes puede extenderse para conseguir relaciones señal a ruido robustas para la detección de señales de bajo nivel. Por ejemplo, una señal generada por una perla de 10 micrómetros de diámetro puede detectarse con como máximo 10
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8 complejos sonda-diana sobre la superficie de la perla. La acción de lente de las perlas también ayuda en la detección.
Como con la implementación de la selección de fármacos, los elementos funcionales de la presente invención pueden combinarse para realizar múltiples procedimientos preparativos y analíticos en ADN.
Ejemplo X Alineamiento y estiramiento de ADN en flujo inducido por campo eléctrico
La presente invención puede usarse para situar ADN de peso molecular alto en su configuración helicoidal remitiéndose a las operaciones fundamentales como se aplican a otras partículas coloidales. Sin embargo, además, el flujo electrocinético inducido por un campo eléctrico en una superficie de electrodo modelada puede emplearse para estirar el ADN en una configuración lineal en la dirección del flujo.
Recientemente se han introducido procedimientos que se basan en la obtención de imágenes ópticas para construir un mapa de sitios de escisión para enzimas de restricción a lo largo del contorno de una molécula de ADN alargada. Esto se conoce generalmente como un "mapa de restricción". Estos procedimientos, que facilitan el estudio de la interacción de estas y otras proteínas con ADN y que también pueden conducir al desarrollo de técnicas de secuenciación de ADN, dependen de la capacidad para estirar y alinear ADN sobre un sustrato plano.
Para moléculas de ADN individuales esto se ha logrado previamente sometiendo la molécula a fuerzas de alargamiento tales como aquellas ejercidas por flujo de fluidos, campos magnéticos que actúan sobre perlas magnéticas ancladas a ADN o fuerzas capilares. Por ejemplo, se han producido "peines" de ADN mediante la simple colocación de moléculas de ADN en una gotita de electrolito que se evapora. Si se toman precauciones para promover la unión química de un extremo de la molécula a la superficie, la cadena de ADN se estira como la línea de retorno de contacto entre la gotita que se encoge y la superficie pasa por alto las moléculas atadas. Esto deja moléculas de ADN secas que están unidas en posiciones aleatorias dentro del área del sustrato inicialmente cubierta por la gotita, estiradas a grados variables y generalmente alineadas en un modelo de simetría radial que refleja la forma de la gotita. Previamente también se han hecho "cepillos" lineales, compuestos por un conjunto de moléculas de ADN químicamente atado por un extremo a una línea común de puntos de anclaje, mediante alineamiento y estiramiento de moléculas de ADN mediante dielectroforesis en campos eléctricos de CA aplicados entre dos electrodos metálicos previamente evaporados sobre el sustrato.
La presente invención se remite al flujo electrocinético adyacente a un electrodo modelado mediante recrecimiento de óxido mediado por UV para proporcionar una aproximación novedosa a la colocación de moléculas de ADN en una disposición predeterminada sobre una superficie de electrodo plano, y al estiramiento de las moléculas de su configuración helicoidal nativa en una configuración lineal estirada que está alineada en una dirección predeterminada. Este procedimiento se muestra en la figura 11 y se realiza creando gradientes controlados en la proximidad de flujo a través de la dimensión de la hélice de ADN. El gradiente de velocidad produce que se muevan diferentes partes de la hélice a diferentes velocidades, estirándose así la hélice. Mediante el mantenimiento de un punto de estancamiento a velocidad cero, la hélice estirada se fijará en la posición. Este procedimiento tiene varias ventajas respecto a las aproximaciones de la técnica anterior. Primera, las moléculas de ADN en su estado helicoidal se someten a control por luz para formar matrices de forma deseada en cualquier posición sobre la superficie. Esto es posible debido a que el ADN grande de cósmidos o YAC forma hélices con un radio en el intervalo de un micrómetro y, por tanto, actúa de un modo análogo a las perlas coloidales. Por tanto, un conjunto de moléculas de ADN puede dirigirse hacia una posición inicial deseada. Segunda, el modelado por UV garantiza que la fuerza de alargamiento creada por el flujo electrocinético está dirigida en una dirección predeterminada. La presencia de electrodos metálicos en contacto con la muestra, una desventaja del procedimiento dielectroforético de la técnica anterior, se evita eliminando esta fuente de contaminación que es difícil de controlar, especialmente en presencia de un campo eléctrico. En los electrodos de Si/SiOx modelados se han generado velocidades de flujo en el intervalo de varios micrómetros/segundo, como se requiere para el alargamiento de moléculas individuales de ADN en flujo. Por tanto, los gradientes en el campo de flujo determinan tanto el alargamiento fraccional como la orientación de la configuración lineal emergente. Tercera, la presente invención facilita el control directo en tiempo real de la velocidad del flujo inducido por campo eléctrico, y ésta transmitirá a su vez un control explícito del alargamiento.

Claims (23)

1. Un procedimiento para manipular partículas y formar una matriz de partículas suspendidas en una disolución de electrolito que residen en la superficie superior de un electrodo de silicio que comprende una capa de óxido de silicio, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:
- generar un campo eléctrico de CA sobre el electrodo, y realizar una de las siguientes etapas;
- modelar o la superficie o el interior de dicho electrodo para reducir la impedancia del electrodo tal que el campo eléctrico controle el movimiento de dichas partículas según dicha área modelada sobre la superficie del electrodo;
- iluminar dicha superficie del electrodo de silicio con un modelo de luz predeterminado para reducir la impedancia del electrodo y controlar el movimiento de dichas partículas según dicho modelo de luz predeterminado;
- modelar o la superficie o el interior de dicho electrodo para reducir la impedancia del electrodo e iluminar dicha superficie del electrodo de silicio con un modelo de luz predeterminado para modificar la impedancia del electrodo y controlar el movimiento de dichas partículas según dicho modelo de luz predeterminado y modelar o la superficie o el interior de dicho electrodo.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho campo eléctrico es al menos uno de un campo eléctrico constante y uno variable con el tiempo.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de modelado se realiza usando al menos una de recrecimiento de óxido mediado por UV, modelado químico de la superficie y perfilado de densidad de carga superficial.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho electrodo es un electrodo sensible a la luz.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de iluminación se realiza usando al menos una única fuente de luz espacialmente modulada.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de iluminación comprende la etapa adicional de:
iluminar un área seleccionada de dicho electrodo para hacer que las partículas se muevan dentro de dicha área seleccionada.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de iluminación comprende la etapa adicional de:
iluminar un área seleccionada de dicha superficie del electrodo con un modelo de luz de alta intensidad de manera que se produzca el movimiento de las partículas fuera de dicha área seleccionada.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de iluminación es variable con el tiempo.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que una onda de limitación transversal progresiva se establece a lo largo de dicho electrodo.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de modelado comprende la etapa adicional de:
crear un área seleccionada de baja impedancia sobre dicho electrodo para hacer que las partículas se muevan dentro de dicha área seleccionada.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la frecuencia de dicho campo eléctrico se ajusta con el fin de colocar partículas en el entorno que delinea dicha área de baja impedancia.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de modelado comprende la etapa adicional de:
proporcionar dicha superficie con baja impedancia excepto para un área seleccionada para hacer que las partículas se muevan fuera de dicha área seleccionada.
13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de modelado se usa para crear primeras y segundas áreas de baja impedancia sobre dicho electrodo, y dicha etapa de iluminación se usa para conectar selectivamente dichas primeras y segundas áreas para hacer que dichas partículas se muevan selectivamente entre dicha primera área y dicha segunda área.
14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de modelado se usa para crear primeras, segundas y terceras áreas de baja impedancia sobre dicha superficie, y dicha etapa de iluminación se usa para hacer selec-
tivamente que dichas partículas coloidales se muevan de dichas primeras y segundas áreas hacia dicha tercer área.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha etapa de modelado se usa para crear primeras, segundas y terceras áreas de baja impedancia sobre dicha superficie, y dicha etapa de iluminación se usa para hacer selectivamente que dichas partículas se separen y se muevan de dicha primer área hacia dicha segunda y tercer área.
16. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además las siguientes etapas:
definir un modelo sobre dicho electrodo, incluyendo dicho modelo un conducto estrecho conectado a un área amplia; y
formar un óxido de espesor reducido sustancialmente constante sobre dicho electrodo, correspondiendo dicho óxido de espesor reducido sustancialmente a dicho conducto estrecho y dicha área amplia.
17. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además las siguientes etapas:
definir un modelo sobre dicho electrodo, incluyendo dicho modelo un conducto estrecho; y
formar un óxido de espesor variable sobre dicho electrodo, correspondiendo dicho óxido de espesor variable sustancialmente a dicho conducto estrecho y aumentar de un primer espesor en un primer extremo de dicho conducto estrecho a un segundo espesor en un segundo extremo de dicho conducto estrecho.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicho óxido de espesor variable aumenta sustancialmente de manera lineal desde dicho primer espesor a dicho segundo espesor.
19. Un aparato de clasificación para implementar el desplazamiento lateral diferencial de partículas suspendidas en una interfase entre un electrodo y una disolución de electrolito, comprendiendo dicho aparato:
un generador de campo eléctrico que genera un campo eléctrico en dicha interfase;
un electrodo;
una disolución de electrolito que tiene un flujo sustancialmente continuo que efectúa el desplazamiento de dichas partículas en una dirección sustancialmente paralela a dicha interfase;
estando modelado dicho electrodo y teniendo modificadas sus propiedades electroquímicas;
una fuente de iluminación que ilumina dicho electrodo con un modelo de luz predeterminado ajustable; y
una pluralidad de partículas localizadas en dicha disolución de electrolito, activándose dichas partículas mediante una combinación de fuerzas que se producen de dicho flujo de electrolito sustancialmente continuo y de dicho campo eléctrico según dicho modelo de luz predeterminado y dichas propiedades electroquímicas del electrodo, desplazándose dichas partículas según variaciones en las propiedades físicas y químicas que determinan la movilidad de dichas partículas.
20. El aparato de clasificación de la reivindicación 19, en el que dicho modelado incluye una pluralidad de filas de áreas de barrera intermitentemente espaciadas de alta impedancia, disminuyendo el espaciado intermitente de las barreras de una fila a la siguiente, estando situadas dichas filas transversalmente a través de dicho electrodo;
modelizándose adicionalmente dicho electrodo para incluir un perfil de impedancia caracterizado porque dicho perfil de impedancia disminuye en la dirección a través de dicho electrodo, teniendo dicho perfil de impedancia un alto valor en un lado de dicho electrodo que se corresponde con la fila de barreras que tiene el mayor espaciado intermitente, y un bajo valor en un lado opuesto de dicho electrodo que se corresponde con la fila de barreras que tiene el menor espaciado intermitente;
provocando dicho campo eléctrico que dichas partículas se muevan en una dirección sustancialmente transversal a dicho flujo de electrolito según dicha variación en la impedancia entre dichos primer y segundo lado de dicho electrodo, actuando dichas filas de barreras intermitentemente espaciadas para separar las partículas por tamaño según el espaciado intermitente de dichas filas de barreras.
21. El aparato de clasificación de la reivindicación 19, en el que dicho electrodo es un electrodo sensible a la luz.
22. El aparato de clasificación de la reivindicación 19, en el que dicho perfil de impedancia se crea por un modelo de iluminación predeterminado.
23. El aparato de clasificación de la reivindicación 19, en el que:
dicho modelado de electrodo incluye un área de baja impedancia bordeada por un área de alta impedancia, incluyendo dicha área de baja impedancia un conducto estrecho en comunicación con un conducto ancho, estando los dos conductos dichos orientados paralelos a la dirección de dicho flujo continuo de dicho electrolito;
incluyendo dicho conducto ancho una fila de áreas intermitentemente espaciadas de barreras de alta impedancia que atraviesan el ancho de dicho conducto ancho;
pudiendo distinguirse ópticamente una parte de dicha pluralidad de partículas de las partículas restantes;
un detector para inspeccionar visualmente dichas partículas que atraviesan la longitud de dicho conducto estrecho en respuesta a dicho flujo continuo de electrolito; teniendo dicho modelo de iluminación sustancialmente la forma de un rectángulo que tiene una dimensión más larga ajustada para ser sustancialmente igual al ancho de dicho conducto ancho, teniendo dicho rectángulo una dimensión más pequeña que se ajusta para ser sustancialmente equivalente al diámetro de dichas partículas, estando localizado dicho modelo delante de dichas barreras, y conformándose dicho modelo de iluminación a un perfil de intensidad que sitúa un valor máximo de intensidad en el centro de dicho conducto ancho y disminuyendo simétricamente a valores más bajos de intensidad en los dos lados de dicho conducto ancho; y un circuito de activación de retraso que activa dicho perfil de iluminación en respuesta a una señal derivada de dicha inspección visual de dichas partículas de manera que produce una partícula iluminada que va a desplazarse de regiones de intensidad máxima a regiones de menor intensidad de dicho perfil de intensidad y va a desviarse hacia de los espacios intermitentes entre dichas barreras.
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