JPH0550272B2 - - Google Patents

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JPH0550272B2
JPH0550272B2 JP60116536A JP11653685A JPH0550272B2 JP H0550272 B2 JPH0550272 B2 JP H0550272B2 JP 60116536 A JP60116536 A JP 60116536A JP 11653685 A JP11653685 A JP 11653685A JP H0550272 B2 JPH0550272 B2 JP H0550272B2
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enzyme
membrane
immobilized
solution
producing
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Masao Goto
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Nok Corp
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Nok Corp
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、酵素固定化膜の製造法に関する。更
に詳しくは、尿素センサー用などとして有効に用
いられる酵素固定化膜の製造法に関する。
〔従来の技術〕
酵素固定化膜において、膜自体の酵素活性を上
げるために、なるべく膜の表面近傍に酵素を固定
化しようとする試みが従来からなされている。そ
のために、膜の表面を化学修飾して酵素のアミノ
基と結合するアルデヒド基などを導入する手法が
とられてきた。こうした試みにもかかわらず、被
検液などの反応液の組成によつては、たん白質な
どの物質が反応液中に存在し、これが膜表面に吸
着するなどして酵素の働きを阻害し、失活させる
という現象がみられた。しかるに、現在のとこ
ろ、こうした酵素固定化膜の失活を防止するよう
な方法は、具体的に提案されていないのが実情で
ある。
〔発明が解決しようとする問題点〕
本発明者は、かかる現状に鑑み、酵素固定化膜
内に固定化された酵素を、反応液中のたん白質な
どの物質の直接の吸着による失活から保護し、こ
の酵素固定化膜を用いる際酵素の反応物である特
定の物質の透過を円滑ならしめる対策を求めて
種々検討の結果、酵素を固定化させる高分子膜の
表面に特定の界面重合膜を形成させることによ
り、かかる課題が有効に解決されることを見出し
た。
〔問題点を解決するための手段〕および〔作用〕 従つて、本発明は酵素固定化膜の製造法に係
り、酵素固定化膜の製造は、含浸性孔部を有する
高分子膜に、酵素を存在させながら、ポリエチレ
ンイミン水溶液を含浸させた後ジイソシアネート
溶液中に浸漬し、高分子膜表面にポリエチレンイ
ミンとジイソシアネートとの界面重合膜を形成さ
せることにより行なわれる。
酵素を固定化させる高分子膜としては、トリ酢
酸セルロース、酢酸セルロース、ポリスルホン、
ポリビニルブチラール、ポリアクリロニトリルな
どある程度親水性を有する高分子物質の膜状体で
あつて、酵素溶解ポリエチレンイミン水溶液を含
浸させ得るような含浸性孔部を有するようなもの
が用いられる。かかる含浸性孔部は、上記の如き
高分子膜材料を約１〜20％の範囲で各種溶媒に溶
解し、製膜後水中でゲル化させると、膜表面に形
成され、その孔径は約0.1〜10μm程度であること
が好ましい。
高分子膜表面への界面重合膜の形成に際して
は、まず高分子膜に、酵素を存在させながら、ポ
リエチレンイミン水溶液を含浸させることが行な
われる。この際に存在させる酵素は、予め高分子
膜に結合させておいた形で用いることもできる
が、一般にはポリエチレンイミン水溶液中に溶解
させておいた形で用いられる。ポリエチレンイミ
ン水溶液は、約0.1〜１％程度の濃度で用いられ、
このような濃度のポリエチレンイミン水溶液１ml
当り約１〜10mg程度の酵素を溶解させたものが含
浸液として用いられる。
酵素としては、ウレアーゼ、グルコースオキシ
ダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、コレステロール
オキシダーゼ、ウリカーゼなどのオキシダーゼ
類、クレアキニナーゼ、グルタミナーゼ、ペニシ
リナーゼ、カタラーゼ、パーオキシダーゼ、イン
ベルターゼ、ムタロターゼ、アミラーゼ、パパイ
ン、トリプシンなどが用いられる。
含浸は、室温条件下に約１〜60分間浸漬するこ
とにより行われ、そこから含浸膜を引き上げた
後、今度はトルエンジイソシアネート、イソホロ
ンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシア
ネートなどのジイソシアネート溶液、例えばヘキ
サンの約0.1〜10％の濃度の溶液中に、室温条件
下で約１〜５分間浸漬させる。
このジイソシアネート溶液中で、ポリエチレン
イミンとジイソシアネートとの界面重合反応が起
り、高分子膜表面に界面重合膜が形成され、酵素
は高分子膜中に固定化される。なお、界面重合反
応は、ポリエチレンイミンとジイソシアネートと
を例えば等重量で用いて行われ、イソシアネート
基はポリエチレンイミンの末端アミノ基および／
または中間イミノ基と尿素結合を形成して、２次
元乃至３次元的に結合される。
酵素が固定化される高分子膜は、それ単体で用
いられる場合には、その両面側に界面重合膜が形
成されるが、一般には無機質担体上に設けられた
状態で用いられ、この場合には、膜の片面側にの
み界面重合膜が形成される。無機質担体として
は、種々のものを用いることができるが、これが
水素イオンの増減を検知し得るセンサーである水
素イオン感応性電界効果型トランジスター
（ISFET）である場合には、そこに例えば次式の
如く尿素を分解する作用を有するウレアーゼ酵素
を固定化させたものを尿素センサーとして使用す
ることができる。
（NH2）2CO＋H2Oウレアーゼ −−−−−−→ 2NH3＋CO2 NH3＋H2O→NH4 +＋OH- 〔発明の効果〕 本発明に係る酵素固定化膜は、そこに固定化さ
れた酵素を被検液などの反応液中のたん白質など
の物質の直接の吸着による失活から保護し、酵素
の反応物である特定の物質、例えば尿素センサー
の場合の尿素などの透過を円滑ならしめる効果を
奏する。そして、尿素センサー以外の各種バイオ
センサー、バイオリアクター、バイオエレクトロ
ニクス、臨床検査用機器などにも、この酵素固定
化膜は有効に使用することができる。
〔実施例〕
次に、実施例について本発明を説明する。
実施例 基板にＰ型ウエハーを用い、シリコンアイラン
ド作成−フイールド酸化−リン拡散（ソース・ド
レイン作成）−ゲート酸化−窒化けい素の化学蒸
着−プラズマエツチングによるコンタクトホール
穴あけ−アルミニウム蒸着による電極形成−水素
アニール−ワイヤーボンデイングという一連の工
程を経て、ISFETを製作した。このISFETは、
幅300μm、長さ4.0mmと小さく、そこに化学蒸着
された窒化けい素の膜厚は約1500Åであつた。
次いで、このISFETについて、その窒化けい
素面上にトリ酢酸セルロース膜の形成を行なつ
た。即ち、トリ酢酸セルロース（イーストマン・
コダツク社製品）の25％塩化メチレン溶液中にこ
のISFETを浸漬し、引き上げてから室温で乾燥
させ、膜状体を形成させた。
得られた膜被覆ISFETを、ポリエチレンイミ
ン（東京化成製品）の0.67％水溶液１ml当り５mg
のウレアーゼ酵素（EC3.5.15；シグマ社製品）を
溶解させた酵素溶解ポリエチレンイミン水溶液中
に室温下に１時間浸漬し、トリ酢酸セルロース膜
中に含浸させた後引き上げ、これを今度はトルエ
ンジイソシアネート（東京化成製品）の0.25％ヘ
キサン溶液中に、室温下に10分間浸漬させた。
このヘキサン溶液中で、ポリエチレンイミンと
トルエンジイソシアネートとの界面重合反応が起
り、トリ酢酸セルロース膜表面に界面重合膜が形
成され、ウレアーゼ酵素はトリ酢酸セルロース膜
中に固定化される。
得られた酵素固定化ISFETについて、第１図
に示されるような測定システムを用い、尿素に対
する応答性を測定した。即ち、試験管３中の被検
液４中に、アースされた銀／塩化銀電極１および
酵素固定化ISFET２がそれぞれ浸漬される。ま
ず、被検液の代りにPH7.0の5mMトリス−HC
緩衝液4.4mlが用いられ、ISFETのソース(S)−ド
レイン(D)間の電圧を1.0V、また電流を150μAと
し、温度37℃で、このとき観察される出力電位の
値が安定したら、マイクロシリンジで所定濃度の
尿素水溶液を前記緩衝液中に加えると、尿素は固
定化ウレアーゼ酵素により分解され、溶液は全体
としてアルカリ側に移行する。これに伴ない、
ISFETの界面電位が変化し、その変化は最初の
安定電位よりマイナス側にシフトする。このとき
の出力電位の減少値が測定溶液の尿素量の対数値
の相関関係となるので、この関係から容易に尿素
濃度を決定し得る。なお、第１図で、符号５は定
電流源、６はオペアンプ、７はエレクトロメータ
ー、また８はレコーダーである。
得られた測定結果は、第２図のグラフに示され
る。なお、最初の約４分間は、界面重合膜の抵抗
によるラグタイム、即ち尿素の界面重合膜に対す
る吸着、溶解、拡散などに要する時間と考えられ
る。このラグタイムの存在は、保護膜としての界
面重合膜の存在を証明するものと考えることがで
きる。更に、電圧降下により、尿素が界面重合膜
を透過し、ウレアーゼ酵素により分解されている
と考えることができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、尿素センサーとしての測定システム
のブロツクダイヤグラムである。第２図は、界面
重合ウレアーゼ酵素固定化ISFETの尿素に対す
る応答特性を示すグラフである。 符号の説明、１……銀／塩化鉄電極、２……
ISFET（イオン感応性電界効果型トランジスタ
ー）、４……被検液。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 含浸性孔部を有する高分子膜に、酵素を存在
    させながら、ポリエチレンイミン水溶液を含浸さ
    せた後ジイソシアネート溶液中に浸漬し、高分子
    膜表面にポリエチレンイミンとジイソシアネート
    との界面重合膜を形成させることにより酵素を固
    定化させることを特徴とする酵素固定化膜の製造
    法。 ２ 酵素がポリエチレンイミン水溶液中に溶解さ
    せた状態で用いられる特許請求の範囲第１項記載
    の酵素固定化膜の製造法。 ３ 無機質担体上に設けられた高分子膜が用いら
    れ、膜の片面側に界面重合膜を形成させる特許請
    求の範囲第１項記載の酵素固定化膜の製造法。 ４ 無機質担体が水素イオン感応性電界効果型ト
    ランジスターの無機質担体面である特許請求の範
    囲第１項または第３項記載の酵素固定化膜の製造
    法。 ５ 尿素センサー用として用いられる特許請求の
    範囲第４項記載の酵素固定化膜の製造法。 ６ 高分子膜の両面側に界面重合膜を形成させる
    特許請求の範囲第１項記載の酵素固定化膜の製造
    法。
JP60116536A 1985-05-31 1985-05-31 酵素固定化膜の製造法 Granted JPS61274682A (ja)

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JPS61274682A JPS61274682A (ja) 1986-12-04
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JP2669497B2 (ja) * 1994-12-26 1997-10-27 工業技術院長 酵素電極及びその製造方法
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US9766199B2 (en) 2012-03-06 2017-09-19 Life Science Biosensor Diagnostics Pty. Ltd. Organic thin film transistors and the use thereof in sensing applications
AU2019271414A1 (en) * 2018-05-15 2021-01-14 Life Science Biosensor Diagnostics Pty Ltd Biosensor with porous wicking layer

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