DE2805366C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung wasserun
löslicher, an einen porösen Träger kovalent gebundener Proteine
durch Adsorption eines in wäßriger Lösung vorliegenden Proteins
an dem in Wasser suspendierten, feinteiligen -NH₃⁺-
bzw. -COO--Gruppen aufweisenden Träger, anschließendes
kovalentes Binden durch Umsetzung mit einem Carbodiimid
derivat und Abtrennen des erhaltenen Produktes vom Reaktions
medium. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.
Es ist bekannt, wasserlösliche, biologisch aktive Proteine,
wie Enzyme, an poröse, wasserunlösliche Träger mittels eines
Carbodiimidderivates, wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholino
ethyl)-carbodiimid-metho-p-toluylsulfonat, kovalent zu
binden, wobei deren Aktivität zum Großteil, und zwar in Abhängigkeit
von dem jeweiligen speziellen Enzym, erhalten
bleibt (vgl. R. Goldman, L. Goldstein, E. Katchalski,
in G. R. Starck, Hrg.) Biochemical Aspects of Reactions on
Solid Supports, Academic Press, New York, 1971, S. 14).
Trägergebundene Enzyme weisen zahlreiche erwünschte Eigen
schaften auf, aufgrund derer sie sich für zahlreiche An
wendungsgebiete vorteilhaft verwenden lassen. So ermöglichen
sie eine technische und gezielte Durchführung von Substratumsätzen,
weil das Enzym zu jedem gewünschten Zeitpunkt aus
dem Inkubationsansatz wieder entfernt werden kann, was bei
Verwendung des Enzyms in Lösung unmöglich ist. Ist der Umsatz
noch nicht vollständig, so läßt sich das gleiche Enzym
erneut einsetzen. Bei Proteasen kann das zu spaltende
Protein-Substrat bei jedem gewünschten Ausmaß der Hydrolyse
isoliert werden. Die Spaltungsreaktion läßt sich damit
direkt verfolgen. Ein trägergebundenes Enzym muß nicht mehr,
wie es bisher bei Enzymlösungen der Fall war, nach dem
Substratumsatz ausgefällt werden, - wobei oftmals eine
Veränderung der Substratumsätze in Kauf genommen werden
mußte - sondern es läßt sich vielmehr durch einfaches
Filtrieren oder Abdekantieren entfernen. Ferner lassen sich
Substratumsätze mit trägergebundenen, z. B. enzymatisch
aktiven, Proteinen vorteilhafterweise auch über Säulen aus
führen. Abgepackt in einem Öffnungen aufweisenden Gefäß
lassen sich trägergebundene Proteine, wie z. B. Enzyme, in
ein flüssiges Inkubationsmedium einbringen und jederzeit
leicht wieder daraus entfernen. Mit proteolytisch wirksamen
trägergebundenen Enzymen lassen sich ferner auf einfache
Weise Inhibitoren isolieren. Die Stabilität der Proteasen
wird dabei durch die Bindung an das Trägermaterial wesentlich
erhöht, da die Proteasen keine Autolysereaktion mehr
eingehen.
Bei der Anwendung der bislang bekannten kovalent träger
gebundenen Proteine, die z. B. eine enzymatische Aktivität
aufweisen, tritt aber der Nachteil auf, daß ihre Wirkung
durch Diffusionsvorgänge beeinträchtigt wird, der dadurch
bedingt ist, daß das Protein auf dem Träger homogen verteilt
ist. Wenn sie z. B. als Katalysatoren verwendet werden,
müssen die Substrate aus ihrer umzusetzenden Lösung ins
Innere des unlöslichen Trägers diffundieren, und die Umsetzungsprodukte
in umgekehrter Richtung. Bei einer Anwendung
in affinitätschromatographischen Verfahren muß der am
Protein, das am Träger gebunden ist, zu adsorbierende Stoff
(in der Regel wiederum ein Protein) ebenfalls aus seiner
Lösung, aus der er abgetrennt werden soll, ins Innere des
Trägers diffundieren. Diffusionsprozesse verlaufen bekanntlich
langsam, so daß in vielen Fällen die Geschwindigkeit
des Gesamtvorganges durch die Diffusion als langsamsten
Teilschritt der Umsetzung bzw. Adsorption bestimmt ist;
dies ist insbesondere bei niedrigen Konzentrationen der um
zusetzenden Lösungen und bei hochmolekularen Substraten als
gelöste Stoffe der Fall. Es sind also trägergebundene Proteine
erwünscht, welche kurze Diffusionswege derartiger
Substratlösungen ermöglichen. Es sind schon verschiedene
Lösungen dieses Problems vorgeschlagen worden. So wurden
z. B. Träger für Proteine mit Festkern und dünner poröser
Außenschale vorgeschlagen [vgl. Horvath, in E. Gruschka, Hrsg.,
Bonded Stationary Phases in Chromatography, Amn Arbor Science
Publ. (1974), Seite 59]. Die Herstellung derartiger Träger
ist jedoch aufwendig, und es sind keine Anwendungen solcher
Präparate bekannt geworden.
Schließlich können Träger mit so kleinen Poren hergestellt
werden, daß das zu bindende Protein nicht in die Poren des
Trägers eindringen kann, sondern nur an der äußeren Ober
fläche gebunden wird. Damit wird aber die Bindungskapazität
des Trägers für das Protein zwangsläufig zu klein, da die
äußere Oberfläche ja immer nur einen kleinen Bruchteil der
Gesamtoberfläche eines Trägers ausmacht.
Aus Methods in Enzymology, Vol. 44, S. 66 bis 83 (1976) ist
ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bekannt,
bei dem man mit Hilfe relativ niedriger Temperaturen und
relativ langer Kupplungszeiten bestrebt ist, möglichst viel
Enzym an den Träger zu binden. Die nach diesem Verfahren
erzielte Bindung ist jedoch ebenfalls homogen und besitzt
die vorstehend bereits beschriebenen Nachteile homogen gebundener
Enzyme.
Bisher ist kein Verfahren bekannt geworden, nach dem ein an
einen Träger kovalent gebundenes Protein hergestellt werden
kann, das über den Trägerquerschnitt inhomogen verteilt
ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
bereitzustellen, das die Herstellung an einen Träger kovalent
gebundener Proteine mit einer inhomogenen Verteilung
auf dem Träger und damit mit verbessertem Wirkungsgrad ermöglicht.
Dabei sollten möglichst herkömmliche, technisch
anwendbare Träger mit guter Bindungskapazität und einfache,
ohne größeren Aufwand durchzuführende Verfahren zum Binden
von Proteinen an den Träger angewandt werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man in einem
gattungsgemäßen Verfahren
- (a) das am Träger zu bindende, gelöste Protein in einer Menge einsetzt, welche wesentlich geringer als die der maximalen Adsorptionskapazität des Trägers für das Protein entsprechende Menge ist, und daß man die Stufe (a) innerhalb von nicht mehr als 10 Minuten bei einer Temperatur über 20°C durchführt und
- (b) unmittelbar nach der Adsorption des Proteins am Träger durch Zugabe des Carbodiimidderivates das Protein mit dem Träger umsetzt und daß man die Stufe (b) innerhalb von nicht mehr als 15 Minuten bei 25 bis 35°C durchführt.
D. h. der Wirkungsgrad der gebundenen Proteine wird verbessert,
wenn man den Träger mit einer wäßrigen Lösung des an ihn
zu bindenden Proteins im deutlichen Unterschuß zu der Menge,
welche der maximalen Adsorptionskapazität des Trägers entspricht,
behandelt, um das Protein am Träger adsorbieren
zu lassen, und so schnell wie möglich mit dem Carbodiimid
derivat eine kovalente Bindung zwischen den beiden Komponenten
herbeiführt. Ein schnelles Binden ist notwendig, um die
beim ersten Verfahrensschritt erhaltene ungleichmäßige Verteilung
des Proteins auf dem Träger zu fixieren, bevor sie
durch Desorptionserscheinungen wieder ausgeglichen wird.
Das Verfahrensprodukt zeichnet sich durch eine ungleichmäßige
Verteilung des an den Träger kovalent gebundenen Proteins,
wie z. B. eines Enzyms, über den Trägerquerschnitt aus, so
daß die Konzentration des Proteins nahe der Trägeroberfläche
höher ist und nach dem Innern des Trägers hin absinkt.
Diese Verteilung bedingt einen höheren Wirkungsgrad
der erfindungsgemäß hergestellten Produkte im Vergleich zu
bislang bekannten Produkten aus einem gleichen Träger und
gleichen, an diesen kovalent gebundenen Protein bei einer
Anwendung als Katalysatoren (wie im Falle von trägergebundenen
Enzymen für die enzymatische Spaltung von Peptid- und
Glycosidbindungen in Substraten wie z. B. Casein bzw. Stärke)
oder in anderen stofftransportabhängigen Verfahren (wie
z. B. im Falle der Affinitätschromatographie).
Man hatte bisher nicht erkannt, daß bei kurzen Kupplungszeiten
sich ein Enzym-Dichtegradient auf dem Träger aufbauen
würde und daß mit einem derartigen Dichtegradienten ein derart
verbesserter Wirkungsgrad erzielt werden würde. Dies war völlig
überraschend.
Geeignete poröse Trägermaterialien sind allgemein solche mit
Festionen; da Proteine - ausgenommen am isoelektrischen
Punkt - Ladungen tragen, wird durch gegensinnige Ladungen
am Träger eine starke Adsorption des Proteins bewirkt. Je
nach der Art des Proteins wählt man einen Träger mit -COO--
bzw. -NH₃⁺-Gruppen aus. Die Teilchengröße des Trägers beträgt
zweckmäßigerweise etwa 0,1 bis 1 mm.
Unter dem Begriff "Adsorption" wird im vorliegenden eine
gegenseitige, reversible Bindung zwischen Protein und Träger
aufgrund von hauptsächlich elektrostatischer Anziehung,
aber auch H-Brückenbindungen und hydrophober Wechselwirkung
verstanden.
Zur kovalenten Bindung des Proteins an den Träger, d. h.
an eine dieser vorgenannten Gruppen desselben, wird
die bekannte Kondensation mittels Carbodiimidderivaten angewandt,
bei der sich Peptidbindungen -CO-NH- ausbilden. Hierbei
gehen sowohl -COO- als auch NH₃⁺-Gruppen aufweisende
Proteine eine solche Bindung mit der jeweils komplementären
Gruppe am Träger ein.
Geeignete Träger sind diese vorgenannte Gruppen aufweisende,
dreidimensional vernetzte organische Polymere und anorganische
poröse Matrizes, die teilweise im Handel erhältlich sind.
Für die Bindung an Säuregruppen des Proteins können dies z. B.
bekannte, dreidimensional vernetzte Copolymere von Acrylamid
mit ungesättigten Säuren, wie Maleinsäure, oder mit Malein
säureanhydrid sein [vgl. DE-OS 19 35 711], wobei im letzteren
Fall die Anhydridgruppen des Trägers vor der Adsorption hydrolysiert
werden; ferner in üblicher Weise mit Chloressig
säure umgesetzte natürliche Kohlenhydrat-Polymere sowie auf bekannte
Weise silanierte poröse Gläser, wie z. B. mit Amino
propyltriethoxysilan behandelte. Dabei wird das Protein entweder
über die Aminogruppe als funktionelle Gruppe des Trägers
gebunden oder, nachdem diese mit Bernsteinsäureanhydrid um
gesetzt wurde, über -COO--Festionen.
Beispiele für geeignete organische Träger sind ein Copolymerisat
aus Acrylamid und Maleinsäure, vernetzt mit etwa 10 Gew.-%,
bezogen auf das gesamte Copolymere, N,N′-Methylen-bis-
acrylamid, das eine Carboxylgruppendichte von etwa 10-3 Mol/g
und einen Teilchendurchmesser von etwa 500 µm aufweist
(Träger zum "Enzygel® Trypsin 5";
ein Perl-Copolymerisat aus Methacrylsäureanhydrid
und Acrylamid mit etwa 5 · 10-3 Mol/g Carboxylgruppen und einer
Teilchengröße von etwa 100-500 µm
(vor der Kupplungsreaktion ist die
Hydrolyse der Anhydridgruppen erforderlich) sowie Agarose-
Chromatographie-Perlen mit einer Teilchengröße von 100-200 µm
und einer Ausschlußgrenze von etwa 1 Million MG,
die mit Chloressigsäure
derivatisiert werden müssen.
Geeignete poröse Glasträger sind z. B. in Perlform vorliegende
Gläser mit einem Porendurchmesser von etwa 400 Å, wie z. B.
ein solches mit einer spezif. Oberfläche von 75 m²/g, einer
NH₂-Gruppendichte von 7 · 10-5 Mol/g und einem Teilchendurch
messer von 150-200 µm
und ein solches mit
einer spezif. Oberfläche von 50-100 m²/g und einer Teilchengröße
von 75-125 µm.
Beispiele für Proteine, die an amino- oder carboxylgruppenhaltige
Träger gebunden werden können, sind Trypsin und
Glucoseoxidase, ferner Acylase, Asparaginase, Glucoamylase,
Invertase, Katalase, Chymotrypsin, wobei z. B. Aminoacylase
und Invertase an DEAE-Cellulose mit positiv geladenen
Festionen, und Trypsin an Carboxymethylcellulose mit negativen
Festionen gebunden werden.
Das Verfahren wird nach folgendem Schema durchgeführt:
Der Träger wird, falls er noch nicht -COO-- und -NH₃⁺-Gruppen
aufweist, mit den gewünschten Festionengruppen in herkömmlicher
Weise derivatisiert. Es wird dann in Wasser in einem
Rührgefäß suspendiert. Der pH-Bereich wird mit wenig, möglichst
einwertigem Puffer (<10-3 molar) so eingestellt, daß
ein erheblicher Teil seiner vorgenannten Festionen im geladenen
Zustand vorliegt (pH 4-5 für -COO-).
Die Suspension soll von sonstigen Salzen frei sein, um die
Adsorption nicht zu stören. Unter Rühren wird dann gelöstes
Protein in vorzugsweise etwa 5 bis etwa 10% der maximal adsorbierbaren
Menge zugegeben und am Träger adsorbieren gelassen.
Es ist zweckmäßig, die Konzentration der Proteinlösung
verhältnismäßig niedrig, vorzugsweise auf einem Wert
von etwa 0,01 g/l, zu halten. Der pH-Wert wird so eingestellt,
daß das Protein gegensinnig zum Ionenaustauscher geladen ist
(pH 4-5 für Proteine mit isoelektrischem Punkt <5).
Die Adsorptionszeit soll möglichst kurz sein; sie beträgt
nur wenige und nicht mehr als 10 Minuten. Die
Temperatur soll eine genügend schnelle anschließende Bildungsreaktion
ermöglichen und liegt über 20°C, vorteilhafterweise
bei 25-35°C. Unmittelbar nachdem der
gewünschte Adsorptionsgrad des Proteins aus der Lösung am
Träger erreicht ist, wird die Kupplungsreaktion mit dem
Carbodiimidderivat möglichst schnell innerhalb eines
Zeitraums von nicht mehr als 15 Minuten bei 25-35°C
durchgeführt.
Zweckmäßigerweise wird das Carbodiimidderivat in einer Menge
eingesetzt, welche zu einer zur schnellen Umsetzung mit dem
Träger und dem Protein erforderlichen Konzentration führt.
Danach wird die Reaktion durch möglichst schnelles Filtrieren
und mehrmaliges Waschen des Reaktionsproduktes mit Wasser
abgebrochen, und nicht-kovalent gebundenes Protein wird mit
steigendem Kochsalzgehalt im Waschwasser, z. B. mit 1n und 5n
NaCl-Lösung, bis zu seiner vollständigen Entfernung aus dem
Produkt ausgewaschen, was bis zu 2 Stunden erfordern kann.
Dieses kann gewünschtenfalls wieder als Ausgangsprodukt für
das Verfahren verwendet werden.
Bei einer Verfahrensvariante wird der poröse Träger durch
Reaktion mit dem Carbodiimidderivat voraktiviert, wonach
überschüssiges Reagens abfiltriert wird. Adsorption und
Kupplung erfolgen dann parallel, wobei erstere der schnellere
Schritt bleibt.
Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der
Erfindung. Die Ausbeute an trägergebundenem, aktivem
Trypsin in den Beispielen 1-3 lagen bei 25 bis etwa 50%; etwa 30%
des in das Verfahren eingesetzten Trypsins wurden in aktiver
Form im Waschwasser wiedergewonnen. Diese Ergebnisse sind
vergleichbar mit denjenigen, die bei den herkömmlichen Her
stellungsverfahren erhalten werden.
(A) 1 g eines mit etwa 10 Gew.-%, bezogen auf das gesamte
Copolymere, N,N′-Methylen-bis-arylamid vernetzten Acrylamid-
Maleinsäure-Copolymeren, das als Granulat mit einem
Teilchendurchmesser von etwa 0,5 mm vorlag und eine
Carboxylgruppendichte von etwa 10-3 Mol/g aufwies (Träger
zum "Enzygel® Trypsin 5")
als Trägermaterial werden in 250 ml Wasser suspendiert
und mit verdünnter NaOH auf pH 4 gebracht. Dies
kann bis zu 1 Stunde beanspruchen. Die Suspension wird auf
30°C thermostatiert. Es werden unter Rühren 1,5 mg Trypsin
zugegeben, wonach man etwa 3-4 Min. adsorbieren läßt.
Es ist zweckmäßig, die Adsorption des Trypsins aus der
Lösung zu verfolgen; sie soll in der angegebenen Zeit
70% überschreiten, was erforderlichenfalls durch Zugabe
von etwas Puffer, pH 4-5, gefördert wird. Es
werden sodann 250 mg 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-
carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (CDI) zugegeben, und
die Kupplung wird unter Rühren 6-7 Min. ablaufen gelassen.
Es wird danach sehr schnell filtriert und einige
Male gewaschen (während eines Zeitraums von 1-3 Min.),
dann mit 1 n NaCl-Lösung solange nachgewaschen, bis die
Waschflüssigkeit frei von aktivem Protein ist.
(B) Das Beispiel 1A wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß
anstelle von 1,5 mg Trypsin 0,75 mg Trypsin eingesetzt
wurden.
Die Mengenverhältnisse hinsichtlich Träger, Protein und
Carbodiimidderivat können variiert werden, z. B. um den
Faktor 2, je nach angestrebtem Präparat.
Unter Anwendung der gleichen Komponenten und Mengenverhältnisse
wie in Beispiel 1 wird der Träger mit dem in Beispiel 1
verwendeten Carbodiimidderivat (CDI) voraktiviert. Hierzu
wird der Träger bei 30°C und pH 4 in 150 ml H₂O mit 500 mg
CDI 7-8 Minuten unter Rühren behandelt. Sodann wird, gegebenenfalls
nach Abfiltrieren von überschüssigem CDI, das
Trypsin zugegeben und 7-8 Minuten adsorbieren und binden
gelassen. Es wird dann wiederum schnell filtriert und wie
in Beispiel 1 gewaschen.
(A) Als Trägermaterial wird ein solches von ca. 100 µm Durchmesser
aus porösem Glas
verwendet, in das durch Umsetzung mit einem Überschuß
an 3-Aminopropyl-triethoxysilan in an sich bekannter
Weise zunächst NH₂-Gruppen eingeführt werden. Durch Umsetzung
mit einem großen Überschuß von festem Bernstein
säureanhydrid bei einem pH-Wert von 6 werden -COO--Gruppen
eingeführt. 1 g dieses Trägers wird in Wasser mit HCl
auf pH 4,5 gebracht, wobei ein geringer Zusatz von Puffer
pH 4-5 erfolgt. Der Zusatz von Puffer wirkt sich positiv
auf die Adsorption aus, die bei 25°C durchgeführt wird.
Nach Zugabe von 2,5 mg in Wasser gelöstem Trypsin wird
die 3 Minuten dauernde Adsorption durch Messung der
Aktivität im Überstand verfolgt. Die nachfolgende Kupplung
mit 200 mg des in Beispiel 1 verwendeten Carbodiimidderivates
dauert 6 Minuten. Nun wird schnell filtriert,
um die Kupplung rasch abzubrechen. Die Desorption von
nicht gekuppeltem Trypsin wird durch Spülung mit 1n
und 5n NaCl-Lösung bewirkt, bis die Waschflüssigkeit
frei von aktivem Protein ist.
(B) Beispiel 3(A) wird mit der einzigen Ausnahme wiederholt,
daß anstelle von 2,5 mg Trypsin 1 mg Trypsin eingesetzt
wird.
Dieses Beispiel veranschaulicht - ebenso wie nachfolgende
Beispiele 5(A) und 5(B) - die Herstellung von im nachfolgenden
Aktivitätstest benutzter Vergleichsprodukte nach bekannten Verfahren (vgl. J. Biol. Chem.,
Bd. 245, S. 3059 (1970) und M. Lynn "Immobilized Enzymes,
Antigens, Antibodies and Peptides", Herausg. H. H. Weetall,
Verlag Marcel Dekker Inc., New York, 1975, S. 36).
1 g des porösen Glasträgers gemäß Beispiel 3, in den in der
in Beispiel 3 beschriebenen Weise COO--Gruppen eingeführt
worden waren, wird in 100 ml 0,01 n CaCl₂-Lösung auf pH 4,5
gebracht und auf 5,5-6°C gekühlt. Dann erfolgt die Zugabe
von ca. 2,9 mg gelösten Trypsin. Der Adsorption von 60
Minuten folgt die Kupplung mit 200 mg Carbodiimidderivat.
Diese Kupplung wird nach ca. 120 Minuten durch Abfiltration
abgebrochen, und die Desorption von nicht-gekuppeltem Trypsin
wird durch Spülen mit 1n und 5n NaCl-Lösung bewirkt.
Diese Verfahrensweise wurde mit einem zweiten gleichen Ansatz
wiederholt, wobei ein zweites Vergleichsprodukt (II in nach
folgender Tabelle) erhalten wurde.
(A) 1 g Trägermaterial des Acrylamid-Maleinsäure-Copolymeren gemäß Beispiel 1
werden in 150 ml 0,01-molarer CaCl₂-Lösung suspendiert,
mit verdünnter NaOH auf pH 4-4,5 gebracht und auf 5°C
gekühlt. Unter Rühren werden 1,5 mg Trypsin, gelöst in
10 ml 0,01 molarer CaCl₂-Lösung und 80 mg Carbodiimid
derivat zugegeben. Die Bindung erfolgt in 1-2 Stunden.
Das Präparat wird dann 10mal mit 1n NaCl gewaschen.
(B) Beispiel 5(A) wurde mit der einzigen Ausnahme wiederholt,
daß anstelle von 1,5 mg Trypsin nur 1 mg Trypsin verwendet
wurde.
Der erhöhte Wirkungsgrad der erfindungsgemäß hergestellten
trägergebundenen Proteine mit Enzymaktivität läßt sich
aufgrund kinetischer Messungen nachweisen. Dazu wird einmal
die maximale Aktivität (entsprechend der bei der Einwirkung
auf ein enzymatisch spaltbares Substrat maximal erreichbaren
Reaktionsgeschwindigkeit V max ) der erfindungsgemäß hergestellten
Produkte mit inhomogener Enzymverteilung und bekannter
Produkte, die eine homogene Enzymverteilung aufweisen,
unter optimalen Bedingungen (d. h. in der Regel bei
einer hohen Substratkonzentration) ermittelt. Diese maximalen
Aktivitäten sind jeweils ein Maß für die Menge des am
Träger gebundenen aktiven Proteins (Enzyms).
Aktivitätenmessungen unter verschiedenen, jeweils der praktischen
Anwendung der Produkte entsprechenden, nachfolgend
genannten Testbedingungen ergeben dann deren Wirkungsgrad
unter den jeweiligen Bedingungen, wenn man die Meßergebnisse
jeweils auf diejenigen bezieht, welche für die wäßrige
Enzymlösung erhalten wurden. Bei der Enzymlösung tritt
kein örtlicher Konzentrationsgradient auf, und alles Enzym
wird in der Regel gleichmäßig mit Substrat versorgt. Die 3
wichtigsten Testbedingungen sind: niedrige Substratkonzentration,
ungeachtet des Molekulargewichtes des Substrats (bei
Anwendung der Verfahrensprodukte in der Analytik und zur
Reinigung von z. B. proteinhaltigen Abwässern durch enzymatischen
Abbau), hochmolekulare Naturstoffe, wie z. B. Casein
oder Stärke, auch bei hohen Konzentrationen (da ein enzymatischer
Abbau derselben ein wichtiges Anwendungsgebiet der
Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens ist) sowie Lösungen
ohne Pufferzusatz (die bei technischer Anwendung bevorzugt
werden); dies gilt für alle Reaktionen, bei denen Säuren
oder Laugen gebildet werden.
In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse derartiger
Aktivitätsmessungen zusammengefaßt, welche mit erfindungsgemäß
hergestellten Produkten aus trägergebundenem Trypsin,
die eine inhomogene Trypsinverteilung auf dem Träger aufweisen
("i"), und als Vergleich mit bislang bekannten
Produkten aus trägergebundenem Trypsin, die eine homogene
Trypsinverteilung auf dem gleichen Träger aufweisen ("h"),
erhalten wurden; als Substrat diente zum einen Benzoyl
argininethylester, zum anderen Casein; als Träger für die
Produkte wurde sowohl ein dreidimensional vernetztes Co
polymerisat als auch ein poröses Glas verwendet. Der
Aktivitätsgrad η₁ ist relativ und bezieht sich auf die
Aktivität einer wäßrigen Lösung von Trypsin als Bezugs
größe.
Die Aktivitäten von Trypsin in wäßriger Lösung bzw. der
erfindungsgemäß hergestellten sowie auf bislang bekannte
Weise hergestellten Präparate mit trägergebundem Trypsin
wurden im Rührgefäß durch Titration freigesetzter Säuregruppen
aus dem umgesetzten Substrat bestimmt. Dazu wurde
ein automatischer Titrator eingesetzt. Etwa 0,1 mg Trypsin
bzw. etwa 10 mg trägergebundenes Trypsin wurden in 50 ml
Substratlösung mit 5 · 10-3 Mol/l Tris-Puffer und 0,1n NaCl
suspendiert. Als Substrate wurden N-α-Benzol-L-argininethylester
(BAEE) und Casein in der in der Tabelle angegebenen
Konzentration verwendet. Unter starkem Rühren wurde der Verbrauch
an verdünnter NaOH gemessen und auf die Präparatmenge
bezogen (in Mol/Min. · g).
Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß der Aktivitätsgrad der
erfindungsgemäß hergestellten Produkte gegenüber demjenigen
der bekannten Vergleichsprodukte überraschenderweise wesentlich,
und zwar teilweise um etwa 100%, höher war.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher, an einen
porösen Träger kovalent gebundener Proteine durch Adsorption
eines in wäßriger Lösung vorliegenden Proteins
an dem in Wasser suspendierten, feinteiligen , -NH₃⁺-
bzw. -COO--Gruppen aufweisenden Träger, anschließendes
kovalentes Binden durch Umsetzung mit einem Carbodiimid
derivat und Abtrennen des erhaltenen Produktes vom Reaktions
medium, dadurch gekennzeichnet, daß man
- (a) das am Träger zu bindende, gelöste Protein in einer Menge einsetzt, welche wesentlich geringer als die der maximalen Adsorptionskapazität des Trägers für das Protein entsprechende Menge ist, und daß man die Stufe (a) innerhalb von nicht mehr als 10 Minuten bei einer Temperatur über 20°C durchführt und
- (b) unmittelbar nach der Adsorption des Proteins am Träger durch Zugabe des Carbodiimidderivates das Protein mit dem Träger umsetzt und daß man die Stufe (b) innerhalb von nicht mehr als 15 Minuten bei 25 bis 35°C durchführt.
2. Abänderung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufen (a) und
(b) von Anspruch 1 kombiniert, indem man einen mit dem
Carbodiimidderivat zuvor umgesetzten Träger in der Stufe
(a) verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Protein in einer solchen Menge verwendet,
welche 5 bis 10% der maximal an dem Träger adsorbierbaren
Menge entspricht.
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1979
- 1979-01-23 JP JP699679A patent/JPS5511560A/ja active Pending
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Publication number | Publication date |
---|---|
DE2805366A1 (de) | 1979-08-16 |
JPS5511560A (en) | 1980-01-26 |
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