DE2615349B2

DE2615349B2 - Verfahren zum Immobilisieren von Antigenen, Enzymen und Enzyminhibitoren

Info

Publication number: DE2615349B2
Application number: DE2615349A
Authority: DE
Inventors: Francesco Di Mailand Gregorio; Franco San Giovanni Persiceto Morisi
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: Anic SpA
Priority date: 1975-04-09
Filing date: 1976-04-08
Publication date: 1978-06-15
Also published as: FR2366303B1; DK145676A; TR18669A; YU90576A; AU1255176A; NO146332C; NO146332B; HU175295B; DE2615349C3; DE2615349A1; AU508947B2; FR2366303A1; IL49356A; SE7604136L; JPS51123884A; CH626402A5; DD123608A5; IT1034957B; BE840450A; CS194238B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Immobilisieren von Antigenen, Enzymen und Enzyminhibitoren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man diese bei Temperaturen zwischen 0 und 25° C und einem pH-Bereich von etwa 7,5 mit Chinonen umsetzt, wobei das einzutretende Chinon bereits an eine in Wasser lösliche oder unlösliche Substanz mit hohem Molekulargewicht angelagert oder chemisch gebunden sein kann.

Verwendet man zur Umsetzung ein an eine wasserlöslich bzw. in Wasser unlösliche Substanz mit hohem Molekulargewicht gebundenes Chinon, so ist im Verfahrensprodukt das betreffende Protein an das wasserlösliche bzw. das in Wasser unlösliche hochmolekulare Polymer gebunden.

Die erfindungsgemäß modifizierten und dadurch immobilisierten Eiweißstoffe sind aufgrund ihrer Funktionen auf verschiedenen Gebieten anwendbar. Handelt es sich beispielsweise um Enzyme, d.h. biologische Katalysatoren, so können sie, wenn sie an in Wasser unlösliche Matrizen gebunden sind, als heterogene Katalysatoren auf dem präparativen, analytischen und biomedizinischen Gebiet verwendet werden. Da sie in dieser zwar immobilisierten, jedoch keineswegs inaktivierten Formel eine beträchtliche Stabilität aufweisen, lassen sie sich leicht aus Reaktionsgemischen, denen sie zugesetzt wurden, wieder abtrennen, so daß sie auch wiederholt verwendet werden können. Auch Enzyme, deren Isolierung und Reinigung bisher recht umständlich und verlustreich war, können, wenn sie erfindungsgemäß modifiziert sind, zurückgewonnen und wieder verwendet werden, was beträchtliche Vorteile bietet

Werden sie mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens an wasserlösliche Polymere gebunden, wodurch ihre Stabilität gegen eine Denaturierung bewirkende Mittel beträchtlich verbessert wird, so kann man sie auch unter Testbedingungen verwenden, die drastischer sind als die gewöhnlich angwandten. Das Molekulargewicht ist bei den an lösliche Polymere gebundenen Enzymen gegenüber den nativen Enzymen so weit erhöht, daß sie in Systemen verwendet werden können, die dann durch Ultrafiltermembraneri, die nur die Reaktionsprodukte durchlassen, getrennt werden.

Antigene werden vorzugsweise über das Chinon an

wasserlösliche Matrizen gebunden bzw. angelagert und können in dieser Form verwendet werden, um aus einem komplexen Gemisch den darin anwesenden entsprechenden Antikörper abzutrennen.

Wendet man das erfindungsgemäße Verfahren zur Immobilisierung von Enzym-Inhibitoren an, so können

ίο diese, nachdem sie über das Chinon an eine unlösliche Matrix gebunden sind, zur selektiven Gewinnung der von ihnen inhibierten Enzyme verwendet werden.

Bei dem erfindungtgcm.ißen Verfahren findet die Umsetzung zwischen den: Protein und dem Chi non bzw. der Chinonverbiruiu.:g oder dem Anlagerungsprodukt bei einer Temperatur statt, bei der die Stabilität des betreffenden Proteins gewähi !eistet ist; man arbeitet bei Temperaturen zwischen 0 und 25° C und stimmt die Umsetzungstemperatur so ab, daß man sicher ist, daß die Reaktion mit entsprechender Geschwindigkeit und möglichst guter Ausbeute verläuft Auch der pH-Wert des vorzugsweise wäßrigen Mediums richtet »ich nach dem Protein und liegt daher in der Gegend vom 7,5. Die Reaktionsbedingungen werden jedenfalls so gewählt, daß das Protein nicht denaturiert wird, so daß man nach Durchführen der Umsetzung das nichtunigesetzte Protein wiedergewinnen kann. In besonderen Fällen können auch Proteine verwendet werden, die nicht völlig rein sind.

Will man das Protein mit einem an ein Polymer gebundenen bzw. angelagerten Chinon unmobilisieren, so kann man ein Produkt verwenden, üas durch eine Reaktion zwischen der als Matrix dienenden hochmolekularen Substanz und dem Chinon bei einer Temperatur zwischen 0 und etwa 150"C, vorzugsweise ungefähr bei 20⁰C, erhalten wurde, wobei die Umsetzungszeit sich nach dem Matrixtyp richtet und gewöhnlich eine halbe Stunde bis 100 Stunden beträgt und der pH-Wert des Reaktionsgemisches in der Gegend von 7,5 gehalten wird.

Die Matrix kann reaktionsfähige Gruppen der verschiedensten Art enthalten, z. B. Hydroxyl-,. Amino-, Sulfhydryl-, Imidazol-, Pyrrol-, Phenol-, Sullonsäure- oder Guanidingruppen u.dgl. Die Reaktion kann sowohl im wäßrigen wie im nichtwäßrigen Medium durchgeführt werden, je nach der Art des verwendeten Chinons und des Polymers.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßem Verfahrens wurde gefunden, daß die Chinonbehandlung auch

so zur gegenseitigen Vernetzung von Proteinniolekülen bzw. zur Bildung von intramolekularen Vernetzungen führen kann, was dann eine weitere Stabilisierung des Proteins hinsichtlich seines Aufbaus zur Folge hat Der Vernetzungsgrad kann dabei so eingestellt weiden, daß man Proteinderivate mit höherem Molekulargewicht als das Ausgangsprotein erhält, die entweder immer noch wasserlöslich sind oder aber so weit vernetzt sein können, daß sie ihre Wasserlöslichkeit eingebüßt haben.

Die Beispiele erläutern das erfindungsgemilße Ver-

fahren näher.

Beispiel 1

Immobilisierung von Trypsin auf 4B-AH-Sepharose ,, mit 1.4-Benzochinon

1 g 4B-AH-Sepharose (Hersteller Pharmacia Fine Chemicals, AR-S-75104, Uppsala I, Schweden) wird aufgeschlämmt in 20 ml einer wäßrigen Natriumchlorid-

lösung (0,5 M) und über Nacht stehengelassen. Dann wird die Aufschlämmung in eine Kolonne (0,9 χ 15 cm) eingebracht und mit 100 ml der obigen Kochsalzlösung und zum Schluß mit 50 ml eines 0,05M-Natriumphosphat-Puffers vom pH 7,4 gewaschen.

Sämtliche Feststoffe (4»nl) werden in 25 ml des Puffers aufgeschlämmt, worauf 2 ml einer wäßrigen Lösung von 1,4-Benzochinon (0,1M), die frisch bereitet ist, zugesetzt werden. Man rührt in einem vom Licht abgeschirmten Gefäß 24 Stunden lang bei Raumtemperatur und füllt die Aufschlämmung dann in eine Kolonne (03 χ 15 cm), wo die Feststoffe mit 100 ml frischer Pufferlösung ausgewaschen werden. Man erhält so einen aktiven Träger aus Feststoffen von dunkelbrauner Färbung. Der Träger wird nun in 25 ml kalter Pufferlösung aufgeschlämmt und mit 5 ml kristallinem Trypsin (Hersteller British Drug Houses Ltd, Laboratory Chemicals Division, Poole, England) in kaltem Wasser (10 Milligramm je ml) versetzt

Man läßt das Ganze 24 Stunden bei 2"C stehen und führt es dann wieder in eine Kolonne (0,9 χ 15 cm) ein, wo die Feststoffe wieder ausgewaschen werden; hierzu verwendet man für ein Gesamtvolumen von 150 ml Fraktionen von je 15 ml Phosphatpuff ar (0,05M) bei einem pH-Wert von 7,4 und einem pi I-Wert von 4,4. Auf diese Weise erhält man ein Trypsin auf 4B-AH-Sepharose als Träger, das eine Esteraseaktivität von 35 Einheiten je ml Träger entwickelt (die Esteraseaktivität wurde bestimmt mit N-«-Benzoylargininäthylester [BAEE] als Subsliai bei 25° C und einem pH-Wert von 8,0 gemäß dem Verfahren von L Goldstein, Methods in Enzymology, Bd. 19, S. 935 bis 962 [1970} Eine Enzymeinheit bedeutet dabei die Menge an Enzym, die unter den obigen Bedingungen ein Mikromol Substrat je Minute hydrolisiert).

Die wie oben bereitete Probe von immobilisiertem Trypsin wurde 3 Monate bei 4⁰C in Im wäßriger Natriumchloridlösung und 0,5 m Moncnatriumphosphat (pH = 4,4) gelagert, wobei gelegentlich die überstehende Lösung erneuert wurde; nach Ablauf der 3monatigen Lagerzeit zeigte sich, daß die Esteraseaktivität noch voll erhalten war.

Eine Probe von 4B-AH-Sepharose, die nicht mit dem Chinon behandelt worden war und während der gleichen Zeit mit der gleichen Menge an Trypsin in Berührung gestanden hatte, zeigte nach dem Auswaschen keinerlei Enzymaktivität mehr, was bedeutet, daß keine physikalische Absorption von Enzym am Träger stattgefunden hatte.

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Beispiel 2

Immobilisierung von Trypsin auf 4B-Sepharose mit 1,4-Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose (Hersteller Fine Chemicals AB) wird gemäß Beispiel 1 gewaschen, in 25 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer bei einem pH von 7,4 aufgeschlämmt und mit 2 ml frisch hergestellter wäßriger Lösung von 0,1 m 1,4-Benzochinon versetzt Das Gemisch wird im abgedunkelten Gefäß bei Raumtemperatur 20 Stunden lang gerührt, worauf der erhaltene dunkelbraune Feststoff analog Beispiel 1 gewaschen, mit Trypsin umgesetzt und dann wieder gewaschen wird. Man erhält zum Schluß eine trypsinhaltige 4B-Sepharose, die eine Esteraseaktivität von 26 Einheiten je ml Träger entwickelt.

Nach dreimonatiger Aufbewahrung analog Beispiel 1 beträgt die Esteraseaktivität immer noch 95%.

Zum Vergleich wurde auch in diesem Fall ein Träger benutzt, der nicht mit Chinon behandelt worde.i war, jedoch mit der gleichen Menge Enzym verbunden und dann ausgewaschen worden war; er entwickelte nach der Lagerung keine Enzymaktivität mehr.

Beispiel 3

Immobilisierung von Trypsin auf 4B-Sepharose mit 1,4-Benzochinon

Gemäß Beispiel 1 wurde eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose in 25 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer bei einem pH von 10 aufgeschlämmt und mit 10 ml einer frisch bereiteten 0,1 m-Lösung von 1,4-Benzochinon in Wasser versetzt

Nach Stehenlassen des Gemisches über Nacht im verdunkelten Gefäß wurde aktivierte Feststoff dann in eine Kolonne (0,9 χ 15 cm) überführt und mit 200 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer bei einem pH von 7,4 ausgewaschen, worauf er gemäß Beispiel 1 mit Enzym umgesetzt und gewaschen wurde. Das so erhaltene feste Produkt entwickelt eine Esteraseaktivität von 65 Einheiten je rctl.

Beispiel 4

Immobilisierung von Trypsin auf p-Aminoüenzylcellulose mit 1,4-Benzochinon

2 g Paraamino-Benzylcellulose (0,11 mäq. je g) (Hersteller British Drug Houses Ltd, Laboratory Chemicals Division) werden in Wasser aufgeschlämmt und in eine Kolonne (0,9 χ 15 cm) eingeführt, wo sie 3 Waschzyklen unterworfen werden, bei denen jedesmal 50 ml 0,1 n-HCl in Wasser, 20 ml H₂O, 50 ml 0,1 n-NaOH in Wasser und 20 ml H2O verwendet werden. Zum Schluß werden sie noch mit 200 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer (pH = 7,4) ausgewaschen und in zwei gleiche Portionen aufgeteilt

Die eine Portion wird in 25 ml des Puffers aufgeschlämmt mit 4 ml frisch bereiteter 0,1 m wäßriger Lösung von 1,4-Benzochinon versetzt und unter Rühren zwei Tage lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Die so erhaltenen braunen Feststoffe werden in eine Kolonne (0,9 χ 15 cm) mit 150 ml des gleichen Puffers gewaschen und dann in 25 ml des Puffers in der Kälte aufgeschlämmt und mit 5 ml einer kalten Lösung von Trypsin (10 mg je ml) versetzt. Das Gemisch wird dann zwei weitere Tage bei 4° C gerührt. Schließlich wird der Feststoff wieder mit dem oben verwendeten Puffer ausgewaschen, bis die Waschwässer kein spektrometrisch (bei 280 nm) nachweisbares Protein mehr enthalten. Das so hergestellte Produkt entwickelt eine Tryptinesterase-Aktivität von 55 Einheiten je Gramm.

Der andere Teil p-Aminobenzylcellulose, der ebenfalls ausgewaschen, jedoch nicht mit Chinon behandelt worden war, entwickelte nach Behandlung mit dem Enzym und Auswaschen wie oben keinerlei Enzymaktivität

Beispiel 5

Immobilisierung von Penicillin-Acylase auf 4B-Sepharose mit 1,4-Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose, die gemäß Beispiel 1 ausgewaschen und dann mit 100 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer bei einem pH von 8,0 behandelt worden war, wird in 16 ml Puffer aufgeschlämmt und mit 5 ml frisch bereiteter 0,1 m wäßriger Lösung von

1,4-Benzochinon versetzt. Das Gemisch wird 13 Stunden im abgedunkelten Gefäß gerührt Die so erhaltenen dunklen Feststoffe werden in einer Kolonne (0,9 χ 15 cm) mit 100 ml des obigen Puffers ausgewaschen, dann in 6 ml Pufferlösung aufge schlämmt und mit 25 ml einer Lösung von Penicillin-Acylase von Escherichia CoIi ATCC 9637 im gleichen Puffer ausgewaschen. (Das Enzym war hergestellt worden gemäß Marconi et aL, journal of Antibiotics, Vol. 26, S. 228 [1973].) Das Gemisch wird einige Zeit bei Raumtemperatur gerührt und dann in eine Kolonne (03 x 15 cm) überführt, wo die Feststoffe bei pH 8,0 abwechselnd mit je 15 ml 0,05 m und 1,0 m Puffer ausgewaschen werden. Das Gesamtvolumen an Waschflüssigkeit beträgt 150 ml, von denen die ersten 50 ml nur Proteine enthalten, die spektrophotometrisch bei 280 nm nachgewiesen werden können. Man erhält auf diese Weise dunkle Feststoffe, die ein Enzym enthalten, welches eine Aktivität von 125 Einheiten je ml entwickelt

Die mit den Feststoffen umgesetzten 25 ml Enzymlösung enthielten 1400 Enzymeinheiten mit einer spezifischen Aktivität von 21,1 Einheiten je Milligramm, während die Mutterlauge aus dem Reaktionsgemisch und die Waschflüssigkeiten zusammen 905 Enzymeinheiten enthielten.

Praktisch erhält man das gesamte zur Umsetzung gebrachte Enzym zurück; außerdem entwickelt das immobilisierte Enzym die gleiche Aktivität als wenn es in Lösung ist

Eine Probe von 4B-Sepharose, die nicht mit dem Chinon, jedoch mit dem Enzym auf gleiche Weise wie oben behandelt worden war, zeigt keinerlei Enzymaktivität, was bedeutet, daß unter den obigen Bedingungen keinerlei Enzymabsorption auf dem Träger stattgefunden hatte.

(Die Enzymaktivität wurde mit Penicillin G als Substrat bei 27° C und einem pH von 8,0 bestimmt, gemäß der Methode von Marconi et al. Journal of Antibiotics, Vol. 26, S. 228, 1973.) Eine Enzymeinheit ist die Menge an Enzym, die unter den Versuchsbedingungen ein Micromol Penicillin G je Minute hydrolisiert Die mehrfach wiederholte Verwendung des gleichen immobilisierten Enzyms innerhalb eines Monats führte nur zu vernachlässigbaren Aktivitätsverlusten.

Beispiel 6

Immobilisierung von Penicillin-Acylase
auf 4B-Sepharose mit 1,4-Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose wird analog den vorangehenden Beispielen gewaschen und mit 1,4-Benzochinon aktiviert. Das Produkt wird dann mit 1580 Einheiten Penicillin-Acylase von Escherichia coli, die eine spezifische Aktivität von 2,7 Einheilen je mg hat, umgesetzt

Die Umsetzungszeit beträgt 15 Stunden, während die anderen Arbeitsgänge und das Auswaschen dem vorangehenden Beispiel entsprechen.

Aus den Mutterlaugen und Waschflüssigkeiten werden 1300 Einheiten Enzymaktivität wiedergewonnen, und die Feststoffe entwickeln eine Enzymaktivität von 67,5 Einheiten je ml.

Zu bemerken ist, daß in diesem Fall das Verfahren auch dann befriedigende Resultate ergibt, wenn ein nicht allzu reines Enzym verwendet wird. Die wiederholte Verwendung des immobilisierten Enzyms innerhalb eines Monats führte auch in diesem Fall nur zu vernachlässigbaren Aktivitätsverlusten.

Beispiel 7

Immobilisierung von Penicillin-Acylase auf 4B-AH-Sepharose mit 1,2-Naphthochinon

1 g 4B-AH-Sepharose wurde gemäß Beispiel 1 mit 0,5 m wäßriger HCl gewaschen und daraufhin nochmals mit 100 ml 0,05 m Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) ausgewaschen und in 25 ml dieses Puffers aufgeschlämmt worauf 25 ml Dioxan mit einem Gehalt an 0,5 Millimol 1,2-Naphthochinon zugesetzt wurden. Nach 18stündigem Stehen in verdunkeltem Gefäß bei Raumtemperatur wird das Gemisch filtriert und die Feststoffe mit 50 ml einer Lösung ausgewaschen, die erhalten wurde durch Vermischen von einem Volumen Phosphatpuffer (0,05 m, pH 8,0) mit einem Volumen Dioxan. Schließlich werden die Feststoffe in einer Kolonne wie oben mit 100 ml Puffer ausgewaschen.

Das so erhaltene schwarze Produkt wird umgesetzt mit Penicillin-Acylase (erhalten aus Escherichia coli ATCC 9637). Das Reaktionsgemisch enthält 4 ml aktivierte 4B-AH-Sepharose und 2030 Enzymeinheiten mit einer spezifischen Aktivität von 2,7 Einheiten je mg in 30 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 8,0. Man läßt das Ganze dann unter Rühren zunächst eine Stunde bei Raumtemperatur, dann 48 Stunden bei 4°C stehen. Dann werden die Feststoffe gemäß Beispiel 5 ausgewaschen, und man erhält schließlich ein immobilisiertes Enzym, das eine Aktivität von 55 Einheiten je ml Träger entwickelt während die aus den Mutterlaugen und der Waschflüssigkeit wiedergewonnenen Enzymeinheiten insgesamt 1815 Einheiten betragen. Auch in diesem Fall tritt kein Enzymverlust ein und im übrigen entwickelt das immobilisierte Enzym die gleiche Aktivität, die es auch in Lösung entwickelt

Beispiel 8

Immobilisieren von Peroxidase auf 4B-Sepharose mit 1,4-Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose wird gemäß Beispiel 5 aktiviert mit 0,5 Millimol 1,4-Benzochinon vom pH 8,0 und dann mit Peroxidase (I. Qualität, Herstelbr Fa. Boehringer Mannheim GmbH) behandelt Das Reaktionsgemiscli enthält 4 ml aktivierter 4B-Sepharose, 100 mg Enzym und 0,05 m Phosphatpuffer vom pH 6,0. Das Gesamtvolumen beträgt 30 ml. Man läßt dann das Gemisch unter Rühren 24 Stunden bei 4° C stehen und wäscht es dann abwechselnd mit je 15 ml 0,05 m und 0,5 m Phosphatpuffer vom pH 6,0, berechnet auf ein Gesamtvolumen von 150 ml, aus. Die Aktivität der Feststoffe beträgt dann 488 Einheiten je ml Träger.

Die Peroxidase-Aktivität wurde bestimmt mit »ABTS« (2^'-Azino-di(3-äthylbenzothiazolin)-6'-suI-fonsäure, Hersteller Boehringer, Mannheim) und Sauerstoffperoxid bei 25° C und einem pH von 7,0, gemäß einer Vorschrift des Herstellers.

Eine Enzymeinheit bedeutet auch hier die Enzymmenge, die ein Micromol Substrat je Minute umwandelt.

Beispiel 9

Immobilisierung «ines Anti-T3-Antikörpers auf 4B-Sephar«se mit 1,4-Benzochinon

Eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose wird gemäß Beispiel 5 aktiviert mit 0,5 Millimol 1,4-Benzochinon und dann mit Anti-Ts-Antiserum (3,3'-Trijodtyronin) von Kaninchen umgesetzt. Das Reaktionsgemisch enthält

4 ml aktivierte 4B-Sepharose, 20 ml Antiserum, 0,2 m Kaliumphosphatpuffer, 0,1 m KCI und hat einen pH-Wert von 7,4 und ein Gesamtvolumen von 30 ml. Man hält das Gemisch unter gelindem Rühren über Nacht bei 4°C und wäscht dann die abfiltrierten Feststoffe mit 200 ml 0,02 m Kaliumphosphatpuffer und 0,05 m Trishydroxymethylaminomethan-Hydrochlorid-(Tris-HCI)-Puffer bei pH 7,4 aus, worauf man sie noch 24 Stunden bei 4⁰C in der Pufferlösung hält.

Zum Vergleich führt man die gleichen Arbeitsgänge an einer Probe durch, die jedoch nicht mit dem Antiserum behandelt ist. An den beiden so vorbereiteten Feststoffträgern wird die Aufnahme von T3-Hormon wie folgt festgestellt: 0,6 ml Träger (entspricht etwa 20 mg trockenem Produkt) werden ins Gleichgewicht gebracht mit 35 Nanogramm T3, das mit J125 markiert ist; die Gesamtmenge beträgt dabei 1,5 ml und das Gemisch enthält noch 0,2 m Phosphatpuffer und 0,1 m KCI bei einem pH von 7,4; es wird eine Stunde bei 37°C und über Nacht bei 4°C gehalten. Dann wird an den abzentrifugierten Feststoffen die aufgenommene Radioaktivität gemessen.

Die mit dem Antiserum behandelten Feststoffe haben 58% der insgesamt eingebrachten Radioaktivität aufgenommen, während das unbehandelte Vergleichs- 2^r> material nur 11 % aufnimmt.

Beispiel 10

Immobilisierung des Trypsininhibitors aus
Soyabohnen auf 4B-Sepharose mit 1,4-Benzochinon

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Eine Probe von 4 ml 4B-Sepharose wird gemäß Beispiel 5 gewaschen mit 0,5 Millimol 1,4-Benzochinon aktiviert und dann innerhalb 10 Stunden mit 25 ml 0,02 m Natriumphosphatpuffer (pH 8,0) und 60 mg Trypsin-Inhibitor aus Soyabohnen (Boehringer, Mannheim) umgesetzt. Es wird dann nochmals mit 0,1 m KCl-Puffer und 0,02 m Natriumphosphat (pH 8,0) nachgewaschen, bis die Waschflüssigkeit kein Protein mehr enthält. Die Mutterlaugen und die Waschflüssigkeit enthalten zusammen 46 mg rückständiges Protein. Der Träger wird dann noch mit 200 ml eines Puffers (pH 8,0) ausgewaschen, der 0,05 m Tris-HCl, 0,1 m KCI und 0,02 m CaCU enthält, worauf man ihn 24 Stunden bei 4° C in der Pufferlösung stehenläßt.

Die so vorbereitete 4-ml-Probe besitzt die Fähigkeit, 13,3 mg kristallines Trypsin zu binden, wobei die Wirksamkeit 63% höher ist als beim nicht immobilisierten Inhibitor (bestimmt nach der Methode von L J. Loeffler und I. V. Pierce in »Biochimica et Biophysica Acta«, Bd. 317, S. 20,1973).

Beispiel 11
Stabilisierung von Trypsin mit 1,4-Benzochinon

50 Milligramm kristallines Trypsin (Hersteller British Drug Houses) werden gelöst in 50 ml 0,05 m Natriumphosphalpuffer (pH 7,3) und versetzt mit 0,02 ml einer 0,1 m wäßrigen Lösung von 1,4-Benzochinon. Das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend 20 Stunden bei 4°C gerührt. Zum Schluß wird das Reaktionsgemisch in der Kälte gegen Wasser dialysiert, das mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH von 3,0 gebracht wurde.

Die gleichen Arbeitsgänge werden parallel an einer Vergleichsprobe durchgeführt, wobei jedoch kein Chinon zugesetzt wird. Sowohl die obige Losung wie die Vergleichsprobe werden nach der Dialyse bei 4°C gelagert, worauf in beiden Fällen nach 5 Tagen und nach Tl Tagen die Enzymaktivität bestimmt wird. Es zeigt sich, daß bei dem behandelten Trypsin die Aktivität nach 5 Tagen noch 100%, nach 11 Tagen noch 97% beträgt, während die unbehandelte Probe eine Aktivität von nur 84 bzw. 74% aufweist.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Immobilisieren von Antigenen, Enzymen und Enzyminhibitoren, dadurch gekennzeichnet, daß man diese bei Temperaturen zwischen 0 und 25° C und einem pH-Bereich von etwa 7,5 mit Chinonen umsetzt, wobei das einzutretende Chinon bereits an eine in Wasser lösliche oder unlösliche Substanz mit hohem Molekulargewicht angelagert oder chemisch gebunden sein kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man das Chinon in einer Form verwendet, in der es an eine hochmolekulare Substanz mit Hydroxyl-, Amino-, Sulfhydryl-, Imidazo!-, Pyrrol-, Phenol-, Sulfonsäure- oder bzw. und Guanidingruppen als reaktionsfähigen Gruppen chemisch gebunden ist

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, daß man ein Chinon verwendet, das mit der hochmolekularen Substanz im Temperaturbereich von 0 bis 20⁰C und dem pH-Bereich von etwa 7,5 innerhalb einer halben bis zu 100 Stunden umgesetzt worden ist