FR2615862A1 - Procede de fabrication de supports enzymatiques utilisables dans des capteurs a enzymes et capteurs a enzymes equipes de tels supports - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé de fabrication de supports enzymatiques utilisables sur des capteurs à enzymes dans lequel on mélange une enzyme avec une protéine de charge et on copolymérise ce mélange en présence d'un agent de pontage, on disperse le mélange encore fluide, de façon homogène, avant sa prise en masse, dans une trame semi-rigide servant d'armature. Ce procédé est caractérisé en ce qu'on forme une membrane enzymatique armée de grande surface et, après durcissement, on découpe cette membrane enzymatique armée de grande surface pour obtenir des supports enzymatiques élémentaires 3 de mêmes formes, dimensions et caractéristiques d'activité, interchangeables et adaptables aux éléments sensibles 2 ou aux sondes enzymatiques des capteurs à enzymes.
Description
La présente invention concerne un procédé de fabrication de supports enzymatiques utilisables dans des capteurs à enzymes et des capteurs å enzymes équipés de tels supports.
On utilise de plus en plus, dans l'industrie, des supports possédant une activité enzymatique contrôlée et reproductible. Ces supports utilisent soi't une armature semi-rigide permettant d'améliorer les propriétées mécaniques, soit une membrane semi-perméable servant de barrière de diffusion sélective. Ces supports- enzymatiques armés sont destinés principalement à la réalisation de capteurs à enzymes mais ils peuvent servir également de surfaces actives dans des bioréacteurs.
L'utilisation des enzymes présente un intérêt croissant en raison de la grande spécificité chimique des réactions et des basses calories mises en jeu. Les conditions particulièrement douces des processus réactionnels et le limitation des réactions secondaires en présence de ces catalyseurs rendent les méthodes enzymatiques tout à fait adaptées aux transformations des substances biologiques et b l'industrie agroalimentaire. On peut ainsi trouver des applications dans la résolution de mélanges racémiques d'acides aminés utilisant 1 amico-acylase, la préparation des pénicillines semi-synthétiques au moyen de la pénicilline amidaee ou la conversion du fructose en glucose-par la glucose isomérase.
Les enzymes sont. en général, solubles dans l'eau et de ce fait la récupération de l'enzyme pour une nouvelle utilisation est souvent difficile et chère. En conséquence, différentes techniques ont été proposées pour l'imoeobilisa- tion des enzymes sur des supports. Compte tenu des phénomènes de relargage observés dans le cas des méthodes d'immobi lisatlon des enzymes par adsorption, les travaux s'orientent de plus en plus sur les procédés de fixation covalente. On peut citer par exemple les travaux de R.P ROHRBACH et M.
MALIARIK (brevet US-A- 4 268 419 ) sur la réalisation de supports de polyamine sur oxyde inorganique pqur enzymes immobilisées, de L. BOROS, B. SZAJANI et K. KOVACKS (demande de brevet internationale WO 83/00345) sur l immobilisation de la cholinestérase sur résine acrylique. et de Y. -KARASAWA et H. KOHKAMA (brevet DE-A- 2939443), concernant la fixation de l'enzyme sous pression dans une couche spongieuse.
Dans le cas d'une application aux capteurs à enzymes, l'immobilisation directe des enzymes sur l'élément sensible du capteur constitue un obstacle pour la commercialisation des électrodes enzymatiques compte tenu de la durée de vie des enzymes qui est relativement courte et de la maîtrise de la technique de greffage de l'enzyme qui est difficilement assimilable par l'utilisateur. Par ailleurs les électrodes enzymatiques qui sont destinées au dosage des inhibiteurs, nécessitent souvent des régénérations de l'enzyme et cette opération de régénérstion est peu commode à réaliser lorsque l'enzyme est immobilisé directement sur l élément sensible du capteur.
Actuellement on fabrique les supports enzymatiques en copolymérisant une enzyme avec une protéine de charge telle que le collagène, l'albumine ou tout autre protéine.
On peut également utiliser les polyamines ou le polyéthylène imine ou tout autre polymère possédant des groupements réactifs telle que NH2 ou COOH par exemple. On mélange intimement l'enzyme et la protéine de charge afin d'obtenir une coréticulation en présence d'un agent de pontage tel que des dialdéhydes, des diisocyanates ou tout autre agent bifonctionnel.
On connalt déjà, ainsi qu'il est décrit dans l'article "Improved Enzyme Electrode for Amygdalin" de R.A-. Llenado et G.A. Rechnitz, ANALYTICAL CHEMISTRY, Vol 43, Noll,
Septembre 1971. p.1457-1461 un procédé de fabrication de supports enzymatiques dans lequel on découpe transversale- ment en tranches un gel extrudé sous forme ctlindrique.'ce gel étant formé par photopolymérisation d'une solution d'enzyme dissoute dans un polymère. On obtient ainsi des supports enzymatiques individuels, sous la forme de membranes circulaires, qui peuvent être ensuite accouplés à l'élément sensible d'une électrode enzymatique, en étant maintenus sur cet élément sensible par un capuchon amovible.Un tel pro cédé de fabrication des membranes enzymatiques présente toutefois l'inconvénient de produire des membranes dont l'épaisseur n'est pas reproductible avec une grande précision puisque l'erreur sur l'épaisseur est de 30% (300 + 100 micromètres). A cette erreur s'ajoute l'incertitude due au gonflement aléstoire de la membrane obtenue sous forme de gel. Or, comme il est bien connu que la réponse de l'élec- trode est fonction de l'épaisseur de la membrane4 la fiabilité et la reproductibilité d'une électrode -utilisant une membrane enzymatique fabriquée par ce procédé en est affectée.
Septembre 1971. p.1457-1461 un procédé de fabrication de supports enzymatiques dans lequel on découpe transversale- ment en tranches un gel extrudé sous forme ctlindrique.'ce gel étant formé par photopolymérisation d'une solution d'enzyme dissoute dans un polymère. On obtient ainsi des supports enzymatiques individuels, sous la forme de membranes circulaires, qui peuvent être ensuite accouplés à l'élément sensible d'une électrode enzymatique, en étant maintenus sur cet élément sensible par un capuchon amovible.Un tel pro cédé de fabrication des membranes enzymatiques présente toutefois l'inconvénient de produire des membranes dont l'épaisseur n'est pas reproductible avec une grande précision puisque l'erreur sur l'épaisseur est de 30% (300 + 100 micromètres). A cette erreur s'ajoute l'incertitude due au gonflement aléstoire de la membrane obtenue sous forme de gel. Or, comme il est bien connu que la réponse de l'élec- trode est fonction de l'épaisseur de la membrane4 la fiabilité et la reproductibilité d'une électrode -utilisant une membrane enzymatique fabriquée par ce procédé en est affectée.
La présente invention a pour but de remédier à ces inconvénients en procurant un procédé permettant d'obtenir des supports enzymatiques facilement adaptables aux capteurs à enzymes, de dimensions et caractéristiques identiques, pouvant être fabriqués en grande série et jetables lorsque le besoin s'en fait sentir.
A cet effet ce procédé de fabrication de supports enzymatiques utilisables sur des capteurs à enzymes dans lequel on mélange une enzyme avec une protéine de charge et on copolymérise ce mélange en présence d'un agent de pontage, est caractérisé en ce mulon disperse le mélange encore fluide, de facon homogène, avant sa prise en masse, dans une trame semi-rigide servant d'armature pourformer une membrane enzymatique arméeplane de grande surface et , après durcissement. on découpe cette membrane enzymatique armée plane de grande surface pour obtenir des supports enzymatiques élémentaires de mêmes formes, dimensions et caractéristiques d'activité, interchangeables et adaptables aux éléments sensibles ou aux sondes enzymatiques des capteurs à enzymes.
Lorsque le support enzymatique obtenu pa le procédé suivant l'invention est utilisé dans un capteur à enzymes on découpe la membrane enzymatique armée de grande surface à l'emporte-pièce pour former des supports enzymatiques élémentaires, de forme circulaire, d'un même diamètre dépendant de la dimension de l'élément sensible du capteur à enzymes.
L'invention a également pour objet un capteur à enzymes comportant une gaine cylindrique entourant coaxis- lement une électrode enzymatique, de diamètre interne supérieur au diamètre externe de l'électrode, pourvue d'un élément sensible contre lequel est appliqué un support enzymatique interchangeable, obtenu par le procédé précité, une bague de centrage entourant l'élément sensible et dont la face frontale sert de plan d'appui pour la zone marginale du
support enzymatique s'étendant en travers de l'élément sensible de l'électrode et en contact avec celui-ci et une bague d'adaptation comprenant une collerette interne sur laquelle prend appui la périphérie de la face externe du support enzymatique, ainsi qu'une jupe cylindrique se terminant par une collerette de clippage interne s'engageant dans une gorge annulaire transversale de même forme prévue dans la surface externe de la gaine . caractérisé en ce-que la gaine cylindrique est maintenue séparée de l'électrode par une bague entretoise de centrage et par la bague de centrage entourant l'élément sensible et formant également entretoise.
support enzymatique s'étendant en travers de l'élément sensible de l'électrode et en contact avec celui-ci et une bague d'adaptation comprenant une collerette interne sur laquelle prend appui la périphérie de la face externe du support enzymatique, ainsi qu'une jupe cylindrique se terminant par une collerette de clippage interne s'engageant dans une gorge annulaire transversale de même forme prévue dans la surface externe de la gaine . caractérisé en ce-que la gaine cylindrique est maintenue séparée de l'électrode par une bague entretoise de centrage et par la bague de centrage entourant l'élément sensible et formant également entretoise.
On décrira ci-après,è titre d'exemples non limitatifs, diverses formes d'exécution de la présente invention, en référence au dessin annexé sur lequel
La figure 1 est une vue en coupe axiale partielle d'un capteur à. enzymes pourvu d'uns support enzymatique maintenu en place d'une manière amovible suivant 1' inven- tion.
La figure 1 est une vue en coupe axiale partielle d'un capteur à. enzymes pourvu d'uns support enzymatique maintenu en place d'une manière amovible suivant 1' inven- tion.
La figure 2 est une vue en coupe axiale d'une variante d'exécution dans laquelle le capteur à enzymes est du type à double membrane enzymatique.
Le capteur à enzymes qui est représenté sur la figure 1, comprend une électrode enzymatique 1, de forme cylindrique, se terminant par une face frontale 2 constituant l'élément sensible du capteur. Contre cet élément sensible 2 est appliqué un support enzymatique 3 constitué par une pièce de forme circulaire, de diamètre un peu supérieur à celui de l'élément sensible 2 et obtenu par le procédé suivant l'invention qui sera décrit en détail plus loin. Ce support enzymatique comprend une trame interne 3a constituant une armature semi-rigide, et une couche durcie 3b, solidaire de cette trame et qui est obtenue par copolyméri- sation d'une enzyme avec une protéine de charge.
Le support enzymatique 3 est maintenu au contact de l'élément sensible 2 de l'électrode 1 au moyen d'une bague d'adaptation 4 qui est fixée, de préférence par clippage, sur une gaine cylindrique 5 entourant coaxialement l'électrode 1, de diamètre interne supérieur au diamètre externe de l'électrode et maintenue séparée de celle-ci par des bagues entretoises de centrage 6 et 7.
La bague de centrage inférieure 6 entoure l'élément sensible 2 et sa face frontale inférieure 6a sert de plan d'appui pour la zone marginale du support enzymatique 3 s'étendant en travers de l'élément sensible 2 de l'électrode 1 et au contact de celui-ci.
La bague d'adaptation 4 comprend une collerette interne inférieure 4a sur laquelle prend appui la périphé- rie de la face externe du support enzymatique 3, et une jupe cylindrique 4b s'étendant vers le haut et se terminant par une collerette de clippage interne 4c s'engageant dans une gorge annulaire transversale 5a de même forme prévue dans la surface externe de la gaine 5.
On voit par conséquent, d'après la description qui précéde, que le support enzymatique 3 est maintenu en contact direct avec l'élément sensible 2 de l'électrode 1 du capteur au moyen de la bague d'adaptation 4. Cette bague d'adaptation 4 est fixée sur la gaine 5 du capteur de préférence par clippage. En effet ce procédé de fixation offre une plus grande fiabilité notamment par rapport aux techniques de vissage, qui peuvent entraîner une torsion de la membrane enzymatique 3, et par rapport aux techniques de fixation par attraction magnétique au moyen de rondelles qui finissent par glisser et se décoller du capteur et qui ne se prêtent pas à une utilisation en présence d'un agitateur magnétique.
Le support enzymatique 3 peut être indépendant de la bague d'adaptation 4 ou bien encore il peut être collé au préalable sur cette bague d'adaptation, réalisée de préférence en matière plastique telle que, par exemple, chlorure de polyvinyle, poîyéthylène, polyuréthane, polytétrafluoroéthylène, etc... L'ensemble formé par la bague 4 et le support enzymatique 3. peut être ainsi jeté lorsque l'enzyme perd son activité.
Dans la variante d'exécution de l'invention représentée sur la figure 2 le capteur à enzymes comprend une sonde enzymatique 8 (thermistance par exemple) réalisée sous forme de disque et présentant sur ses deux faces frontales, deux éléments sensibles 9 et 10. Sur ces deux éléments sensibles 9 et 10 sont respectivement plaqués deux supports enzymatiques 3 , constitués par des pièces circulaires de même diamètre que la sonde enzymatique en forme de disque 8. Les deux supports enzymatiques 3 sont maintenus, sur les deux faces frontales opposées de la sonde 8, au moyen de deux bagues d'adaptation 11,12, réalisées de préférence en matière plastique et fixées l'une à l'autre par clippage.
Dans ce cas les diamètres internes des bagues 11,12 sont sensiblement égaux au diamètre externe de la sonde circulaire 8 et des supports enzymatiques 3. Des fils de connexion électriques 13, reliés à la sonde 8, traversent l'une des bagues d'adaptation en l'occurrence la bague 12.
Le capteur à enzymes à doubie membrane enzymatique 3 qui est représenté sur la figure 2, permet d'obtenir une plus grande sensibilité de détection de la mesure.
La membrane enzymatique 3 peut être obtenue par copolymérisation d'une enzyme avec une protéine de charge telle que le collagène, l'albumine ou toute autre protéine ou encore les polyamines ou le polyéthylène imine ou tout autre polymère possédant des groupements réactifs tel que
NH2 ou COOH par exemple. On mélange intimement l'ensemble avec l'enzyme pour obtenir une coréticulation en présence d'un agent de pontage tel que des dialdéhydes, diisocyanates
ou tout autre agent bifonctionnel. Pour conférer à la membrane enzymatique 3 les propriétés mécaniques nécessai res à une manipulation aisée on disperse le mélange encore fluide, de façon homogène , avant sa prise en masse, dans une trame semi-rigide servant d'armature.Cette trame peut être constituée d'un tissu cellulosique, pofitaide au polyester ou par tout autre support poreux tel que métal fritté ou céramique par exemple. Le dépôt de la couche enzymetique active sur la trame est effectué, en une ou plusieurs couches successives, avec une baguette de -verre pour des petites surfaces, avec un racloir en caoutchouc pour les surfaces plus grandes ou bien encore par pulvérisation en aérosol de la solution enzymatique puis de la solution contenant l'agent de pontage.
NH2 ou COOH par exemple. On mélange intimement l'ensemble avec l'enzyme pour obtenir une coréticulation en présence d'un agent de pontage tel que des dialdéhydes, diisocyanates
ou tout autre agent bifonctionnel. Pour conférer à la membrane enzymatique 3 les propriétés mécaniques nécessai res à une manipulation aisée on disperse le mélange encore fluide, de façon homogène , avant sa prise en masse, dans une trame semi-rigide servant d'armature.Cette trame peut être constituée d'un tissu cellulosique, pofitaide au polyester ou par tout autre support poreux tel que métal fritté ou céramique par exemple. Le dépôt de la couche enzymetique active sur la trame est effectué, en une ou plusieurs couches successives, avec une baguette de -verre pour des petites surfaces, avec un racloir en caoutchouc pour les surfaces plus grandes ou bien encore par pulvérisation en aérosol de la solution enzymatique puis de la solution contenant l'agent de pontage.
Après durcissement du mélange on découpe la- membrane enzymatique armée de grande surface, à ltemporte-pièce, en supports enzymatiques élémentaires 3, ayant la même forme les même dimensions et par conséquent les mêmes caractéristiques d'activité. Ces supportsenzymatiques 3 ont une forme dépendant de l'emploi qui doit en être fait. Si ces supports enzymatiques 3 sont utilisés d'une manière interchangeable dans un capteur à enzymes à électrode de section droite circulaire, ils ont alors égaiement une forme circulaire d'un diamètre égal ou supérieur à celui de l'élément sensible de l'électrode du capteur.
Le procédé de fabrication suivant l'invention permet une fabrication en série des supports enzymatiques élémentaires, ce qui augmente la reproductibilité des mesures. En effet ces supports enzymatiques élémentaires 3, issus d'une même membrane enzymatique armée de grande surface, sont assurés d'avoir une activité et une épaisseur identiques. Ces petites membranes enzymatiques interchangeables 3 peuvent être stockées dans un réfrigérateur et elles évitent ainsi à l'utilisateur du capteur d'effectuer périodiquement une nouvelle opération de'rvêtement d-e l'électro- de 1 avec l'enzyme dans des conditions nuisant à la reproductibilité des mesures (vieillissement des protéines, oxydation de l'agent pontant, humidité ambiante etc...).
Ces petites membranes armées possèdent également une très bonne tenue mécanique qui évite ainsi le décollage et le déchire ment de la membrane en cours de manipulation qui pertuberaient la diffusion des substances réactives et donneraient lieu à des résultats peu reproductibles.
Claims (5)
- 2.- Procédé suivant la revendication 1 caractérisé en ce qu on effectue le dépôt de la couche enzymatique active sur la trame, en une ou plusieurs couches successives, avec une baguette de verre pour des petites surfaces-,avec un racloir en caoutchouc pour les surfaces plus grandes ou bien encore par pulvérisation en aérosol de la solution enzymatique puis de la solution contenant l'agent de pontage.
- 3.- Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 1 et 2 caractérisé en ce qu'on utilise, en tant quetrame semi-rigide, un support poreux constitué par un tissu en matière cellulosique, polyamide ou polyester, une céramique ou un métal fritté.
- 4.- Capteur à enzymes comportant une gaine cylindrique (5) entourant coaxialement une électrode enzyma-tique(1), de diamètre interne supérieur au diamètre externe del'électrode (1), pourvue d'un élément sensible (2) contrelequel est appliqué un support enzymatique interchangeable (3), obtenu par le ' procédé suivant l'une quelconque desrevendications 1 à 3, une bague de centrage (6) entourantl'élément sensible (2) et dont la face frontale (6a) sert de plan d'appui pour la zone marginale du support enzymatique(3) s'étendant en travers de l'élément sensible (2) del'électrode (1) et en contact avec celui-ci et uhe bague d'adaptation (4) comprenant une collerette interne (4a) sur laquelle prend appui la périphérie de la face externe du support enzymatique ( 3), ainsi qu'une jupe cylindrique (4b)se terminant par une collerette de clippage interne (4c) s'engageant dans une gorge annulaire transversale (5a) de même forme prévue dans la surface externe de la gaine (5), caractérisé en ce que la gaine cylindrique (5) est maintenue séparée de ltelectrode (1) par une bague entretoise de centrage (7) et par la bague de centrage (6) entourant l'élé- ment sensible (2) et formant également entretoise.
- 5.- Capteur à enzymes caractérisé en ce qu'il comprend une sonde enzymatique (8) réalisée sous forme de disque et présentant, sur ses deux faces frontales, deux éléments sensibles (9,10') sur lesquels sont respectivement plaqués deux supports enzymatiques (3), constitués par des pièces circulaires de même diamètre que la sonde enzymatique (8) en forme de disque et les deux supports enzymatiques (3) sont maintenus au moyen de deux bagues d'adaptation (11,12), fixées l'une à l'autre par clippage.
- 7.- Capteur à enzymes suivant l'une quelconque des revendications 4 et 5 caractérisé en ce que le support enzymatique (3) est collé à la bague d'adaptation (4,11,12).
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|---|---|---|---|
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1987
- 1987-05-29 FR FR8707584A patent/FR2615862B1/fr not_active Expired - Fee Related
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| EP0372911A3 (fr) * | 1988-12-05 | 1991-01-02 | CHIRANA Vyzkumny ustav zdravotnicke techniky koncernova ucelova organizace | Capteur enzymatique réutilisable avec système de remplacement de la membrane |
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|---|---|
| FR2615862B1 (fr) | 1990-07-06 |
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