DE2405316A1 - Stabilisierte enzyme auf anorganischen traegern - Google Patents

Stabilisierte enzyme auf anorganischen traegern

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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
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Description

Anmelderin: Coming Glass Works
Corning, N. Y., USA
Stabilisierte Enzyme auf anorganischen Trägern
Die Erfindung betrifft stabilisierte Enzyme auf anorganischen, kieselsäurefreien Trägern.
Die meisten hochmolekularen Enzyme sind wasserlöslich, was ihre Anwendbarkeit als Katalysatoren begrenzt, weil sie mit in Lösung gehen, die Produktreinheit beeinträchtigen und überdies verloren gehen.
Es ist daher versucht worden, sie zu stabilisieren, d. h. wasserunlöslich zu machen, z. B. durch Bindung an oder Einschluss in einem wasserunlöslichen Träger ohne Beeinträchtigung der katalytischen Aktivität auf längere Dauer. Bisher wurden vielfach organische Träger verwendet, z. B. Polyaminostyrolperlen oder Zellulosederivate. Nachteile der organischen Träger sind Quellung, mangelnde Steifigkeit, geringe Diffusion des Sub-
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strats, Mikrobenbefall, geringe Wärmebeständigkeit, schwierige Sterilisierung usf. Deshalb werden nach der Lehre der US-FS
3,556,°A5 "und 3,519,538 anorganische Träger bevorzugt. Die
Oberfläche soll gross sein, wobei die Porengrösse auch eine
Solle spielt, vgl. Messing in Enzymologia, Bd. 39, S. 12-14-(197Ο). Kürzlich wurde gefunden, dass kieselsäurehaltige träger, wie ζ. B. poröses Glas in alkalischer Umgebung keine sehr lange Lebensdauer haben; das ist umso bedauerlicher, als viele Enzyme bei alkalischen pH-Werten katalytisch besonders wirksam sind. Die Alkalifestigkeit kann durch Überzug mit einem Metalloxid, ζ. Β. Zirkonoxid, verbessert werden. Jedoch bedeutet
dies einen weiteren Bearbeitungsschritt und höhere Gestehungskosten.
Die Erfindung hat demnach stabilisierte Enzyme auf anorganischen Trägern mit besserer Alkalibeständigkeit und Lebensdauer zur Aufgabe.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäss dadurch gelöst, dass das
Enzym an die Innenfläche eines porösen, im wesentlichen kieselsäurefreien Keramikkörpers gebunden ist, dessen durchschnittlicher Porendurchmesser wenigstens so gross wie die grösste
Abmessung des Enzyms, aber kleiner als 1000 % ist.
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Von kritischer Bedeutung ist das Verhältnis von durchschnittlicher Porengrösse und der Abmessung des an den Träger zu bindenden Enzyms. Die durchschnittliche Porengrösse soll Beschickung und Halbwertszeit der Lebensdauer möglichst erhöhen und eine leichte Diffusion des Substrats in das Trägermaterial und zum gebundenen Enzym gewährleisten. Vorzugsweise wird das Enzym an kieselsäurefreies, keramisches Material aus agglomerierten Metalloxidpartikeln wie Aluminium-, Titan- oder Zirkonoxid gebunden. Der Träger kann auch mehrere dieser Metalloxide enthalten.
Der Träger muss im wesentlichen frei von Kieselsäure sein, also möglichst kein SiOp enthalten. Er besteht aus einem nicht brüchigen, keramischen Material mit einer Oberfläche grosser als 5 qm/g und hat einen Durchmesser der durchschnittlichen Porengrösse, der wenigstens so gross wie die grösste Abmessung des zu bindenden Enzyms, aber kleiner als etwa 1000 A ist.
Der Träger muss porös sein, bloss fein verteilte Metalloxidpartikel genügen also nicht ohne weiteres. Ein kritisches Merkmal ist das Verhältnis der durchschnittlichen Porengrösse des Trägers und der grössten Abmessung des Enzyms. Der bevorzugte durchschnittliche Porendurchmesser hängt unmittelbar von der grössten Abmessung des verwendeten Enzyms, und in gewissem Umfang auch von der Grosse des in Frage kommenden Substrats ab,
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falls dieses etwa grosser als das Enzym sein sollte. In jedem Falle muss es zwar wenigstens so gross wie die grösste Abmessung des Enzyms, aber kleiner als 1000 S sein. Durch geeignete Auswahl aus diesem Bereich können auch Träger mit die Diffusion grösserer Substrate gestattender Porengrösse erhalten werden. Das Enzym muss in das innere Porennetzwerk im Wege der Massendiffusion eindringen können. Ist das Substrat grosser, ζ. B. bei proteolytischen Enzymen, so muss die durchschnittliche Porengrösse auch das Substrat eindringen lassen. Die obere Grenze sollte aus zwei Gründen jedoch 1000 Ä nicht übersteigen. Grössere Porenweiten verringern die Gesamtoberfläche für die Enzymaufnahme. Zweitens wird der Schutz des Enzyms unter Turbulenzbedingungen bei grösseren Porenweiten geringer, d. h. es besteht die Gefahr der Ablösung des Enzyms, besonders bei Durchlaufumsetzungen mit grösserem Druckabfall. Der praktische Bereich für die meisten Enzyme liegt zwischen 100 und 1000 S, vorzugsweise 100 - 500 £· Die beste durchschnittliche Porengrösse hängt aber immer vom jeweiligen Enzym und seinem Substrat ab.
Die grösste Abmessung eines Enzyms oder seines Substrats kann in bekannter Weise aus dem Molekülgewicht oder durch Ausschlussversuche bestimmt werden. Bei sphärischen Enzymen ist die grösste Abmessung etwa der Moleküldurchmesser. Bei länglichen Enzymen ist die grösste Abmessung die Länge, usw.
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Die durchschnittliche Porengrösse muss in manchen Fällen auch das Substrat berücksichtigen. Ist das Substrat kleiner als das Enzym, so diffunidert das Substrat zum gebundenen Enzym (z. B. Glucose und Sauerstoff zur gebundenen Glucoseoxidase) meist ohne Schwierigkeit. Ist das Substrat dagegen so gross wie oder grosser als das Enzym, so muss die durchschnittliche Porengrösse des Trägers dies berücksichtigen. Soll ein stabilisiertes Papainpräparat z. B. zur Hydrolyse eines Proteins wie Alpha-Casein dienen, so muss das mehrfach grössere Alpha-Case inmolekül (Molekülgewicht 121.000 im Vergleich zu 21.000 des Papain) diffuirLeren lassen. Die durchschnittliche Porengrösse muss z. B. das 2- bis 4-fache der G-rösse des Papainmoleküls betragen, also wenigstens etwa 100 - 200 S, wenn das Papain zur Hydrolyse von Eiweiss (Molekülgewicht 40.000 70.000) verwendet werden soll. Dagegen kann bei Herstellung von Fructose durch Einwirkung von Glucoseisomerase (Molekülgewicht 180.000, Grosse etwa 100 S) auf Glucose die Porengrösse näher am unteren Ende des angegebenen Bereichs liegen. Das gleiche gilt z. B. bei Urease (etwa 125 A) mit ebenfalls kleinem Substrat. Bei sehr grossen Enzymen wie Pyruvatdecarboxylase mit einem berichteten Molekülgewicht von über 1.000.000 muss der Träger näher an der Porengrösse von 1000 Ä liegen, und auch der kritische Bereich ist entsprechend kleiner. Auch bei Catalase mit einem Molekülgewicht von etwa 250.000 und einer
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grössten Abmessung von etwa 183 A ist der kritische Bereich etwas kleiner, liegt also zwischen 183 - 1000 S, wobei übrigens das kleinere Substrat (Wasserstoffsuperoxid) unberücksichtigt bleiben kann.
Die Art der Bindung hängt in bekannter Weise vom beabsichtigten Gebrauch, den Kosten, der technischen Durchführbarkeit, der behaltenen Enzymaktivität, der Zugänglichkeit der Reagenzien usw. ab. Meist kommen drei Methoden in Frage, nämlich Adsorption z. B. gemäss US-PS 3,556,94-5, chemische Bindung über Silankuppler gemäss US-PS 3,519,538, 3,669,841 und Adsorption und Verkettung in den Poren gemäss Patentanmeldung P 23 39 805.2 der gleichen Anmelderin. Die Trägeroberfläche muss lediglich freie Oxid- oder Hydroxylgruppen zur Bindung aufweisen, die das Enzym über Adsorption, eventuell auch Verkettung in den Poren oder über chemische Kuppler mit wenigstens einem mit diesen Gruppen umsatzbereiten Teil binden. Alle drei Methoden werden hier mit "Bindung" bezeichnet. Sie können auch kombiniert werden. In den weiter unten erläuterten Beispielen wurden die Enzyme nach dem Verfahren der US-PS 3,556,°A5 adsorbiert.
Von grosser Wichtigkeit für Herstellung und Gebrauch des Präparats ist die Korngrösse des porösen Keramikträgers. Um
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seine Oberfläche voll auszunutzen, muss das Enzym vor Bindung tief in den porösen Träger eindringen können und nach Bindung des Enzyms gilt dies auch für das Substrat.
Die Diffusionsfähigkeit des Enzyms hängt von mehreren Faktoren ab, wie Porengrösse und Korngrösse des Trägers, pH-Wert und isoelektrischer Punkt des Enzyms, sowie Zeit und Temperatur. Als bevorzugter Korngrössenbereich des Trägers wurden 0,074 4,76 mm (4 - 200 mesh) gefunden. Grössere Partikel erschweren die Diffusion, so dass die Oberfläche nicht voll genutzt wird, und erfordern beim Durchlauf eine sehr lange Verweilzeit des Substrats. Kleinere Partikel sind nur schwer in der Kolonne zu halten und verursachen bei dichter Packung eiiB η besonderen Aufwand erfordernden starken Druckabfall. Besonders günstig ist der Bereich 0,177 - 0,71 mm (25 - 80 mesh).
!Für die Herstellung wird ein poröser, im wesentlichen kieselsäurefreier Keramikkörper mit entsprechender Porengrösse gemahlen und klassiert, wobei vorzugsweise auf möglichst gleichmassige Porenverteilung geachtet wird. Geeignet sind beispielsweise poröses Aluminium-, Titan- oder Zirkonoxid, einzeln oder in Mischung oder auch andere, wasserunlösliche Metalloxide, Die porösen Körper werden dann mit einem geeigneten Puffer für die anschliessende Enzymbindung vorbereitet oder hydratiert,
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um möglichst viele Oxid- oder Hydroxylgruppen an der Oberfläche zu bilden. Zur Adsorption von z. B. Glucoseisomerase auf porösem Aluminiumoxid wird eine Hydratation mit einem Puffer mit mehr als 7 pH bevorzugt. Zur Bindung durch Adsorption wird zunächst der Puffer entfernt, jedoch werden die Partikel feucht gehalten. Sodann wird das Enzym mit einer die optimale Adsorption oder optimale Beschickung der verfügbaren Oberfläche gewährleistenden Konzentration zugesetzt.
Die Adsorption und Massendiffusion des Enzyms in den Poren kann durch Bewegung beschleunigt werden, z. B. Umlauf, Rühren, Umkippen, Verwendung eines fluiden Betts und dergleichen. Die erforderliche Dauer der optimalen Adsorption hängt vom Träger, der Porengrösse, Partikelgrösse, Grosse und Spin der Enzymmoleküle, Temperatur, pH-Wert, Bewegung usw. ab, jedoch ist für ausreichende Adsorption und Beschickung mindestens eine halbe Stunde erforderlich, meist 1.1/2 - 5 Std. Meist sollte der pH-Wert so gewählt werden, dass die Oberflächenladung des Enzyms umgekehrt der Oberflächenladung des Trägers ist. Nach der Adsorption wird loses Enzym abgewaschen, ζ. Β. mit Wasser, Salzlösung (z. B. 0,5 M NaCl), u. a., die das Präparat nicht bee inträchtigen.
Bei Anwendung kann das Enzympräparat in einer verstöpselten Durchlaufkolonne, einem ständig gerührten Umsetzungsgefäss,
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einem fluiden Bett und dergleichen mit der Möglichkeit der Substrataufgabe zur Inkubation gehalten werden. In den Beispielen wurde die Enzymaktivität wiederholt unter statischen und dynamischen Bedingungen untersucht. Bei Prüfung unter dynamischen Bedingungen (entsprechend der geplanten Anwendung) wurde die Halbzeit des Enzyms (Verlust der halben Anfangsaktivität) gemessen. Je langer diese Halbzeit, desto wertvoller ist auch das Enzym. Die Beispiele zeigen durchweg sehr lange Halbzeiten und gute Lagerfähigkeit.
Meist wird kontinuierliches Arbeiten dem abschnittsweisen gegenüber bevorzugt. Bei Verwendung in einer Kolonne kann mit Hilfe eines Wassermantels eine optimale Inkubationstemperatur und eine die Halbwertszeit möglichst verlängernde Temperatur eingehalten werden; z. B. bei Herstellung von Fructose Glucose-Substrat und Glucoseisomerase ist für beide Gesichtspunkte 60 günstig. Der pH-Bereich und das Puffersystem für die Inkubation hängen auch vom geweiligen Enzymsystem ab, z. B. bei Herstellung von Fructose, 7>2 - 8,2 oder, besonders günstig, 7,4 - 7*8. In der Regel wird das Puffersystem im Hinblick auf die saure oder alkalische Beschaffenheit des Substrats gewählt, die durch die Substratlösung selbst und/oder die Gegenwart verschiedener, zugesetzter aktivierender Ionen verursacht wird, sowie den optimalen pH-Wert des Enzymsystems.
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In den folgenden Beispielen wurden als Träger für die angegebenen Enzyme poröse Keramikkörper verschiedener, kieselsäurefreier Metalloxide mit Porengrössen von 14-0 - 985 S verwendet. Die Partikelgrösse der Träger lag zwischen etwa 25 und 80 mesh. Die Träger bestanden jeweils aus
Al2O5 - (175 S)
ZrO2 - (175 S)
TiO2 - (350 S) (420 S) (820 S) (855 S)
TiO2-Al2O3 - (220 S)
Der zuletzt aufgeführte Träger bestand aus 44 Gew.% TiOp und 56% Al2O3.
BEISPIEL I
Glucoseisomerase adsorbiert auf porösem AIpO^
Glucoseisomerase (grösste molekulare Abmessung etwa 100 S, Molekülgewicht 180.000) wurde auf porösen Aluminiumoxidkörpern mit den folgenden physikalischen Merkmalen adsorbiert:
Poröser AIpO^ Träger
durchschnitt1icher Porendurchme s s er Porendurchme s s er, Minimum Porendurchmesser, Maximum Porenvolumen
Oberfläche
Partikelgrösse in mesh 25 - 60
175 S
140 S
220 S
0,6 CBr/g
100 m2/g
0 9 8 3 U I 0 7 6 1
Das adsorbierte Enzym "bestand aus roher Glucoseisomerase enthaltend 444 internationale Glucoseisomeraseeinheiten (IGIE) pro g. Die Enzymaktivität wurde mit einem modifizierten Cystein-Garbozolverfahren "bestimmt. Das stabilisierte Präparat wurde folgendermassen hergestellt:
einer Lösung von 28,7 ml 0,1 M Magnesiumazetat wurde 5 g des obigen rohen Glucoseisomerasepräparats zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 25 Min. bei Zimmertemperatur gerührt und durch Filterpapier filtriert. Der Rückstand auf dem Filterpapier wurde mit 14,3 ml 0,1 M Magnesiumazetatlösung und anschliessend mit 14,3 ml 0,5 M NaHGO5 und 4,3 ml 0,5 M NaHCO-, gewaschen. Das Waschprodukt wurde direkt im Filterpapier aufgefangen. Das Gesamtvolumen der Enzymwaschlösung betrug etwa 50 ml.
500 mg des porösen Aluminiumoxids wurden in eine 50 ml Kugelflasche gegeben und 10 ml der Glucoseisomeraselösung zugesetzt. Die Flasche wurde an einem Rotationsverdampfer befestigt, ein Vakuum angelegt und die Flasche in einem auf 30 - 45 gehaltenen Bad 25 Min. lang rotiert. Sodann wurden 10 weitere ml Glucoseisomeraselösung zugesetzt und die Verdampfung unter den gleichen Bedingungen 35 Min. fortgesetzt. Dies wurde zweimal wiederholt, dann eine abschliessende Menge von 7 ml GIucoseisomerase zugesetzt und bei 45° weitere 70 Min. verdampft.
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Die Flasche wurde dann übers Wochenende in einen kalten Raum verbracht. Insgesamt 4-7 ml Glucoseisomeraselösung waren den porösen Aluminiumoxidpartikeln zugesetzt worden.
50 ml Puffer aus 0,01 M Natriummaleat mit pH 6,8 - 6,9 und enthaltend 0,001 Cobaltchlorid und 0,005 Magnesiumsulfat wurden dem Enzympräparat zugesetzt und die Probe 1 Std. bei Zimmertemperatur extrahiert, dann mit 200 ml Wasser und anschliessend 10 ml 0,5 M NaCl gewaschen. Die letzte Wäsche wurde über einem Glasfrittentrichter mit 50 ml Wasser durchgeführt. Das Enzympräparat wurde dann in einen 50 ml Erlenmeyer-Kolben gegeben und im Puffer bei Zimmertemperatur gelagert. Wiederholte Proben wurden während 106 Tagen entnommen. Der durchschnittliche Wert der Prüfungen betrug 130 IGIE pro 500 mg, die Enzymaktivität sausbeute betrug 6%. Der Durchschnittswert wurde durch 20 Prüfungen während der 106 Tage ermittelt, wobei 16 der Prüfungen eine Aktivität von 100 - 150 IGIE pro 500 mg (200 - 300 IGIE prog) zeigten. Diese Ergebnisse zeigen eine sehr hohe statische Stabilität bei vergleichsweise starker Enzymbeschickung. Die zurückbehaltene Extraktlösung wurde ebenfalls geprüft; sie enthielt 39,8 IGIE pro ml, also eine Enzymaktivitätsausbeute von 90%.
BEISPIEL II
Zur Prüfung unter dynamischen Bedingungen, die einen besonderen Wert der erfindungsgemässen Präparate ausmachen, wurde die
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Enzymwirkung "bei der Isomerisation von Glucose zur Fructose unter industriellen Einsatzbedingungen geprüft. Die Fructoseherstellung aus billiger Glucoselösung ist wegen der doppelten Süsswirkung bei gleichem Kaloriengehalt, bzw. gleicher Süsswirkung bei halbem Kaloriengehalt von besonderem wirtschaftlichen Interesse.
10 g des stabilisierten Glucosexsomerasepraparats wurden in mit Wasserkühlmänteln umgebene Kolonnen gegeben. Die Kolonnen wurden durch Thermostate auf einer Temperatur von 60° gehalten. Eine 50%ige Glucoselösung wurde hindurchgepumpt, wobei der Durchsatz so eingestellt wurde, dass eine Pructoseumwandlung von 80 - 85% der theoretischen erreicht wurde. Gegebenenfalls wurde der Durchsatz in bestimmten Absätzen herabgesetzt. Die Anfangsdurchsatzrate war 190 ml pro Std. Das Präparat wurde folgendermassen hergestellt.
11 g der im Beispiel I beschriebenen porösen Aluminiumoxidkörper wurden in einen 100 ml Glaszylinder gebracht und unter Zusatz von 100 ml 0,05 M Magnesiumazetat und 0,01 M Cobaltazetat mit pH 7,5 vorbehandelt. Der Zylinder wurde verstöpselt und nach Mischen durch Umdrehen in ein 60 warmes Bad gesetzt. Nach 15 Min. Umsetzung wurde der Zylinder umgedreht und die Flüssigkeit abgegossen. 100 ml frisches Magnesium-Cobaltazetat wurden zugesetzt, durch Umdrehen des Zylinders gemischt und 2.1/2 Std. bei Zimmertemperatur stehen gelassen.
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"Vor der Adsorption wurde eine rohe Enzymlösung bestehend aus 590 IGIE pro ml in 0,6 gesättigtem Ammoniumsulfat wie folgt gereinigt: 40 ml der Glucosexsomeraselosung wurden 1,4 weitere g Ammoniumsulfat zugesetzt, um das Enzym auszufällen. Die Aufschlämmung wurde bei Zimmertemperatur 20 Min. gerührt, und dann "bei 2° 30 Min. lang mit 16.000 UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen und weggeworfen. 12 ml der obigen Magnesium-Cobaltazetatlösung wurden der Ausfällung zugesetzt und gerührt. Sodann wurden 3 ml 0,5 M Natriumbicarbonat zugegeben und bis zur Auflösung gemischt. Die Lösung wurde 15 Min. in ein 60° warmes Bad gebracht und nach Entnahme 15 Min. bei 2° mit 16.000 TJpM zentrifugiert. Die klare überstehende Enzymlösung wurde abgegossen und die Ausfällung weggeworfen. Die Enzymlösung (28 ml) hatte einen pH-Wert 755· Falls bei der Reinigung keine Aktivität verloren ging, so betrug die Aktivität der Lösung etwa 23-600 IGIE.
Zur Adsorption wurde nun die Magnesium-Cobaltazetatlösung nach Umkehren von den porösen Aluminiumoxidkörpern abgegossen und 28 ml Enzymlösung in einem Zylinder zugesetzt. Der Zylinder wurde verstöpselt, durch Umdrehen gemischt und in ein 60 warmes Bad gesetzt. Die Enzyme wurden in die Poren diffundieren und mit dem porösen Aluminiumoxid bei 60° 2.1/2 Std. umsetzen gelassen. Während dieses Zeitraums wurde der Zylinder
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alle 15 Min. durch Umdrehen gemischt. Nach Entnahme aus dem Bad wurde die Adsorption bei Zimmertemperatur durch Umdrehen und Mischen alle 50 Min. während 2 Std. fortgesetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur durch Stehenlassen zu Ende geführt. Die Enzymlösung wurde abgegossen (28,5 nil, pH 7>l) "und für die weitere Prüfung aufbewahrt. Das stabilisierte Enzympräparat wurde mit 60 ml destilliertem Wasser und sodann mit 40 ml 0,5 M NaGl und schliesslich 40 ml Magnesium-Oobaltazetatlösung gewaschen. Drei kleine Proben von je etwa 1 g wurden für die weitere Prüfung entnommen.
Die übrigen 10 g wurden in eine thermostatisch auf 60° gehaltene Kolonne gebracht; der Kolonne wurde eine 50% Glucose und 0,005 M Magnesiumsulfat, mit Natriumsulfit auf pH 7,7 - 8 gepufferte Lösung zugeführt. Während der ersten 26 Std. wurden der Speiselösung 0,001 M Cobaltchlorid zugesetzt, anschliessend war der einzige Aktivator Magnesium. Der anfängliche Durchsatz betrug 190 ml pro Std., der dann periodisch auf eine Umwandlungsrate von 80 - 85 der theoretischen (entsprechend einer Fructoseausbeute von etwa 40 - 42.1/2%) verringert wurde. Die Durchlaufzeit betrug insgesamt 3I Tage. Die Kolonne wurde dann durch Abbruch der Lösungszfuhr ausgetrocknet, Produktproben entnommen und die in g/Std. erzeugte Fructosemenge gemessen. Da der Durchlauf periodisch verringert wurde, so dass eine
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konstante Umwandlungsrate von 80 - 85% gegeben war, ist die an einem bestimmten Tag pro Std. erzeugte Fruct ο s einenge ein getreuer Maßstab für die Enzymaktivität in der Kolonne. Die Anfangsbeschickung der Kolonne betrug 381 IGIE pro g, die gesamte Kolonne enthielt 3810 IGIE, die über 31 Tage 42 - 28 g Fructose pro Std. ergaben, so dass die Halbzeit des Präparats etwa 42 Tage betrug. Der Versuch zeigt eine hohe Stabilität des Enzympräparats, der vermutlich auf der spezifischen Auslegung des Trägers mit einer für die Glucoseisomerase optimalen durchschnittlichen PorengrÖsse beruht.
BEISPIELE III und IV Glucoseisomerase adsorbiert auf porösem ZrO0 und TiOp-AlpO-,
Die Träger hatten die folgenden Eigenschaften:
ZrO2 TiO2-Al2O3
Porendurchmesser, durchschn. 175 £ 220 £
Porendurchmesser, Minimum 140 £ 140 £
Porendurchmesser, Maximum 200 £ 300 £
Porenvolumen in ccm/g 0,23 0,5
Oberfläche in qm/g 50 75
Partikelgrösse in mesh 25-60 25-60
500 mg poröses ZrO2 und 300 mg TiOp-AIpO^ wurden getrennt mit 0,05 M Magnesiumazetat-Ο,ΟΙΜ Cobaltazetatlösung, pH 7,5, 60° während 15 Min. und dann bei Zimmertemperatur während 3 Std. vorbehandelt. Die Lösung wurde sodann abgegossen. Den Trägern
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wurde 0,8 ml (672 IGIE) nach Beispiel II gereinigte Glucoseisomeraselösung "beigegeben. Die Adsorption wurde "bei 60 während 4 Std. durchgeführt und dabei alle 15 Min. durch Umdrehen gemischt, und über Nacht ohne weiteres Mischen weiter adsorbieren gelassen. Die restliche Enzymlösung wurde dann abgegossen.
Die stabilisierten Glucoseisomerasepräparate wurden dann nacheinander erst mit 0,5 M NaGl-Lösung, mit 0,05 M Magnesiumazetat-0,01 M Cobaltazetatlösung, pH 7,5 und zuletzt mit destilliertem Wasser gewaschen. Sie wurden dann getrennt bei Zimmertemperatur in Wasser aufbewahrt. Sie wurden dann während 18 Tagen auf Glucoseisomeraseaktivität geprüft. Die Tabelle I enthält die Ergebnisse.
TABELLE I Statische Prüfung bei 60° auf Aktivität in IGIE/g
Träger (durchschnittliche Porengrösse in a) Tag ZrO2 (175 Ä) TiO2-Al2O3 (220 S)
0 53,6 259
3 50,0 259
6 43,6 213
11 57,4 213
12 41,6 199
18 38,9 198
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Beide Träger ergaben ein stabiles Enzympräparat.
ι— ι— _y
zeigte infolge grösserer durchschnittlicher Porenweite, grösserer Oberfläche und grösserem Porenvolumen eine stärkere Besetzung mit aktivem Enzym.
BEISPIELE V und VI
Papain adsorbiert auf porösem TiO0 und porösem TiOp-Al0O.,
Zur Herstellung stabilisierter Papainpräparate wurden Träger mit den folgenden physikalischen Eigenschaften verwendet:
Poröse TiO2 und TiOp-AlpO^-Träger
Porendurchmesser, durschnittl. (S) Porendurchmesser, Minimum (S) Porendurchmesser, Maximum (S) Porenvolumen (ccm/g) Oberfläche in qm/g
Partikelgrösse in mesh 25-60 25-60
Je 5OO mg Träger wurden getrennt mit 9 ml 0,5 M FaHCOx-Lösung während 1.1/2 Std. bei 37° in einem Büttelwasserbad vorbehandelt. Der Puffer wurde dann abgegossen und die Träger mit destilliertem Wasser gewaschen. 10 g Papin (Molekülgewicht 21.000, grösste Abmessung 48 S) wurden in 50 ml 0,2 M Phosphatpufferlösung mit pH 6,95 enthaltend 86 mg Cysteinhydrochlorid und 37 mg Dinatriumäthylendiamintetraessigsäure suspendiert und auf den betreffenden Trägern adsorbiert. Die erhal-
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TiO2 TiO0-Al0Ox
CL et P
350 220
220 140
400 300
0,45 0,5
48 77
tenen Präparate wurden mit Casein (Molekülgewicht 121.000) nach dem Verfahren der US-PS 3,556,945 geprüft. Dies geschah im einzelnen folgendermassen.
10 ml enthaltend 2 g Enzym der Papinlösung wurden jedem Träger zugegeben und die Adsorption während 3 Std. "bei 37° in einem Schuttelwasserbad vorgenommen. Die Enzymlösung wurde dann abgegossen und die Präparate mit destilliertem Wasser gewaschen, anschliessend mit 0,5 M NaCl und nochmals mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Sie wurden dann bei Zimmertemperatur in Wasser aufbewahrt. Die Präparate wurden dann während 15 Tagen mit Casein geprüft. Sie hatten die folgende Aktivität:
TABELLE II ■
Statische Prüfung bei 37° auf Aktivität in mg Papain/g Träger
Träger (durchschnittliche Porengrösse in a) Tag TiO2 (350 S) TiO2-Al2O5 (220 Ä)
O 7,41 und VIII 9,06
5 6,82 Protease 6,80
6 3,84 rösem TiO2 und porösem TiO, 4,85
15 2,24 4,00
BEISPIELE VII
Alkalischer Bacillus subtilis adsorbiert auf po-
,-Al2O3
Ähnliche Träger wie in den vorigen beiden Beispielen wurden für die Adsorption des Bacillus subtilis verwendet, der ein
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Molekülgewicht von 27-000 und eine grösste Abmessung von 42 £ aufweist. Die Enzympräparate wurden durch Verwendung einer aus 10 g alkalischer Protease suspendiert in 50 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 enthaltenden Lösung hergestellt. 10 ml (2 g Enzym) der Proteaselösung wurden 500 mg Proben jedes Trägers (350 £ TiO2 und 220 £ TiO2-Al2O^) zugesetzt. Die Adsorption entsprach etwa der für die obigen Papainbeispiele.
Die erhaltenen Präparate wurden wie gemäss der US-PS 3,556,945 mit Casein (Molekülgewicht 121.000) geprüft, jedoch enthielt die Substratlösung 0,1 M Phosphatpuffer und der pH betrug 7,4. Die Proben enthielten weder Cysteinhydrochlorid noch Äthylendiamintetraessigsäure. Die Tabelle III enthält die Prüfergebnisse von 15 Tagen.
Träger, duranschnitt1. Porengrösse in £
TiO2 (350 £) TiO2-Al2O3 (220 £)
TABELI1E III 5,47
3,60
1,17
0,67		 4,69
1,57
0,64
0,40
Statische Prüfung
Aktivität in mg alkalische Protease/g Träger
Tag
0
5
6
15
- 21 -
409834/0761
BEISPIELE IX - XIII
Urease adsorbiert auf Trägern mit verschiedener Porengrösse Stabilisierte Ureasepräparate können zum Messen des Harnstickstoffgehalts im Blut verwendet werden, weil Urease Harnstoff selektiv zu messbaren Mengen HH^ und GOp hydrolisiert, die ihrerseits zum Harnstoffgehalt in Beziehung gesetzt werden können. In den folgenden Beispielen wurde Urease an verschiedene poröse Keramikkörper mit Porengrössen von 140 und durchschnittlichen Porenweiten von 175 - 855 A* gebunden, um den Träger mit der optimalen Porengrösse für dieses Enzym zu bestimmen. Urease hat ein Molekülgewicht von etwa 480.000 und eine grösste Abmessung von etwa 125 Ä als Monomer und etwa 250 & als Dimer. Da Harnstoff, das Substrat für Urease, im Verhältnis zum Enzym sehr klein ist, kann es bei Bestimmung der durchschnittlichen Porengrösse für den Träger ausser acht bleiben, im Gegensatz zum Papainsubstrat Casein. Die Träger hatten die folgenden physikalischen Eigenschaften:
Poröse Träger Al2O
durchschnittl. ^
Porendurchmesser (a) 175 Minimum
Porendurchmesser (ä) 140 Maximum
Porendurchmesser (A) 220 Porenvolumen, ccm/g 0,6 Oberfläche, qm/g 100 Partikelgrösse, mesh 25-60
- 22 409834/0761
Al2O3-TiO2 TiO2 TiO2 TiO2
220 350 420 855
140 220 300 725
3OO 400 590 985
0,5 0,45 0,4 0,22
77 48 35 9
25-60 25-60 30-80 25-8
500 mg eines jeden dieser Träger wurden durch Schütteln in 11 ml 0,5 Μ NaHGO, "bei 37° während 1 Std. und 40 Min. vorbehandelt. Die NaHCO^-Lösung wurde dann abgegossen. Jeder 500 mg Probe des Trägers wurden 20 ml einer l%igen wässerigen Ureasesuspension mit 400 Sumner-Einheiten (SE) Ureaseaktivität pro g oder 80 SE pro Probe beigegeben. Träger und Ureaselösungen wurden 5 Std. in einem Wasserbad bei 37° geschüttelt und die Mischung dann bei Zimmertemperatur 22 Std. stehen gelassen. Dann wurde die Enzymlösung abgegossen und die Präparate zuerst· mit destilliertem Wasser, dann mit 0,5 M HaCl.Lösung und zuletzt wieder mit destilliertem Wasser gewaschen. Sie wurden dann in kleine Kolonnen überführt und bei Zimmertemperatur während eines Zeitraums von 32 Tagen auf Aktivität geprüft. Die Tabelle enthält die Ergebnisse.
- 23 409834/0761
A] TABELLE IV TiO2 TiO2 TiO2
(350) (420) (855)
Aktivität ; in 1,18 4,36 2,46
L2O3 SE/g mit Trägern verschiedener Porengrössen - — -
Tage (175) Al2O5-TiO2 - - -
O O, (220) 0,63 2,32 1,77
O o, 0,81 0,43 1,98 0,95
1 ο, - 0,33 1,98 0,61
4 - - 0,29 1,56 0,36
5 ο, 0,59 0,16 1,11 0,19
6 0,45 0,11 0,73 0,09
7 0,06 0,07 0,47 0,03
11 0,05 0,05 0,34 _
18 0,03
27-28 0,03
32 0,01
,35 —
,22
,11
,05
Wie die Tabelle zeigt, liegt die durchschnittliche Porengrösse für Urease "bei etwa 420 &, wenn auch dne kleinere Enzymaktivität mit Trägern durchschnittlicher Porengrössen von 175 oder 855 S erhalten "bleibt.
BEISPIELE XIV und XV
Die kritsche Bedeutung einer zumindest der Enzymgrösse entsprechenden durchschnittlichen Porengrösse erhellt auch aus den folgenden Beispielen, in denen zwei verschiedene Enzyme gleichzeitig in den Poren eines Trägers mit kleinerer und eines Trägers mit grösserer durchschnittlicher Porengrösse als der Enzymgrösse adsorbiert wurden. Als Enzyme wurden
- 24 409834/0761
Glucoseoxidase und Catalase mit den folgenden Eigenschaften gewählt:
Glucoseoxidase - Molekülgewicht 150.000, grösste Abmessung 84- A, Oatalase, Molekülgewicht 250.000, grösste Abmessung 183 Ä.
Diese "beiden Enzyme wurden auf einem porösen Aluminiumoxidträger nach Beispiel I und einem porösen Titanoxidträger nach Beispiel V mit durchschnittlichen Porendurchmessern von 175 bzw. 350 α adsorbiert. Das Adsorptionsverfahren entsprach dem der oben erwähnten gleichlaufenden Anmeldung.
Durch Einwirkung von Glucoseoxidase auf Glucose in Gegenwart von Sauerstoff entsteht Gluconsäure und Wasserstoffsuperoxid. Es wird also fortlaufend Sauerstoff benötigt, gleichzeitig aber oxidiert das Wasserstoffsuperoxid das Enzym, das dadurch seine Aktivität einbüsst. Dem kann durch gleichzeitige Adsorption von Oatalase entgegengewirkt werden, da diese durch Einwirkung auf das Wasserstoffsuperoxid Sauerstoff freisetzt. Bei kleineren Porengrössen, wie Aluminiumoxid (175 ^) bleibt Gatalase (183 A) aber ausgeschlossen und die Tabelle zeigt die Folgen hiervon im Vergleich zum Träger mit weiterer Porengrösse.
- 25 -409834/0761
TABELLE V (GOU) pro g po-
Vergleich der Gluooseoxidase-Aktivitäten
roses Al0Ox und TiO0 BEISPIEL XV
BEISPIEL XIY poröses (350 S) TiO3
Prüfungstag poröses (175 Ä) Al3O3 20,5
1 12,9 56,2
1 18,7 56,2
4 11,7 56,2
5 10,1 56,2
6 8,5 56,2
7 7,0 52,5
58 zu niedrig, unmessbare
Werte 56,2
59 - 55,9
85 - 55,5
103 — 52,5
156 — 29,6
165 —
Die Aktivität wurde hierbei durch Einsetz,en von 3OO mg Proben in eine Durchlaufkolonne gemessen. Eine Standardlösung von Glucose wurde mit einem Durchsatz von 145 ml/Std. eingeführt. Die Glucoseeinheiten wurden indirekt durch periodische Messung des Gluconsaureanteils bestimmt.
- 26 4 0 9 S 3 k I 0 7 6 1
BEISPIELE X7I-XIX
Weitere 300 mg Präparate wurden hergestellt, bestehend aus Glucoseoxidase und Gatalase, adsorbiert auf porösen Titanoxidträgern mit durchschnittlichen Porengrössen von 350, 4-20, 820 und 855 &* und den folgenden Eigenschaften:
TABELLE VI poröse Träger
durchschnitt1. Porendurchmesser (a)
Minimum
Porendurchmesser (a)
Maximum
Porendurchmesser (S) Porenvolumen, ccm/g
Oberfläche, qm/g -t-o ?y ( ~p
Partikelgrösse, mesh 25-60 30-80 25-80 25-80
Das Adsorptionsverfahren ist in der gleichlaufenden Anmeldung beschrieben.
Die Präparate wurden während 42 Tagen wie in den vorigen Beispielen wiederholt geprüft, wobei das Substrat in die Kolonnen aber mit dem höheren Durchsatz von 390 ml/Std. eingeführt wurde. Infolge verstärkter Substratdiffusion ist hier eine gesteigerte Glucoseoxidaseaktxvitat zu erwarten.
- 27 409834/0761
TiO2 TiO2 TiO2 TiO2
350 420 820 855
220 300 760 725
400 590 875 985
0,45 0,4 0,2 0,22
48 35 7 9
TABELLE VIII
Vergleich der Glucoseoxidaseaktivität pro g TiOp Träger mit steigenden durchschnittlichen Porendurchmessern
Träger, durchschn. Porengrösse in
?50 Ä 420 S 820 I 855 S
66,0 56,4 43,9 37,8
66,0 77,7 43,9 39,7
66,0 84,5 46,2 40,3
66,0 84,5 46,2 44,3
66,0 80,5 40,3 42,0
Prüfungstap;
0
Wie die Tabelle zeigt, ist die langfristige Glucoseoxidaseaktivität (GOE/g) aller vier Präparate ausserordentlich 'beständig. Dies gilt ganz besonders für poröse Titanoxidträger mit durchschnittlichen Porengrössen von 350 £; über einen Zeitraum von 42 Tagen konnte hier kein Aktivitätsverlust beobachtet werden, und das unter Bedingungen mit gesteigertem Durchsatz der Substratlösung (390 ml/Std. gegenüber 145 ml/Std.), die an sich eine grössere Enzymablösung erwarten liessen. Bei grösserem durchschnittlichem Porendurchmesser des Trägers, über 420 S, war eine abnehmende Enzymbeschickung zu beobachten, die auf die geringere Oberfläche (7-9 qm/g) der porösen TiO£-Träger mit durchschnittlichen Porengrössen von 820 und 855 Ä zurückgeführt werden kann. Präparate mit Trägern aus porösem Titanoxid mit durchschnittlichem Porendurchmesser von 420 S zeigten die stärkste Beschickung in GOE/g. Ein diesem
- 28 409834/0761
etwa entsprechender poröser Träger (Porendurchmesser 500 a Minimum, 590 α Maximum) wird für ein Synergistisches Glucose-Oxidase-Catalasesystem daher "bevorzugt. Selbst Präparate mit Trägern einer durchschnxttlichen Porengrösse von 855 S. (725 §· Minimum und 985 α Maximum) waren bemerkenswert beständig, obgleich die Zahl der GOE/g infolge der kleineren Oberfläche geringer war.
- 29 409834/0761

Claims (8)

Patent ansprüche
1). Immobilisiertes Enzympräparat, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym an die Innenfläche eines porösen, im wesentlichen kieselsäurefreien Keramikkörpers gebunden ist, dessen durchschnittlicher Porendurchmesser wenigstens so gross wie die grösste Abmessung des Enzyms, aber kleiner als 1000 α ist,
2. Enzympräparat gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Keramikkörpers grosser als 5 qm/g ist.
3. Enzympräparat gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Porendurchmesser 100 - 1000 S, vorzugsweise 100 500 £ beträgt.
4-. Enzympräparat gemäss Anspruch 3? dadurch gekennzeichnet, dass der Keramikkörper wenigstens teilweise aus Aluminiumoxid, Titanoxid oder Zinkoxid besteht.
5. Enzympräparat gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die durchschnittliche Korngrösse 0,177 - 0,71 mm (25 80 mesh) beträgt.
6. Enzympräparat gemäss Anspruch 5? dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym am Keramikkörper durch Adsorption gebunden ist.
409834/0761 _n
- 30 -
7. Enzympräparat gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym und die jeweils dazu verwendete Keramik zumindest teilweise eine der folgenden mit der dazu angegebenen durchschnittlichen Porengrösse ist:
Enzym Keramik 0 in A
Glucose Isomerase poröses
Aluminiumoxid 14-0 - 220
Papain Titanoxid 220 - 400
alkalische Protease Titanoxid 220 - 400
Glucose Isomerase Zirkonoxid 140 - 200
Urease Titanoxid 220 - 985
Urease Titanoxid 300 - 590.
8. Enzympräparat gemäss irgend einem der vorhergehenden Jnsprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym mit einem Substrat grosser als es selbst verwendet wird, und der durchschnittliche Porendurchmesser des Keramikkörpers wenigstens so gross wie die grösste Abmessung des Substrats ist.
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