DE3315201A1

DE3315201A1 - Verfahren zum fixieren enzymatisch aktiver materialien

Info

Publication number: DE3315201A1
Application number: DE19833315201
Authority: DE
Inventors: Hirosuke Yokohama Kanagawa Imai; Ko Kawasaki Kanagawa Sakata
Original assignee: Nippon Oil Corp
Current assignee: Eneos Corp
Priority date: 1982-04-27
Filing date: 1983-04-27
Publication date: 1983-10-27
Also published as: DE3315201C2; US4525457A; GB2118949A; GB8311435D0; GB2118949B; JPS58187188A

Description

Verfahren zum Fixieren enzymatisch aktiver Materialien

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Festlegen oder Fixieren enzymatisch aktiver Materialien oder Substanzen, und sie bezieht sich insbesondere auf ein Verfahren zum Fixieren eines enzymatisch aktiven Materials an einem wasserunlöslichen Polyanlon, Dieses Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen eines polykationhaltigen wässrigen Mediums und des enzymatisch aktiven Materials mit dem wasserunlöslichen Polyanion.

Es 1st bereits eine Anzahl VQn Verfahren zum Festlegen oder Fixieren enzymatisch aktiver Materialien bekannt. Diese be-*· kannten Verfahren umfassen z,B, das Verfahren des chemischen Kombinierens eines enzymatisch aktiven Materials mit einem anderen enzymatisch aktiven Material oder einem unlöslichen Träger durch kovalente oder ionische Bindung und das Verfahren des Einschließens eines enzymatisch aktiven Materials innerhalb einer wasserunlöslichen Substanz oder In Mikrokapseln, Unter den restlichen Verfahren besitzt das Adsorptionsverfahren f bei dem ein enzymatisch aktives Material auf der Oberfläche eines inerten Trägers durch ionische oder andere physikalische Kräfte fixiert wird, verschiedene Vorteile gegenüber anderen Fixierungsverfahren, Beispielsweise gestattet das Adsorptionsverfahren, daß ein enzymatisch aktives Material unter sehr milden Bedingungen fixiert und lose an einen Träger gebunden wird. Auf diese Weise erleidet das enzymatisch aktive Material geringe Schädigung durch das Fixierungsverfahren und unterliegt, nachdem es einmal fixiert worden Ist, nur einem geringen Grad der Entaktivierung, Weiterhin gestattet das Adsorptionsverfahren, daß das enzymatisch aktive Material in der Nähe der Oberflächen des Trägers fixiert wird. Wenn daher ein Substrat mit der fixierten Zubereitung des enzymatisch aktiven Materials In Kontakt gebracht wird, verbreitet sich das Substrat schnell bzw, leicht über das enzymatisch aktive Material, so daß es sehr hohe Aktivität auch im fixierten Zustand aufweisen kann. Außerdem ist es möglich, den Träger In Abwesenheit des enzymatisch aktiven Materials herzustellen und vorzubereiten. Deshalb besteht im Vergleich zu der Herstellung und Vorbereitung eines Trägers bei anderen Fixierungs^ verfahren ein größerer Spielraum für die Bestimmung des Typs des verwendeten Trägers und des Herstellungsverfahrens, Dies ermöglicht, einen Träger auszuwählen, der Im hohen Maße für den beabsichtigten Zweck geeignet ist, Ein weiterer Vorteil dear Adsorptionsverfahrens ist, daß das Fixierungsverfahren in einem Kulturgefäß oder dergleichen durchgeführt werden kann. Dies dient nicht nur dazu, das Risiko der Verunreinigung mit

unerwünschten Mikroorganismen während des Verfahrens zum Fixieren eines enzymatisch aktiven Materials 3tark zu senken, sondern vereinfacht auch das Fixierungs-verfahren bis zu einem merklichen Grad.

Trotz all dieser Vorteile besitzt das Adsorptionsverfahren noch viele Nachteile und kann nicht als zufriedenstellendes Verfahren zum Fixieren von enzymatisch aktiven Materialien angesehen werden. Das Adsorptionsverfahren ist speziell im Vergleich zu den oben beschriebenen chemischen und physikalischen Fixierungsverfahren in der Hinsicht nachteilig, daß das Fixierungsverfahren einen niedrigen Wirkungsgrad besitzt und eine lange Zeitdauer erfordert. Da weiterhin die Adsorption in weitem Maße von den Oberflächenbedingungen auf dem Träger abhängt, neigt das enzymatisch aktive Material zu Desorption aufgrund der Änderung der Oberflächenbedingungen auf dem Träger während des Gebrauchs» Außerdem ist das Adsorptionsvermögen des enzymatisch aktiven Materials in Bezug auf den Träger so niedrig, daß während der Fixierung des enzymatisch aktiven Materials oder während aes Gebrauchs der entstehenden fixierten Zubereitung das enzymatisch aktive Material die Neigung zeigt, unter dem Einfluß von mechanischem Schock und dergleichen von dem Träger freigesetzt zu werden. Wenn darüber hinaus lebende mikroskopisch kleine Zellen Und Ähnliches als enzymatisch aktives Material verwendet werden, werden die meisten der neu gewachsenen Zellen von dem Träger freigegeben.. Dies macht das Adsorptionsverfahren ungeeignet für die Fixierung von wachsenden mikroskopisch kleinen Zellen.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein neues verbessertes Verfahren zum Fixieren enzymatisch aktiver Materialien zu schaffen.

Dabei Ist es Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zum Fixieren enzymatisch aktiver Materialien zu schaffen, das das Inkontaktbrlngen eines polykationhaltigen wässrigen Mediums und eines enzymatisch aktiven Materials mit

einem wasserunlöslichen Polyanion umfaßt,

dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden ein polykationhaltiges wässriges Medium und ein enzymatisch aktives Material mit einem wasserunlöslichen Polyanion mit irgendeiner gewünschten Form in Kontakt gebracht, wodurch das. enzymatisch aktive Material gleichzeitig mit der Bildung eines Filmes in der Nähe der Oberfläche des wasserunlöslichenPolyanions festgelegt oder fixiert wird.

Im Vergleich zu dem bekannten Adsorptionsverfahren besitzt das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die folgenden Vorteile:

Ca) Die Adsorptionsrate für ein enzymatisch aktives Material

wird merklich erhöht,
Cb) Eine fixierte Zubereitung kann mit einer,hohen Ausbeute

und mit guter Reproduzierharkeit erhalten werden. Cc) Wenn ein enzymatisch aktives Material einmal fixiert oder

festgelegt ist, wird es kaum freigesetzt. Cd) Wenn lebende mikroskopisch kleine Zellen fixiert werden,

werden neu wachsende mikroskopisch kleine Zellen ebenfalls fixiert.
Ce) Ein enzymatisch aktives Material kann ohne Beachten der Oberflächenbedingungen des wasserunlöslichen Polyanions fixiert werden.

Cf) Die Lebensdauer der Enzymaktivität wird verlängert. Cg) Dieses Verfahren ist unbeschränkt anwendbar auf eine

breite Vielfalt von enzymatisch aktiven Materialien. Ch) Es werden geringe Schaden für das enzymatisch aktive Material verursacht.

Darüber hinaus besitzt das Verfahren der vorliegenden Erfindung auch die Vorteile, die das bekanniE Adsorptionsverfahren aufweist. Spezieller gesagt, das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise auch gekennzeichnet durch guten

Kontakt zwischen dem Substrat und dem enzymatisch aktiven Material, Einfachheit der Handhabung, geringes Risiko der Verunreinigung mit unerwünschten Mikroorganismen und dergleichen ._

Wenn schließlich das erfindungsgemäße Verfahren mit dem bekannten kovalenten-Bindungs^Verfahren verglichen wird, zeichnet sich das Verfahren gemäß der Erfindung durch geringere. Schädigung des enzymatisch aktiven Materials und durch größere Einfachheit des Ablaufs aus. Im Vergleich mit dem bekannten EinschTießverfahren ist das Verfahren gemäß der vor liegenden Erfindung durch geringeres Freisetzen von enzymatisch aktivem Material, eine längere Lebensdauer der Enzymaktivität und geringeres Risiko der Verunreinigung mit unerwünschten Mikroorganismen während des Fixierungsverfahrens gekennzeichnet.

Es gibt keine besondere Beschränkung für den Typ des PoIykations, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, solange sichergestellt ist, daß es mit einem Polyanion reagieren kann, wie es nachfolgend beschrieben wird, um einen Komplex zu bilden, Beispiele für die.Polykationen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die folgenden Polymere (Polymerisate)»

I) Polymere, die eine quaternäre Ammoniumionengruppe in der Hauptkette enthalten*

Typische Beispiele für derartige Polymere sind: Ca) Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktur einheiten der allgemeinen Formel

R₁ R- R-

I¹ I² φ|³

-CH-CH-N-

wobei R^ und R₃ Wasserstoffatome oder Alkylreste nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind und R₃ und R. Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind,

Cb) Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktureinheiten der allgemeinen Formel

R₁ R₀
il |2

wobei R. ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen ist, R₂ und R₃ Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind und m eine ganze Zahl von 3 oder mehr ist, und

Cc) Homopölymere,Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktureinheiten der allgemeinen Formel

R₁ ^XR. Θ
1 2 χ

wobei R. und R₂ Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen oder Allylreste sind,

II) Polymere, die eine quaternäre Ammoniurasalzgruppe in den Seitenketten enthalten.

Typische Beispiele für derartige Polymere sind;

Ca) Koraopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktureinheiten der allgemeinen Formel

?1

-CH₂-C-

33152Ό1

R₉ R-

I² I³

-O- CH-CH^-

-(CH.

J⁴
•N-R_r

wobei R

R₂ und

Wasserstoffatome oder Methylreste

sind, R₄ und R₅ Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind, Rg. ein Alkylrest mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen, ein Benzylrest, ein Allylrest, ein Alkoxylrest oder eine Carbonamidgruppe ist, m eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist und η eine ganze Zahl von 0 bis 5 istj

ι² f³ V

)-CH"CH-CH-

N-R,

wobei R] ein Wasserstoffatom oder ein Methylrest ist, R₂, R3 und R₄ Wasserstoff atome, Methylreste oder Hydror. xylgruppen sind, R₅ und R_g Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind, R_ ein Alkylrest mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen, ein Allylrest oder ein Alkoxylrest ist und η eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist;

Cc) Somopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktureinheiten der allgemeinen Formel
R,

-CH₂-C-

C = O

N-f-CH. H

2 N-R-

'-.1O-

Rj ein Wasser stoff atom oder ein iiethylrest ist, R₂ und R₃ Al&ylreate mit nicht mehr als 4 Kohlenstoff-* atomen aind, R₄ ein Alkylrest mit nicht mehx als 4 Kohlenstoffatomen oder ein Renzylrest ist und η eine ganze Zahl von 3 Bis 4 ist;

Cd) Horaoplymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit tureinheiten der allgemeinen Formel

R-,

-CHo-C-

⁵N-R, R.

wobei Rj ein Wasserstoffatom oder ein Methylrest ist und R₂ f R₃ und R₄ Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind;

Ce) Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktur·* einheiten mit den allgemeinen Formeln

CH₂-CH-

CH₂	-CH- ι	-R₄

^R2

oder

,θ

wobei Rj , R₂ f R₃ und R₄ Wassers toff atqme oder #ethylreste sind und R ein Alkylrest mit nicht mehr als 5 Kohlenstoffatomen ist; und dergleichen,

IXI) Polymere, die eine Amingruppe oder ein Salz derselben in der Hauptkette enthalten.

Typische Beispiele für derartige Polymere sind;

Ca) Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktureinheiten der allgemeinen Formel

R₁ R₉ R,
,1 ,2 ,3

-CH CH N-

oder ein Salz derselben, wobei. R₁, R₂ und R₃ Wasserstoffatome oder Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind;

oder ein Salz derselben, wobei R ein Alkylrest mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen ist; und dergleichen,

IV) Polymere, die eine Aroingruppe oder ein Salz derselben in' den Seitenketten enthalten.

Typische Beispiele für derartige Polymere sind;

Ca) Homopolymere_f Copolymere und Pfropfpolymere.mit Struktur* einheiten der allgemeinen Formel

- η.

-CH₂-C-R₂-N-R₃

oder ein Salz derselben, wobei R- ein Wasserstoffatom oder ein Methylresrt ist und R₂ und R₃ Wasserstoffatome oder Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind;

Cb) Homopolymere, Copolymere und pfropfpolymere mit Struktur einheiten der allgemeinen Formel

-CHo-C-
ί ι

-eO- CH- CH

oder ein Salz derselben, wobei R-, R- und R₃ Wasserstoffatome oder Methylreste sind, R₄ und R₅ Wasserstoffatome, Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen, Benzylreste, Allylreste oder Alkoxylresie. sind, ni eine ganze Zahl von 1 bis 30 ist und η eine ganze Zahl von O bis 35 ist;

Cc) Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere mit Struktureinheiten der allgemeinen Formel

-CH₂-C-

C=O

NH-f-CH

2 η

oder'ein Salz derselben, wobei R- ein Wasserstoffatom oder ein Methylrest ist, R_ und R₃ Wasserstoffatome, Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen, Benzylreste oder Alkoxylreste sind;

id) Komopolyniere, Copolymere und pfropfpglymere rait Struktur einheiten der allgemeinen Formel

oder ein Salz derselben, wobei R, ein Wasserstoffatom oder ein Methylrest ist und R₂ und R₃ Wasserstoffatome oder Alkylreste mit nicht mehr als 4 Kohlenstoffatomen sind;

(e) Homopolymere, Copolymere unf Pfropfpolymere mit Struktureinheiten mit den allgemeinen Formeln

-CH₉-CH- -CH₇-CH-

2 . L

^R2t1

R₁-N/

-CH₂-CH-
oder

^l

oder ein Salz derselben, woLei R₁, R₂, R₃ und R₄ Wasserstoffatome oder Methylreste sind;

(f) Aminozucker(wie Chitosan) und Salze derselben; und dergleichen*

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung können Polymere, die unter eine der oben angegebenen Kategorien I bis IV fallen, entweder allein oder in Mischung als Polykation verwendet wer^ den. Es ist auch möglich, Polymere zu verwenden, die unter zwei oder mehr der oben angegehenen Kategorien I bis IV fallen.

In den Kategorien I und II ist χ ein Atom oder eine gruppe, die ein Anion bildet. Wenn K^ ein einwertiges Anion

ist, umfassen typisch-e Beispiele dafür Halogenr-Anionen, Nitrat-Anion, Nitrit-rAnion, Schwefelsäuremonoester-Anionen Cwie Monomethylsulfat- und Monoäthylsulfatanionen) , Cyanid-Anion, Formiat^Anion, Acetat-Anion, Propionat-Anion und dergleichen. Wenn andererseits χ ein zweiwertiges Anion ist, umfassen typische Beispiele dafür Sulfat-Anion, Carbonat-Anion, Thiosulfat-Anion und dergleichen. Im Falle eines zweiwertigen Anions wird dieses in einer Menge verwendet, die gleich der Hälfte derjenigen eines einwertigen Anions ist.

Bei den obigen Kategorien III und IV ist ein Salz einer Aminrgruppe ein Salz, das durch Umsetzen einer Gruppe, die von einem primären, sekundären oder tertiären Amin abgeleitet ist, mit einer sauren Substanz gebildet wird, Typischerweise werden anorganische Säuren wie Chlorwasserstoffsäure, Schare feisäure, Salpetersäure usw. und organische Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure usw, als saure Substanz verwendet.

In dem Polykation, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wixd, sind die kationischen Struktureinheiten, die eine guaternäre Aromoniumionengruppe, Amingruppe, ein Salz einer Amingruppe oder dergleichen enthalten, in einer Menge von 1 bis 100 % und vorzugsweise 10 bis 100 %, bezogen auf die gesamten Struktureinheiten des Polykations, vorhanden. Wenn der Anteil der kationischen Struktureinheiten zu klein ist, neigt der durch die Wechselwirkung des Polykations mit dem wasserunlöslichen Polyanion gebildete Komplex zum Aufweisen einer Abnahme in der Festigkeit, Wenn im Gegensatz dazu der Anteil der kationischen Struktureinheiten zu hoch ist, wird das Verfahren unwirtschaftlich«

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete Polykation besitzt üblicherweise ein Molekulargewicht im Bereich von 1000 bis 10 000 000, Wenn das Molekulargewicht zu niedrig ist,

zeigt der gebilaete Komplex eine Ahnahme in der Festigkeit. Wenn andererseits das Molekulargewicht zu hoch ist_f wird die Viskosität des wässrigen Mediums, in dem das Polykation gelöst oder suspendiert ist, so erhöht, daß der Wirkungsgrad der Verarbeitung verschlechtert wird.

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung kann das Polykation in Wasser gelöst werden und als eine wässrige Lösung verwendet werden. Wenn wenigstens ein Teil des Polyfcatlons in Wasser unlöslich Ist, kann es als eine Suspension verwendet werden.

Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete wässrige Medium kann Wasser, eine wässrige Lösung oder eine wässrige Suspension entsprechend dem beabsichtigten Zweck umfassen. Es kann beispielsweise eine Pufferlösung, eine wässrige Lösung des Substrats, ein Kulturmedium und eine wässrige Lösung einer wasserlöslichen organischen Verbindung wie Äthylalkohol und dergleichen als das wässrige Medium je nach Notwendigkeit verwendet werden. Darüber hinaus kann auch, eine wässrige Suspension eines enzymatisch aktiven Materials, das in Wasser unlöslich ist, oder dergleichen als wässriges Medium ent~ sprechend den Erfordernissen verwendet werden. Es wird nicht ausgeschlossen, daß das wässrige Medium weiterhin eine oder mehrere Substanzen enthält, die die praktische Durchführung der Erfindung nicht beeinträchtigen. Wenn ein unter die obige Kategorie I oder II fallendes Polykation zu dem wässrigen Medium hinzugegeben wird, wird der Wasserstoffionen konzentration des wässrigen Mediums keine besondere Beschränkung auferlegt. Wenn jedoch ein Polykation, das unter die obige Kategorie III oder IV fällt und ein Salz einer Aroin·^ gruppe enthält, zu dem wässrigen Medium hinzugegeben wird, wird es bevorzugt,, einen sauren pH zu verwenden, der niedrig ger als 7 ist. Da das wässrige Medium üblicherweise mit einem enzymatisch aktiven Material in Kontakt kommt, wie es nachfolgend beschrieben wird, ist es notwendig, geeignete Bedin^·

gungen auszuwählen Cz, B, Wasserstoff ionenkiDnzentration, den Typ und die Konzentration des gelösten/una des Suspensoids und die Temperatur),. die das enzymatisch aktive Material nicht entaktivieren« Bei der praktischen Durchführung der Erfindung liegt die Konzentration des Polykations in dem wässrigen Medium im allgemeinen In dem Bereich von 0,01 bis 70 Gew.-% und vorzugsweise 0,1 bis 50 Gew.*-%, Wenn die Konzentration zu niedrig ist, wird die Ausbeute der fixierten Zubereitung von enzymatisch aktivem Material verringert. Wenn Im Gegensatz dazu die Konzentration zu hoch ist, wird die Viskosität des wässrigen Mediums so erhöht, daß das Verfahren nicht mehr für die Praxis geeignet ist.

Die enzymatisch aktiven Materialien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Enzyme, Mikroorganismen, Zellfraktionen oder Zellteile und dergleichen. Hierbei besteht keine besondere Beschränkung für den

Typ des verwendeten Enzyms. Typische Beispiele für brauchbare Enzyme werden im folgenden angegeben.

Oxidoreductasen (Oxo-Redoxasen) :

Aminosäureoxldasen, Uricase, Catalase, Xanthinoxidase, GIucoseoxidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glutamatdehydro*

genasen, Cy tochrom-c-roxidase, T.yrosinase,

Mllchsäuredehydrogenase, Peroxidasen, 6-Phosphogluconatdehydrogenase, Malatdehydrogenase und dergleichen.

Transferasen:

Aspartatace ty !transferase, Aspartataminotransf erase _f Aminosäu-r reaminotransferasen, Glycinaminotransferase, Glutaminsäure-Oxaloessigsäure^Aminitransferase (engl,: glutamic^oxaloacetic amlnitransferase), Glutaminsäure-Brenztraubensäure^Aminitransferase (engl,; glutamlc-pyruvic amlnitransferase), Creatine phosphokinase, Hlstaminmethyltransferase, Brenztraubensäure-

esterkinase oder Pyruvatkinase, Fructokinase, Hexokinase, s-^Lysinacety !transferase, Leucinaminopeptidase und derglei^ chen,

Hydrolasen:

Asparaginase, Acetylcholinesterase, Aminoacylase, Arginase,L-Arginin - deiminase, Invertase, Urease, üricase, Urokinase, Esterasen, Kallikrein, Chymotrypsin, Trypsin, Thrombin, Naringinase, Nucleotidasen, Papain, Hyaluronidase, Plasmin, Pectinase, Hesperidinase, Pepsin, Penicillinase, Penicillinamidase, Phospholipase, Phosphatasen, Lactase, Lipase, Ribonucleasen, Rennin und dergleichen..

Lyasen:

Aspartatdecarboxylasen, Aspartase, Citratlyase, Glutamatdecarboxylasen, Histidinammoniak^Lyase, Phenylalaninammoniak-Lyase, Fumarase, Fumarathydrase (oder ^hydratase), Malatsynthetase und dergleichen.

Isomerasen:

Alaninracemase, Glucoseisomerase, Glucosephosphatisomerase, Glutamatracemase, Lactatracemase, Methioninracemase und dergleichen.

Ligasen:

Asparaginsynthetase,Glutathionsynthetase, Glutaminsynthetase, Pyruvatsynthetase, Puruvatsynthetase und dergleichen.

Es besteht keine besondere Beschränkung auf den Typ von Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sofern sichergestellt ist, daß er als Quelle für Enzym dient. Die Mikroorganismen, die bei der vorliegenden Er-

findung verwendet werden können, umfassen z,R, Bakterien, Pilze Cfungi), Schlammschiramel, Lichen Qder Flechten, Algen, Protozoen und andere Mikroorganismen, die Enzyme enthalten, wie sie vorstehend beispielsweise aufgezählt sind. Diese Mikroorganismen können, entweder lebende Zellen oder eine Zubereitung umfassen, die dadurch erhalten worden ist, daß lebende Zellen dem Gefriertrocknen, Gefrieren und Tauen, einer Acetonbehandlung, einer Wärmebehandlung oder dergleichen unterworfen worden sind. Die Zellteile, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Zellwände von mikroskopisch kleinen Zellen, Mitochondrien, Protoplasmakörnchen fMikrosomen) , Organellen (.Zellorgane) , aufgespaltene und lösliche Teile, die Enzyme, wie sie vorstehend angegeben sind, enthalten, und auch Mischungen der vorgenannten Materialien, Das bei der vorliegenden Erfindung verwendete enzymatisch aktive Material kann entweder ein einziges Enzym oder ein komplexes Enzymsystem-umfassen. Darüber hinaus können zwei oder mehr enzymatisch aktive Materialien in Kombination verwendet werden,

Es besteht keine besondere Beschränkung für den Typ dtis wasserunlöslichen Polyanions, das bei der vorliegenden Erfin-r dung verwendet wird, vorausgesetzt, daß es irgendeine gewünschte Form besitzt, die für den beabsichtigten Einsatz der entstehenden fixierten Zubereitung des enzymatisch aktiven Materials geeignet ist, und daß es eine anionische Gruppe enthält, die mit dem oben beschriebenen Polykation reagieren kann, um einen starken Komplex zu bilden. Obgleich das wasserunlösliche Polyanion irgendeine gewünschte Form, die für den beabsichtigen Zweck geeignet ist, besitzen kann, wird es üblicherweise in Form einer festen Masse, eines Hydrogels, einer Suspension, eines festen oder flüssigen Polymeren oder dergleichen benutzt, Damit das wasserunlös^ liehe Polyanion der vorliegenden Erfindung mit dem oben be^ schriebenen Polykation reagieren kann, um einen starken Komlex zu bilden, muß es eine anionische Gruppe enthalten, die

z.a. eine Carhonsäuregruppe oder ein Salz derselhen, eine Sulfonsäuregruppe oder ein Salz derselhen, eine Schwefelsäureestergruppe oder ein Salz derselben oder eine Phosphorsäureestergruppe oder ein Salz derselben sein kann. Im folgenden werden spezifische Beispiele für brauchbare Polyanionen angegeben.

Ca) Polymere, die eine Carbonsäuregruppe oder ein Salz der*- selben enthalten.

Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere, die als ein Monomer eine Carbonsäure (.wie z,B. Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäure, Fumar - säure, Itaconsäure usw.) oder ein Salz derselben enthalten, und auch Carboxyl enthaltende Polysaccharide Cwie z.B. Alginsäure, Pectin, Carboxymethylcellulose usw.) und Salze derselben.

(b) Polymere, die eine Sulfonsäuregruppe oder ein Salz derselben enthalten,

Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere _f die als ein Monomer eine Sulfonsäure Cwie z,B. 2-Acrylamido-^2-methylpropansulfonsäure, 2-Acrylamidoäthansulfonsäure, 2~Methacrylamidoäthansulfonsäure, Vinylsulfonsäure, Allylsulfonsäure, Styrolsulfonsäure usw.) oder ein Salz derselben enthalten.

Cc) Polymere, die eine Schwefelsäureestergruppe oder ein Salz derselben enthalten,

Schwefelsäureesterverhindungen Cwie z,B. Carrageenan, Furcellan, Agar, Cellulosesulfat, Stärkesulfat, sulfatierte Stärke, sulfatierterPolyvinylalkohol usw.) und Salze derselben.

(.d) Polymere/ die eine Phoaphoraäureegtergruppe oder ein Salz derselben enthalten.

Homopolymere, Copolymere und Pfropfpolymere, die als ein Monomer einen Phosphorsäureester (wie z,B, saures Phos^ phoxyäthylmethacrylat, saures Phosphoxypropylacrylat, saures Phosphoxypropylmethacrylat usvr») oder ein Salz derselben oder phosphatieren Polyvinylalkohol, Stärkephosphat und Salze derselben enthalten.

Bei der praktischen Durchführung der Erfindung kann spielsweise eine wasserunlösliche oder für Wasser unlöslich gemachte Form von Polymeren, wie sie oben beschrieben sind, als wasserunlösliches Polyanion der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Für diesen Zweck können derartige Polymere allein oder in Mischung verwendet werden. Der Ausdruck "wasserunlösliches Polyanion", wie er hier verwendet wird, bezeichnet wasserunlösliche Polyanionen, die z,B» durch Vernetzen eines Polymeren, wie es oben beschrieben ist, nach einem herkömmlichen Verfahren erhalten worden ist, um sie in Wasser unlöslich zu machen, wasserunlösliche Polyanionen, die bei der praktischen Durchführung der Erfindung durch Halten eines Polymeren, wie es oben beschrieben ist, oder einer wässrigen Lösung derselben bei einer Temperatur/ die niedriger als ihr Verfestigungspunkt ist, erhalten worden sind, und dergleichen.

In dem oben beschriebenen wasserunlöslichen Polyanion ist die anionische funktioneile Gruppe im allgemeinen in einer Menge von 1 bis 70 Gew.-% und vorzugsweise 5 bis 60 Gew,-% vorhanden..

Wie bereits gesagt wurde, kann das wasserunlösliche PoIy^- anion der vorliegenden Erfindung entweder in fester oüer in flüssiger Form verwendet werden. Spezifische Beispiele für wasserunlösliche Polyanionen in fester Form umfassen ein

Hydrogel mit einem Wassergehalt\von z,B. nicht weniger 300 Gew,-■%, eine feste Masse mit einem Wassergehalt von weniger als 100 Gew.-% üild dergleichen. Wasserunlösliche Polyanionen in fester Form können nach dem Verfahren der Vernetzung durch ionische Bindungen hergestellt werden (beispielsweise indem ein wasserlösliches Salz von Alginsäure mit einer wässrigen Lösung wie einer wässrigen Lösung von Kalziumchlorid, die Gelierung des Salzes bewirken kann_f in Kontakt gebracht wird) oder sie können nach dem Verfahren der Vernetzung durch kovalente Bindungen mittels Radikalreaktion, Kondensationsreaktion oder dergleichen hergestellt werden (z.B. durch Mischen von Acrylsäure mit einem radikal- oder restevernetzenden Mittel und anschließendes unterwerfen der Mischung der Radlkal^Polymerisatlon),. Dies soll so verstanden werden, daß wasserunlösliche Polyanionen, die durch Einführen einer anionischen Gruppe in vernetzte Polymere erhalten worden sind Cz,BY wasserlösliche Polyanionen, die durch Einführen der Sulfonsäuregruppe in von Styrol^divinylbenzol oder Phe·^ nol-rFormaldehyd hergestellte vernetzte Polymere erhalten worden sind), auch bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, Weitere praktisch durchführbare Verfahren zum Erhalten von wasserunlöslichen Pplyanionen in fester Form sind ζ,Β, /ς-«-Carrageenan auf eine Temperatur abzukühlen, die niedriger als Ihr Verfestigungspunkt ist, ein Polyäthylenharz, in das die Sulfonsäuregruppe eingeführt worden ist, auf einer Temperatur zu halten, die niedriger als ihr Verfestigungspunkt Ist, und dergleichen.

Wenn ein wasserunlösliches Polyanion in fester Form bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ihm entsprechend dem beabsichtigten Zweck irgendeine gewünschte Form verliehen werden. Es kann beispielsweise ein granuläres wasserunlöslt·? chas Polyanion hergestellt werden, in dem ein wasserlösli*- ches Salz von Alginsäure tropfenweise zu einer Gelierungs*- lösung dafür hinzugegeben wird» Weiterhin kann ein blattar-^ tiges, folienartiges oder filmartiges wasserunlösliches Poly-

anion hergestellt werden, indem eine Mischung von Acrylsäure und einem Radikale oder Reste vernetzenden Mittel auf einer flachen Schale ausgebreitet wird und dann die Mischung polymerisiert wird. So kann entsprechend dem Beabsichtigten Zweck das wasserunlösliche Polyanion der vorliegenden Erfindung z,B_t zu Folien, Filmen, Granulat _r Fasern, Rohren, hohlen Fasern, Netzen und dergleichen ausgeformt werden.

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung kann das wasserunlösliche Polyanion auch in Form einer Suspension verwendet werden.Solch eine Suspension kann z.B. hergestellt werden, Indem eine wasserunlösliche Form eines **"" festen oder flüssigen Polymeren, wie es oben beschrieben wurde,, in Wasser suspendiert wird oder indem es in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelöst oder suspendiert und dann die entstehende Lösung oder Suspension in Wasser suspendiert wird«

Zum Festlegen oder Fixieren eines enzymatisch aktiven Materials nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das enzymatisch aktive Material mit einem wasserunlöslichen Polyanion in Kontakt gebracht. Wenn das wasserunlösliche Polyanion in fester Form verwendet wird, kann das enzymatisch aktive Material mit den Oberflächen des wasserunlöslichen Polyanions in Kontakt gebracht werden« Wenn das wasserunlösliche PoIyanion in flüssiger Phase vorliegt, kann das enzymatisch aktive Material in der flüssigen Phase suspendiert werden. Alternativ dazu kann eine Lösung oder Suspension des enzymatisch aktiven Materials in Wasser oder eine wässrige Lösung mit dem wasserunlöslichen Polyanion in Kontakt gebracht werden. Nach diesem Verfahrensschritt wird das wasserunlösliche Polyanion in Kontakt mit dem enzymatisch aktiven Material mit einem polykationhaltigen wässrigen Medium in Kontakt gebracht, um das Fixierungsverfahren fertigzustellen. In einer anderen Ausführungsform kann das Fixierungsverfahren In einem^Ver^ahrensschrltt durchgeführt werden, indem das enzymatisch aktive

Material in einem polykationhaltlgen wässrigen Medium gelöst oder suspendiert und die entstehende Lösung oder Suspension mit dem wasserunlöslichen Polyanion in Kontakt gebracht wird. Dies soll so verstanden werden _t daß während des vorstehend beschriebenen Fixierungsverfahrens eine oder mehrere Substanzen, die die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht beeinträchtigen, in dem enzymatisch aktiven Material, der wässrigen Lösung oder der Suspension derselben und in dem polykationhaltigen :*. wässrigen Medium vorhanden sein können.

Es besteht keine besondere Beschränkung für die Art, in der das enzymatisch aktive Material mit dem wasserunlöslichen Polyanion in Kontakt gebracht wird, vorausgesetzt, daß sie sich, im wesentlichen Kontaktieren können. So kann das enzymatisch aktive Material z.B. auf das wasserunlösliche Poly-' anion gesprüht werden« In der Ausführungsform, bei der eine Lösung oder eine Suspension des enzymatisch aktiven Materials in Wasser oder eine wässrige Lösung und das polykationhaltige wässrige Medium mit dem wasserunlöslichen Polyanion in Kontakt gebracht werden, ist es vorzuziehen, das wasserunlösliche Polyanion in das polykationhaltige wässrige Medium einzutauchen oder darin zu suspendieren. Bei der oben beschriebenen Reaktion werden das wasserunlösliche Polyanion und das polykationhaltige wässrige Medium in solchen Anteilen verwendet, daß das Verhältnis der Äquivalente der kationischen Gruppe des letzteren zu den Äquivalenten der anionischen Gruppe des ersteren im Bereich von 0,01 bis 100 und vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 10 liegt. Wenn die Menge der kationischen Gruppe zu klein ist, härtet das Gel nicht bis zu einem vollständigen Grad aus. Wenn im Gegensatz dazu die Menge der kat.ionisch.en Gruppe zu groß Ist_f wird das Verfahren unwirt-r schaftlich.,

Die oben beschriebene Kontaktreaktion wird bei einer Temperatur Im Bereich von -20 bis 100 C und vorzugsweise Im Bereich von 0 bis 80°C durchgeführt. Bei der praktischen Durch-

führung der Erfindung kann der pH desr Wassers _r der wässri·*- gen Lösung oder, des wässrigen Mediums-/ das zum Lösen oder Suspendieren des enzymatisch, aktiven Materials verwendet wird in Abhängigkeit von der Natur des enzymatisch aktiven Materials in weitem Maße variieren. Er liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von ί bis 12 und vorzugsweise im Bereich von 2 bis 9,

Gemäß dem vorliegenden Verfahren zum Fixieren von enzymatisch aktiven Materialien kann die fixierte Zubereitung von enzymatisch aktivem Material, die aus der oben beschriebenen Reaktion herrührt, weiterhin mit einem wässrigen Medium,das

ein Polyanion, und, wenn es gewünscht wird,,das enzymatisch ^J H_n Kontakt gebracht werden ^J

aktive Material enthält', wodurch eine neue fixierte Z übereitung von enzymatisch aktivem Material erhalten wird. Insbesondere kann ein enzymatisch aktives Material in Schichten fixiert werden, indem ein polyanionhaltiges wässriges Medium und ein polykationhaltiges wässriges Medium abwechselnd verwendet werden.

Die fixierte Zubereitung von enzymatisch aktivem Material, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, kann stabil gelagert werden, indem sie mit einer Pufferlösung, wenn es notwendig ist, gewaschen wird und bei einer Tempe:

Temperatur im Bereich von -20⁰C bis Raumtemperatur gehalten

Da die fixierte Zubereitung von enzymatisch aktivem Material, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wird, in Wasser unlöslich ist, kann die enzymatische Reaktion kontinuierlich über eine lange Zeitdauer durchgeführt werden, indem sie in eine Kolonne gepackt wird und eine Lösung des Substrats hindurchgeleitet wird. Die gleiche enzyraatische Reaktion kann auch wiederholt durch chargenweisen Einsatz durchgeführt werden,. Da weiterhin das Verfahren der voliegenden Erfindung gestattet, daß die Oberfläche einer Elektrode mit einem

Film aus einem enzymatisch wirksamen Material he5ch4.ch.tet wird, und dazu dient, ein enzymatisch aktives .Material auf der äußeren oder inneren Oberfläche eines rohrförmigen Körpers festzulegen, bietet sich hierdurch eine praktische Anwendung auf dem Gebiet der Enzymelektroden, der medizinischen Analysatqren und künstlichen Organe an. Außerdem kann die fixierte Zubereitung aus enzymatisch aktivem Material, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten worden ist, auf dem Gebiet der Fermentation eingesetzt werden, um kontinuierliche und wirksame Fermentationsreaktionen zu erleichtern. Das Verfahren ist auf verschiedene Typen der Fermentation anwendbar, Wenn beispielsweise Aufschäumen beteiligt ist,, kann es sowohl in einer Wirbelschicht-Fermentiereinrichtung als auch in einer Festbett-Fermentiereinrichtung verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. Diese Beispiele sollen jedoch nicht den Umfang der Erflnung beschränken,

Beispiel 1

Es wurde eine Lösung hergestellt, indem 2 g PolyCvinylbenzyltrimethylammoniumchlorid) in 100 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst wurden, Nachdem diese Lösung durch Dampf bei 120 C 15 min, lang sterilisiert worden war, wurden 50 Platinösen voll von J.B.A, (Japan Brewer's Association) No.6 Hefe hinzugegeben und darin suspendiert.

Andererseits wurde eine Lösung hergestellt, indem 10 g Natrium 2-Acrylami.do-2-methylpropansulfQnat und 1 g Ν,Ν'τ-Methylenbisacrylamid in 89 g Wasser gelöst wurden und Stickstoff eine Stunde lang hei 5⁰C hindurchperlen gelassen wurde. Zu dieser Lösung wurden J ml einer 0,05 % wässrigen Lösung Ammoniumpersulfat und 0,04 ml N,N,N'_fN'-Tetramethyläthylendiamin hinzugegeben, Nachdem Stickstoff durch die wässrige

Lösung 30 Minuten hindurchperlen gelassen worden war_f wurde eine Polymerisationarreaktion hei 30 C 30 Minuten lang und dann eine Stunde lang bei 70⁰C durchgeführt. 10 g des erhaltenen Polymeren in Form eines Hydrogels wurde in Würfel von 3 mm Kantenlänge geschnitten und dann 15 Minuten hei 120°C sterilisiert.

Dann wurden diese Hydrogelwürfel aseptisch zu der vorgenannten Hefesuspension in der PolyCvinylbenzyltrimethylammoniumchlorid)-Lösung hinzugegeben und in diese eingetaucht, die hei 20°C eine Stunde lang gehalten wurde. Am Ende dieser Zeitdauer wurde die Hefesuspension abgetrennt, und die Hydrogelwürfel wurden zweimal mit vorher sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Danach wurden sie in 100 ml eines Kulturmediums für Hefe, das bei 120⁰C sterilisiert worden war, hinzugegeben und eingetaucht. Dieses Kulturmedium enthielt 10 % Glucose, Ό,15 % Hefeextrakt/ 0,25 % Ammoniurachlorid 0,1 % Natriumchlorid, 0,55 % Dikaliumphosphat, 0,01 % Magnesiumsulfat, 0,001 % Kalziumchlorid und 0,3 % Zitronensäure, Nachdem seine Temperatur 40 Stunden lang auf 30°C gehalten worden war, besaß das Kulturmedium eine Äthanolkonzentration von 2,5 %, Darüber hinaus wurden Hefekolonien in der Nähe der Oberflächen der Hydrogelwürfel beobachtet.

Beispiel 2

Es wurde eine Lösung hergestellt, indem 2 g Natriumalginat -(hergestellt und vertrieben von Kamogawa Kasei Co, unter dem Handelsnamen "Duck Algin NSPM") in 98 g Kasser gelöst wurden, Nachdem diese Lösung bei 120 C 15 Minuten lang sterilisiert worden war,, wurde sie aseptisch tropfenweise zu einer 5 % wässrigen Lösung Kalziumchlorid hinzugegehen, die 15 Minuten lang hei 120°C sterilisiert worden war_f so daß granuläres Kalziumalginatgel erhalten wurde. Dieses Gel de aseptisch in eine mit Mantel versehene Glaskolonne mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Höhe von 10 cm gepackt.

Andererseits wurde ein Nährmedium, das- 0,5 % Glucose, 3,25 % Hefeextrakt, 1,0 % Pepton, 0,5 % Fleischextrakt und 0,5 % Natriumchlorid enthielt (pH 7,0), mit Serratia marcescens geimpft und dann Iff Stunden lang bei 30°C geschüttelt. In 500 ml des entstandenen Kulturmediums mit mikroskopisch kleinen Zellen, die darin suspendiert waren, wurden 1,0g Polyamin-Sulfon (hergestellt und vertrieben von Toyobo Co. unter dem Handelsnamen "PAS-H<-40") gelöst, das vorher 15 Minuten lang bei 120°C sterilisiert worden war.

Diese Lösung wurde von dem Boden durch die beschriebene Kolonne mit einer Durchflußrate von 8 ml/Stunde geleitet, wobei die innere Temperatur der Kolonne auf 30 C gehalten wurde. Nach 24 Stunden wurde der Durchgang der Lösung beendet, Andererseits wurden 2 % "PAS-H-40" in einem frischen Medium gelöst, das die gleiche Zusammensetzung wie oben beschrieben besaß, jedoch keine mikroskopisch .kleinen Zellen enthielt. Diese Lösung wurde 15 Minuten lang bei 120°C sterilisiert und dann mit einer Durchflußrate von 8 ml/Stunde durch die Kolonne geleitet, wo bei die innere Temperatur der Kolonne auf 30⁰C gehalten wurde. Nach 60 Stunden besaß der Auslauf, der aus dem Auslaß der Kolonne austrat, eine Isoleucinkonzentration von 2,3 mg/ml. Darüber hinaus wurden Kolonien sowohl in der Nähe, der Oberflächen des Gels als auch im Inneren des Gels beobachtet.

Beispiel 3

Es wurde eine Lösung hergestellt, indem 4 g K--"Carrageenan (hergestellt und vertrieben von Sansho Co, unter dem Handels-?· namen "Genüge1-WG") in 96 g Wasser gelöst wurden. Nachdem diese Lösung 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert worden war, wurde sie auf 50 C gehalten und aseptisch tropfenweise zu einer 5% wässrigen Losung von Kalziumchlorid (bei 2Q°C) hinzugegeben, die 15 Minuten bei 120⁰C sterilisiert worden war, so daß granuläres Kalziumalginatgel erhalten wurde. Dieses Gel wurde

ageptisch. in eine ummantelte GlasJcolonne mit einem Durchmesser von 2 cm und einer Höhe von JO cm gepackt.

Andererseits wurde ein Kulturmedium, in dem Serratia marcescens suspendiert enthalten war, auf die gleiche Weise, wie es in Beispiel 2 beschrieben iart, hergestellt. In 500 ml des entstandenen Kulturmediums wurden 20 g PolyC4«vinyl-1·^ methylpyridiniumchlorid) gelöst, das vorher 15 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert worden war*

Diese Lösung wurde durch, die vorgenannte Kolonne von dem Boden aus mit einer Durchflußrate von 8 ml/Stunde hindurchgeleitet, wobei die innere Temperatur auf 30°C gehalten wurde. Nach 24 Stunden wurde der Durchgang der Lösung beendet. Andererseits wurden 4 % Poly (A-vinyl-1-methylpyridiniumchlorid) in einem frischen Medium gelöst, das die gleiche Zusammensetzung besaß, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, jedoch, keine mikroskopisch kleinen Zellen enthielt. Diese Lösung wurde 15 Minuten bei 120°C sterilisiert und dann mit einer Druchströmrate von 8 ml/Stunde durch die Kolonne geleitet, deren innere Temperatur auf 30°C gehalten wurde. Nach 60 Stunden besaß der Auslauf, der aus dem Auslaß der Kolonne austrat, eine Isoleucinkonzentration von 2,0 mg/ml. Danach, wurde ein frisches Medium _f das die gleiche Zusammensetzung wie in Beispiel 2 beschrieben, besaß, jedoch kein Polykation enthielt, durch, die Kolonne hindurchgeleitet. Nach 60 Stunden besaß der Auslauf, der aus dem Auslaß der Kolonne austrat, eine Isoleucinkonzentration von 2,5 mg/ml.

Claims

Patentansprüche

1, Verfahren zum Fixieren enzymatisch, aktiver Materialien, dadurch. gekennzeichnet, daß ein polykationhaltiges wässriges Medium und ein enzymatisch aktives Material mit einem wasserunlöslichen Polyanion
in Kontakt gebracht werden, wodurch das enzymatisch aktive Material an das wasserunlösliche Polyanion fixiert wird.

2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e *-

kennzeich.net , daß das Polykation wenigstens 1 Polymer- umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist,

bestehend aus Polymeren,, die eine quaternäre Ammonium·«-
/in der^Hauptkette ^

lonengruppel enthalten, Polymeren, die eine quaternäre
Ammoniumsalzgruppe in den Seitenketten enthalten,, PoIy^ meren, die eine Amingruppe oder ein Salz derselben in der

Hauptkette enthalten,und Polymeren_p die eine Amingruppe qder ein S"alz derselben in den Seitenketten enthalten,

3» Verfahren nach. Anspruch 3, dadurch. g e -

kennzeichnet , daß das enzymatisch aktive Material ein Glied umfaßt, das aus der Gruppe, bestechend aus Enzymen, Mikroorganismen und Zellfraktionen oder Zellteilen, ausgewählt ist,

4, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserunlösliche Polyanion wenigstens 1 Polymer umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polymeren, die eine Carbonsäuregruppe oder ein Salz derselben enthalten, Polymeren, die eine Sulfonsäuregruppe oder ein Salz derselben enthalten, Polymeren, die eine Schwefelsäureestergruppe oder ein Salz derselben enthaltn und Polymeren,, die eine Phosphorsäureestergruppe oder ein Salz derselben enthalten,

5, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß. das wasserunlösliche Polyanion und das polykationhaltige wässrige Medium

in solchen Anteilen verwendet werden, daß das Verhält-

v nis der Äquivalente der kationischen Gruppe zu den Äqui

valenten der anionischen Gruppe in dem Bereich von 0,01 bis 100 liegt,

6, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Temperatur, bei der das polykationhaltige wässrige Medium und das enzyma·? tisch aktive Material mit dem wasserunlöslichen Polyanion in Kontakt gebracht werden, in dem Rereich. von ^-2Q bis 100⁰C liegt.