JPS5835679B2 - コウソハンノウノ ジツシホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素反応の実施方法に関し、さらに詳しくは
、微孔性膜の微孔に架橋させた不溶性酵素を用いる酵素
反応の実施方法に関する。

酵素反応において不溶性酵素を用いることの利点は、基
質溶液の水流（こ連続的（こ酵素を接触作用させ、この
触媒反応で得られた生成物から酵素を分離する必要を除
くことを可能にする点にある。

酵素反応の実施に際して不溶性酵素を用いるこ゛とは公
知である。

たとえば、以下のような公知の方法が使用されている。

１、不溶性酵素粒子をタンク中Ｏこ撹拌しながら懸濁し
、排出した液をろ過器に通ずる。

２、不溶性酵素粒子をカラム中（こ充填し、これに連続
的に基質溶液を通す。

両系とも種々のグループによって研究され、多くの場合
、粒子内および粒子周囲の非撹拌層から生ずる拡散制限
が認められた。

この制限は、基質の拡散速度が低く、かつ酵素反応速度
が高いときに１す１す重要になる。

すなわち、この拡散制限が不溶性酵素粒子の効率を低下
させ、場合によっては潜在活性のごく一部しか利用され
ない。

したがって、この公知方法の不利益を回避した。

不溶性酵素による酵素反応の実施方法の発見が望まれて
きたのである。

本発明は、酵素反応（こより化学的（こ変換すべき基質
の水溶液に圧力を適用し、上記水溶液は圧力差（こよっ
て架橋酵素膜中を通過させ、得られた溶液生成物を公知
方法によって分離することを特徴とする酵素反応の実施
方法を発見し完成されたものである。

この場合、架橋酵素膜としては、微孔性でその微孔中に
酵素が二官能性カップリング剤によって架橋されている
架橋酵素膜を用いる。

本発明（こおけろ水溶液とは、酵素反応が行われるに必
要な十分の量の水を含んでいる溶液を意味する。

基質が水に十分溶解しないような場合ｌこは、他の溶媒
、たとえばエタノールを加える必要がある。

しかしながら、通常、溶媒は少なくとも５゜φの水より
なるものである。

本発明の方法において用いられるものと類似の酵素膜は
、これまでにも製造されたことがあり文献（こ記載され
ている。

たとえば、Ｑｏ ｌ ｄｍａ ｎら：５ｄｉｅｎｃｅ
１５０，７５８−７６０（１９６５）およびＡＹ ｒ
ａｍｅ ａ ｓら： ＤＯ８１，９１５，９７０号であ
る。

しかしながら、これらの記述は、拡散条件下（こ釦ける
生物学的膜およびこの種の膜の微小環境の調製および研
究を目的としたものであり、本発明の方法およびそれに
より達成される優れた効果については全く述べられてい
ないし、示唆もない。

その他の関連ある記述としては、英国特許第１，１８３
，２６０号がある。

これは、不溶性酵素ならびにその製法釦よび使用法を目
的としたものであって、さらに詳しくは、不溶性支持体
に化学的に結合させた酵素を用いて酵素反応を実施する
方法に関するものである。

この特許においては、特にＱｏｌｄｍａｎらの記述ｌこ
言及し、その教示を検討した結果、酵素反応を実施する
（こあたり、膜にとりつけた架橋酵素を用いる試みは実
用的でないと結論し、膜に直接補原子価（ｃｏｖａｌｅ
ｎｔ ）結合した酵素が選択されているのである。

上記特許の教示訃よび結論に反し、本発明の酵素反応実
施方法が、不溶性酵素粒子または補原子価結合させた酵
素膜の使用に基づく上記方法に比べて多くの利点を有す
ることを発見し完成されたものである。

大部分の従来技術における非流動性酵素反応装置の設計
は、酵素粒子Ｇこ基づいたもので、この場合、拡散抵抗
が重要な関係をもってくる。

可溶性酵素の場合と異なり、マトリックス支持酵素は不
均一な環境で作用し、全酵素過程に５つの別個のステッ
プが存在する。

すなわち、■）全体相から担体表面への基質の拡散（外
部拡散） ２）担体表面から酵素の支配範囲への基質の輸送（内部
拡散） ３）酵素に触媒された基質の変換 ４）酵素の充填された微孔内部から粒子表面への生成物
の輸送 ５）粒子表面から全体相への生成物の拡散である。

ステップ１お−よび５は、マトリックス支持酵素表面の
周辺に存在する停滞層からの外部もしくは全体への拡散
効果である。

この領域を通じての基質の輸送は主として分子拡散によ
るものであり、これが拡散抵抗となる。

全体相への拡散制限は、小充填カラムの場合、また酵素
膜の場合（こ認められる。

高分子量基質の場合Ｇこは、その低拡散率のために、拡
散障害がさらに著しく作用する。

すなわち、結合パパイン、フィチン釦よびキモトリプシ
ンをカゼインに作用させる場合、低分子量基質にたいし
ての活性Ｇこ比し、活性の低下が認められる。

ステップ２釦よび４は内部もしくは微孔拡散効果である
。

これは、非流動性酵素の大部分は微孔性担体マトリック
スの内部に結合していて、基質捷たは生成物が酵素の反
応部位に到達しまたことから離れるためＯこは狭い酵素
含有微孔内部を内部へまたは外部へ拡散しなければなら
ないこと（こよる。

多くの場合、これらの内部拡散抵抗が酵素の表示触媒活
性を低下させる。

たとえば、微孔担体に補原子価結合させたエノラーゼは
、その一部分のみが担体表面近くに存在して活性を現わ
すため、潜在活性の４分の１の活性を示す（こすぎない
。

内部拡散の制限は、反応生成物の微小環境からの拡散が
遅い故に、生成阻害をも増大させる。

これは、蛋白分解酵素によるアミノ酸エステル氷解の場
合に観察されている。

酵素反応によって生成する水素イオンが、全体のｐＨに
比し部分的ｐＨを低下させ、その結果ｐＨ活性曲線にし
たがった活性の変移を生ずる。

このようなｐＨ活性変動の例は、パパイン、トリプシン
、キモトリプシン釦よびグルコースオキシダーゼの場合
に観察される。

上述のように、本発明によれば、微孔壁が架橋酵素分子
の層によって被覆された微孔性膜を通して加圧ろ過を行
う酵素反応器を用いること（こより、上述の拡散制限の
問題は、すべてではないにしてもかなりの部分が解決さ
れたのである。

基質の微孔への流入は、圧力勾配によって調整される。

酵素Ｇこ触媒される変換は微孔内部で起こり、生成物は
その生成に応じて除去される。

孔径の小さい微孔性膜を用いるときは、上述の過程にち
・ける拡散に基づくステップは完全に消失する。

基質は圧力勾配によって強制的に微孔内（こ流入させら
れるので、外部非撹拌層は存在しない。

また、微孔の半径が小さいので、微孔内部拡散の問題も
無視できる。

上述の加圧導入式酵素膜反応器では、外部釦よび内部物
質輸送制限の問題がないので、すなわち、ａ）反応過程
は拡散によって調整されるのではなく、機械的に調整さ
れる。

ｂ）酵素が粒子に結合している場合は、微孔内拡散制限
のために、反応は粒子表面のみに制限されることが多い
のにたいし、膜の微孔壁に結合した酵素は、はるかに効
率よく触媒反応に利用される、 ことから、生物学的効率が増大する。

さらに、微孔壁表面と微孔容量の比は大きく（径Ｏ１１
μの微孔の場合２・１０５）、その結果、微孔中の部分
酵素濃度は著しく高くなる。

微孔が同一の直線シリンダーであり、酵素分子が微孔壁
を一分子層で覆っているものと仮定すると、酵素濃度は
つぎのように計算できる。

微孔サイズ０．１μの膜における酵素濃度は０．６μＭ
／Ｃｅとなる。

これをη表示にすると、分子量２５．０００（すなわち
、キモトリプシンの場合）の酵素では１５■μとなる。

この高濃度局在は基質の高度検車を生む。

本発明の架橋酵素膜を用いた場合には、英国特許第１，
１８３，２６０号における補原子価結合酵素膜に比し、
さらに以下の利点が得られる。

１、膜の負荷能、すなわち膜の単位量により不溶化され
る架橋酵素量が大きい。

酵素分子は微孔表面上ｌこ緊密に接した層を形成し、微
孔中にきわめて高い酵素の部分的濃度が達成される。

２、膜中での酵素の三次元構造がマ） ＩＪラックス強
度を増大させ、本発明の方法においてはしばしば生ずる
押しつぶし外力に対する膜の抵抗性が増す。

３、架橋酵素は、補原子価結合させた酵素に比して熱変
性に安定であり、長期に保存できる。

さらに、酵素分子を不活性蛋白に架橋することにより、
マトリックスへの架橋による安定効果に周囲の不活性蛋
白による保護効果を加えることができる。

４、予め生成した膜の内部への酵素の架橋は、般的な非
特異的方法で実施することが可能で、どのマトリックス
、どの酵素にも適用できる。

膜上に活性部分を形成する必要はなく、適当な二官能性
反応剤を要するのみである。

すなわち、本発明の方法は大きな進歩をもたらすもので
あり、酵素反応の実施に多くの利点を与えるものである
ことは、特に評価さるべきである。

本発明の他の態様として、本発明の方法に使用する架橋
酵素膜製造の至適方法をも包含する。

すなわち、本発明は、酵素溶液を膜の微孔中に圧入し、
ついでこの酵素負荷膜を二官能性架橋剤溶液中に浸漬す
ることにより、上述の本発明酵素反応実施方法に使用す
るに特に適した架橋酵素膜の製法の提供をも目的とする
ものである。

ＧｏｌｄｍａｎおよびＡｖｒａｍｅａＳは、いずれも酵
素膜を拡散法によって製造しているが、この方法は不満
足なものであって、この拡散法の不利な点を改善した酵
素膜の新しい製法の発見が望１れていた。

多くの研究の結果、膜微孔内に酵素分子を導入するのに
圧力を用いると、膜の負荷能の調整が容易になり、公知
の拡散法に比し負荷能を増大させうろことが明らかにさ
れたのである。

しかも、この方法（こより、製造は容易かつ迅速に行わ
れるようになった。

さらに、特に有利な点は酵素膜の大量生産が可能となっ
たことである。

さらに詳細（こ説明すれば、膜をとり、この膜の微孔中
に、圧力差を用い、たとえば圧力セル中で酵素溶液を強
制的ｆこ導入する。

かくして膜の微孔ｌこ酵素溶液が充填されるが、ついで
この酵素負荷膜を二官能性架橋剤溶液中に浸漬する。

この方法によって、架橋酵素膜が製造できる。

圧力は、膜を通じての酵素溶液の流速が、約０．０５な
いし約０．５ ｃＡ／ｒｕｉｎ・ｃｒｒｔとなるような
圧力を用いるのが好ましい。

酵素溶液の濃度は１−１０■／Ｃｔ、 ｐＨは５−９と
するのが好ましい。

酵素浴Ｉｆこは、また、不活性蛋白、たとえばアルブミ
ンを添加してもよい。

この蛋白は、不安定な酵素を不活性化から保護する。

さらに、上記溶液には、可逆性阻害剤または架橋剤と反
応する基を含１ない基質を添加することが好捷しい。

膜の架橋剤への浸漬は、約１−３０℃で約１−１０時間
を要する。

ついで、結合しなかった酵素および架橋剤を除去するた
め、膜を加圧ろ過セル中で洗浄するのが有利である。

遊離アルデヒド、またその他の活性基は、グリシンある
いはその他の適当な保護剤で保護することもできる。

使用する膜は、限外ろ過またはミクロろ過の範囲の細孔
サイズ、すなわち、０．０１−１０ミクロン、好１しく
は約０．０２５ないし０．５ミクロンの細孔サイズをも
った任意の予め形成された膜、たとえばセルロースアセ
テート、セルローストリアセテート、セルロースナイト
レート、混合エステルセルロース、ナイロン、多電解質
コンプレックスなどの膜でよい。

適当な架橋剤としては、たとえば、ジアルデヒドたとえ
ばゲルタールアルデヒド、ジオキソベンチジン、ヘキサ
メチレンジイソシアネート、■。

５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、ＮｙＮ−
へキサメチレンビスヨードアセトアミドなどを挙げるこ
とができる。

酵素は、動物性のものでも植物性のものでもよい。

例としてはこ氷解酵素たとえばキモトリプシン、トリプ
シン、アミラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、アミノア
シラーゼトよびカルボキシペプチダーゼ、酸化酵素たと
えばグルコースオキシダーゼ、カララーゼ、アルコール
デヒドロゲナーゼ釦よびパーオキシダーゼ、アミダーゼ
たとえばウレアーゼ、アスパラギナーゼ、アルカリホス
ファターゼなどを挙げることができる。

阻害剤を用いる場合、この阻害剤は各酵素に特異的なも
のである。

すなわち、たとえばゲルコールオキシダーゼを保護する
にはグルコースを用い、キモトリプシンを保護するには
β−フェニルプロピオネートを用いるなどである。

上述のように、本発明の酵素反応実施方法は、酵素反応
により化学的に変換すべき基質の水溶液を、圧力差によ
って架橋酵素膜中に流入させるものであって、酵素反応
を行うに適当な任意の酵素が酵素膜の部分として利用で
きる。

すなわち、酵素反応ｆこよって実施できる任意の反応を
、本発明の方法は、Ｎ−４たはＯ−アシルアミノ酸のラ
セミ混合物の分割に利用できる。

この場合、この混合物を、一方の異性体を水解してＬ−
１たはＤの光学的に純粋なアミノ酸と水解されない異性
体のＤ−４たはＬ−アシルアミノ酸との混合物を与える
ような適当な酵素膜に通じ、ついでこの混合物を公知方
法によ−って分離する。

また、酵素としてグルコースオキシダーゼを用い、グル
コースをグルクロン酸に酸化することもできる。

さらＱこ、尿素を分解するためのウレアーゼを利用する
こともできる。

その他、過酸化物を分解するため（こ、カタラーゼを利
用することも可能である。

酵素反応を実施するのに必要な圧力は、酵素膜、基質の
濃度、所望の変換率および／または所望の反応速度によ
って決する。

しかしながら、使用する反応原料訟よび必要な結果によ
って指定された各酵素反応について至適の圧力差を決定
することは容易である。

たとえば、特定の架橋酵素膜については、圧力を増加さ
せると、反応速度が上昇するとともに変換率は低下し、
至適結果はそれによって調整できる。

実際（こは、この圧力差は約０．０５ないし約１０気圧
の範囲であり、約０．０５ないし約５気圧が好ましいこ
とが明らかにされている。

この圧力差は、基質溶液（こ直接圧力を加えても、また
架橋酵素膜の反対側を減圧Ｇこ維持することによっても
得られることは当然である。

つぎに、本発明を以下の実施例に釦いて特定の好ましい
態様を参照して説明するが、この実施例は、本発明を特
定の態様に限定するものではなく、本発明は、特許請求
の範囲に定義された発明の範囲内に包含されるすべての
変更、改変、均等物を含むものである。

すなわち、以下の好ましい態様を挙げた実施例は、本発
明を実施を容易するためのものであって、示した特定例
は本発明の好ましい態様の例を挙げ、詳細に説明するた
めの目的でのみ挙げられたものであり、本発明のもつと
も有用と考えられる点、操作の記述ならびに本発明の原
理および概念の理解を容易にすると思われる点を掲げた
ものである。

以下の実施例から明らかなように、数種の架橋酵素膜が
製造され、６膜について、加圧下膜を通じての基質液相
の連続的流入を含め、種々の液相流人条件が検討されて
いる。

さらに、６膜について、基質のバッチ中での膜の振動撹
拌を含めたバッチ条件での結果も検討した。

後者の場合、架橋酵素膜は粒子結合酵素と同様な挙動を
とるものであることがわかる。

バッチ条件むよび液相流人条件下にむける同程度の変換
にたいする反応速度を各場合について比較した結果、バ
ッチ条件に比し液相流人条件に釦いて高い値が得られて
いる。

この速度の差は、一方では基質の移動４こより拡散制限
がないこと、他方ではこの制限が存在することにより生
ずるものである。

液相流入条件下では、基質は膜中に強制的に流入し、微
孔内の非流動酵素分子に容易に接触する。

一方、バッチ条件では。基質は、１ず膜表面に沿って形
成された非撹拌層を通って、つぎに膜の微孔内へと、膜
中Ｇこ拡散しなければならない。

液相流人条件下でバッチ条件下より反応速度が増大する
のは拡散制限がないことによるものであって、この２つ
の速度の比、すなわち実施例中に速度比として記述した
ＶＦ／ ＶＢは流入条件下に酵素を利用した場合の効率
の上昇を定量的（こ示すものである。

例Ｉ キモｌ−’Ｊプシン膜の製造および分析 ０、５ Ｍ ＩＪン酸塩緩衝液ｐＨ７，０中にキモＩ−
ＩＪプシンむよび阻害剤としてβ−フェニルプロピオネ
ート（１ｃｔ：中、キモトリプシン６７％ｈよび阻害剤
７７ｎ？）を含有するキモトリプシン溶液を、加圧下（
０，１気圧）、微孔サイズ約０．１μのセルローストリ
アセテート膜（特許）に通ずる。

膜を水で軽く洗浄し、１時間、ゲルタールジアルデヒド
溶液（２，５％）に浸漬する。

ついで、これを圧力セル中にとり、水、１０ ’ＮＨＣ
ｔ（酵素−阻害剤コンプレックスを分解するため）釦よ
び緩衝液で、洗液中に紫外部吸収ｐよび酵素活性が認め
られなくなる昔で洗浄する。

ついで、基質として、３０％ＥｔＯＨ−７０％ＣａＣ７
２（０，０５Ｍ ）含有Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７，８（
０，０５Ｍ）中Ｎ−ベンゾイルーＬチロシンエチルエス
テル（ＢＴＥＥ）、ＣａＣＪ、２（０，０５Ｍ）含有Ｔ
ｒｉｓ緩衝液ｐＨ’７．８ （０，０５Ｍ）中Ｎ−アセ
チルトリプトファンメチルエステル、およびＣａＣｌ２
（０，０５Ｍ ）含有Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７，８（０
，０５Ｍ）中Ｎ−アセチルーＤＬ−フェニルアラニンエ
チルエステルを用い、膜の酵素活性を試験する。

基質は２６℃Ｏこ耘いて種々の圧力で膜内に導入し、溶
出液中に生成した生成物を測定する。

つぎに、膜をバッチ条件下ｌこ分析する。

すなわち、膜を基質のバッチとともに振動撹拌する。

結果、および同一変換率が得られる液相流人条件ち゛よ
びバッチ条件の反応速度比を以下の表（こ示した。

表中、欄および列の見出しおよび略号の意味は次の通り
である。

Ｐ−膜前後の圧力差 Ｑ＝流入速度 Ｖ−反応速度 倒一基質の生成物への変換率 バッチ−酵素反応をバッチ条件で実施 速度比＝液相流人条件下０反応速度 バッチ条件下の反応速度 上記表から明らかなように、本発明の方法を用いた場合
、変換率７５多、５０φ、９０％および４６咎の値が得
られ、同一の基質濃度、同一の膜によりバッチ法で処理
した場合Ｑこ比し、それぞれ１５ 、６ 、１３ｊ、−
よび６倍の反応速度が達成される。

例２ トリプシン膜の製造および分析 ０、０５ Ｍ ＣａＣｌ２中トリプシン溶液（ＩｃＣ中
５η）を、０．１気圧の圧力で、微孔サイズ約０．１μ
のセルローストリアセテート膜に通ずる。

ついで、膜を軽く水洗し、つぎに、０．１Ｍ−ＮａＯＨ
でｐＨを７にした２、５多グルクールアルデヒド溶液中
に室温で１時間浸漬させる。

ついで、膜を限外ろ過セル中にとり、水および緩衝液（
リン酸塩、ｐＨ７，０）で、紫外部吸収訃よび酵素活性
が洗液中に認められなくなる１で洗浄する。

基質として、ＣａＣ１２（０，０１Ｍ ）含有’Ｉ’ｒ
ｉｓ緩衝液ｐＨ８，０（０，０５Ｍ ）中Ｎ−ベンゾイ
ルアルギニンエチルエステルおよヒｃａｃ１２（０，０
１Ｍ ）含有Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ８，０（０，０５Ｍ）
中Ｎ−ベンゾイル−Ｄ、 Ｌ−リジンエチルエステル
を用いて、膜の活性を分析する。

基質は加圧下、２６℃で膜を通過させ、溶出液中に生成
した生成物の量を測定する。

膜はバッチ条件下に釦いても、すなわち、基質のバッチ
とともに振動撹拌下に処理したものについても分析した
。

同一変換率が得られる液相流人およびバッチ条件下に訃
ける速度比を計算する。

結果を表４および５／ｌこ示す。例３ カルボキシペプチダーゼ−Ｂ膜の製％よび分析ＬｉＣ１
（１０多Ｗ／Ｖ）中カルボキシペプチダーゼ１３ （ｌ
ｃｒ：中３．３ ｙｎｑ ）溶液を、加圧下（０，１
気圧）、ミクロろ過膜（Ｍｉ ｌ ｌ ｉ ｐｏｒｅ
ＭＦ −ＧＳ 。

微孔サイズ０．０２μ）ｌこ通ずる。

膜を軽く洗浄し。ゲルタールアルデヒド架橋液（２，５
％、 ｐＨ７，０）に室温で１時間浸漬する。

ついで膜を限外ろ過セルにとり、水卦よびベロナール緩
衝液（０，０５Ｍ。

ｐＨ７，０）により、紫外部吸収および酵素活性が洗液
中に認められなくなる１で洗浄する。

前例と同様（こして、液相流人条件およびバッチ条件下
の膜の活性を分析し、速度比を計算する。

用いた基質は、ＮａＣ１（０，１Ｍ ）含有Ｔｒｉｓ緩
衝液ｐＨ７，６（０，０３Ｍ）中Ｎ−ヒプリルアルギニ
ンである。

結果を表６に示す。

例４ カタラーゼ膜の製造トよび分析 ＮａＣ１（１％）含有リン酸塩緩衝１ｐＨ７，０（０，
０５Ｍ）中カタラーゼ（ｌＣｘ中３１１１ｇ）溶液をミ
クロろ過膜（Ｍｉ ｌ ｌ ｉ ｐｏｒｅ ＭＦ−ＧＳ
、微孔サイズ０．２２μ）（こ通ずる。

膜を軽く洗浄し、リン酸塩緩衝液ｐＨ７，０（０，０５
Ｍ）中ゲルタールアルデヒド溶液（２，５％）中に２時
間浸漬する。

ついで膜を、限外ろ過セル中加圧下、水および１０φＮ
ａＣ１により、紫外部吸収および酵素活性が洗液中に認
められなくなる１で洗浄する。

次（こ、例１と同様ｌこして液相流人条件むよびバンチ
条件下、リン酸塩緩衝液（０，０５Ｍ）中退酸化水素（
０，０３５Ｍ）溶液を用いて、膜の活性を分析する。

液相流入むよびバッチ条件下同じ変換率を与える速度比
を計算する。

結果を表７に示す。例５ グルコースオキシダーゼ膜の製造および分析グルコース
（１係）含有０．０５ＭＩＪン酸塩緩衝液ｐＨ６中グル
コースオキシダーセ゛（１ｃｒ：中５■）溶液をＭｉ
Ｉ ｌ １ｐｏｒｅ膜（ＨＡ−ＭＰ、微孔サイズ０．４
５μ）の微孔中（こ圧入する。

ついで、膜を、ゲルタールアルデヒド溶液（２，５％）
中、室温に２時間浸漬する。

つぎ（こ水勢よびリン酸塩緩衝液ｐＨ６，８により、紫
外部吸収および酵素活性が洗液中に認められなくなる昔
で洗浄する。

この膜にリン酸塩緩衝液ｐＨ６，０（０，０５Ｍ）中５
饅グルコース溶液を通じ、溶出洛中に生成したＨ２Ｏ２
量を測定して、膜を試験する。

結果を、バッチ条件下の同一反応と比較する。

結果を表８に示す。

例６ ウレアーゼ膜の製造および分析 １０’−３ＭＥＤＴＡ含有０．０２Ｍリン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７中、ウレアーゼ（１α中３ｍｙ）溶液を微孔サイズ
０．２ｐの膜（Ｇｅｌｍａｎ−Ｍｅｔｒｃｅｌ ＴＣＭ
２００）中に圧入する。

ついで、膜を水勢よびリン酸塩緩衝液で洗液中（こ紫外
部吸収釦よび酵素活性が認められなくなる１で洗浄する
。

次に、例１に記載したと同様にして、液相流入卦よびバ
ッチ条件下、ＥＤＴＡ（１０−３Ｍ）含有リン酸塩緩衝
液ｐＨ７，０（０，１Ｍ ）中０．３多尿素溶液（こよ
り膜の活性を分析する。

結果を表９に示す。例７ 各種微孔径のキモｌ−ＩＪプシン膜の製造および分析０
．０５ＭＩＪン酸塩緩衝１ｐＨ７、Ｏ中、阻害剤として
β−フェニルプロピオネートを含有するキモトリプシン
溶液（ｌＣｒ：中、キモトリプシン３．３７１１９およ
び阻害剤７ｍｇ）を、加圧下Ｑこ、各種微孔サイズ １）０．０２５μＭ （ＶＳ −ＭＦ−Ｍｉ Ｉ Ｉ
ｉ ｐｏ ｒｅ ）２）０．１ ７ＪＭ（ＶＣ−ＭＦ
−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）３）０．２２ １Ｍ （ＧＳ−
ＭＦ−Ｍｉ Ｉ ｌ ｉ ｐｏ ｒ ｅ ）のＭｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ膜を通ずる。

酵素溶液を通じ膜を負荷するに用いる圧力差は、それぞ
れ約０．４気圧：０，１気圧釦よび０．０２気圧である
。

膜を軽く洗浄し、０．０５ＭＩＪン酸塩緩衝液ｐＨ７，
０，中、グルタールアールデヒド溶液（２，５多）に浸
漬する。

２時間後、膜を圧力セル中にかき、ＨＣＩ １０−３Ｍ
（酵素−阻害剤コンプレックスを分解するため）むよび
緩衝液で、洗液中をこ紫外部吸収むよび酵素活性が認め
られなくなる１で洗浄する。

ついで、３０ ％ ＥｔＯＨ−７０％ Ｔｒｉｓ緩衝液
ｐＨ７，８（０，０５Ｍ）中Ｎ−ベンゾイルチロシンエ
チルエステル（２，５・１０−”Ｍ）溶液を加圧下（こ
通じ、溶出液中に生成した生成物の量を測定して、膜の
活性を分析する。

膜は、バッチ条件でも、すなわち、バッチの基質と振動
の撹拌下に処理しても試験し、同じ変換率が得られる肢
相流入釦よび条件での速度比を計算する。

結果を表１０（こ示す。

例８ 非セルロース物質のキモＩ−ＩＪプシン膜の製造および
分析 ０．０５Ｍ’Ｊン酸塩緩衝液ｐＨ７，０中β−フェニル
プロピオネート含有キモトリプシン溶液（１ｃｒ：中キ
モトリプシン３ｒＩｌｆ！ｂよび阻害剤７η）を以下の
非セルロース性物質で製造した膜（こ通ずる。

ａ）不活性合成非セルロースポリマー ＊ ＊ Ａｍ１ｃｏｎ製１）ｉａｆｌｏ限外ろ過膜ＸＭ ３００
（分子量：約３００，０００） ｂ）ポリカルボネートｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ膜（微孔径
０．４μ、厚さ１１μ） 膜を軽く洗浄し、２時間ゲルタールアルデヒド溶液（２
，５％）中に浸漬する。

ついで洗浄し、例１に記載したと同様にしてＢＴＥＥ（
２，５・１０−３Ｍ）で試験する。

結果を表１１（こ示す。本発明が前述の例示的態様に限
定されるものでなく、その本質から逸脱することなくそ
の他の特定の態様をとることが可能であることは、本技
術分野（こむいては自明のとむりである。

したがって、上述の態様はあらゆる点で例示的なもので
あり、限定的なものではないことに留意すべきである。

本発明の解釈（こ際しては、上述の例示的記載を参照す
べきではなく、本発明の範囲内に包含されるすべての改
変を包含するものとして記述された特許請求の範囲の記
述によるべきである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 酵素反応により化学的に変換すべき基質の水溶液に
   圧力を適用し、上記水溶族は圧力差によって架橋酵素膜
   中を通過させ、得られた溶液生成物を公知方法によって
   分離することを特徴とし、上記架橋酵素膜としては、微
   孔性でその微孔中に酵素が二官能性カップリング剤（こ
   よって架橋されている架橋酵素膜を用いる酵素反応の実
   施方法。