DD210302A5

DD210302A5 - Verfahren zur immobilisierung des cyclodextringlycosyltransferaseenzyms

Info

Publication number: DD210302A5
Application number: DD83254163A
Authority: DD
Inventors: Laszlo Boross; Ivan Daroczi; Katalin Ivony; Gabor Seres; Bela Szajani; Jozsef Szejtli
Original assignee: Reanal Finomvegyszergyar
Priority date: 1982-08-24
Filing date: 1983-08-23
Publication date: 1984-06-06
Also published as: JPS5995888A; HU187152B; DE3330571A1; FR2544331A1; FR2542010A1; FR2542010B1; FR2544331B1; US4593004A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des Cyclodextringlycocyltransferaseenzyms. Die Immobilisierung kann nach zwei Verfahren durchgefuehrt werden.Bei den einen Verfahren wird das Cyclodextringlycosyltransferaseenzym mit einer geloesten Carbodiimidverbindung aktiviert u. das so behandelte Enzym in einer Loesung mit einem pH-Wert von 4,5 bis 8,5 auf ein mindestens 0,1mAequv./g freie Aminogruppen enthaltendes Polysaccharidderivat aufgebracht. Nach dem anderen Verfahren wird das Enzym in einer Loesung mit einem pH-Wert von 4,5 bis 8,5 an ein mindestens 0,1mAequv./g funktionelle Carboxygruppen enthaltendes Polymer gebunden,danach mit einer geloesten Carbodiimidverbindung aktiviert, woraufhin das erhaltene Produkt gewaschen und gegebenenfalls getrocknet wird. Der Vorteil des erfindungsgemaessen Verfahrens besteht darin, dass das immobilisierteEnzym - im Gegensatz zum freien Enzym - zur dauerhaften Anwendung geeignet ist und deshalb auch im kontinuierlichen Betrieb eingesetzt werden kann.

Description

Dia Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierungdes.Cyclodextringlycosyltransferaseenzyms.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen·.

Bei der Behandlung von partiell hydrolisierter Stärke mit einem Cyclodextringlycosyltransf eras.eenzym-( nachfolgend kurz CGTase genannt) entstehen aus 6, 7 oder 8 Glucopyranoseeinneiten gebildete Molekülenringe (die sogenannten Cyclodextrine, und zwar U/- > S- und . f-Cyclodextrin), die zum Einschließen von Molekülen anderer Verbindungen fähig sind.. Dieser Vorgang kann zur Verbesserung der Eigenschaften von bestimmten empfindlichen, flüchtigen, leicht oxydierenden oder schwer löslichen Substanzen verwendet werden.

in untMnOO

-Z-

.Mirtels eines gelösten CG ι ase-Enzyins kann nur ein diskontinuierliches Verfahren verwirklicht werden. Bei der kontinuierlichen Arbeitsweise wird das Enzym zweckmäßig an einem festen Träger immobilisiert. Ein derartiges Verfahren ist in "Biotechnol.-Bioeng." 19_, 87 (1977) beschrieben. Nach dieser Literaturstelle kann eine sukcinierte Form des CgTase-Enzyms an einem Vinylpyridinkopolymer Anionenaustauscher durch ionische Sindungen immobilisiert' werden*Obwohl bei dieser Methode die vorherige Sukcinierung die Stärke der ionischen Bindungen erhöht, muß mit einer allmählichen Desorption des Enzyms gerechnet werden» Die Desorption kann vermieden werden, indem man das Enzym durch kovalente Bindungen an den. Träger bindet. In diesem Fall entsteht ein neuer, die kataIytische Aktivität des Enzyms aufrechterhaltender _# gegenüber den Reaktionsbedingungen weniger empfindlicher fester Katalysator.

Ziel der Erfindung: . ."

Ziel .der Erfindung ist die Bereitstellung.eines verbesserten Verfahrens zur Immobilisierung des Cyclodextrin ringlycosy1 transferaseenzyms»

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein immobilisiertes CGTase^E_nzym herzustellen, das an einen festen Träger durch kovalente Bindungen gebunden ist.

Hierbei soll ein solches immobilisiertes CGTase-Enzympräparat hergestellt werden, das zur dauerhaften Anwendung geeignet ist und das Enzym an einen Träger gebunden enthält,, der chemisch relativ beständig oder inert ist und der der Einwirkung von Mikroorganismen; sehr stark

oder unbegrenzt widersteht. Ferner soll der Träger über günstige mechanische Eigenschaften verfügen und eine große Durchströmungsgeschwindigkeit gewährleisten. Eine weitere Forderung besteht darin, daß das Enzym unter milden Reaktionsbedingungen an den Träger gebunden werden soll«

Es wurde gefunden, daß die folgenden Substanzen den obigen Forderungen vollständig entsprechen:

A) eine primäre Aminogruppe enthaltende Polysaccharidderivate, welche mindestens 0,1 mAequv./g - zweckmäßig 1-2 mAequv./g - funktioneile NH₂-Gruppen enthalten und

B) aus Acrylsäure und/oder Methacrylsäure und Acrylamid und/oder-Methacrylamid Monomeren unter Anwendung eines Vernetzungsmittels des Acryl- oder Allyl-Typs (ζτ8. N ,N'-Methylen-bis-acrylamid, Äthylendiacrylat oder N,N'-Oiallyl-weinsäureamid) gebildete, mindestens 0,1 mAequv./g -·- zweckmäßig.;2-8 mAequv./g -· furiktidöelle.,. COOH-Gruppen enthaltende Polymere.

Die obigen Träger können nach an sich bekannten Verfahren hergestellt werden.

im Falle der primären Aminogruppen enthaltenden PoIysaccharidträger werden die Carboxylgruppen der einzelnen Asparagyl- oder Glutamyl-Seitenketten des Enzyms. durch Behandlung mit Carbodiimid in Q-Acyl-isoharnstoff-Derivate überführt, welche mit den am Träger angeordneten Aminogruppen reagieren. Bei der Anwendung von funktionelle Carboxygruppen enthaltenden polymeren Trägern werden die Carboxygruppen in an sich bekannter Weise mit Carbodiimid aktiviert und so zur 3indung des CGTase-

-Enzyms fähig gemacht. Die Anwendung der Carbodiimide als Aktivierungsmittel ist mit dem Vorteil verbunden, daß die Aktivierungsreaktion unter milden Bedingungen (0 - 4⁰C, pH = 6,0-8,0) durchgeführt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Immobilisierung des Cyclodextringlycosyltransferaseenzyms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) das Cyclodextringlycosyltransferaseenzym mit einer wasserlöslichen oder bei einer Temperatur unter O⁰C in organischen Lösungsmitteln löslichen Carbodiimidverbindung aktiviert, danach das so behandelte Enzym in einer Lösung mit einem pH-Wert von 4,5-8,5 auf mindestens 0,1 iisAequv./g NH^-Gruppen enthaltende Polys ccharidderivate aufbringt und das Produkt wäscht und schließlich gegebenenfalls trocknet oder

b) zunächst ein 'mindestens 0,1 mAequv./g funktionelle-Carboxylgruppen aufweisendes Polymer, welches aus den Monomeren Acrylsäure und/oder Methacrylsäure und Acrylamid und/oder Methacrylamid unter Einwirkung eines Vernetzungsmittels des Acryl- oder Allyltyps hergestellt worden ist, als Träger mit einer wasserlöslichen oder bei einer Temperatur unter O⁰C in organischen Lösungsmitteln löslichen Carbodiijnidverbindung aktiviert und danach das Cyclodextringlycosyltransfereaseenzyni in einer Lösung mit einem pH-Wert von 4,5 bis 8,5 auf das so aktivierte Polymer aufbringt und abschließend das Produkt wäscht und gegebenenfalls trocknet.

Als Polymer können besonders vorteilhaft die Arainopropylderivate von Zellulose und Dextranen (Zellulose A bzw. MolselectA) und die Äcrylamid-N,N'-methylen-bis-acrylaraid-acrylsäure-Copolymere (Akrilex C) eingesetzt werden,

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann als Enzym ein beliebiges nach irgendwelcher Methode isoliertes CGTase- -Enzyra beliebigen Ursprungs Verwendung finden.

Als aktivierende Carbodiiraidverbindung kann z.B. N-Cyclohexyl-N'-^~2-(4-morpholinyl)-äthyl7-carbodiiraid-methyl-p- -toluolsulfonat oder N-Äthyl-N-(3-diraethylaminopropyl)-carbodiimid-hydrochlorid Verwendung finden. Als Carbodiiraidverbindung können vorteilhaft wasserlösliche Substanzen eingesetzt werden. Aus den nur i,n organischen Lösungsmitteln löslichen Carbodiimidverbindungen können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die ira angegebenen organischen Lösungsmittel kalt (d.h. bei einer Temperatur unter O⁰C) löslichen Substanzen verwendet werden.

Das CGTäse-Enzym/ bzw·, dessen O-Acyl-isohä rristof f-Derivat wird auf den Träger in einer Lösung mit einem pH-Wert . von 4,5-8,5 - vorzugsweise 5,5 - aufgebracht.. Als Reaktionsmedium kann zweckmäßig eine Natriumacetatpufferlösung (pH 5,5) dienen.

Die durch die:Kupplungsreaktion gebildeten immobilisierenden Enzympräparate werden in an sich bekannter Weise gewaschen und gewünschtenfalls getrocknet. Die Enzyrnpräparate können jedoch auch in wäßriger Suspension, bei .0-4⁰C gelagert oder aufbewahrt werden.

Ois Aktivität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immibilisierenden Enzympräparate beträgt 13-450.Kitahata Einheiten/g Xarogel, was vom Standpunkt

der praktischen Anwendbarkeit betrachtet als sehr günstig angesehen werden kann. (Eine solche Einheit entspricht einer Enzymmenge, welche bei 40⁰C per Minute eine lineare Transraissionserhöhung von 1 % bewirkt.)

Das nach dem erfindungsgetnaßen Verfahren an einem Acrylamid-N ,N'-methylen-bis-acrylamid-acrylsäure-Copolymer (Akrilex C) immobilisierte CGTase-Enzym zeigt in einem schwach sauren Medium, d.h. bei dem optimalen pH-Wert der Anwendung,. (pH 5,5), eine höhere Stabilität als das gelöste Enzyra. Dieser Vorteil ist besonders bei einer dauerhaften Anwendung von großer Wichtigkeit.

Au s füh run as be is p ie le :

Weitere Einzelheiten der Erfindung sind' den nachstehenden Beispielen zu entnehmen ohne den Schutzumfang auf diese Seispiele zu bescfarärike-n.

Beispiel 1

Einem Träger des Zellulose A Typs /_ 3 g; Trockensubstanzgehalt 17%; Bindungskapazität - NH^-Gehalt - 1,86 mAequv./ g/ werden 55 ml einer salzfreien CGTase-Lösung mit einem Proteingehalt von 9,9 mg/ml zugegeben. Zur Auflösung und Dialyse, des Enzyms wird ein 0,05 molarer Natriumacetatpuffer verwendet (pH 5,5)-. Die Mischung wird auf einem eiskalten Wasserbad 10 Minuten lang gerührt , wonach eine. Lösung von 1 g N-Cyclohexyl-N'-_</~2-(-morpholinyl)-äthyl/-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat in 20 ml eines kalten ( + 4 C) Puffers zugefügt wird. Die Reaktion wird bei O bis 4⁰C 48 Stunden lang durchgeführt, hierbei wird das Reaktionsgemisch zweimal 5 Stunden lang gerührt. Die feste Phase wird durch Filtrieren getrennt und dreimal mit jeweils 60 ml eines Natriumaoetatpuffers (py 6,5) dreimal

mit jeweils SO ml eines 0,05 molaren, 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden Natriumacetatpuffers (pH 6,5) und dreimal mit jeweils 50 ml eines 0,05 molaren Matriumacetatpuffers (pH 6,5) gewaschen. Die Substanz wird schließlich dreimal mit jeweils 120 ml destil-. liertetn Wasser salzfrei gewaschen, filtriert, in 40 ml.aeines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,5) aufgenommen und im Kühlschrank aufbewahrt (+ 4⁰C). Ausbeute: 758 mg (auf die Trockensubatnz bezogen) immobilisertes" CGTäse'-Enzymi Aktivität: 26,5 Kitahata Einheiten/¹ g Trockensubstanz. '

Seispiel 2

Einem Träger· des Molselect A Typs ;(1,5'·. g ; TrockerrsiiftV·'-.·. stanzgehalt 33 %; 8indungskapazität - iNlHg-Geh'alt -' 1,27 mAequv./g) werden 55 ml. einer salzfreien CGTase-Lösung mit einem Proteingehalt von 9,9 mg/ml zugegeben., Zur Auflösung und Dialyse,: des Enzyms wird ein 0,05;: molarer'"Nätriüraacs'tatpüffer (pH 6/5) verwendet» Nach 1 Q-a:in ü ti gern·'*' Rü h'-r&rr""' a ü f^;i' einem* eis 'ka-JL-t a-n^!""W^_;&©eTb^d^;'' wird der Suspension eine Lösung von 0,5 g N-Cyclohexyl- -N'-^/ 2-(4-morpholinyl)-äthyl7-carbodiimid-methyl-ptoluolsulfonat in 5 ml eines kalten (*4 C) 0,05 molaren Natriuraacetatpuffers (pH 6,5) zugefügt. Die Reaktionszeit beträgt 48 Stunden bei 0-4⁰C; hierbei vyird die % . Suspension zweimal 6 Stunden lang gerührt. Das Gel wird durch Filtrieren entfernt, nacheinander dreimal mit jeweils 60 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers·' (pH 6,5)', dreimal mit jeweils SO ml eines 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden, 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,5) und dreimal mit jeweils 60 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 5,5) gewaschen. Das Gel wird schließlich zweimal mit jeweils 120 ml Wasser_: salzfrei gewaschen, filtriert, in 40 ml eines

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Ό,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,5) aufgenommen und in Kühlschrank bei +4⁰C aufbewahrt. Ausbeute: 861 "g (auf die Trockensubstanz bezogen) immobilisiertes CGTase-Enzym. Aktivität: 13,5 Kitahata Einheiten/g Trockensubstanz.

Beispiel 3

0,4 g eines Akrilex AH-C. Xerogels (Bindungskapazität - COOH-Gehalt - 3,08 mAequv./g werden in 8 al eines 0,05 molaren Natriuraacetatpuffers (pH 6,5) suspendiert. Der Suspension wird auf einem eiskalten Wasserbad unter ständigem Rühren eine Lösung von 0,8 g N-Cyclohexyl-N'- _</~2-(4-raorpholinyI)-äthyl7-carbodiijnid-methyl-p-tcluolsulfonat in 100 ml kaltem (+4 C) Puffer zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird: .10 Minuten lang gerührt, »vonach 40 ml einer CGTase-Lösung (10. mg/ml) zugegeben werden. Zur Auflösung und Dialyse das Enzyms wird eine 0,05 molare Natriumace.tatpuf f erlösung, ( pH 6_:#5) verwendet.« Die Brutt-Oreaktiönszait beträgt 48.. Stunden bei 0-4⁰C> vvährend dieser Zeit wird das Gemisch zweimal 6 Stunden lang gerührt. Das Gel wird durch Filtrieren getrennt und nacheinander dreimal mit jeweils 50 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,5), dreimal mit jeweils 100 ml eines 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden 0,05 molaren Natriumacetatpuffers.(pH 6,5) und dreimal mit jeweils 100 ml eines OjOS molaren Natriumacetatpuffers (pH 5,5) gewaschen. Das Gel wird zweimal mit jeweils 250 ml destilliertem Wasser salsfrei gewaschen und liophylisiertv Ausbeute: 0,2 g immobilisiertes CGTäse-Enzyra Aktivität: 80 Kitataha Einheiten/g Xerogel.

Sexspiel 4

0,13 g Akrilex C-100 Xerogel (Bindungskapazität - COOH Gehalt - 5,2 mAequv./g; Teilchengröße 100-320,Um) werden in 5 ml eines 0,05 molaren Natriumacstatpuffers (pH 5,0) suspendiert, wonach bei O⁰C unter ständigem Rühren eine Lösung von 0,25 g N-Cyclohexyl-isi¹ -</~2-(4-morpholinyl)-äthyl7-carbodiimid~methyl-p-toluolsulfonat in 5 ml kaltem (+4⁰C) 0,05 molaren Natriumacetatpuffer (pH 5,0) zugefügt'wird. Das Reaktionsgemisch wird 10 Minuten lang weitergerührt. Nach Zugabe von 11 ml einer CGTase-Lösung (11,4 mg/ml) wird der pH-Wert des Rsaktionsgemisches auf 5,0 eingestellt. Die·Bruttoreaktionszeit beträgt 48 Stunden (bei 0-4⁰C). Das Gemisch wird während dieser Zeit zweimal 6- Stunden lang gerührt. Am Anfang der üsnse,tzung wird der pH-Wert jede halbe Stunde und später stündlich kontrolliert und notfalls korrigiert. Nach Beendigung der Reaktion wird das Geä durch Zentrifugieren entfernt und nacheinander dreimal rait jeweils 30-.ml eines 0,05 molaren Natriümacetatpuffers (pH 5,0) , dreimal mit jeweils30 ml eines 1 Mol NitTiUraOhioriⁱd^i:'ent;haitä_;,nd;i8ⁱfT"-··· 0,05 molaren Natriümacetatpuffers (pH 5,0) Und dreimal mit jeweils 30 ml eines Natriumacetatpuffers (pH 5,0) gewaschen. Sodann wird das Gel dreimal mit jeweils 50 ml destilliertem Wasser salzfrei gewaschen und liophylisiert. Ausbeute: 0,2 g immobilisiertes CGTase-Enzym. Aktivität: 147 Kitahata Einheiten/g Xerogel.

Beispiel 5 .

0,13 g Akrilex C-100 Xerogel (Bindungskapazität - COOH Gehalt - 6,2 mAequv»/g; Teilchengröße 100 bis 320 ,um) werden in 5 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 5,5) suspendiert, woraufhin bei O⁰G unter ständigem Rühren eine Lösung von 0,25 g N-Cyclohexyl-tM'-^"*2-(4-

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- XU -

-morpholinyl)-äthyl/-carbodiimid-inethyl-p-toluolsulfonat in 5 ml kaltem (+4 C) 0,05 molaren Natriumacetatpuffer (pH 5,5) zugefügt wird. Nach 10-minütigem Rühren werden dem Reaktionsgemisch 11 ml einer CGTase-Lösung (11,4 mg/ml) zugegeben» Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird auf 5,5 eingestellt* Die Bruttoreaktionszeit beträgt 48 Stunden bei Q-4°C, hierbei, wird die Suspension zweimal für jeweils S Stunden gerührt. Bei Beginn der Umsetzung wird der pH-Wert jede halbe Stunde und später stündlich kontrolliert und notfalls korrigiert. Nach Beendigung der Reaktion wird das Gel durch Zentrifugieren- entfernt und dreimal mit jeweils 30 ml eines 0,05 molaren. Natriumacetatpuffers (pH 5,5), dreimal mit jeweils 30 ml eines, 1 Hol Natriumchlorid enthaltenden 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 5,5) und dreijnäl mit jeweils 30 ml eines Natriumacetatpuffers (pH 5,5) gewaschen. Das Gel wird dreimal mit jeweils ml destilliertem Wasser salzfrei gewaschen und piophylisiert. Ausbeute: 0,2 g immobilisiertes CGTase. · Aktivität: 235 Kitahata Einheitsn/g Xerogel.

Beispiel 6

0,13 g Akrilec C-IOO Xerogel (Bindungskapazität: -COOH Gehalt -6,2 mAequv./g, Teilchengröße 100-320 um) werden in 5 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,0) suspendiert., woraufhin bei 0 C unter ständigem Rühren eine Lösung von 0,26 g N-Cyclohexyl-N'-^/~2-(4-morpholinyl)-athyl7-carbodiimid-raethyl-p-toluol-suifonat in 5 ml kaltem (+4⁰C) 0,05 molaren Natriumacetatpuffer (pH 6,0) zugefügt wird. Nach 10-minütigem weiteren Rühren werden dem Reaktionsgemisch 13 ml einer CGTasa-Lösung (10 mg/ml) zugegeben, woraufhin der pH-Wert des Rsaktionsgemisches auf 6,0 eingestellt wird . Die Bruttoreaktionszeit beträgt 48 Stunden bei 0-4⁰C und in dieser

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- J.J. —

Zeit wird die Suspension zweimal 6 Stunden lang, gerührt. Am Anfang der Reaktion wird der pH-Wert jede halbe Stunde und später stündlich kontrolliert und notfalls korrigiert. Nach Beendigung der Reaktion wird das Gel durch Zentrifugieren isoliert und nacheinander dreimal mit jeweils 30 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,0), dreimal mit jeweils 30 ml eines 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden 0,05 molaren Natriumacetatpuffers ' (pH 6,0) und dreimal mit jeweils 30 al eines Natriumacetatpuffers (pH 6,0) gewaschen, Abschließend wird das Gel dreimal mit jeweils 60 ml destilliertem Wasser salzfrei gewaschen und liophylisiert. 'Ausbeute: 0,2 g immobilisiertes CGTase-Enzym.. Aktivität: 380 Kitahata Einheiten/g Xerogel..

Seispiel^:7

0,13 g Akrilex C-IOO Xerogel (Bindungskapazität: -COOH-Gehalt -6,2 mAequv./g; Teilchengröße 100-320 um) werden in 5 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,5) su spe/n d ie rt'V v/o rauf hin bei 0 C untaf ständigeis^ Rühren' eine Lösung von 0,26 g N-Cyclohexyl-N'-^~2-(4-laorpholinyl)-äthyl7~carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat in 5 ml kaltem (h4 C) 0,05 molaren Natriumacetatpuffer (pH 6,5) zugegeben wird· Nach weitereai 10-minütigem Rühren werden dem Reaktionsgemisch 13 ml einer CGTase-Lösung (10 mg/ml) zugefügt und der pH-Wert des Reaktionsgemisches wird auf 6,5 eingestellt. Die 3ruttoreaktionszeit beträgt 48 Stunden bei 0-4⁰C; hierbei wird die Suspension zweimal 5 Stunden lang gerührt. Am Anfang der Umsetzung wird der pH-Wert jede halbe Stunde und später stündlich kontrolliert und notfalls korrigiert. Nach Beendigung der Umsetzung wird das Gemisch durch Zentrifugieren isoliert und nacheinander dreimal mit jeweils 30 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH .6,5) , freimal mit jeweils 30 ml eines 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden

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0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 6,5) und dreimal mit jeweils 30 ml eines Natriumacetatpuffers (pH 6,5) gewaschen. Danach wird das Gel dreimal mit jeweils." 60· ml destillierten] Wasser salzfrei gewaschen und liophylisiert* Ausbeute: 0,2 g immobilisiertes CGTase-Enzym· Aktivität: 450 Kitahäta Einheiten/g Xerogels

Beispiel 8

1 g Akrilex C-IOO Xerogel (Bindungskapazität: - COOH Gehalt - 6,2 mAequv./g; Teilchengröße 100-320 um) werden in 24 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 7,0) suspendiert, woraufhin bei 0 C unter ständigem Rühren eine Lösung von 2g N-Cyclohexyl-N*-^~2-(4-raorphoiinyl)-äthyl7-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat in 15 ml einer kalten (+4⁰G) 0,05 molaren Natriumacetatlösung (pH 7,0) zugegeben wird. Nach 10 minütigem weiteren Wühren werden dem Reaktionsgemisch .113 ml einer CGTase-Lösung (12 mg/ml) zugefügt, und der pH-Wert" des Rsaktionsgemisches wird· auf· 7,0 eingestellt». Die Sruttoreaktionszeit beträgt bei 0-4⁰C 4_;8 Stunden, während dieser Zeit wird das Gemisch zweimal 6 Stunden lang gerührt. Am Anfang der Umsetzung wird der pH-Wert jede halbe- Stunde und später stündlich kontrolliert und nötigenfalls korrigiert. Nach Beendigung der Reaktion wird, das Gel durch Zentrifugieren getrennt und dreimal· mit je 300 ml einer 0,05 molaren Natriumacetatlösung (pH 7,0), dreimal mit jeweils 300 ml einer 1 Mol Natriumchlorid enthaltenden 0,05 molaren Natriumacetatlösung (pH 7,0) und dreimal mit jeweils 300 ml einer 0,05 molaren Natriumacetatlösung (pH 7,0) gewaschen. Das Gel wird schließlich dreimal, mit je 300 ml destilliertem Wasser salzfrei gewaschen und liophylisiert. Ausbeute: 1,5 g immobilisiertes CGTase. Aktivität: 366 Kitahäta £inheiten/g Xerögei.

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Seispiel 9

0,2 g Akrilax C-100 Xerogel (Sindungskapazität; - COOH Gehalt -6,2 mAequv./g ,-Teilchengröße 100-320 um) werden in 5 ral einer Natriumacetatlösung (pH 7,5) suspendiert, woraufhin bei O C unter ständigem Rühren eine Lösung von 0,4 g N-Cyclohexyl-N'-^""2~(morpholinyl)-äthyl7-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat in 5 ral kaltem (+4⁰C) 0,05 molaren Natriumacetatpuffer (pH 7,5) gelöst» zugefügt wird» Nach weiteren lQ-fflinütig.em Rühren werden dem Reaktionsgemisch 21,6 ml einer CGTase-Lösung (12 rag/ml) zugegeben, und der pH-Wert wird auf 7,5 eingestellt* Die Bruttorekationszeit beträgt bei 0-4⁰C 48 Stunden, und die Suspension wird während dieser Zeit zweimal 6 Stunden lang gerührt. Am Anfang der Reaktion wird der pH-Wert jede halbe Stunde und später stündlich kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Nach Beendigung der Umsetzung wird das Gel durch Zentrifugieren isoliert und nacheinander dreimal mit jeweils 60. ral, eines 0,05 molaren Natriuraacetatpuffers (pH 7,5), dreimal mit jeweils 60 ml· sines I Mol Natriumchlorid ent-· -haltenden 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 7,5) und;dreimal mit jeweils 60 ml eines Natriumacstatpuffers (pH 7,5) gewaschen, zweimal mit jeweils 200 ml destilliertem Wasser salzfrei gewaschen und liophylisiert. Ausbeute: 1,3 g immobilisiertes' CGTase-Enzyra. Aktivität: 370 Kitahata Einheitsn/g Xerogel.

Beispiel 10

0,:26 g Akrilex· C-IOO Xerogel (Bindungskapazität COOH Gehalt - 5,2 mAequv./g, Teilchengröße 100-320 um) werden in 10 al eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 8,0) suspendiert, woraufhin bei O⁰C unter ständigem Rühren eine Lösung von. 0,52 g N-Cyclohexyi-

-N' -/^""2-(4-mo r pho liny l)-äthyl7-car bod iimid-methyl-ptoluolsulfonat in 10 ml kaltem (+4⁰C) 0,05 molaren Natriumacetatpuffer (pH 8,0) zugegeben wird. Dem Reaktionsgeraisch werden nach 10-minütigera Rühren 29 tnl einer CGTAse-Lösung zugefügt (9,25 mg/ml)> woraufhin der ρΗ-ΐ/Yert des Reaktionsgemisches auf 3,0 eingestellt wird. Dia Bruttoreaktionszeit beträgt bei 0-4⁰C 48 Stunden, hierbei wird das Reaktionsgemisch zweimal 6 Stunden lang gerührt« Am Anfang der Umsetzung wird dar pH-Wert jede halbe Stunde und später stündlich kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Nach Beendigung der Reaktion wird das Gel durch Zentrifugieren entfernt und dreimal mit jeweils 50 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 8,0), dreimal mit jeweils 60 ml eines 1 Mol Natriumchlorid enthaltender.-0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 8,0) und dreimal mit jeweils 60 ml sines 0,05 molaren Natriuraacetatpuffers (pH 8,0) gewaschen« Das Gel wird schließlich mit je 200 ml destilliertem Wasssr salzfrei gewaschen und liophylisiert. Ausbeute: 0,3 g immobilisiertes CGTase-Enzym . Aktivität': 300: Kitahata Sinne it en/gi Xärogel.

Seispiel 11

0,26 g Akrilex C-IOO Xe regal (Binduöingskapazität -COOH Gehalt - 6,2 mAequv./g ; ,Teilchengröße·-100-320 um) werden in 10 ml einer 0,05 polaren Natriumacetatlösung. (pH 8,5) gelöst, woraufhin bei O C unter ständigem Rühren eine Suspension von 0,52 g N-Cyclohexyl-N'- j/ 2-(4-morpholinyl)-äthy^-carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat in 10 ml kaltem (+4 C) 0,05 molarem Natriumacetatpuffer (pH 8,5) zugefügt wird. Nach 10-rainütigem Rühren werden dem Reaktionsgemisch 29 ml einer CGTase-Lösung (9,25 mg/ml) zugegeben, und der pH-Wert wird auf 8,5 eingestallt. Die Bruttoreaktionszeit Oe--

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trägt bei 0-4⁰C 48 Stunden. Während dieser Zeit wird das Reaktionsgemisch zweimal 5'Stunden lang gerührt. Am Anfang der Umsetzung wird der pH-Wert jede halbe Stunde und später stündlich kontrolliert und notfalls korrigiert. Nach Beendigung der Reaktion wird das Gel durch Zentrifugieren isoliert und nacheinander dreimal mit jeweils 60 ml eines 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 3,5), dreimal mit jeweils δ ml eines 1 Hol Natriumchlorid enthaltenden 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 8,5) und dreimal mit jeweils 60 ml eines¹ 0,05 molaren Natriumacetatpuffers (pH 8,5) gewaschen. Das- Gel wird schließlich zweimal mit jeweils 200 ml destilliertem.Wasser salzfrei gewaschen und liophyli- siertt Ausbeute: 0,4 g immobilisiertes CGTase-Enzym. Aktivität: 173 Ka.tahjaX&i 'Ein:fiei'.ten/g ; Xarogel«,,,

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Tabelle I Immobilisierung des Cyclodextringlycoeyltransferaseenzyms

Immobilisiertes Protein (%)

Trager

ImmobilisierteIn gelostemVerlust

Aktivität (%) Zustand zu- an

rückgewonnene Aktivität Aktivität '(%) (%)

Aktivität des Produktes, Kitahata Einheiten/g Trockensubstanz

Zellulose A 26,8

Molselect A 26,9

Akrilex AII-C4 27,9

Akrilex C-IOO 39,4

0,1	6,4
0,1	13,5
0,1	11,5
3,84	63,0

93,5	26,5
86,4	13,6
88,4	80,0
33,16	450,0

Tabelle, II

Effekt des pH-Wertes auf die Immobilisierung des Cyclodextringlycosyltransferaseenzyms unter Anwendung eines Akrilex C Trägers

pH des Reaktions- Immobilisiertes Immobilisierte In gelöstem Verlust Aktivität des

gemisches Protein (%) Aktivität (%) Zustand zu- an Produktes, Kitahata

rückgewonnene Aktivität Einheiten/g Xerogel

Aktivität (%) ^l (%)

5,0 36,6

5,5 26,0

6,0 36,0

6,5 . 39,4

7,0 47,4

7,5 48,8

8,0 52,0

8,5 53,5

0,75	38,9	60,35	147
1,20	40,0	58,80	235
3,25	78*0	18,75	380
3,84	63,0	33,16	450
1,83	41,0	-57,17	366
1,93	73,0	25,07	370
0,50	43,0	56,50	300
0,39	50,6	49 ,01	173

CO I

Claims

Erfindung s an spruch

1. Verfahren zur Immobilisierung des Cyclodextringlycosyltransferaseenzyms, gekennzeichnet dadurch _t daß man

a) das Cyclodextringlycosyltransferaseenzym mit einer wasserlöslichen oder bei einer Temperatur unter 0 G in organischen Lösungsmitteln löslichen Carbodiimidverbindung aktiviert, danach das so behandelte Enzym in einer Lösung mit einem pH-Wert von 4,5 bis 8,5 auf mindestens 0,1 raAequv./g NH^-Gruppen enthaltende Polysaccharidderivate aufbringt und das Produkt"wascht und schließlich gegebenenfalls trocknet oder

b) zunäscht ein mindestens 0,1 raAequv./g funtkionelle Carboxylgruppen aufweisendes Polymer, welches aus den MonomerenAcrylsäure, und/oder Methacrylsäure und Acrylamid und/oder Methacrylamid unter Einwirkung, eines Vernetzungsmittels des Acryl- oder Allyltyps hergestellt worden ist, als Träger mit einer wasserlöslichen oder bei einer Temperatur unter O⁰C in organischen Lösungsmitteln löslichen Carbodiimidverbindung aktiviert und danach das Cyclodextringlycosyltransferaseenzym in einer Lösung mit einem pH-Wert von 4,5 bis 3,5 auf das so aktivierte Polymer aufbringt und abschließend das Produkt wäscht und gegebenenfalls trocknet.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als Träger Arainopropylderivate von Zellulose oder Dex-

tranen verwendet.
3., Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß

man das Glycosyltransferaseenzyra auf ein Acryiamid-N,
N'-raethylen-bis-acrylaraid-aerylsäure-Kopolymer aufbringt ♦ ' .
4. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch , daß man die Aktivierung mit N-Cyclohexyl-N '-^~2-{4-fflorpholinyl)-äthyl7-carbodiimid-fnethyl-p-
-toluolsulfonat oder N-Äthyl-N-(3-dimethylaminopropyl)-

. carbödiimid-hydrochlorid durchführt. '
5. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man die Iramobilisierungsreaktion in einer
vorzugsweise 0,05 bis.0,1 molaren Natriumacetatpufferlösung ra.it- eine®' pH-Wert^ von 6 ,5 durchführt»
6. Verfahren nach einera der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß man die Iraraobilisierungsreaktion bei einer Temperatur von 0 bis 4⁰C, innerhalb von 45 bis 55 Stunden,insbesondere 48 Stunden, durchführt.
7. Verfahren nach einein der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß man das immobilisierte Rohprodukt mit einer Natriumacetatpufferlösung, einer Natriumchlorid enthaltenden Natriumacetatpuffarlösung und destilliertem
Wasser wäscht.

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