JPS58187188A - 酵素活性物質の固定化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素活性物質の新規な固定化法に関し、さら
に詳しくはポリカチオンを含有する水系媒体および酵素
活性物質を水不溶性のポリアニオンと接触させることに
より酵素活性物質を水不溶性ポリアニオンに固定化する
方法に関する。

従来、酵素活性物質を固定化する方法としては。

酵素活性物質どうしあるいは酵素活性物質と不溶性担体
との間を共有結合やイオン結合などで化学的に結合して
固定化する方法や酵素活性物質を水不溶性物質やマイク
ロカプセルの内部に包括する方法などが公知である。中
でも、不活性担体の表面に酵素活性物質をイオン的な結
合あるいは他の物理的な力によって固定化する吸着法は
他の固定化法に対していくつかの特徴を有している。例
えば、吸着法による固定化条件が極めて温和であり、か
つ酵素活性物質と担体との結合が緩やかであるため、固
定化にともなう酵素活性物質の損傷はほとんどなく、ま
た一旦固定化した後の酵素活性物質の失活は非電に少な
い。さらに、吸着法で固定化した酵素活性物質は担体の
表面近傍に固定化されるため、この固定化された酵素活
性物質を基質々とに接触させる必要がある場合の基質の
酵素活性物質への拡散が良好で、固定化状態でも大きな
活性を発現できる。また、酵素活性物質が共存しない条
件で担体の調製、処理が可能であるので。

他の固定化法の場合の担体の調製や処理よりも担体の選
択やその調製法が自由になシ、使用目的に応じた担体の
選択が可能になる。さらに、吸着法による固定化の利点
は、必要に応じて固定化操作を培養器などの中で行うこ
とができるので、酵素活性物質の固定化操作にともなう
雑菌汚染の危険性が大巾に低減できると共に固定化操作
が極めて簡便になることである。

しかしながら、上記吸着法は多くの利点を有するにもか
かわらず、なお多くの欠点もあり酵素活性物質の固定化
法として十分とはいいがたい。吸着法は前述の化学的結
合法や物理的固定化法と比較して、固定化の効率の低い
点、固定化に長時間を要する点、吸着が担体の表面状態
に大きく依存するため使用条件での担体表面の状態変化
による酵素活性物質の脱着の起りやすい点、酵素活性物
質の担体への吸着力が小さいため、目的とする固定化酵
素活性物質の製造や使用に際して機械的衝撃などにより
活性物質の担体からの脱離がおこシやすい点、さらに酵
素活性物質として増殖性の生菌体などを用いた場合に、
増殖によシ生じた新たな菌体の大部分は担体から脱離す
るので、増殖菌体の固定化には適しない点、などを欠点
として羊げることができる。

本発明者等は、上記固定化法に見られる問題点を解消す
る目的で、吸着速ｔＷおよび固定化収率が人きく、シか
も吸着後の脱着の少ない酵素活性物質の固定化法を鋭倉
恢討の結果本発明に到達した。

すなわち、本発明は任意の形状をした水不溶性のポリア
ニオンにポリカチオ／を含有する水系媒体および酵素活
性物質を接触させると、酵素活性物質が水不溶性ボリア
ニオ／の表面に吸着ごれると同時にポリカチオン、とポ
リアニオン間の相互作用によって強固なコンプレックス
が形成されて水不溶４／１−の被膜が牛成し、酵素活性
物質が水不溶性ポリアニオンの表面付近に固定化されて
脱離しなくなるという全く新規な境象が発見されたこと
に基づくものである。

本発明は、ポリカチオンを含む水系媒体および酵素法（
＜Ｆ物質を任意の形状を有する水不溶性のポリアニオン
と接触させることによって酵素活性物質を目的とする形
状の水不溶性ポリアニオンの表面付近に被膜を形成する
と同時に固定化することを牛ｊ徴とする。

本発明の方法によれば従来の吸着法と比較して次のよう
な利点がある。

ビ）酵素活性物質の吸着される速度が著しく増加する。

（ロ）　固定化収率が冒り、かつ再現性がある。

（ハ）一旦固定された酵素活性物質は脱着しにくい。

に）生菌体を固定化した場合、増殖により新たに生じた
菌体も固定化される。

化）水不溶性のポリアニオンの表面状態に関係なく酵素
活性物質が固定化される。

（へ）酵素活性の寿命が長くなる。

（）ｌ　　酵素活性物質に限定はなく広範囲に応用でき
る。

（１）酵素活性物質の損傷がほとんどない。

以上の外１本発明の方法は従来法の長所である。

例えば基質と酵素活性物質の良好な接触、操作の簡便さ
、雑菌汚染の危険性の少ないことなどの特性も具備して
いる。

さらに、従来の共有結合法と比較して酵素活性物質の損
傷が少なく操作が簡便である点、また従来の包括固定法
と比較して酵素活性物質の脱離が少なく、しかも酵素活
性の寿命が長く、固定化操作中の雑菌汚染の少ない点な
ど本発明の方法の特色である。

本発明に使用されるポリカチオンは後述するポリアニオ
ンと反応してコンプレックスを生成する。

もりであれば特に限定はなく１例えば次のようなポリマ
ーを代表例として例示することができる。

Ｉ　　Ｊ’、＆Ａに４級アンモニウムイオングループを
含ず１するポリマー これらのポリマーには、次のようなポリマーが代表例と
してあげられる。　　′ （−一般式 ％式％ ０式中、Ｒ１，ｌ（，２は水素または炭素数ｌ以Ｆのア
ルキル基、１４３．）ｔ４は炭素数ｌ以下のアルキル基
）で表現される単位を有する単独ＩＦ合体、共重合体ま
たはグラフト重合体；（ｂ）　　一般式 （式中、Ｒｔは水素壕だは炭素数ｊ以下のアルキル基、
）（，２，１（３は炭素数μ以下のアルキル基１ｍは３
以上の整数）で表現される単位を有する単独重合体、共
重合体またグラフト重合体；または （ｃｌ　　一般式 ％式％ Ｃ式中、Ｒ１、Ｒ２は炭素数μ以下のアルキル基、アリ
ル基）で表現される単位を有する単独重合体、共重合体
またはグラフト重合体。

１［側鎖に〃級アンモニウム１島基を有するポリマこ７
１らのポリマーには、次のようなポリマーが代表例」と
してあげら７′ｌる。

にｉｌ　　−一般式 Ｃ式中２１もｌ、Ｒｚ、Ｒ３は水素またはメチル４！−
１）ｔ４．Ｒｓは炭素数μ以下のアルキル帖、Ｈ，６は
炭素Ｈｇ以下のアルキル基′、ベン／ル基、アリル基、
アルコキシル基またはカルボンアミド基１ｍは１〜３０
の整数、ｎは０〜ｊの整数）で表現される単位を有する
単独重合体、共重合体またはグラフト重合体；（ｂｌ　
　一般式 ％式％ （式中、Ｒｔは水素まだはメチル基、１４２゜ｕ　ｓ　
、　Ｈ，４は水素、メチル基または水酸基。

Ｒ５，Ｒ６は炭素数Ｊ以下のアルキル基、Ｒｒは炭素数
ψ以下のアルキル基、アリル基、アルコキシル基、ｎは
／、ｉｔの整数）で表現される単位を有する単独重合体
、共重合体またはグラフト重合体； ［Ｃ）　　一般式 ％式％ （式中、ｌＬｘは水素またはメチル基、Ｒ２゜１（，３
は炭素数Ｊ以下のアルキル基、Ｒ１４は炭素数μ以下の
アルキル基、ベンジル基、ｎは／〜ｔの整数）で表現さ
れる単位を有する単独重合体、共重合体またはグラフト
重合体；ｉｄｌ　　一般式 ％式％ （式中、Ｒ１は水素まだはメチル基、Ｒ２゜■、３．ｌ
ｅ４は炭素数μ以下のアルキル基）で表現される単位を
有する単独重合体、共重合体またはグラフｉ・重合体；
まだは ｔｅｌ　　一般式 −ＣＩｌｚ−ＣＩ− Ｈ５ｌ Ｃ式中、）Ｌｌ、Ｒ２、ｌ（ｓ　、Ｒ４は水素またはメ
チル基、Ｒは炭素数ｊ以下のアルキル基）で表現される
単位を有する単独重合体、共重合体まだはグラフト重合
体など。

■　主鎖にアミン基またはその塩を含有するポリマー これらのポリマーには１次のようなポリマーが代表例と
してあげられる。

（ａｌ　　一般式 ％式％ の塩を有する単独重合体、共重合体またはグラフト重合
体；まだは （ｂｌ　　−一般式 （人中、比は炭素数ｊ以下のアルキル基、アリル基）で
表現される単位またはその塩を有する単独重合体、共車
合体またはグラフト重合体など。

■　側鎖にアミン基またはその塩を含有するポリこれら
のポリマーには、次のようなポリマーが代表例としてあ
げられる。

（ａｌ　　−ｍ一般式 ％式％ ） Ｃ式中、Ｒ１は水素またはメチル基、Ｒ２゜ル３は水素
または炭素数ｊ以下のアルキル基ゝで表現される単位ま
たはその塩を有する単独重合体、共重合体またはグラフ
ト重合体；（ｂ）　　一般式 Ｃ式中、Ｒｔ、Ｒ２，Ｒａは水素またはメチル基、Ｒ４
、Ｒｓは水素または炭素数ｊ以下のアルキル基、ベンジ
ル基、アリル基またはアルコキシル基１ｍは１〜３０の
整数、ｎはθ〜３５の整数）で表現される単位またはそ
の塩を有する単独重合体、共重合体またはグラフト重合
体； （ｃｌ　　一般式 ％式％ Ｃ式中、ルーは水素またはメチル基、ｌ（２゜１（３は
水素または炭素数ｊ以下のアルキル基。

べ／ジル基またはアルコキシル基）で表現さＪする単位
またはその塩を有する単独重合体。

共重合体またはグラフト重合体； （山　一般式 ％式％ Ｃ式中、＃Ｌ１は水素またはメ′チル基、Ｒ２゜ｌ（，
３は水素または炭素数ｊ以下のアルキル基）で表現され
る単位またはその塩を有する単独重合体、共重合体また
はグラフト重合体；（ｅｌ　　一般式 −ＣＨ２−ＣＩＩ− ）Ｌｌ Ｃ式中、Ｒｘ、Ｒｚ、Ｒｓ、Ｒ＜は水素またはメチル基
）で表現される単イ９またはその塩を有する単独重合体
、共重合体またはグラフト重合体；または、 （ｆ）　　キトサンなどのアミノ糖またはその塩など。

本発明の実施にあたって、ポリカチオンとして上記のＩ
から■のポリマーを単独あるいは２種以上ブレンドして
使用することには何ら問題はなく。

まだ１種類のポリマーで上記のＩから■の２つ以上に該
当するポリマーとして使用することも可能である。

上記Ｉまたは■におけるＸｏは陰イオンを有する原子ま
たは原子団であシ１例えば１価の陰イオンを有する場合
の代表例としては、・・ロゲンアニオン、硝酸アニオン
、亜硝酸アニオン、モノメチル硫酸やモノエチル硫酸な
どの硫酸モノエステルのアニオン、＾゛酸アニＡン、ギ
酸アニオン、酢酸ｆ　＝ニオン、プロピオ −万Ｘ　が２価の陰イオンを有する場合の代表例とｌ−
ては、硫酸アニオン、炭酸アニオン、チオ硫酸アニオン
などカニあげられる。Ｘ　が２価の陰イオンを有する場
合は，１価を有する場合の半分の駄が１史用される。

上記ＩＩＩまたは■におけるアミンの塩とは，第１統．
第２級または第３級アミンと酸性物質との塩で．ちる、
、この酸性物質には通當塩酸，硫酸，硝酸などの無機酸
およびギ酸，酢酸，グロビオン酸などの＋４°機酸が使
用される。

４、発明に使用されるポリカチオンにおいては。

第４級アンモニウムイオン、アミノ基およびアミノ盾の
塩などを有するカチオン性の単位がポリカチオンポリマ
ーの全構成単位に対して占める割合は、／．／ＱＱ％、
好”！しくｕｌｏ−１００％である。上記カチオン性の
単位の割合が少なすぎると水不俗性ポリアニオンとの相
互作用にょシ生成するコンプレックスの強度が低下する
傾向があり。

また逆に上記の割合が多くなシすぎると経済的でなくな
る。

本発明に使用されるポリカチオンの分子量は通常／，　
０　０　０　〜／　０，　０　０　０，　０　０　０　
（７）範囲である。分子量が小さすぎると生成されるコ
ンプレックスの強度が低下し、逆に分子量が大きすぎる
と、ポリカチオンの溶解したシ懸濁している水系媒体の
粘度が細大して操作性が悪化する。

本発明においてポリカチオンを使用するに際しては，ポ
リカチオンを水に溶解して水溶液として用いてもよいし
，また一部が水に不溶の場合は懸濁液として使用できる
。

本発明で使用する水系媒体としては，目的によって水，
水溶液または懸濁液を用いることができる。例えば、水
溶液としては必要に応じて緩衝液。

基質の水溶液，培地またはエチルアルコールなどの水浴
性有機物を含む水浴液を使用することができる。また懸
濁液としては必要に応じて水不溶性の濁素活性物質など
を懸濁させて用いてもよい。

また、この水系媒体は本発明の実施に支障のない物’１
’１をａむことは何ら問題とならない。また、−り記１
　＆−よび■に例示［７たポリカチオンを水系媒体にき
有させる場むにｈ水系媒体の水素イオン濃度には特に限
犀はないが，上記■および■に例示したポリカチオンで
アミン塩を含有するポリマーを水系媒体に含有させる場
合には，ｐＨ７以下の酸性条ｆトが好ましい。なお、こ
の水系媒体は通常後述するように酵素活性物質と接触す
るので，酵素宿＋１゛物′ｉ−１を失活させないような
条件，例えば水素ｆオノメ゛狽度，溶質、懸濁物の種類
と濃度および温度などを適宜に選ぶ必要がある。本発明
に使用さ７するポリカチオンの水系媒体に対する濃度は
通常０、０／〜７０重幇係の範囲，好ましくはＱ，／−
オ０市ｙ俤の範囲である。濃度が低すぎると酵素活性物
″１ｔの固定化収率が低下し．選に濃度が高すぎると水
系媒体の粘度が上昇して実用的でなくなる。

本ｊε明において使用される濁素活性物質としては、酵
素，微生物，細胞画分などが誉げられる。

こねらの中，酵素については特に限定はなく，例示すｔ
ｌば次のようなものか埜げられる。

酸化還元酵素ニ アミノ酸オキンダーゼ、ウリカーゼ、カタラーゼ、キサ
ンチンオキンダーゼ、グルコースオキシダーゼ、クルコ
ース−乙−ホスフニートチヒドロゲナーゼ、グルタミン
酸デヒドロゲナーゼ、チトクローム０オキシダーゼ、チ
ロンナーゼ、　ｆＬ［−ｊ−ヒドロゲナーゼ、ペルオキ
ンダーゼ、乙−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ、
リンゴ酸デヒドロゲナーゼなど。

転移酵素： アスパラギン酸アセチルトランスフェラーゼ。

アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸ア
ミントランスフェラーゼ、グリンンアミントランスフエ
ラーゼ、グルタミン酸オキザロ酢酸アミントランスフェ
ラーゼ、グルタミン酸ピルビン酸アミノトランスフェラ
ーゼ、クレアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルト
ランスフェラーゼ、ピルベートキナーゼ、フルクトキナ
ーゼ、ヘキンキナーゼ、Ｓ−リジンアセチルトランスフ
ェラーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼなど。

加水分解酵素： アスパラギナーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、アミ
ノア／ラーゼ、アルギナーゼ＋　Ｌ−アルキニンデイミ
ナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー上１ウ
ロキナーゼ、エステラーゼ。

カリクレイン、キモトリプ／ン、トリプンン、トロンビ
ン、ナリノギナーゼ、ヌクレオチダーゼ。

ハハイン、ヒアウロニダーゼ、プラスミン、ペクチナー
ゼ、ヘスペリギナーゼ、ペプン／、ベニ／リノ−−−ゼ
、ペニンリンアミダーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファタ
ーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、レン
ニノナト。

リアーゼ： アスパラギン酸テカルボキシラーゼ、アスパルターゼ、
クエン酸リアーゼ、グルタミン酸デカルボキンラーゼ、
ヒスチジンアンモニアリアーゼ。

フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、フマラーゼ、フ
マール酸ヒドラーゼ、リンゴ酸シンテターゼなど。

異性化酵素： アスパラギナーゼ、グルコースイソメラーゼ。

グルコースホスフェートイソメラーゼ、グルタミン酸ラ
セマーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼなど
。

リガーゼ： アスパラギンシンテターゼ、グルタチオ／シンチターゼ
、グルタミンシンテターゼ、ピルビン酸シンテターゼな
ど。

本発明に使用される微生物としては、酵素酸として使用
しうるものであれば特に制限はなく５例えば上記の如き
酵素を含有する細菌類、真菌類、粘菌類、地衣類、藻類
、原生動物などがあげられる。

これら微生物は生菌体は勿論、生菌体を凍結乾燥したも
の、凍結融解したもの、アセトン処理したもので、加熱
処理したものなどであってもよい。

１だ本発明に使用される細胞画分としては、上記の如き
酵素を含有する微生物の細胞壁、ミトコンドリア、ミク
ロゾーム、オルガネラ、枝、可溶性画分あるいはこれら
の混合物などがあげられる。

本発明に使用される酵素活性物質は単一酵素、複合酵素
系いすねでもよい。さらに、２種以上の酵素活性物′ｔ
・ｆを同時に使用してもよい。

本）色間において便用１される水不溶性のポリアニオン
１−Ｌ、目的とする固定化した酵素活性物質を使用１す
るのにＷ　Ｌだ任意の形状を有し、かつ上述のポリカチ
オンと反応して強固なコンプレックスを肘成Ｌ１（）る
アニオン基を含有していれば特に限定を−［ない。この
水不溶１′１ポリアニオンの形状はその目的に適した任
練の１１ゑ状にすることができるが。

凹児は水不溶性ポリアニオンの塊状物またはヒトｒ」ゲ
ノ【などの１３１体状、あるいは固体状または液体状の
懸／１８物などである。また本発明の水不溶性ポリアニ
オンが上述のポリカチオンと反応して強固なコンプレッ
クスを肘成するだめには、アニオン基として例えば、カ
ルボン酸基まだはその地、スルホン酸基まだはその塩、
硫酸エステル基まだはぞ−のｊ、、Ａおよびり／酸エス
テル基またはその塩などかば有されていればよい。これ
らポリアニオン基を具体的に例示すると次のようになる
。

（６１）　　カルボン酸基またはその塩を含むポリマー
アクリル（！β、メタクリル酸、マレイン酸、フマル酸
、イタコン酸などのカルボン酸またはその塩をモノマー
として含有する単独重合体、共重合体またはクラフトａ
合体あるいはアルギン酸、ペクチンまたはカルホキ／メ
チルセルロースなどのカルボン酸含有の多糖またはその
塩。

（Ｉ））　　スルホン酸基またはその塩を含むポリマー
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、
、２−アクリルアミドエタンスルホン酸、２−メタクリ
ルアミドエタンスルホン酸。

ビニルスルホン酸、了りルスルホン酸、スチレンスルホ
ン酸彦どのスルホン酸まだはその塩をモノマーとして含
有する単独重合体、共重合体またはグラフト重合体、 （ｃｌ　　硫酸エステル基またはその塩を含むポリマー
カラギーナン、ファーセレラン、寒天、硫酸セルロース
、硫酸デングン、硫酸化デンプン、ポリビニールアルコ
ールの硫酸化物などの硫酸エステル化合物またはその塩
。

ｆｄ）　　ＩＪン酸エステル基またはその塩を含むポリ
マア７ソドホスホオキ／エチルメタクリレート、ア／ン
トホスホオキ／プロピルアクリレート。

ア／ノドポスホオキ／プロピルメタクリレートなどのり
ノー亡エステルまたはその塩をモノマーとして含有する
単独重合体、共重合体またはクラフトｉ合体あるいはポ
リビニルアルコールのリン酸化物、デンプンのリン酸エ
ステルまだはその塩など。

本発明の水不溶性のポリアニオンとしては１例えば水不
溶性の、あるいは水不溶化された上述のポリマーを用い
ることができる。その際、上述のポリマーは単独あるい
は一種以上使用することが”Ｔ　ｒａｔ’である。ここ
で用いる用語「水不溶性のポリ−ｒ　＝−オ／」とは１
例えば公知の方法で架橋されて水不溶性が付与された上
述のポリアニオン、あるいは本発明を実施するに際して
、上述のポリマー（、 またに−１その水溶液をその、凝固応以下の温度に保つ
ことにより７％られる水不溶性のポリアニオンなどを意
味する。

上記水溶性のポリアニオンに対する上述のアニオン性官
能基の割合は通％　／〜７０重量係の範囲。

好ましくはｊ−６０重葉係の範囲である。

本発明に用いる水不溶性のポリアニオンには前述のよう
に固体状のものと液体状のものがあり。

固体状の水不溶性ポリアニオンの例としては含水率が例
えば１００重量重量上のもの（ヒドロゲル）や１００軍
ｋｔ１未満のもの（固体）などがある。

固体状の水不溶性ポリアニオンの調製法としては、例え
ば水溶性のアルギン酸塩をゲル化させる水溶液（例えば
、塩化カルシウム水溶液）と上記水溶性アルギン酸塩を
接触させるなどのイオン的な架橋による方法、アクリル
酸ヒラジカル性架橋剤を混合したのちラジカル重合を行
なうことにより架橋させるなどのラジカル反応や縮合反
応などを用いる共有結合によシ架楡させる方法などの架
橋による方法などの架橋による水不溶性ポリアニオンの
調整法がある。もちろん、スチレン−ジビニルベンゼン
やフェノールーホルムアルデヒトヲＪｊＮ　ｌ）とする
架橋された重合体にスルホン基を導入してｆｔ）らｈる
水不溶性ポリアニオンのような、架橋さｉｌだ中介体に
アニオン性基を導入して得られる水不Ｍ＋トボリアニオ
ンも本発明に使用可能である。

また、固体状の水不溶性ポリアニオンの別の調製法とし
て１例えばに−カラギーナンをその凝固点゛以下に冷却
したり、スルホ／基の導入されたポリエチレン樹脂を凝
固り以下に保つなどによる方法も本発明の水不溶性ポリ
アニオンの調製法として実施可能である。

本発明に用いる固体状の水不溶性ポリアニオンの旧状は
その目的に応じて任意の形にすることがＩＪＴｒ正であ
る。例えば、上述の水溶性のアルギン酸塩をそのゲル化
液に滴下することによって粒状の水不溶性ポリアニオン
の調製が可能であるし、また上７のアクリル酸とラジカ
ル架橋剤を混合して浅い皿に拡げたのち重合すると板状
ないし薄膜状の水不溶性のポリアニオンが調製される。

このようにその目的によって例えば板状、膜状２粒状。

繊維状、管状、中空糸状または網状などに成形すること
かできる。

本発明に使用可能な懸濁状の水不溶性ポリアニオンとし
ては１例えば上述の固体状または液体状のポリマーで水
不溶性のものもしくはそれらを水不溶性溶媒に溶解また
は懸濁させたものを水に懸濁させたものが挙げられる。

本発明の方法を用いて酵素活性物質を固定化するには酵
素活性物質を水不溶性ポリアニオンに接触させるが、水
不溶性ポリアニオンが固体状の場合は酵素活性物質をそ
の表面に接触させることが可能であり、水不溶性ポリア
ニオンが液相の場合は酵素活性物質を液相に懸濁させて
もよい。その他、水または水溶液に酵素活性物質を一旦
溶解または懸濁させたものと水不溶性ポリアニオンと接
触させてもよい。以上の操作に続いて、酵素活性物質と
接触した水不溶性ポリアニオンをポリカチオンを含有す
る水系媒体に接触させることによって固定化処理は完了
する。このほか、まず酵素活性物質をポリカチオンを含
有する水系媒体に溶解または懸濁させたのちに、これを
水不溶性ポリアニオンに接触させることによって固定化
処理を一段で几■′することも＋Ｔ［能である。上記操
作中に。

本発明の夷ＫＭにβ・５害とならない物質を酵素活性物
質および−ぞの水浴液または恕ｌ蜀液あるいはポリカチ
オンを有轟に共存させることはもちろん可能であど、。

本珀明において酵素活性物質を水不溶性ボリア二′Ａ）
に接触させる方法としては１例えば酵素活性！１１η′
ＣＪを水不溶性ポリアニオンに散布するなど、両者か−
（質的に接触される方法であれば特に限定はない。また
、酵素活性物質を溶解または懸濁させた水剤だは水溶液
およびポリカチオンを含有する水系媒体を水不溶性ポリ
アニオンと接触させる万ｄ、としては１例えば上記水系
媒体中に水不溶性ポリアニオンを浸漬または懸濁させる
などの方法が’／ＩＩＬい。上記反応において、ポリア
ニオンゲルとポリカチオン含有水系媒体の使用割合は、
前省°のアニオン性基の当量に対する後者のカチオン性
基の当量−で表示して０．０／−１００，好ましくは０
、／〜１０である。カチオン性基が少なすぎるとゲルの
硬化が不十分であり５逆にカチオン性基が多すぎると経
済的でなくなる。

上記接触反応に使用する温度は−、ｉ！θ〜１００Ｃの
範囲、好ましくはθ〜♂ＯＣの範囲である。

また１本発明の方法において酵素活性物質を溶解または
懸濁している水、水溶液または水系媒体の好適なｐ　Ｉ
Ｉは酵素活性物質によって大きく異るが通常／〜）、２
、好ましくは２〜９である。

本発明の酵素活性物質の同定化法においては。

上記の反応により得られた目的とする固定化酵素活性物
質を、ポリアニオンを含有し、目的によって酵素活性物
質を含有する水系媒体とさらに接触させることによって
新規な固定化酵素活性物質を得ることも可能である。す
なわち、ポリアニオンを含有する水系媒体とポリカチオ
ンを含有する水系媒体を交互に接触させて酵素活性物質
を層状に固定化することが可能である。

上記の本発明の方法により製造された固定化酵素活性物
質は、必要に応じ緩衝液で洗浄して一２０゛Ｃから室温
までの温度で安定に保存することができる。

本発明の方法により得られる固定化酵素活性物’ｆ１は
水に不溶性であるので、カラムに充填してこれにＶ、質
溶ｌｆｋをｖ１５すことによって長期間にわだ多連続的
（て酵素反応を実施することができ名ほか。

、回分法によっても繰り返し酵素反応を行わせるこ゛と
ができる。また、電極表面を酵素活性物質で膜状に−１
したり、あるいは管状物質の外面または内［ｆｌｌに酵
素活性物質を同定化することができるので、酵素電極、
医療用分析器５人工臓器系分野での利用が期待される。

−万１発酵法の分野に本発明の］−１１定化酵素活性物
質を応用すると、連続的かつ９：Ｊ、　ｊ↓シ的な発酵
反応が可能になるほか、発泡を伴うような場合には固定
床のみ、ならず流動床式など神々の発酵彫式にも応用が
可能である。

以丁、実施例を埜げて本発明を具体的に説明するが、こ
れらは本発明を限定するものではない。

実施例１ ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニラムクｕ　Ｉ
Ｊド）、２ｔを生理的食塩水１００ｒｎｅに溶解したの
ち、／、２０°Ｃで１．３−分間スチーム減菌処理をし
、これに協会Ｚ号酵母ｊＯｎ金耳を添加して懸濁させた
。

別に１．２−アクリルアミド−２メチルプロパンスルホ
ン酸ナトリウム／ＱｆｊとＮ　、　Ｎｌ−メチレンビス
アクリルアミドＩｆを水ｇ９１ｊに溶解し１．ｊＣで窒
素バブリングを１時間行った。次に、この水溶液にｏ、
　ｏ　ｔ　％の過硫酸アンモニウム水溶０／ｍ／とＮ　
、　Ｎ　、　Ｎｌ　、　Ｎｌ−テトラメチルエチレンジ
アミン０．０１Ａｍｚを加えて窒素バブリングを３０分
間行つだのち、水溶液の温曳を３０　’Ｏに上げて重合
反応を３０分間行わせ、さらに７０Ｃで１時間後重合を
行った。得られたヒドロゲル状重合体の／Ｑｆを３ｎ角
のサイコロ状に切断し、これを／　、２０’Ｃでｉ３分
間減菌処理した。

次に、このサイコロ状物を前述のポリ（ビニルベンジル
トリメチルアンモニウムクロリド）の酵母懸濁液に無菌
的に添加、浸漬して２０　’ＯＫ　／時間保った。１時
間後に酵母懸濁液を除き、あらかじめ滅菌処理された生
理的食塩水で上記ゲルを２回洗浄したのち、これを／　
Ｊ　Ｏ’Ｏで滅菌処理されたグルコースｌθ係、酵母エ
キスＱ、　／まチ、塩化ア／七ニウムｏ、ｒｓｑｂ、塩
化ツートリウム０．１％、す／酸二カリウムＯｊｊ％、
硫酸マグネンウムｏ、ｏ／１ｓ＝＝化ノノル／ウムｏ、
ｏＯｉ係およびクエン酸０３％を含有する酵母の増殖培
地−／　００　ｍ　／？に添ＩＪ［１，浸漬し、液温を
３０　’Ｃに保ったところ。

１１−９時間後の液中のエタノール濃度は２．５％であ
った。さらに、サイコロ状のヒドロゲルの表面材ｉｌｔ
にｔ土酵母のコロニーが観祭された。

火、％１例ノ アルギン酸すトリウム（商品名：［ダツクアルギ／Ｎ　
ＳＰ　Ｍ　Ｊ鴨川化成社製）−２ｔを水９ｇｔに浴ｉ１
．・Ｃし、ノー２０Ｃで７５分間減菌処理したのち、こ
Ｊｔ　＠−／　２０　Ｃで／ｊ分間滅菌処理されたｊチ
塩化カル／ウム水浴液に無菌的に滴下して粒状のアルギ
ン酸力ルンウムゲルを得た。このゲルを直径、２　（Ｍ
、高さ／　Ｑ　ｃｙｍの外套付きのガラス製カラムに無
菌的に充填した。

−”１１．セラチア・マルセッセンスを栄養培ｉ（グル
コースＯ，ＳＳ、酵母エキス／、　、２　、ｔ　％　、
ベプ）　ン／、０％、肉エキス０．５％および塩化ナト
リウムＯｊ係を含有する培地、［）Ｈ７，０）に接種し
。

３０Ｃでｌ乙時間振とうして培養した。得られた菌体の
懸濁された培養液ｊ　００　ｎｌ　７？に、あらかじめ
１２０°Ｃで１５分間滅菌処理されたポリアミンスルホ
ン（商品名：　「ＰＡＳ−１１−≠０」日東紡社製）１
０＃を溶解した。

この溶液を上記のカラムの下部よ＃）Ｉｍ／／ｈｒの流
速で流し、内部温度を３０　’Ｃに保った。、２≠時間
後に上記の液の流通を停止し１次に菌体を含まない上記
培地に！係の［ＰＡｓ−１１−≠０］を溶解した液を／
　、！　Ｑ　’Ｏで１５分間滅菌処理し２てｇｍ／／ｈ
ｒの流速で供給し、内部温度を３０　’Ｃに保った。６
０時間後のカラム出口における流出液中のインロイシン
濃度は、２．３ｍｌ／ｍｅであった。さらに、ヒドロゲ
ルの表面付近および内部にはコロニーが観察された。

実施例３ に−カラギーナン（商品名：　［Ｑｅｎｕｇｅｌ−町三
品社製）Ｊｔを水り乙ｔに溶解して／　、ｌ！０　’０
でｌよ分ｌｉ１滅凶処理をしだのもｓ　ｏ　’ｃの温Ｉ
Ｗに保ち、あらかＬめ／ノＯＣで１３分間滅菌処理され
たｊ％聰化カリウム水溶液（液温、２０°Ｃ）に無菌的
に滴下して粒状のゲルをイ（）た。これを直径、ｌ！備
、高さ１０Ｃ１の外イｂ付きのガラス製カラムに無菌的
に充゛填した。

一万、実加ｉ例ノと同様のセラチア・マルセッセンスの
懸濁した培養液ｓｏｏｍｅにあらかじめ／ノＯＣで７５
分間滅菌処理されだポ＋）（Ｉｔ−ビニル−／−メチル
ピリジニウムクロリ）’　）　、２０　ｔを溶解した。

この溶液を上記のカラムの下部よ＃）Ｉ　ｍ　ｌ／ｈｒ
のｊｌｉｒ、連で流し、内部温度を３０°Ｃに保った。

、２１Ｊ時間後に上記の液の流通を停止し１次に菌体を
含まない実施例！の培地に４（％のポＩＪ（４’−ビニ
ル−７−メチルピリジニウムクロリド）を溶解した液を
／　、２０　’Ｏでｌｊｆ分間滅菌処理して１ｍｌ／ｈ
ｒのカ１〕速で供給し、内部温度を３０゛Ｃに保った。

６０時間後のカラム出口における流出液中のインロイシ
ン濃度は２．０ｍ　＃　７ｍ　／であった。その後、ポ
リカチオンを含まない実施例ノに記載の培地を流通した
ところ６０時間後のカラム出口における流出液中のイノ
ロイシン濃度は、２．３　ｍ　？　７ｍ　１となった。

特許出願人　　日本石油株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１１ポリカチオンを含有する水系媒体および酵素活性
   物質を水不溶性のポリアニオンと接触させることにより
   酵素活性物質を水不溶性ボリア互オンに固定化すること
   を特徴とする酵素活性物質の固定化法。