JPS59164953A - 固定化酵素膜およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は所定の電極とともに固定化酵素膜センサを形
成する固定化酵素膜およびその製造方法に関する。一般
に、かかる酵素膜センサは、医療上の重要な指標となる
生体の糖類、コレステロール等の物質やその他の溶液中
の微量成分等を所定の酵素を用いて選択性良く定量分析
する分析装置に使用され、特に、このセンサを構成する
固定化酵素膜としては、酵素負荷量が大きく、応答性お
よび長期安定性が良く、かつ製造が容易であることが望
ましい。

従来、上述の如き糖類、コレステａ−ルまたは溶液中の
微量成分等を選択性よく定量する方法として、溶液状の
酵素を用いる方法が知られている。

この方法は、酵素が有する基質特異性と高い触媒活性を
利用するもので、特に多成分溶液中の微量成分の分析に
効果を上げているが、高価な酵素を多量に消費すること
や、操作が煩雑でしかも分析に時間を要すること、また
酵素が不安定であることなどの問題を有していた。そこ
で、これらの問題を解決するために多孔性担体上に固定
された酵素と電極とを組み合わせた酵素膜センサが開発
された。したがって、このような酵素膜センサによれば
分析操作が極めて容易となるばかりでなく、測定時間が
短縮され、酵素の使用効率が向上するという利点がもた
らされる。ところで、かかる酵素膜センサにおいては、
酵素は多孔質膜状担体に物理的または化学的に固定化さ
れるが、その具体的な例として、例えば次の如きものが
知られている。

第１Ａ図および第１Ｂ図は固定化酵素膜の従来例を示す
構造断面図である。

第１Ａ図に示されるものは、多孔質有機高分子膜１の膜
孔（以下、単に孔ともいう。）２に酵素３を物理化学的
に固定化したものである。なお、これについて、必要な
らば、例えば特開昭５２−１７８８９号公報を参照され
たい。しかしながら、これは空隙率が充分でない（孔の
数が少ない）ため酵素負荷量（酵素が反応に寄与し得る
能力）が不足するばかりでなく、酵素３を化学的に固定
化する多孔質膜が１枚であるため、酵素３を保持できず
に脱離するというおそれがある。

一方、第１Ｂ図に示されるものは、多孔質有機高分子膜
ｌと選択透過性（酵素の種類、大きさおよび膜孔の径な
どによって反応が行なわれたり、行なわれなかったりす
ること。）を有する均質膜４との間にゲル化された酵素
をラミネートするものである。なお、これについて、必
要ならば、例えば特開昭５２−５５６９１号公報を参照
されたい。したがって、第１Ａ図に示されるものと比較
して、酵素負荷量が太きく、シかも脱離のおそれがない
ものであるが、均質膜４にその厚さが２μ（ミクロン）
以下の極薄膜が必要となるため、成膜および固定化時の
製造工程が複雑で、高度の熟練を要するうえ機械的強度
に弱いという欠点を有している。

この発明はこれらの点に鑑みてなされたもので、酵素負
荷量が大きく、かつ製造が容易で、しかも充分な強度を
有する固定化酵素膜およびその製造方法を提供すること
を目的とする。

すなわち、この発明による固定化酵素膜は、膜孔内およ
び表面に所定の酵素がそれぞれ化学的に固定化された２
枚の多孔質高分子有機膜を互いに重ね合わせて接着した
点に特徴を有するものであり、その製造方法は、酵素と
、接着成分となる不活性蛋白質と、固定化のための所定
成分とを含む溶液中に少なくとも２枚の多孔質高分子有
機膜を浸漬してその膜孔内および表面に酵素をそｎぞれ
固定化した後、この２枚の多孔質高分子有機膜を互いに
重ね合わせて接着するとともに酵素の固定化部分をゲル
化することを特徴とするものである。

第２図はこの発明による固定化酵素膜を示す構造断面図
である。これは、同図からも明らかなように、同じ材料
からなる２枚の多孔質膜１１　ｒ　１２を重ね合わせて
構成され、少なくともそれらの膜間および膜孔内に酵素
と不活性蛋白質（多孔質膜の接着成分）とのち密ゲル部
からなる固定化部が形成さｎている点が特徴である。こ
こで、多孔質膜１１　、１２の材料としてはポリカーボ
ネート、ポリアミドイミド、ポリエステル、脂肪族およ
び芳香族ポリアミド、セルロース誘導体、アクリロニト
リル系共重合体、ポリウレタン、ポリメチルメタクリレ
ート等を使用することができる。また、その膜厚として
は、７〜ｌＯμ、孔径としては０．０１５〜０．０３μ
程度に選ばれることが望ましい。酵素としては、例えば
グルコースオキシダーゼ、コレステロールオΦシダーゼ
、アルコールオキシダーゼ、ウレアーゼ、アミラーゼま
たはカタラーゼ等があり、これらの酵素は単独または必
要に応じて２種類以上混合して用いることも可能である
。したがって、多孔質膜の膜孔の径および酵素の種類、
大きさを選ぶことによってＰ９Ｔ足の選択透過性を付与
することができる。

第３図は上述の如き固定化酵素膜製造方法の実施例を説
明するフローチャートである。

マス、グルコースオキシダーゼ（酵素）１００■、アル
ブミン（接着成分となる不活性蛋白質）１００■を０．
１Ｍ（モル）のリン酸緩衝溶液（ＰＨ＝７．０）３−に
溶解した液に２５％グルタルアルデヒド水溶液０．３−
を添加した酵素溶液を用意する。この酵素溶液に多孔質
ポリカーボネート膜（外径φ４７、膜厚７〜ｌＯμ、孔
径０．０１５〜０．０３μ）を少なくとも２枚浸漬し、
５℃で１６時間の置屋化処理を行なうことにより、多孔
質膜の孔中および弐面にち密ゲル部を形成させる（■）
。

なお、このときの酵素固定化処理時間は、通常１時間以
上２４時間以内とするのが望ましく、その処理温度１１
′ｌｉ′酵素が失活（活性化を失なうこと〕しない程度
の温度、すなわち室温から０℃の間で行なうことが望ま
しい。所定時間の固定化処理を行なったら、この処理膜
を酵素溶液より取り出し、例えばガラス板上で２枚の処
理膜を重ね合わせる（＠〕。この場合、処理膜は酵素溶
液がゲル化しないうちに取り出すことは云う迄もない。

こうして、重畳さｎた多孔質膜は、温度５℃で２時間か
けて多孔質処理膜の＃、素固定化部をゲル化するととも
に、膜間の接着を行なう（■）。次いで、上記ガラス板
と一緒に１〜３’　ｍｎＨｆの真空乾燥器内で２〜４時
間のＸ窒乾燥を行ない（＠）、しかる後、第２図の如き
形状とするための表面処理を適宜実行ｑ、さらにＯ，１
Ｍのリン酸緩衝液（ＰＨ＝’７；０）で洗浄後、風乾す
る（（ト））。このようにすることにょ９、酵素は多孔
質膜の孔中および膜間に充分かつ強固に固定されるため
酵素負荷量が大きく、シかも２枚の多孔質膜を重畳して
いることがら強度の高い固定化酵素膜を得ることができ
る。また、浸漬法を採用しているため、同時に複数枚の
多孔質膜の固定化が可能であることから、その製造が著
しく簡略となる利点を有するものである。なお、との実
施例では、グルタルアルデヒドなる架橋試薬による架橋
法を用いて酵素の固定化を行なうようにしているが、こ
れのみに限定されるものではなく、その他の適宜な固定
化方法を採用することができる。

こうして作られた固定化酵素膜は、過酸化水素電極と組
み合わされて第４図の如き酵素膜センサが構成される。

なお、第４図は酵素膜センサの構造を示す断面図である
。すなわち、同図の符号１１で衣わされる固定化酵素膜
は白金電極１２、銀電極１３および絶縁体１４からなる
過酸化水素電極とともにケース１５に収容されて酵素膜
センサが形成される。なお、１６は固定化酵素膜１１を
取り付けるためのＯ−リングであり、１７；１８はそれ
ぞれ白金電極１２．銀電極１３から導出されるリード線
でｂる。

第５図はこの発明による固定化酵素膜を用いた酵素膜セ
ンサの実測結果を示す特性図である。

上述の如くして得られる酵素膜センサを、３５℃でＰＨ
７，０の０．１Ｍリン酸緩衝液１０ゴを入れたＱｆ定の
セル内に浸漬し、測足の対象となるグルコース標準溶液
（１５０■／ｄｔ　）　２０μｔ　を攪拌下にマイクロ
ピペットを用いてセル中に投入すると、その出力電流は
２０秒間で一定値を示し、第５図の如き実測結果が得ら
れた。なお、第５図の横軸はグルコース標準溶液の濃度
（■／ｄｔ　）を示し、縦軸はその実測値（Ｔｑ／ｄｔ
　）を示すものである。同図からも明らかなように、グ
ルコース濃度と実測値との間には良好な直線性が認めら
れ、これより未知濃度のグルコースの分析が可能である
ことが確かめられた。１だ、セル中に放置した状態での
長期安定性を調べた結果、３０日間安定であることが確
認された。さらに、電極反応阻害物である尿酸溶液１０
　ｍ？／ａｔを投入しても電極反応は観測されず、した
がって、電極反応阻害物質の反応を排除する選択透過性
の機能も８認された。

以上のように、この発明によれば、多孔質高分子膜の膜
孔内および膜間に酵素と不活性蛋白質のち密層が形成さ
扛るため、所定の選択透過性を有するとともに酵素負荷
量が大きく、シかも長期安定性があり、さらには同一材
料を重ね合わせて構成するようにしたので強度が高く、
かつ製造が著しく簡略化され、したがって、高度の熟練
を要することなく製造することができる利点を有するも
のである。また、同一材料を重ね合わせた構造であるた
め長手方向の軸に対して対称となり、シたがって、従来
例の如く方向性を持たないので、過酸化水素電極への取
り付けが容易になるという利点を有するものである。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図および第１Ｂ図は固定化酵素膜の従来例を示す
構成図、第２図はこの発明による固定化酵素膜を示す構
成図、第３図はこの発明による固定化酵素膜の製造方法
の一実施例を示す流れ図、第４図は酵素膜センサの全体
的な構造を示す断面図、第５図はこの発明による固定化
酵素膜を用いたセンサの実測結果を示す特性図である。 符号説明 １　、１＋　、　１２・・・多孔質重分子有機膜、２・
・・膜孔、３・・・酵素、４・・・均質膜、１１・・・
固定化酵素膜、１２・・・白金電極、１３・・・銀電極
、１４・・・絶縁体、１５・・・ケース、１６・・・ｏ
−９ング、１７．１８・・・リード線 代理人　弁理士　蓬　木　昭　夫 代理人　弁理士　松　崎　　　　溝 膜１Ａ図 第　２　図 第　５１’！！１ グルコ−スジＫｌ（凛υ会υ 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）　Ｗｒ定径の膜孔を有する多孔質高分子有機膜２枚
   を互いに重ね合わせ、少なくともその膜孔内および膜間
   に所定酵素の固定化部を形成してなる固定化酵素膜。 ２）ＦＩＴ定の酵素と、接着成分である不活性蛋白質と
   、酵素を固定化するための固定化成分とを含む溶液中に
   少なくとも２枚の多孔質高分子有機膜を浸漬してその膜
   孔内および表面に酵素を固定化し、しかる後該２枚の多
   孔質高分子有機膜を互いに重ね合わせて接着するととも
   に、前記酵素の固定化部をゲル化する固定化酵素膜の製
   造方法。