JP2669497B2 - 酵素電極及びその製造方法 - Google Patents

酵素電極及びその製造方法

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文雄 水谷
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    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001Enzyme electrodes
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    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/817Enzyme or microbe electrode

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は酵素電極に関し、さらに
詳しく言えば酵素基質等を簡便かつ正確、しかも迅速に
定量するための酵素電極とその製造方法に関するもので
ある。
【0002】
【従来の技術】酵素電極は、多くの場合、基板となる電
極上に酵素固定化膜(膜I、表層)、及び電極活性物質
の選択透過膜(膜II、下層)の少なくとも2枚の膜を設
けて構成される。酵素電極を挿入した溶液中に試料を添
加すると、試料中の基質等は電極表面の膜Iに達する。
すると、膜I中で酵素反応が進み、これに伴い電極活性
物質を生成もしくは消費する。電極活性物質は、膜IIを
透過して電極電流を与えるが、上記の電極活性物質の生
成量または消費量に伴い電極電流も変化する。この電極
電流の変化から、予め作製した校正曲線に基づき試料中
の基質濃度を決定するのが、酵素電極による基質等の測
定の方法である。例えば、血液中の乳酸濃度を測定する
ための酵素電極では、乳酸酸化酵素固定化膜が過酸化水
素を検出するための電極上に設けられており、固定化膜
中での酵素反応、乳酸+酸素→ピルビン酸+過酸化水
素、の反応に伴い生成した過酸化水素の電極上での酸
化、すなわち、H22 (過酸化水素)→2H+ +O2
+2e- 、に基づく電流値[電子(e- )の流れ]から
乳酸濃度を測定することができる。
【0003】膜Iは、酵素を化学結合法、包括法等によ
り固定化して作製されるが、通常、作製に煩雑な操作を
必要とする。膜IIは、例えば、上記の原理の乳酸測定用
の電極では、血液中に含まれるアスコルビン酸、尿酸、
アセトアミノフェン等の易酸化性成分を排除する等の目
的に用いられる。これらの成分は過酸化水素の電解酸化
が起こる電位で酸化されるので、膜IIを省略した酵素電
極を用いて、これらの成分を多量に含む試料の測定を行
うと過大な酸化電流応答が得られ、基質測定に大きな誤
差が生じる。そこで分子量の比較的小さい過酸化水素の
みを選択的に透過させる分子ふるいの機能を持つ膜の利
用が必要となる。
【0004】しかしながら、少なくとも2枚の膜を必要
とし、かつそのうちの1枚が煩雑な操作により作製され
る酵素固定化膜であることは、酵素電極の作製、構成方
法を複雑にしている。分子ふるいの機能を持つ膜中に酵
素を固定化することができれば、膜I及び膜IIの機能を
1枚の膜で果たすことができ、酵素電極の構成の可能と
なるわけであるが、このような機能性膜中に酵素を簡便
な手順で、高活性かつ安定に固定化することは困難であ
り、実用的な固定化方法は開発されていなかった。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
事情のもとで、分子ふるいとしての機能を持つ薄膜中に
簡便な手順で、高活性かつ安定に酵素を固定化して成
る、高感度、迅速応答性、高耐久性等の、優れた特性を
示す酵素電極を提供することを目的としてなされたもの
である。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、電極上へ
の酵素固定化膜の作製方法について種々研究を重ねた結
果、電極上でポリカチオン水溶液とポリアニオン水溶液
とを混合、乾燥するとポリイオンコンプレックス膜が電
極上に構成されるという事実に着目し、このポリイオン
コンプレックス形成時に周辺に酵素分子が存在すると、
酵素を取り込んだポリイオンコンプレックスが形成され
ること、及びこの酵素含有ポリイオンコンプレックス膜
が緻密であり、分子ふるいとしての機能を示すことを見
出し、この知見に基づいて本発明をなすに至った。すな
わち本発明は、 (1)基板電極上に、酵素を固定化したポリイオンコン
プレックス膜を設けてなることを特徴とする酵素電極、
及び (2)基板電極上に、(a)ポリカチオン水溶液及び酵
素水溶液を展開し、次いでポリアニオン水溶液を展開
るか、又は(b)ポリアニオン水溶液及び酵素水溶液を
展開し、次いでポリカチオン水溶液を展開し、乾燥する
ことを特徴とする酵素電極の製造方法を提供するもので
ある。
【0007】本発明において利用される基板電極の材質
としては特に制限はないが、耐腐食性等から、白金、金
等の貴金属あるいはカーボン系の材料が好都合に利用さ
れる。本発明において利用されるポリカチオンとは、カ
チオン基を有するポリマーであり、繰り返し単位中にカ
チオン基を有するポリマーが好ましく用いられ、具体的
には、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリジメチル
アミノエチルメタクリレート、四級化ポリビニルピロリ
ドン等が挙げられる。またポリアニオンとは、アニオン
基を有するポリマーであり、繰り返し単位中にアニオン
基を有するポリマーが好ましく用いられ、具体的には、
ポリスチレンスルホン酸、ポリグルタミン酸、ナフィオ
ン(商品名、Du Pont社製)、AQポリマー(商
品名、Eastman Kodak社製)等が挙げられ
る。ポリカチオンとポリアニオンの組み合わせは特に制
限はないが、好ましい組み合わせは、ポリリジンとポリ
スチレンスルホン酸、ポリリジンとAQポリマー、四級
化ポリビニルピロリドンとポリグルタミン酸、ポリエチ
レンイミンとポリグルタミン酸である。
【0008】次に本発明の実施形態の一例を詳細に説明
すると、まず、基板電極を研磨等の所定の前処理を行っ
た後、この表面にポリカチオン水溶液(またはポリアニ
オン水溶液)を滴下し、続いて固定化すべき酵素の水溶
液を滴下し、最後にポリアニオン水溶液(またはポリカ
チオン水溶液)を滴下する。この最後の滴下の過程で酵
素を取り込んだポリイオンコンプレックスが基板電極上
に沈降する。水溶液を風乾すれば酵素固定化膜が基板電
極上に設けられた酵素電極が得られることになる。この
方法で用いるポリカチオンとポリアニオンの比はコンプ
レックスを形成するのに必要な当量比とするのが好まし
い。ポリカチオン、ポリアニオンの水溶液の濃度は特に
制限はないがポリカチオンは0.1〜1%(重量%をい
う。以下同様)の濃度とするのが好ましく、ポリアニオ
ンは0.1〜1%の濃度とするのが好ましい。また、固
定化する酵素の量は酵素の種類、酵素電極の活性度など
により異なるが、ポリイオンコンプレックスに対し、1
0%以上、好ましくは30〜100%とする。この固定
化する酵素の溶液は0.1〜10%、好ましくは1%前
後の濃度とする。ここで使用する水溶液が極端な酸性あ
るいはアルカリ性のものであると酵素が失活するので、
酵素が安定に存在し得るpHに保っておくことが必要で
あり、通常、pH5〜9、好ましくは7前後の緩衝溶液
にポリカチオン、ポリアニオン、及び酵素をそれぞれ溶
解した水溶液が好都合に利用される。
【0009】この酵素電極の作製プロセスは極めて簡単
であり、電極上に設けられる酵素を含有したポリイオン
コンプレックス膜の厚さのコントロールも任意に行うこ
とができる。酵素電極の応答性(基質添加に対する応答
時間、応答電流の大きさ等)及び分子ふるいとしての機
能は酵素固定化膜厚に依存するが、本法では適当な厚さ
の膜を電極上に設けることは容易である。ポリイオンコ
ンプレックス膜の厚さは通常0.1μm以上、好ましく
は1〜10μmである。このようにして得られた酵素電
極を作用極とし、適当な対極、あるいは参照電極及び対
極と組み合わせることにより測定系が構成される。
【0010】
【発明の効果】本発明方法によれば、極めて容易に酵素
固定化膜を形成した酵素電極を製造することができ、厚
さの調節も容易に行うことができる。本発明の酵素電極
を用いることにより、酵素基質等を易酸化性の共存物質
に対する妨害を受けることが少なく簡便かつ正確、しか
も迅速に定量することができる。本発明の酵素電極は、
医療計測、発酵工程管理、食品管理等の分野において利
用される。
【0011】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。 実施例1(乳酸酸化酵素含有ポリイオンコンプレックス
膜被覆電極の作製) 直径3mmのグラッシーカーボンの端面を基板電極とし
て用い、この電極上に平均分子量100,000のポリ
リジン塩酸塩0.6%(w/v)水溶液(pHは7に調
整)5マイクロリットルを滴下し、次いで乳酸酸化酵素
(EC番号未決定、シグマ)0.6%(w/v)水溶液
(pH7)5マイクロリットルを滴下し、最後に分子量
70,000のポリスチレンスルホン酸ナトリウム0.
6%(w/v)水溶液(pH7)10マイクロリットル
を滴下して、室温で2時間以上放置、乾燥させることに
より、酵素を含有するポリイオンコンプレックス膜で被
覆した電極Iを得た。ポリイオンコンプレックス膜厚は
5μmであった。電極Iの表面を十分にリン酸緩衝液
(0.1モル/リットル、pH7)で洗浄してフリーの
乳酸酸化酵素を洗浄した後、表面の酵素活性をフェノー
ル/4−アミノアンチピリン/ペルオキシダーゼを発色
系とする常法により見積もったところ、0.05ユニッ
ト/平方センチメートルであった。この値は、汎用法で
ある化学結合法、包括法等により調製された固定化乳酸
酸化酵素膜の活性と比較してなんら遜色はなかった。
【0012】試験例1(乳酸酸化酵素含有ポリイオンコ
ンプレックス膜被覆電極による乳酸濃度測定) 実施例1で作製した電極Iを作用極、銀−塩化銀電極を
参照極、白金ワイヤを対極とする三電極系を構成し、定
電圧電源(北斗電工 HA−502)に接続した。上記
の三本の電極は容積20ミリリットルの試験液(リン酸
緩衝液、pH7.7、25℃)中に挿入した。試験液は
空気飽和の状態に保ち、磁気撹拌子で撹拌し、上記定電
位電源により、作用極に1ボルト(対銀−塩化銀電極)
を印加し、電流を測定した。時間0、10、20、30
秒において、ここに乳酸0.1ミリモル/リットルを加
えたときの電極Iの電流と時間との関係を表わすグラフ
を図1に示す。図1から明らかなように乳酸添加2秒後
に電流は定常値に達しており、迅速に乳酸濃度が測定で
きることが分かる。また、0.1ミリモル/リットルの
乳酸測定を一日十回行い、これを連日繰り返した結果、
この十回の測定に対する応答電流の平均値は、電極作製
後6週間低下せず、高い耐久性を持つものであることが
示された。
【0013】参考例(光架橋性ポリビニルアルコールを
用いた乳酸酸化酵素の固定化と固定化膜被覆電極による
乳酸濃度測定) 光架橋性ポリビニルアルコール水溶液(10%、東洋合
成工業)100ミリグラムに上記乳酸酸化酵素10ミリ
グラムを溶解させ、溶液の展開、乾燥、光照射のプロセ
ス(「アナレティカ・シミカ・アクタ(Anal. Chim. Ac
ta)」177巻、第153〜166ページ、1985
年)で酵素固定化膜(膜厚10ミクロン)を作製した。
この膜を直径3mmのグラッシーカーボン電極上に載
せ、O−リングを用いて電極表面上に密着させ、電極II
を作製した。この電極IIを作用極とし、試験例1と同様
の条件で乳酸の測定を行った結果、乳酸添加後、定常電
流を選るのに要する時間は30秒、一日十回の乳酸測定
試験に対する耐久性は3週間であった。
【0014】試験例2(電極I及びIIのアセトアミノフ
ェン、アスコルビン酸、尿酸応答等の比較) 実施例1及び参考例で作製した2種類の電極I及びIIに
ついて試験例1と同様の条件で、過酸化水素、アセトア
ミノフェン、尿酸、アスコルビン酸、ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド還元型(NADH)(いずれも濃
度0.1ミリモル/リットル)に対する応答電流を記録
し、乳酸応答と比較した。結果を表1に示す。表1から
分かる通り、電極Iにおいては、乳酸は同濃度の過酸化
水素に比べて1/2以下の応答電流を与えているにすぎ
ない。しかし、これは乳酸から酵素反応により過酸化水
素が生成する場合は、固定化膜の電極近傍で生成した過
酸化水素は、ほぼ100%が電極側へ拡散するが、固定
化膜の溶液側で生成した過酸化水素はどうしても溶液側
へリークしていってしまうことから、やむを得ないこと
と考えられる。一方、分子量百数十のアセトアミノフェ
ン、アスコルビン酸、尿酸に対する応答電流は同濃度の
乳酸に対する応答電流よりはるかに小さく、さらに分子
量の大きいNADHは、事実上、応答電流を与えない。
これは、電極Iで利用した酵素含有ポリイオンコンプレ
ックス膜が分子ふるいとして十分に機能していることを
示している。参考例で作製した電極IIでは、乳酸応答に
比べて、他の全ての成分が2〜5倍の応答電流を与えた
のに比べ、電極Iでは、易還元成分による妨害を抑制で
きることが分かる。血液中のアセトアミノフェン、アス
コルビン酸、尿酸の濃度は通常、乳酸濃度の1/10以
下であり、従って、電極IIでは乳酸応答に対し十〜数十
%の誤差を与える可能性があるのに対し、電極Iでは誤
差のレベルは、その1/10以下となり、正確な乳酸濃
度測定が可能なことが分かる。
【0015】
【表1】
【0016】実施例2(コリン酸化酵素含有ポリイオン
コンプレックス膜被覆電極の作製と電極のコリン応答
性) 直径3mmのグラッシーカーボンの端面を基板電極とし
て用い、この電極上に平均分子量100,000のポリ
リジン塩酸塩0.6%(w/v)水溶液(pHは7に調
整)5マイクロリットルを滴下し、次いでコリン酸化酵
素(EC 1.1.3.17、東洋紡)0.6%(w/
v)水溶液(pH7)5マイクロリットルを滴下し、最
後に分子量70,000のポリスチレンスルホン酸ナト
リウム0.6%(w/v)水溶液(pH7)10マイク
ロリットルを滴下して、室温で2時間以上放置、乾燥さ
せることにより、酵素含有ポリイオンコンプレックス膜
被覆電極を得た。この電極の表面を十分にリン酸緩衝液
(0.1モル/リットル、pH7)で洗浄してフリーの
コリン酸化酵素を洗浄した後、表面の酵素活性をフェノ
ール/4−アミノアンチピリン/ペルオキシダーゼを発
色系とする常法により見積もったところ、0.02ユニ
ット/平方センチメートルであった。この値は汎用法で
ある化学結合法、包括法等により調製された固定化乳酸
酸化酵素膜の活性と比較してなんら遜色はなかった。試
験例1と同様の条件でコリン応答性を評価したところ、
コリン添加5秒後に定常電流が得られた。このときの定
常電流とコリン濃度の関係を表わすグラフを図2に示
す。図2より明らかなように、0.5マイクロモル/リ
ットルから0.2ミリモル/リットルの間で両者に直線
関係が得られ、この濃度範囲のコリンの測定が可能なこ
とが分かった。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の試験例1における乳酸酸化酵素含有ポ
リイオンコンプレックス膜被覆電極(電極I)で得られ
た電流応答と時間の関係を表わすグラフである。
【図2】本発明の実施例2におけるコリン酸化酵素含有
ポリイオンコンプレックス膜被覆電極で得られたコリン
濃度と定常電流応答との関係を表わすグラフである。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−274682(JP,A) 特開 平4−173841(JP,A) 特開 平3−54447(JP,A)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 基板電極上に、酵素を固定化したポリイ
    オンコンプレックス膜を設けてなることを特徴とする酵
    素電極。
  2. 【請求項2】 基板電極上に、(a)ポリカチオン水
    液及び酵素水溶液を展開し、次いでポリアニオン水溶液
    を展開するか、又は(b)ポリアニオン水溶液及び酵素
    水溶液を展開し、次いでポリカチオン水溶液を展開し、
    乾燥することを特徴とする酵素電極の製造方法。
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