DE2805366C2

DE2805366C2 -

Info

Publication number: DE2805366C2
Application number: DE19782805366
Authority: DE
Inventors: Klaus Dipl.-Chem. Dr. Buchholz; Axel Dipl.-Chem. 6000 Frankfurt De Borchert
Original assignee: Dechema Deutsche Gesellschaft fur Chemisches Apparatewesen Ev 6000 Frankfurt De
Current assignee: Dechema Deutsche Gesellschaft fur Chemisches Apparatewesen Ev 6000 Frankfurt De
Priority date: 1978-02-09
Filing date: 1978-02-09
Publication date: 1989-03-02
Also published as: DE2805366A1; JPS5511560A

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung wasserun löslicher, an einen porösen Träger kovalent gebundener Proteine durch Adsorption eines in wäßriger Lösung vorliegenden Proteins an dem in Wasser suspendierten, feinteiligen -NH₃⁺- bzw. -COO^--Gruppen aufweisenden Träger, anschließendes kovalentes Binden durch Umsetzung mit einem Carbodiimid derivat und Abtrennen des erhaltenen Produktes vom Reaktions medium. Die Ansprüche 2 und 3 betreffen Ausgestaltungen dieses Verfahrens.

Es ist bekannt, wasserlösliche, biologisch aktive Proteine, wie Enzyme, an poröse, wasserunlösliche Träger mittels eines Carbodiimidderivates, wie z. B. 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholino ethyl)-carbodiimid-metho-p-toluylsulfonat, kovalent zu binden, wobei deren Aktivität zum Großteil, und zwar in Abhängigkeit von dem jeweiligen speziellen Enzym, erhalten bleibt (vgl. R. Goldman, L. Goldstein, E. Katchalski, in G. R. Starck, Hrg.) Biochemical Aspects of Reactions on Solid Supports, Academic Press, New York, 1971, S. 14).

Trägergebundene Enzyme weisen zahlreiche erwünschte Eigen schaften auf, aufgrund derer sie sich für zahlreiche An wendungsgebiete vorteilhaft verwenden lassen. So ermöglichen sie eine technische und gezielte Durchführung von Substratumsätzen, weil das Enzym zu jedem gewünschten Zeitpunkt aus dem Inkubationsansatz wieder entfernt werden kann, was bei Verwendung des Enzyms in Lösung unmöglich ist. Ist der Umsatz noch nicht vollständig, so läßt sich das gleiche Enzym erneut einsetzen. Bei Proteasen kann das zu spaltende Protein-Substrat bei jedem gewünschten Ausmaß der Hydrolyse isoliert werden. Die Spaltungsreaktion läßt sich damit direkt verfolgen. Ein trägergebundenes Enzym muß nicht mehr, wie es bisher bei Enzymlösungen der Fall war, nach dem Substratumsatz ausgefällt werden, - wobei oftmals eine Veränderung der Substratumsätze in Kauf genommen werden mußte - sondern es läßt sich vielmehr durch einfaches Filtrieren oder Abdekantieren entfernen. Ferner lassen sich Substratumsätze mit trägergebundenen, z. B. enzymatisch aktiven, Proteinen vorteilhafterweise auch über Säulen aus führen. Abgepackt in einem Öffnungen aufweisenden Gefäß lassen sich trägergebundene Proteine, wie z. B. Enzyme, in ein flüssiges Inkubationsmedium einbringen und jederzeit leicht wieder daraus entfernen. Mit proteolytisch wirksamen trägergebundenen Enzymen lassen sich ferner auf einfache Weise Inhibitoren isolieren. Die Stabilität der Proteasen wird dabei durch die Bindung an das Trägermaterial wesentlich erhöht, da die Proteasen keine Autolysereaktion mehr eingehen.

Bei der Anwendung der bislang bekannten kovalent träger gebundenen Proteine, die z. B. eine enzymatische Aktivität aufweisen, tritt aber der Nachteil auf, daß ihre Wirkung durch Diffusionsvorgänge beeinträchtigt wird, der dadurch bedingt ist, daß das Protein auf dem Träger homogen verteilt ist. Wenn sie z. B. als Katalysatoren verwendet werden, müssen die Substrate aus ihrer umzusetzenden Lösung ins Innere des unlöslichen Trägers diffundieren, und die Umsetzungsprodukte in umgekehrter Richtung. Bei einer Anwendung in affinitätschromatographischen Verfahren muß der am Protein, das am Träger gebunden ist, zu adsorbierende Stoff (in der Regel wiederum ein Protein) ebenfalls aus seiner Lösung, aus der er abgetrennt werden soll, ins Innere des Trägers diffundieren. Diffusionsprozesse verlaufen bekanntlich langsam, so daß in vielen Fällen die Geschwindigkeit des Gesamtvorganges durch die Diffusion als langsamsten Teilschritt der Umsetzung bzw. Adsorption bestimmt ist; dies ist insbesondere bei niedrigen Konzentrationen der um zusetzenden Lösungen und bei hochmolekularen Substraten als gelöste Stoffe der Fall. Es sind also trägergebundene Proteine erwünscht, welche kurze Diffusionswege derartiger Substratlösungen ermöglichen. Es sind schon verschiedene Lösungen dieses Problems vorgeschlagen worden. So wurden z. B. Träger für Proteine mit Festkern und dünner poröser Außenschale vorgeschlagen [vgl. Horvath, in E. Gruschka, Hrsg., Bonded Stationary Phases in Chromatography, Amn Arbor Science Publ. (1974), Seite 59]. Die Herstellung derartiger Träger ist jedoch aufwendig, und es sind keine Anwendungen solcher Präparate bekannt geworden.

Schließlich können Träger mit so kleinen Poren hergestellt werden, daß das zu bindende Protein nicht in die Poren des Trägers eindringen kann, sondern nur an der äußeren Ober fläche gebunden wird. Damit wird aber die Bindungskapazität des Trägers für das Protein zwangsläufig zu klein, da die äußere Oberfläche ja immer nur einen kleinen Bruchteil der Gesamtoberfläche eines Trägers ausmacht.

Aus Methods in Enzymology, Vol. 44, S. 66 bis 83 (1976) ist ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 bekannt, bei dem man mit Hilfe relativ niedriger Temperaturen und relativ langer Kupplungszeiten bestrebt ist, möglichst viel Enzym an den Träger zu binden. Die nach diesem Verfahren erzielte Bindung ist jedoch ebenfalls homogen und besitzt die vorstehend bereits beschriebenen Nachteile homogen gebundener Enzyme.

Bisher ist kein Verfahren bekannt geworden, nach dem ein an einen Träger kovalent gebundenes Protein hergestellt werden kann, das über den Trägerquerschnitt inhomogen verteilt ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das die Herstellung an einen Träger kovalent gebundener Proteine mit einer inhomogenen Verteilung auf dem Träger und damit mit verbessertem Wirkungsgrad ermöglicht. Dabei sollten möglichst herkömmliche, technisch anwendbare Träger mit guter Bindungskapazität und einfache, ohne größeren Aufwand durchzuführende Verfahren zum Binden von Proteinen an den Träger angewandt werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man in einem gattungsgemäßen Verfahren

(a) das am Träger zu bindende, gelöste Protein in einer Menge einsetzt, welche wesentlich geringer als die der maximalen Adsorptionskapazität des Trägers für das Protein entsprechende Menge ist, und daß man die Stufe (a) innerhalb von nicht mehr als 10 Minuten bei einer Temperatur über 20°C durchführt und
(b) unmittelbar nach der Adsorption des Proteins am Träger durch Zugabe des Carbodiimidderivates das Protein mit dem Träger umsetzt und daß man die Stufe (b) innerhalb von nicht mehr als 15 Minuten bei 25 bis 35°C durchführt.

D. h. der Wirkungsgrad der gebundenen Proteine wird verbessert, wenn man den Träger mit einer wäßrigen Lösung des an ihn zu bindenden Proteins im deutlichen Unterschuß zu der Menge, welche der maximalen Adsorptionskapazität des Trägers entspricht, behandelt, um das Protein am Träger adsorbieren zu lassen, und so schnell wie möglich mit dem Carbodiimid derivat eine kovalente Bindung zwischen den beiden Komponenten herbeiführt. Ein schnelles Binden ist notwendig, um die beim ersten Verfahrensschritt erhaltene ungleichmäßige Verteilung des Proteins auf dem Träger zu fixieren, bevor sie durch Desorptionserscheinungen wieder ausgeglichen wird.

Das Verfahrensprodukt zeichnet sich durch eine ungleichmäßige Verteilung des an den Träger kovalent gebundenen Proteins, wie z. B. eines Enzyms, über den Trägerquerschnitt aus, so daß die Konzentration des Proteins nahe der Trägeroberfläche höher ist und nach dem Innern des Trägers hin absinkt. Diese Verteilung bedingt einen höheren Wirkungsgrad der erfindungsgemäß hergestellten Produkte im Vergleich zu bislang bekannten Produkten aus einem gleichen Träger und gleichen, an diesen kovalent gebundenen Protein bei einer Anwendung als Katalysatoren (wie im Falle von trägergebundenen Enzymen für die enzymatische Spaltung von Peptid- und Glycosidbindungen in Substraten wie z. B. Casein bzw. Stärke) oder in anderen stofftransportabhängigen Verfahren (wie z. B. im Falle der Affinitätschromatographie).

Man hatte bisher nicht erkannt, daß bei kurzen Kupplungszeiten sich ein Enzym-Dichtegradient auf dem Träger aufbauen würde und daß mit einem derartigen Dichtegradienten ein derart verbesserter Wirkungsgrad erzielt werden würde. Dies war völlig überraschend.

Geeignete poröse Trägermaterialien sind allgemein solche mit Festionen; da Proteine - ausgenommen am isoelektrischen Punkt - Ladungen tragen, wird durch gegensinnige Ladungen am Träger eine starke Adsorption des Proteins bewirkt. Je nach der Art des Proteins wählt man einen Träger mit -COO^-- bzw. -NH₃⁺-Gruppen aus. Die Teilchengröße des Trägers beträgt zweckmäßigerweise etwa 0,1 bis 1 mm.

Unter dem Begriff "Adsorption" wird im vorliegenden eine gegenseitige, reversible Bindung zwischen Protein und Träger aufgrund von hauptsächlich elektrostatischer Anziehung, aber auch H-Brückenbindungen und hydrophober Wechselwirkung verstanden.

Zur kovalenten Bindung des Proteins an den Träger, d. h. an eine dieser vorgenannten Gruppen desselben, wird die bekannte Kondensation mittels Carbodiimidderivaten angewandt, bei der sich Peptidbindungen -CO-NH- ausbilden. Hierbei gehen sowohl -COO^- als auch NH₃⁺-Gruppen aufweisende Proteine eine solche Bindung mit der jeweils komplementären Gruppe am Träger ein.

Geeignete Träger sind diese vorgenannte Gruppen aufweisende, dreidimensional vernetzte organische Polymere und anorganische poröse Matrizes, die teilweise im Handel erhältlich sind. Für die Bindung an Säuregruppen des Proteins können dies z. B. bekannte, dreidimensional vernetzte Copolymere von Acrylamid mit ungesättigten Säuren, wie Maleinsäure, oder mit Malein säureanhydrid sein [vgl. DE-OS 19 35 711], wobei im letzteren Fall die Anhydridgruppen des Trägers vor der Adsorption hydrolysiert werden; ferner in üblicher Weise mit Chloressig säure umgesetzte natürliche Kohlenhydrat-Polymere sowie auf bekannte Weise silanierte poröse Gläser, wie z. B. mit Amino propyltriethoxysilan behandelte. Dabei wird das Protein entweder über die Aminogruppe als funktionelle Gruppe des Trägers gebunden oder, nachdem diese mit Bernsteinsäureanhydrid um gesetzt wurde, über -COO^--Festionen.

Beispiele für geeignete organische Träger sind ein Copolymerisat aus Acrylamid und Maleinsäure, vernetzt mit etwa 10 Gew.-%, bezogen auf das gesamte Copolymere, N,N′-Methylen-bis- acrylamid, das eine Carboxylgruppendichte von etwa 10^-3 Mol/g und einen Teilchendurchmesser von etwa 500 µm aufweist (Träger zum "Enzygel® Trypsin 5"; ein Perl-Copolymerisat aus Methacrylsäureanhydrid und Acrylamid mit etwa 5 · 10^-3 Mol/g Carboxylgruppen und einer Teilchengröße von etwa 100-500 µm (vor der Kupplungsreaktion ist die Hydrolyse der Anhydridgruppen erforderlich) sowie Agarose- Chromatographie-Perlen mit einer Teilchengröße von 100-200 µm und einer Ausschlußgrenze von etwa 1 Million MG, die mit Chloressigsäure derivatisiert werden müssen.

Geeignete poröse Glasträger sind z. B. in Perlform vorliegende Gläser mit einem Porendurchmesser von etwa 400 Å, wie z. B. ein solches mit einer spezif. Oberfläche von 75 m²/g, einer NH₂-Gruppendichte von 7 · 10^-5 Mol/g und einem Teilchendurch messer von 150-200 µm und ein solches mit einer spezif. Oberfläche von 50-100 m²/g und einer Teilchengröße von 75-125 µm.

Beispiele für Proteine, die an amino- oder carboxylgruppenhaltige Träger gebunden werden können, sind Trypsin und Glucoseoxidase, ferner Acylase, Asparaginase, Glucoamylase, Invertase, Katalase, Chymotrypsin, wobei z. B. Aminoacylase und Invertase an DEAE-Cellulose mit positiv geladenen Festionen, und Trypsin an Carboxymethylcellulose mit negativen Festionen gebunden werden.

Das Verfahren wird nach folgendem Schema durchgeführt: Der Träger wird, falls er noch nicht -COO^-- und -NH₃⁺-Gruppen aufweist, mit den gewünschten Festionengruppen in herkömmlicher Weise derivatisiert. Es wird dann in Wasser in einem Rührgefäß suspendiert. Der pH-Bereich wird mit wenig, möglichst einwertigem Puffer (<10^-3 molar) so eingestellt, daß ein erheblicher Teil seiner vorgenannten Festionen im geladenen Zustand vorliegt (pH 4-5 für -COO^-).

Die Suspension soll von sonstigen Salzen frei sein, um die Adsorption nicht zu stören. Unter Rühren wird dann gelöstes Protein in vorzugsweise etwa 5 bis etwa 10% der maximal adsorbierbaren Menge zugegeben und am Träger adsorbieren gelassen. Es ist zweckmäßig, die Konzentration der Proteinlösung verhältnismäßig niedrig, vorzugsweise auf einem Wert von etwa 0,01 g/l, zu halten. Der pH-Wert wird so eingestellt, daß das Protein gegensinnig zum Ionenaustauscher geladen ist (pH 4-5 für Proteine mit isoelektrischem Punkt <5).

Die Adsorptionszeit soll möglichst kurz sein; sie beträgt nur wenige und nicht mehr als 10 Minuten. Die Temperatur soll eine genügend schnelle anschließende Bildungsreaktion ermöglichen und liegt über 20°C, vorteilhafterweise bei 25-35°C. Unmittelbar nachdem der gewünschte Adsorptionsgrad des Proteins aus der Lösung am Träger erreicht ist, wird die Kupplungsreaktion mit dem Carbodiimidderivat möglichst schnell innerhalb eines Zeitraums von nicht mehr als 15 Minuten bei 25-35°C durchgeführt.

Zweckmäßigerweise wird das Carbodiimidderivat in einer Menge eingesetzt, welche zu einer zur schnellen Umsetzung mit dem Träger und dem Protein erforderlichen Konzentration führt.

Danach wird die Reaktion durch möglichst schnelles Filtrieren und mehrmaliges Waschen des Reaktionsproduktes mit Wasser abgebrochen, und nicht-kovalent gebundenes Protein wird mit steigendem Kochsalzgehalt im Waschwasser, z. B. mit 1n und 5n NaCl-Lösung, bis zu seiner vollständigen Entfernung aus dem Produkt ausgewaschen, was bis zu 2 Stunden erfordern kann. Dieses kann gewünschtenfalls wieder als Ausgangsprodukt für das Verfahren verwendet werden.

Bei einer Verfahrensvariante wird der poröse Träger durch Reaktion mit dem Carbodiimidderivat voraktiviert, wonach überschüssiges Reagens abfiltriert wird. Adsorption und Kupplung erfolgen dann parallel, wobei erstere der schnellere Schritt bleibt.

Die folgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung. Die Ausbeute an trägergebundenem, aktivem Trypsin in den Beispielen 1-3 lagen bei 25 bis etwa 50%; etwa 30% des in das Verfahren eingesetzten Trypsins wurden in aktiver Form im Waschwasser wiedergewonnen. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denjenigen, die bei den herkömmlichen Her stellungsverfahren erhalten werden.

Beispiel 1

(A) 1 g eines mit etwa 10 Gew.-%, bezogen auf das gesamte Copolymere, N,N′-Methylen-bis-arylamid vernetzten Acrylamid- Maleinsäure-Copolymeren, das als Granulat mit einem Teilchendurchmesser von etwa 0,5 mm vorlag und eine Carboxylgruppendichte von etwa 10^-3 Mol/g aufwies (Träger zum "Enzygel® Trypsin 5") als Trägermaterial werden in 250 ml Wasser suspendiert und mit verdünnter NaOH auf pH 4 gebracht. Dies kann bis zu 1 Stunde beanspruchen. Die Suspension wird auf 30°C thermostatiert. Es werden unter Rühren 1,5 mg Trypsin zugegeben, wonach man etwa 3-4 Min. adsorbieren läßt. Es ist zweckmäßig, die Adsorption des Trypsins aus der Lösung zu verfolgen; sie soll in der angegebenen Zeit 70% überschreiten, was erforderlichenfalls durch Zugabe von etwas Puffer, pH 4-5, gefördert wird. Es werden sodann 250 mg 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)- carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (CDI) zugegeben, und die Kupplung wird unter Rühren 6-7 Min. ablaufen gelassen. Es wird danach sehr schnell filtriert und einige Male gewaschen (während eines Zeitraums von 1-3 Min.), dann mit 1 n NaCl-Lösung solange nachgewaschen, bis die Waschflüssigkeit frei von aktivem Protein ist.

(B) Das Beispiel 1A wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß anstelle von 1,5 mg Trypsin 0,75 mg Trypsin eingesetzt wurden.

Die Mengenverhältnisse hinsichtlich Träger, Protein und Carbodiimidderivat können variiert werden, z. B. um den Faktor 2, je nach angestrebtem Präparat.

Beispiel 2

Unter Anwendung der gleichen Komponenten und Mengenverhältnisse wie in Beispiel 1 wird der Träger mit dem in Beispiel 1 verwendeten Carbodiimidderivat (CDI) voraktiviert. Hierzu wird der Träger bei 30°C und pH 4 in 150 ml H₂O mit 500 mg CDI 7-8 Minuten unter Rühren behandelt. Sodann wird, gegebenenfalls nach Abfiltrieren von überschüssigem CDI, das Trypsin zugegeben und 7-8 Minuten adsorbieren und binden gelassen. Es wird dann wiederum schnell filtriert und wie in Beispiel 1 gewaschen.

Beispiel 3

(A) Als Trägermaterial wird ein solches von ca. 100 µm Durchmesser aus porösem Glas verwendet, in das durch Umsetzung mit einem Überschuß an 3-Aminopropyl-triethoxysilan in an sich bekannter Weise zunächst NH₂-Gruppen eingeführt werden. Durch Umsetzung mit einem großen Überschuß von festem Bernstein säureanhydrid bei einem pH-Wert von 6 werden -COO^--Gruppen eingeführt. 1 g dieses Trägers wird in Wasser mit HCl auf pH 4,5 gebracht, wobei ein geringer Zusatz von Puffer pH 4-5 erfolgt. Der Zusatz von Puffer wirkt sich positiv auf die Adsorption aus, die bei 25°C durchgeführt wird. Nach Zugabe von 2,5 mg in Wasser gelöstem Trypsin wird die 3 Minuten dauernde Adsorption durch Messung der Aktivität im Überstand verfolgt. Die nachfolgende Kupplung mit 200 mg des in Beispiel 1 verwendeten Carbodiimidderivates dauert 6 Minuten. Nun wird schnell filtriert, um die Kupplung rasch abzubrechen. Die Desorption von nicht gekuppeltem Trypsin wird durch Spülung mit 1n und 5n NaCl-Lösung bewirkt, bis die Waschflüssigkeit frei von aktivem Protein ist.

(B) Beispiel 3(A) wird mit der einzigen Ausnahme wiederholt, daß anstelle von 2,5 mg Trypsin 1 mg Trypsin eingesetzt wird.

Beispiel 4 (Vergleich)

Dieses Beispiel veranschaulicht - ebenso wie nachfolgende Beispiele 5(A) und 5(B) - die Herstellung von im nachfolgenden Aktivitätstest benutzter Vergleichsprodukte nach bekannten Verfahren (vgl. J. Biol. Chem., Bd. 245, S. 3059 (1970) und M. Lynn "Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and Peptides", Herausg. H. H. Weetall, Verlag Marcel Dekker Inc., New York, 1975, S. 36).

1 g des porösen Glasträgers gemäß Beispiel 3, in den in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise COO^--Gruppen eingeführt worden waren, wird in 100 ml 0,01 n CaCl₂-Lösung auf pH 4,5 gebracht und auf 5,5-6°C gekühlt. Dann erfolgt die Zugabe von ca. 2,9 mg gelösten Trypsin. Der Adsorption von 60 Minuten folgt die Kupplung mit 200 mg Carbodiimidderivat. Diese Kupplung wird nach ca. 120 Minuten durch Abfiltration abgebrochen, und die Desorption von nicht-gekuppeltem Trypsin wird durch Spülen mit 1n und 5n NaCl-Lösung bewirkt.

Diese Verfahrensweise wurde mit einem zweiten gleichen Ansatz wiederholt, wobei ein zweites Vergleichsprodukt (II in nach folgender Tabelle) erhalten wurde.

Beispiel 5 (Vergleich)

(A) 1 g Trägermaterial des Acrylamid-Maleinsäure-Copolymeren gemäß Beispiel 1 werden in 150 ml 0,01-molarer CaCl₂-Lösung suspendiert, mit verdünnter NaOH auf pH 4-4,5 gebracht und auf 5°C gekühlt. Unter Rühren werden 1,5 mg Trypsin, gelöst in 10 ml 0,01 molarer CaCl₂-Lösung und 80 mg Carbodiimid derivat zugegeben. Die Bindung erfolgt in 1-2 Stunden. Das Präparat wird dann 10mal mit 1n NaCl gewaschen.

(B) Beispiel 5(A) wurde mit der einzigen Ausnahme wiederholt, daß anstelle von 1,5 mg Trypsin nur 1 mg Trypsin verwendet wurde.

Vergleichsversuche

Der erhöhte Wirkungsgrad der erfindungsgemäß hergestellten trägergebundenen Proteine mit Enzymaktivität läßt sich aufgrund kinetischer Messungen nachweisen. Dazu wird einmal die maximale Aktivität (entsprechend der bei der Einwirkung auf ein enzymatisch spaltbares Substrat maximal erreichbaren Reaktionsgeschwindigkeit V _max ) der erfindungsgemäß hergestellten Produkte mit inhomogener Enzymverteilung und bekannter Produkte, die eine homogene Enzymverteilung aufweisen, unter optimalen Bedingungen (d. h. in der Regel bei einer hohen Substratkonzentration) ermittelt. Diese maximalen Aktivitäten sind jeweils ein Maß für die Menge des am Träger gebundenen aktiven Proteins (Enzyms).

Aktivitätenmessungen unter verschiedenen, jeweils der praktischen Anwendung der Produkte entsprechenden, nachfolgend genannten Testbedingungen ergeben dann deren Wirkungsgrad unter den jeweiligen Bedingungen, wenn man die Meßergebnisse jeweils auf diejenigen bezieht, welche für die wäßrige Enzymlösung erhalten wurden. Bei der Enzymlösung tritt kein örtlicher Konzentrationsgradient auf, und alles Enzym wird in der Regel gleichmäßig mit Substrat versorgt. Die 3 wichtigsten Testbedingungen sind: niedrige Substratkonzentration, ungeachtet des Molekulargewichtes des Substrats (bei Anwendung der Verfahrensprodukte in der Analytik und zur Reinigung von z. B. proteinhaltigen Abwässern durch enzymatischen Abbau), hochmolekulare Naturstoffe, wie z. B. Casein oder Stärke, auch bei hohen Konzentrationen (da ein enzymatischer Abbau derselben ein wichtiges Anwendungsgebiet der Produkte des erfindungsgemäßen Verfahrens ist) sowie Lösungen ohne Pufferzusatz (die bei technischer Anwendung bevorzugt werden); dies gilt für alle Reaktionen, bei denen Säuren oder Laugen gebildet werden.

In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse derartiger Aktivitätsmessungen zusammengefaßt, welche mit erfindungsgemäß hergestellten Produkten aus trägergebundenem Trypsin, die eine inhomogene Trypsinverteilung auf dem Träger aufweisen ("i"), und als Vergleich mit bislang bekannten Produkten aus trägergebundenem Trypsin, die eine homogene Trypsinverteilung auf dem gleichen Träger aufweisen ("h"), erhalten wurden; als Substrat diente zum einen Benzoyl argininethylester, zum anderen Casein; als Träger für die Produkte wurde sowohl ein dreidimensional vernetztes Co polymerisat als auch ein poröses Glas verwendet. Der Aktivitätsgrad η₁ ist relativ und bezieht sich auf die Aktivität einer wäßrigen Lösung von Trypsin als Bezugs größe.

Die Aktivitäten von Trypsin in wäßriger Lösung bzw. der erfindungsgemäß hergestellten sowie auf bislang bekannte Weise hergestellten Präparate mit trägergebundem Trypsin wurden im Rührgefäß durch Titration freigesetzter Säuregruppen aus dem umgesetzten Substrat bestimmt. Dazu wurde ein automatischer Titrator eingesetzt. Etwa 0,1 mg Trypsin bzw. etwa 10 mg trägergebundenes Trypsin wurden in 50 ml Substratlösung mit 5 · 10^-3 Mol/l Tris-Puffer und 0,1n NaCl suspendiert. Als Substrate wurden N-α-Benzol-L-argininethylester (BAEE) und Casein in der in der Tabelle angegebenen Konzentration verwendet. Unter starkem Rühren wurde der Verbrauch an verdünnter NaOH gemessen und auf die Präparatmenge bezogen (in Mol/Min. · g).

Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß der Aktivitätsgrad der erfindungsgemäß hergestellten Produkte gegenüber demjenigen der bekannten Vergleichsprodukte überraschenderweise wesentlich, und zwar teilweise um etwa 100%, höher war.

Tabelle

Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeiten bei der Einwirkung erfindungsgemäß hergestellter, an verschiedene Träger inhomogen (i) gebundener Trypsinprodukte und von bekannten derartigen Produkten, welche eine homogene (h) Trypsinverteilung aufweisen, auf Casein bzw. Benzoylargininethylester als Substrat

Claims

1. Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher, an einen porösen Träger kovalent gebundener Proteine durch Adsorption eines in wäßriger Lösung vorliegenden Proteins an dem in Wasser suspendierten, feinteiligen , -NH₃⁺- bzw. -COO^--Gruppen aufweisenden Träger, anschließendes kovalentes Binden durch Umsetzung mit einem Carbodiimid derivat und Abtrennen des erhaltenen Produktes vom Reaktions medium, dadurch gekennzeichnet, daß man

2. Abänderung des Verfahrens gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufen (a) und (b) von Anspruch 1 kombiniert, indem man einen mit dem Carbodiimidderivat zuvor umgesetzten Träger in der Stufe (a) verwendet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Protein in einer solchen Menge verwendet, welche 5 bis 10% der maximal an dem Träger adsorbierbaren Menge entspricht.