NL9002764A - Elektrode, voorzien van een polymeerbekleding met een daaraan gebonden redox-enzym. - Google Patents

Description

Elektrode, voorzien van een polymeerbekleding met een daaraan gebondenredox-enzym.

De uitvinding heeft betrekking op een elektrode, welke voorzien isvan een polymeerbekleding met een daaraan gebonden redox-enzym en welkeelektrode, afhankelijk van het gekozen doel, hetzij in een- biosensorvoor het specifiek detecteren van bepaalde, voor het betreffende enzymherkenbare stoffen hetzij bij de produktie van chemicaliën, welke doorhet betreffende enzym kunnen worden bereid, gebruikt kan worden. Tevensheeft de uitvinding betrekking op biosensoren resp. produktie-inrich-tingen voor chemicaliën, welke een dergelijke elektrode bevatten.

Een biosensor van het bovenbeschreven type is bekend uit Anal.Chem. I99O. 62. blz. 1111-1117· Meer in het bijzonder heeft dezeliteratuurplaats betrekking op een geplatiniseerde koolstofelektrode,welke van het redox-enzym glucose-oxidase en een door middel vanelektropolymerisatie opgebrachte gepolymeriseerde 1,2-diaminobenzeenlaagis voorzien. Met een dergelijke glucose-sensor, gebaseerd op flavine-adeninedinucleotide (FAD) - gebonden glucose-oxidase (GOd), wordt het tedetecteren glucose indirekt bepaald met behulp van het vrijgekomenwaterstofperoxide, zoals verduidelijkt met de onderstaande reaktie-vergelijkingen: GOd-FAD + glucose -* G0d-FADH2 + gluconolactonG0d-FADH2 + 02 - GOd-FAD + H202.

De detectie van dit waterstofperoxide, dat aan de anode wordtgedetecteerd, bezit echter het nadeel, dat deze bij hoge spanningen opde sensor dient te worden uitgevoerd, wat aanleiding kan geven totinterferenties van andere stoffen. Bovendien bezit het waterstofperoxideeen degraderende werking op het als redox-enzym gebruikte glucose-oxidase (zie blz. 1112, linker kolom, derde alinea). Voorts wordt naarvoren gebracht, dat er bij voorkeur een immobilisatie van het glucose-oxidase plaats vindt onder toepassing van een carbodiimide als covalentebindingen verschaffend middel en/of glutaaraldehyde als verknopings-middel, wat de vervaardiging van een dergelijke biosensor tamelijkomslachtig maakt.

In Acc. Chem. Res. 2J (1990). blz. 128-13^ wordt het gebruik vandiffusiemediators, zoals bijvoorbeeld ferroceen en ferroceenderivatenals kunstmatige elektronacceptor voor redox-enzymen vermeld. In hetgeval van glucose-oxidase wordt het te detecteren glucose indirekt viade (gereduceerde) mediator bepaald; zie de onderstaande reaktie-vergelijkingen: GOd-FAD + glucose -* G0d-FADH2 + gluconolactonG0d-FADH2 + 2 mediatorox -* GOd-FAD + 2 mediatorre<* + 2H+

De verkregen gereduceerde mediator wordt vervolgens elektro¬chemisch geoxideerd. Gebleken is echter, dat het gebruik van een media¬tor behept is met nadelen zoals het weglekken van de mediator uit hetsysteem. Tevens hebben geschikte mediatoren veelal toxische eigen¬schappen, hetgeen het toepassingsgebied van hierop gebaseerde sensorensterk beperkt.

Uit Sensors and Actuators BI (1990), blz. 537-5^1 is het gebruikvan een op een elektrodeoppervlak aangebrachte polypyrroolfilm bekend,welke film via een carbodiimide-aktivering op covalente wijze met redox-enzymen zoals glucose-oxidase e.d. is verbonden. Op deze wijze wordenbiosensoren met een relatief korte responstijd verkregen. Echter is bijde vervaardiging van dergelijke biosensoren een carbodiimide als reagensvereist, waarvan het gebruik als ongewenst wordt ervaren.

Uit Biotechnol. Bioeng. (1988), 31, 6, 3/2, 553~558 is eenelektrokatalysereaktor bekend, waarin als redox-enzym glucose-oxidasewordt toegepast. Dit glucose-oxidase is op het oppervlak van koolstof-vilt aangebracht door middel van het uitvoeren van een grensvlakoxidatievan het koolstof ter vorming van carbonzuurgroepen en een aktivering vandeze groepen met een carbodiimide, gevolgd door immobilisatie van hetglucose-oxidase. Door de in deze literatuurplaats beschreven reaktorwerd een oplossing van glucose (als uitgangsmateriaal voor gluconzuur)en benzochinon (als elektronenoverdrachtmediator) geleid. De reaktorbezit een produktiviteit aan gluconzuur uit glucose van ca. 100 g/uur.liter reaktor. Behalve de specifieke wijze van immobiliseren van hetredox-enzym wordt eveneens het gebruik van de mediator als minder ge¬schikt ervaren.

De uitvinding heeft ten doel een elektrode van het in de aanhefgeformuleerde type te ontwikkelen, welke op een eenvoudige wijze ver¬vaardigd kan worden en ruime toepassingsmogelijkheden bezit, zoals bijv.in een biosensor of in een produktie-inrichting voor het bereiden vanbepaalde chemicaliën. Een dergelijke produktie-inrichting is in deliteratuur nog niet verschenen.

Gevonden werd, dat het bovenvermelde doel kan worden bereikt metbehulp van een elektrode, welke opgebouwd is uit een membraan, voorzienvan door dit membraan heen lopende open poriën, waarbij de wand van deporiën een elektrisch geleidende polymeerbekleding bezit, welke poly-meerbekleding een daaraan gebonden redox-enzym bevat en waarbij éénzijde van het membraan van een geleidende metaallaag is voorzien, welke metaallaag in kontakt staat met de polymeerbekleding.

Meer in het bijzonder kan in het kader van de uitvinding wordengesteld, dat aanvraagster gebruik heeft gemaakt van enerzijds de meso-scopische ruimte van de poriën-bevattende membranen en anderzijds van demorfologie van het elektrisch geleidende polymeer, waarmee het mogelijkis gebleken in een via het polymeer lopende elektronenoverdra'cht tussenhet redox-enzym zoals bijv. glucose-oxidase en de elektrode te bewerk¬stelligen alsook in de poriën het redoxenzym in te bouwen onder hand¬having van de aktiviteit ervan. Als belangrijk voordeel van het onder¬werp van de uitvinding wordt naar voren gebracht, dat hierbij geen uitde stand der techniek bekende hulpstoffen zoals carbodiimiden, glutaar-aldehyde e.d. voor het immobiliseren van het redox-enzym benodigdworden.

Voorts wordt ten aanzien van de elektrode volgens de uitvindingnaar voren gebracht, dat de zich in de poriën van het membraan bevin¬dende redox-enzymen enerzijds een betere gelegenheid hebben huntertiaire structuur te bewaren en anderzijds in de poriën van het mem¬braan beter afgeschermd zijn ten opzichte van invloeden van buiten af,zoals daarop uitgeoefende afschuifkrachten en de bij het hanteren van desensor optredende invloeden.

Als membranen kunnen inzake de elektrode volgens de uitvindingvele in de handel verkrijgbare inerte membranen worden toegepast zoalsde handelsprodukten Nuclepore-membranen, Cyclopore-membranen, Anopore-membranen en Millipore-membranen. Meer in het bijzonder zijn Nuclepore-membranen bijvoorbeeld polycarbonaat- of polyester-membranen, welkemembranen voorzien zijn van uniforme cylindrische poriën, welke door hetmembraan heen lopen. Evenals de organische Nuclepore-membranen bezittende organische Cyclopore-membranen en de anorganische Anopore-membraneneveneens door het membraan heen lopende poriën. Met betrekking tot dedikte van de membranen kan worden gesteld, dat deze op zich nietkritisch is en meestal in het trajekt van 1-20 pm ligt en met voordeelca. 10 pm bedraagt. De diameter van de in de membranen aanwezige poriënkan binnen wijde grenzen variëren en ligt normaliter in het trajekt van100-10.000 nm (0,1-10 pm), met voordeel in het trajekt van 100-1000 nm.De poriedichtheid (aantal poriën/cm2) is mede afhankelijk van de porie-diameter, maar is normaliter gelegen in het trajekt van 10^-3.10^.

Als elektrisch geleidend polymeer kunnen in principe de uit destand der techniek bekende polymeren worden toegepast, zoals de poly¬meren, welke gebaseerd zijn op pyrrool, gesubstitueerde pyrrool-derivaten, thiofeen, gesubstitueerde thiofeenderivaten, aniline en gesubstitueerde anilinederivaten. Bij voorkeur wordt pyrrool als mono-meer toegepast voor de vorming van een elektrisch geleidende poly-pyrroolbekleding. De dikte van de in de poriën aangebrachte laag hangtmede af van de diameter van de poriën in het membraan, aangezien dezeporiën na het aanbrengen van de polymeerbekleding nog open dienen tezijn. Normaliter worden polypyrroolbekledingen met een dikte Van 50-200nm toegepast maar er kunnen ook bekledingen met een daarvan afwijkendedikte worden gebruikt.

Als in de beklede poriën van het membraan aan te brengen redox-enzymen kunnen velerlei typen redox-enzymen worden genoemd. Voorbeeldenvan dergelijke enzymen zijn glucose-oxidase, lactose-oxidase, galac-tose-oxidase, enoaat reductase, hydrogenase en choline-dehydrogenase.Met voordeel wordt het glucose-oxidase gebruikt. Dit redox-enzym isnormaliter in een hoeveelheid van 0.02-0.2 U/cm2 membraan-oppervlakaanwezig. (1 U (unit) oxideert 1 pmol β-D-glucose tot D-gluconzuur enH2O2 per minuut bij pH=5,l en een temperatuur van 35*C). Met behulp vandergelijke redox-enzymen kunnen de betreffende stoffen hetzij specifiekgedetecteerd worden (biosensor) hetzij specifiek omgezet worden tot debetreffende omzettingsprodukten (bio-elektrochemische produktieinrich-ting). Als voorbeeld kan β-0-glucose-oxidase worden genoemd waarmeeenerzijds op specifieke wijze glucose kan worden gedetecteerd en ander¬zijds β-0-glucose op specifieke wijze in gluconzuur kan worden omgezet.

De elektrode volgens de uitvinding is aan tenminste één zijdevoorien van een metaallaag, welke de elektrode met de daaraan gekoppeldemeetinrichting kan verbinden. Voorbeelden van geschikte metalen zijno.a. platina, goud en palladium, waarbij platina de voorkeur verdient.Het opbrengen van de metaallaag kan op bekende wijze, zoals bijvoorbeeldsputteren, opdampen e.d., worden uitgevoerd. De dikte van een dergelijkemetaallaag bedraagt normaliter 100-500 nm.

In het kader van de uitvinding kunnen de elektroden als volgtworden vervaardigd. Als membranen kunnen bijvoorbeeld Nuclepore-membranen met poriën met bijvoorbeeld een diameter van 100-10.000 nm,met voordeel 200-8000 nm en bij voorkeur 800-1000 nm worden toegepast.De elektrisch geleidende polymeerbekleding kan met behulp van een oxida-tief-chemische polymerisatie in de poriën van het membraan worden aange¬bracht. Hierbij laat men bijvoorbeeld een pyrrooloplossing in water(bijv. 0,3"0,8 M pyrrool) en een ijzer(III) chloride-oplossing in water(1,5-2,5 M) met elkaar in kontakt komen, waarbij men één reagens aan éénzijde van het membraan en het andere reagens aan de andere zijde van hetmembraan plaatst. In de poriën van het membraan ontmoeten de pyrrool- monomeren en de oxiderende ijzer(III) chloride-oplossing elkaar, watresulteert in een polymerisatie van het pyrrool. De polymerisatietijd ishierbij niet kritisch en kan bijvoorbeeld 2-10 min. bedragen. In ditverband wordt naar voren gebracht, dat de porositeit als de voornaamsteparameter geldt. De polymerisatiereaktie kan bijvoorbeeld door spoelenmet water of een fosfaatbufferoplossing (PBS: pH = 6,5) worden gestopt.Een aanzienlijk langere polymerisatietijd dan 10 min. leidt tot niet-poreuze membranen, welke in het kader van de uitvinding niet bruikbaarzijn.

Na het aanbrengen van de elektrisch geleidende polymeerbekledingop de wand van de poriën van het membraan en het verwijderen van deeventuele polymeerbekleding op de zijde(n) van het membraan door bij¬voorbeeld afvegen, wordt op een zijde van het membraan een metaallaagvan platina of een soortgelijk metaal aangebracht door middel van bij¬voorbeeld opsputteren met een Edwards Sputtercoater S150B.

Tenslotte wordt het membraan in de poriën, waarvan de wand met eenelektrisch geleidend polymeer is bekleed, voorzien van een redox-enzymzoals glucose-oxidase door het behandelen ervan met een redox-enzym-houdende oplossing onder roeren bij een temperatuur van bijvoorbeeld 2-10°C, met voordeel 4°C gedurende tenminste 0,1 uur, bij voorkeur ten¬minste 0,5 uur. De concentratie van het glucose-oxidase in de oplossingkan binnen wijde grenzen variëren en bedraagt ca. 5 mg/ml. Na dezebehandeling kunnen de gerede membranen gedurende een nacht worden ge¬droogd in een exsiccator boven CaCl2.

LEGENDA

Fig. 1: Opstelling voor het uitvoeren van de pyrroolpolymerisatie in de poriën van een membraan: (1) injectiespuit; (2) plunjer van de injectiespuit; (3) FeCl^-oplossing; (4) houder voor het membraan; (5) membraan; (6) pyrrool-oplossing; (7) rubber ring.

Fig. 2: Weergave van GOd-aktiviteit van met polypyrrool gemodificeerd

Nuclepore-membraan, waarbij het polypyrrool van glucose-oxidase is voorzien. In deze figuur worden op de X-as de tijdin minuten en op de Y-as de stroomsterkte in microampèreweergegeven.

De cijfers 1 t/m 5 geven de volgende punten aan: (1) : inbrengen van de volgens het onderstaande voorbeeld verkregen, met polypyrrool gemodificeerd Nuclepore-mem¬braan (poriediameter: 800 nm; porositeit: 3·10?poriën/cm2; materiaal: polyester), waarbij het poly¬ pyrrool voorzien is van glucose-oxidase in een elektro¬chemische cel, zoals onderstaand beschreven is voor deproef voor het bepalen van de enzym-aktiviteit; (2) : verwijderen van het membraan uit de elektrochemische cel; (3) : inbrengen van het membraan in de elektrochemische cel; (4) : verwijderen van het membraan uit de elektrochemische cel; (5) : inbrengen van een oplossing, welke 0.02 U GOd bevat, om de meting te calibreren.

Fig. 3 ' Weergave van de amperometrische respons ten opzichte vanglucose van een sensormembraan onder Argon-atmosfeer.

In de figuur worden op de X-as de tijd in minuten en op de Y-as de stroomsterkte in microampère weergegeven.

Fig. 4: Weergave van de calibratiekromme van glucose.

In deze figuur worden op de X-as de glucoseconcentratie in mMen op de Y-as de stroomsterkte in microampère weergegeven. Dekromme geeft de respons onder argon weer, na injektie van15 Ui, 30 μΐ, 45 μΐ, 75 μΐ. 150 μΐ, 225 μΐ, 300 μΐ en 375 μΐglucose (1 Μ) in 15 ml PBS-buffer (ρΗ = 7.0; concentratiefosfaat: 10 mM).

VOORBEELD

A) Vervaardiging van een elektrode volgens de uitvinding.

(1) Toegepaste reagentia.

Glucose-oxidase (E.C. 1.1.3*4) type II (25.000 U/g) en cata-lase (E.C. 1.11.1.6), 2800 U/mg werden betrokken van Sigma.Benzochinon werd betrokken van Aldrich (Frankrijk) en werdvoor gebruik gesublimeerd. Pyrrool werd van Merck en watervrijijzer(III)chloride {38%) werd van Fluka betrokken en dezeverbindingen werden alszodanig toegepast. De Nuclepore-mem-branen werden van Ankersmit (Nederland) betrokken. Alle anderetoegepaste reagentia waren van p.a. (pro-analyse) kwaliteit.

(2) Oxidatief-chemische polymerisatie van pyrrool in de Nuclepore-membranen.

De polymerisatie van pyrrool in de poriën van de filtratie-membranen van het type Nuclepore, werd teweeggebracht door ineen membraan (diameter: 25 mm) een waterige oplossing van 2 MFeClj (normaliter gebruikte hoeveelheid: 4 ml) en een waterigeoplossing van 0,6 M pyrrool (normaliter gebruikte hoeveelheid:1 ml) te laten scheiden. In de praktijk werd dit gerealiseerddoor een injectiespuit, welke gevuld was met de ijzerchloride-oplossing, verticaal te positioneren en op de spuit eenstandaard-membraanhouder te monteren (zie Fig.l). De oxideren¬de ijzer(III)chloride-oplossing werd zover omhooggedrukt in demembraanhouder, dat het erop rustende membraan juist werdgeraakt. Een rubberring lag ter verzwaring op het membraan.Vervolgens werd op het membraan 1 ml. van de bovenvermeldepyrrooloplossing gebracht. Vanaf dit moment van opbrengen werdde duur van de polymerisatie gemeten. Voor Nuclepore-membranenmet poriën met een diameter van 0,8 pm (poriedichtheid: 3.10^poriën/cm2) en met poriën met een diameter van 1 pm (porie¬dichtheid: 2.10? poriën/cm2) werd de polymerisatie gedurende1-10 min. voortgezet, waarna het membraan werd verwijderd enmet een overmaat water of een fosfaatbuffer (PBS); pH = 6.5.gespoeld.

(3) Bekleding van een zijde van de Nuclepore-pyrrool-membraanvolgens (2) met platina.

Door middel van een mal met een opening, die juist ietskleiner was dan de diameter van het betreffende membraan werd een polypyrrool gemodificeerd filtermembraan tegen de koel-plaat van een Edwards S150B sputtercoater bedrukt. Vervolgenswordt bij een Argon-druk van 8 mBar en een sputterstroom van50 mA 100-400 nm Pt opgesputterd. De laagdikte werd gemetenmet een Edwards FTM5-eenheid.

(4) Immobilisatie van glucose-oxidase in de gemodificeerde filter-membranen volgens (3).

Voor de enzym-immobilisatie werden de volgens (3) verkregenmembranen met een oorspronkelijke poriediameter van 800 en1000 nm gebruikt. Voor de immobilisatie werd in 4 ml van een 5mg/ml GOd-oplossing een membraan gebracht, waarna het geheelwerd geschud met behulp van een Gyrotory Shaker Model G2 (NewBrunswick Scientific, USA). De immobilisatie vond plaats bij4°C gedurende minimaal een half uur. Vervolgens werd hetmembraan in PBS (pH = 6.5) gespoeld en gedurende een nacht bij4*C gedroogd. Dit drogen vond plaats in een exsiccator ondernormale druk en bij aanwezigheid van CaCl2· B) Onderzoek van de onder (A) verkregen elektrode volgens de uitvinding.

Proefmethoden (1) De enzymaktiviteit werd bepaald met behulp van een drie-elek-trodencel, welke 15 ml 0.1 M fosfaatbuffer (pH = 6,5). 5 mMbenzochinon en 0,5 M glucose bevatte. Men liet de glucose-oplossing ten minste 24 uur mutaroteren. De proef werd uitge¬voerd met een Pt-roterende schijfelektrode (RDE), welke voor¬zien was van een Electrocraft Corporation Model E550 motor eneen E552 snelheidscontrole-eenheid. Aan de Pt-werkelektrodewerd een potentiaal van 0,350 V (Ag/Ag+-referentie) aangelegden werd met een snelheid van 3000 toeren per minuut geroteerd.Een spiraalvormige Pt-elektrode werd als hulpelektrode toege¬past. De oplossing werd voor elke proef met Argon gespoeld.Tijdens de proef werd de oplossing met Argon afgedekt.

Alle elektrochemische metingen werden uitgevoerd met eenAutolab potentiostaat, die geregeld werd met een Olivetti M24personal computer en General Purpose Electrochemical System(GPES)-software (Eco Chemie, Nederland). De stroomafgifte werdmet een Yew 3056 penrecorder geregistreerd. De eigenlijke proef werd uitgevoerd door het opnemen van de stroomafgiftevan de RDE bij het onderdompelen van het monstermembraan in debovenvermelde oplossing.

(2) Amperometrische metingen aan membraansensoren volgens deuitvinding werden uitgevoerd in een drie-elektrodencel met desensor als werkelektrode. Hierbij werd het membraan tussen eengevouwen Pt-strip geklemd, welke strip elektrisch verbondenwas aan een potentiostaat. Voor het verkrijgen van een starreelektrode werd het membraan met behulp van dubbenzijdigeplakband aan een glasplaat verbonden.

Aan de sensor werd een potentiaal van 0,175 V vs Ag-referentieaangelegd. Een spiraalvormige Pt-draad werd als hulpelektrodetoegepast. De cel bevatte 15 ml 0.1 M fosfaatbuffer (pH = 6.5)met 10 U/ml catalase en werd onder een Argon-atmosfeer gehou¬den. Het roeren werd met behulp van een magnetisch roerstaafjebewerkstelligd. Na een aanvankelijke stroomsterkte nam deze aftot een steady-state-waarde, waarna monsters van een 1 Mglucose-oplossing werden toegevoegd; de hierbij optredendestroomrespons werd opgenomen.

C) Resultaten (1) De enzymaktiviteit werd met behulp van de bovenstaande methodebepaald. Bij het uitvoeren van de proef was het natuurlijkeco-substraat (zuurstof) vervangen door de kunstmatige elek-tronenacceptor benzochinon. Het hydrochinon, dat bij de kata¬lytische cyclus werd gevormd, werd elektrochemisch gemeten metde roterende schijfelektrode (RDE). De regeneratie van hetbenzochinon uit hydrochinon begint aan de RDE bij een bepaaldepotentiaal (0,35 V vs Ag) en de resulterende stroom is eenmaat voor de enzymaktiviteit. Ofschoon er een geringe toenamein stroomsterkte optreedt als gevolg van de niet-gekatalyseer-de oxidatie van glucose door benzochinon, is de stroomsterkteals gevolg van de katalytische werking van het enzym grootgenoeg om een aanmerkelijk verschil in helling van de stroom-tijd-kromme te geven (zie Fig.2). Fig.2 geeft het effekt op degemeten stroom weer, wanneer het membraan volgens de uitvin¬ding (zie boven) in de elektrochemische cel wordt gebracht.Zo¬als uit Fig.2 blijkt, neemt de stroom onmiddellijk toe na het inbrengen van het membraan. Dit effekt treedt op bij de boven¬aangegeven Nuclepore-membranen met de initiële poriediametersvan 800 nm en 1000 nm.

Het gegeven, dat na verwijderen van het membraan volgens deuitvinding de aktiviteit tot de initiële waarde terugkeert, iseen bewijs voor een geschikte immobilisatie van het enzym.Niet op juiste wijze geïmmobiliseerd materiaal zal in deoplossing blijven en als gevolg hebben, dat de helling van delijn na punt 2 in Fig.2 hoger zou zijn. Dit is in werkelijk¬heid ook gevonden voor membranen, welke met een GOd oplossingzijn behandeld maar waarbij geen polypyrroolbekleding in deporiën van het membraan aanwezig zijn. Daar er geen poly-pyrrool aanwezig is op het oppervlak van het membraan (zie hetexperimentele gedeelte) wordt aangenomen, dat op dit oppervlakgeen enzym wordt geadsorbeerd. Fig.2 laat zien, dat hetachtereenvolgens inbrengen en verwijderen van het membraangeen invloed heeft op de hoeveelheid aktief geïmmobiliseerdenzym. Dit is eveneens het geval, wanneer een membraan wordtgemeten, dat twee weken op is opgeslagen. Er kan geensignificante afname van de enzymaktiviteit worden waargenomen.Aan het einde van elke meting werd een bekende hoeveelheid(5 pg = 0.1 U) enzym toegevoegd om de aktiviteit te calibreren(punt 5 in de Fig.2). Aannemende, dat de elektrochemischereaktie een snel proces is, zal de diffusie van hydrochinonnaar de elektrode de snelheidsbepalende stap zijn. Derhalve ishet van geen of nauwelijks belang voor de meting, waar hethydrochinon wordt gevormd. Dit houdt in, dat de hellingen,resulterend van geïmmobiliseerd en vrij enzym kunnen wordengekorreleerd, tenminste in een semi-kwalitatieve wijze. Uit decalibratie kan worden geconcludeerd, dat ca. 0.02 U/cm2 aktiefGOd in het membraan aanwezig is.

(2) Fig. 3 geeft de elektrochemische respons van het systeeminzake het toevoegen van glucose weer. In dit voorbeeld werd,zoals bovenstaand weergegeven, het membraan als werkelektrodetoegepast. Aan het membraan werd een potentiaal van 0,175 Vvs. Ag aangelegd. Een platinadraad diende als hulpelektrode.De amperometrische respons werd bepaald in een geroerde cel,welke gevuld was met 15 ml 0,1 M fosfaatbuffer. De boven¬ beschreven Nuclepore-membranen met poriën met een diameter van800 en 1000 nm werden op deze wijze beproefd. De toename instroomsterkte (Fig.3) werd bepaald onder argon atmosfeer enbij aanwezigheid van 10 U/ml catalase. Het laatstgenoemdeenzym was toegevoegd voor het ontleden van mogelijk aanwezigH2O2. De toegepaste potentiaal bedroeg, zoals vermeld, 0,175 Vvs. Ag-referentie, wat een te geringe potentiaal is, om H2O2te oxideren. Derhalve kan worden gesteld, dat het enzym zijnelektronen direkt naar het geleidende polymeer transporteert.De begrensde ruimte in de poriën van het membraan, tezamen metde amorfe structuur van het polypyrrool brengt blijkbaar deaktieve centra van de enzymmoleculen in nauw kontakt met hetgeleidende polymeer.

De responstijd is minder dan één minuut, wat snel geacht kanworden onder beschouwing van de geometrie van de sensor.Hierbij dient tevens de tijd in acht genomen te worden, welkenodig is voor het verkrijgen van een uniforme glucoseconcen-tratie over de gehele oplossing; deze tijd kan 10 seconden ofmeer bedragen.

Het injecteren van grote hoeveelheden glucose geeft aanleidingtot een verzadigingseffekt, zodat de stroomrespons nietlineair is met de glucoseconcentratie. Dit werd duidelijkwanneer een calibratie-curve werd gemaakt door het achtereen¬volgens toevoegen van bepaalde hoeveelheden glucose tot de¬zelfde oplossing in de cel (Fig.4). Onder argon uitgevoerdemetingen bij aanwezigheid van catalase in de oplossing gavengoede resultaten tot een concentratie van 25 mM glucose.

(3) Concurrentie tussen het geleidende polymeer en zuurstof.

Wanneer zuurstof aanwezig is wordt het een concurrerend sub¬straat voor het polypyrrool inzake het accepteren van elektro¬nen uit de flavine-eenheden van GOd. In dit geval wordt nietslechts de stroom vanwege de direkte elektronenoverdracht naarhet polymeer kleiner maar wordt ook waterstofperoxide gevormd.Behalve het feit, dat waterstofperoxide het enzym en hetgeleidende polymeer degradeert draagt deze verbinding even¬eens bij tot het gemeten signaal. Ondanks de lage aangelegdepotentiaal aan de werkelektrode (0,175 V/Ag) reageert deze nog op waterstofperoxide. Echter in aanwezigheid van catalasewordt het gevormde H2O2 effectief vernietigd en wordt demeting niet verstoord.

Voor het verkrijgen van enig inzicht in de effekten van cata¬lase en de aanwezigheid van een inerte atmosfeer werdenmetingen onder verscheidene proefomstandigheden uitgevoerd. Deresultaten worden in de onderstaande Tabel A vermeld.

TABEL A

Respons voor glucose onder verschillende proefomstandigheden

Uit de in Tabel A vermelde resultaten blijkt, dat een kleinehoeveelheid catalase reeds de interferentie van zuurstofonderdrukt, terwijl argon geen additioneel effekt had.

(4) Selectiviteit

De selectiviteit van de sensor volgens de uitvinding werdbeproefd voor fructose. Er werd geen respons voor fructosewaargenomen.

Claims (11)

1. Elektrode, voorzien van een polymeerbekleding met een daaraangebonden redox-enzym, gekenmerkt doordat de elektrode opgebouwd is uiteen membraan, voorzien van door dit membraan heen lopende open poriën,waarbij de wand van deze poriën een elektrisch geleidende, polymeer¬bekleding bezit, welke polymeerbekleding een daaraan gebonden redox-enzym bevat en waarbij een zijde van het membraan van een elektrischgeleidende metaallaag is voorzien, welke metaallaag in kontakt staat metde polymeerbekleding.

2. Elektrode volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat het membraanuit een inert polycarbonaat- of polyestermateriaal bestaat.

3. Elektrode volgens conclusie 1 of 2, gekenmerkt doordat hetmembraan van poriën met een diameter van 100-1000 nm is voorzien en eenporositeit van 10^-3.10^ poriën/cm2 bezit.

4. Elektrode volgens een of meer der conclusies 1-3, gekenmerktdoordat het elektrisch geleidende polymeer polypyrrool is.

5· Elektrode volgens conclusie 4, gekenmerkt doordat de poly-pyrroolbekleding een dikte van 50-200 nm bezit.

6. Elektrode volgens een of meer der conclusies 1-5, gekenmerktdoordat het redox-enzym glucose-oxidase of enoaat-reductase is.

7. Elektrode volgens conclusie 6, gekenmerkt doordat het glucose-oxidase in een hoeveelheid van 0,02-0,2 U/cm2 membraanoppervlak aanwezigis.

8. Elektrode volgens een of meer der conclusies 1-7, gekenmerktdoordat het metaal van de metaallaag platina is.

9. Elektrode volgens conclusie 8, gekenmerkt doordat de metaallaageen dikte van 100-500 nm bezit.

10. Werkwijze voor het detecteren van specifieke stoffen zoalsglucose in monsters, met het kenmerk, dat men daarbij een biosensor metde elektrode volgens een of meer der conclusies 1-9 toepast, welkeelektrode een voor het doel geschikt redox-enzym bevat.

11. Werkwijze voor het bereiden van specifieke stoffen zoalsgluconzuur, met het kenmerk, dat men daarbij een elektrochemischeinrichting met de elektrode volgens een of meer der conclusies 1-9 toepast, welke elektrode een voor het doel geschikt redoxenzym bevat. «#**