DE2429196A1 - Poroese anorganische traeger mit iminogruppen - Google Patents

Poroese anorganische traeger mit iminogruppen

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DE2429196A1
DE2429196A1 DE19742429196 DE2429196A DE2429196A1 DE 2429196 A1 DE2429196 A1 DE 2429196A1 DE 19742429196 DE19742429196 DE 19742429196 DE 2429196 A DE2429196 A DE 2429196A DE 2429196 A1 DE2429196 A1 DE 2429196A1
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Howard Hayyin Weetall
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Corning Glass Works
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Corning Glass Works
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Description

Anmelderin: Corning Glass Works
Corning,. N. T., USA
Poröse anorganische Träger mit Iminogruppen
Die Erfindung betrifft poröse anorganische Träger grosser Gesamtoberfläche mit Iminogruppen an der Oberfläche, an welche organische Stoffe, z. B. Enzyme, Proteine, Antigene, Antikörper usw. gekoppelt werden können.
Anorganische, poröse Träger mit grosser Gesamtoberfläche, 100 qm/g oder mehr, aus' wenigstens einem Metalloxid, sind als Träger für Katalysatoren bekannt, US-PS 3,54-9,524- und 3,4-85,687. Gegenüber organischen Trägern haben sie zahlreiche "Vorteile wie grosse Stabilität, Steifigkeit, fehlende Quellung; sie werden nicht von Mikroben befallen, können leichter sterilisiert, gehandhabt, gelagert und verwendet werden. Oft sind sie auch billiger als organische Stoffe vergleichbarer Oberfläche. Ihrer Verwendung als Träger für
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katalytisch, aktive organische Stoffe steht jedoch die mangelnde Bindungsfäliigkeit entgegen. Bei der Adsorption von Enzymen nach. US-PS 3,556,94-5 an die Oberfläche von porösem Glas ist die Bindung ziemlich, schwach und abhängig vom pH-Wert, sowie unspezifisch in dem Sinne, dass die für die kata- -lytische Wirkung benötigten aktiven Stellen besetzt werden, die katalytisch^ (enzymatisch^) Wirkung also schwächen. Die US-PS 3,519,538 schlägt daher die chemische Bindung über kuppelnde Silane vor, mit Hilfe derer auch Antigene und Antikörper, US-PS 3,652,761, Gheliermittel, US-PS (Ser. Fo. 167,770) oder Enzyme, US-PS 3,669,841; 3,715,278 auf verschiedene Weise gekoppelt werden können.
Die Behandlung ist allerdings in vielen Fällen aufwendig und teuer und erfordert mehrere Verfahrensschritte. In einigen Fällen, z. B. bei Diazotierung, muss das Enzym rasch, nach einer gegebenenfalls vorgenommenen Modifizierung des organischfunktionellen Teils des Silans gekoppelt werden. Häufig polymerisieren die Silane an der Oberfläche und vereiteln die genaue Einstellung des Abstands zwischen Träger und gebundenem Stoff.
Einige dieser Nachteile werden durch chemische Bindung an Zellulosederivate oder wasserunlösliche Polymere vermieden, US-PS 3,278,392 und 3,64-5,852, jedoch entfallen bei diesen
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_ 3 —
organischen Trägern die Vorteile anorganischer Träger. Die DT-PS 2,154-, 672 "beschreibt die chemische Bindung von Enzymen an-anorganische Träger ohne Silane, jedoch haben die als Träger verwendeten Lehme·keine regelbare Porosität und Gesamtoberfläche.
Überraschend wurde nun ein einfaches Verfahren zur chemischen Bindung verschiedener organischer Stoffe an poröse, anorganische Träger grosser Gesamtoberfläche, aus wenigstens einem Metalloxid, porösem Glas, und dergleichen gefunden. Überraschend sind Träger aus wenigstens einem Metalloxid oder porösem Glas für chemisch ,zu bindende organische Stoffe hervorragend geeignet, wenn sie an der Oberfläche Iminogruppen aufweisen.
Nach dem Verfahren der Erfindung werden an der Oberfläche Hydroxid oder Oxidgruppen aufweisende Träger mit einer Lösung aus Cyanogenhalid, z. B. Cyanogenbromid behandelt, so dass an der Oberfläche Iminogruppen entstehen, welche mit dem organischen Stoff unmittelbar oder über eine zwischengeschaltete Verbindung umgesetzt werden können.
Vorzugsweise beträgt die Gesamtoberfläche des Trägers wenigstens 5 am/g und besteht aus porösem Glas oder wenigstens
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einem Metalloxid, wie ζ. Β. porösem Aluminiumoxid, porösem Titanoxid, mit genau klassierter durchschnittlicher Porengrösse.
Die unbehandelten anorganischen Träger sollen aus wenigstens einem Metalloxid "bestehen, im wesentlichen wasserunlöslich und porös sein. Sie sollen eine grosse Oberfläche besitzen, um mit den organischen Stoffen stark besetzt werden zu können; an der Oberfläche sollen Hydroxyl- oder Oxidgruppen zur Umsetzung mit einer Cyanogenhalidlösung zu Iminogruppen an der Oberfläche verfügbar sein. Die Oberfläche sollte wenigstens 5 qin/g, vorzugsweise mehr als 50 qm/g betragen. Vorzugsweise werden poröse, anorganische Partikel der Grössenordnung 0,177 - 0,84 mm, 20 - 80 mesh, verwendet. Die optimale durchschnittliche Porengrösse hängt von dem an den Träger zu koppelnden organischen Material ab. Sollen z. B. hochmolekulare Proteine, Enzyme und dergleichen gekoppelt werden, so wird der durchschnittliche Porendurchmesser 200 - 1000 Ä betragen, ^e nach der Grosse des Proteins, der beabsichtigten Verwendung des Proteins oder Endprodukts, usw. Besonders wichtig sind Porosität und grosse Oberfläche. Günstig ist eine genaue Einstellung der durchschnittlichen Porengrösse des Trägers im angegebenen Bereich, z. B. mit Abweichungen von nur _+ 10%.
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Beispiele als Ausgangsmaterial günstiger poröser Glaspartikel sind Corning Code GZO 3900 und MZO 3900 (durchschnittliche Porengrössen 550 Ä, _+ 10%, Oberfläche 70 bzw. 82 qm/g).
Die Umsetzung der Hydroxyl- oder Oxidgruppen mit der Cyanogenhalidlösung, z. B. Cyanogenbromid, geht wahrscheinlich folgendermassen vonstatten:
0 I
-O-Si-OH
I I
0 + BrON-> Ο
-O-Si-OH
I
-0-Si-O-C=CJ
-O-Si-OH
0 = NH
Glasoberfläche
Iminogruppe von der Oberfläche
Nach Aktivierung der Oberfläche durch Entstehung der Iminogruppen sind die Träger zur Kopplung organischer Stoffe geeignet, z. B. durch Umsetzung mit der Iminogruppe oder über ein Zwischenprodukt mit einer umsetzungsbereiten Stelle, das dann als Zwischenglied verschiedener Länge zwischen dem Träger und- dem organischen Material dient.
So kann z. B. ein Diaminoalkan oder Diaminobenzol mit der Iminogruppe an der Oberfläche umgesetzt werden, wobei an der Oberfläche Alkylamin- oder Arylamingruppen entstehen. Mit der
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restlichen Amingruppe können dann verschiedene organische Stoffe gebunden oder (z. B. im Fall von Arylamin) chemisch modifiziert (z. B. diazotiert) und mit umsetzungsbereiten organischen Stoffen gekoppelt werden.
Beispiel einer unmittelbaren Umsetzung der Iminogruppen mit organischem Material ist z. B. die folgende Umsetzung eines Enzyms, das für die Enzymaktivität nicht wesentliche Aminogruppen aufweist, mit den Iminogruppen auf porösem Glas:
0
I 		= KH + NH2 - Protein —^ 0
I
0-Si-O.
I \ 		-O-Si-0
I
I >
0
I S 		I
0
ι
O-Si-0
ι 		0
I 		-O-Si-0
ι
I
0		 I
-O-Si-O-CO-NH-Prοt e in
ι 		0
O
j
-O-Si-OH
A
G = If - Protein
Wahrscheinlich spielen zahlreiche derartige Bindungen bei der Enzymbindung eine Rolle.
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In den folgenden Beispielen wurden verschiedene Enzyme an poröses Glas, mit Zirkonoxid überzogenes poröses Glas, poröses Titanoxid und poröses Aluminiumoxid kovalent gebunden. Die Träger wurden zuvor mit Cyanogenbromid behandelt und enthielten Iminogruppen an der Oberfläche. Nach Koppelung der Enzyme wurden die Präparate wieder kalt in Harnsäurelösungen gewaschen, um adsorbierte Enzyme zu entfernen. Sodann wurden sie auf Enzymaktivität geprüft. Die Ergebnisse bestätigen die chemische Bindung der Enzyme.
Die behandelten Träger binden zahlreiche organische Stoffe, die an unbehandelte Träger nicht gebunden werden können, wie z. B. Antikörper, Protein-Antigene und andere Makromoleküle mit funktionellen Gruppen. Analog mit Hilfe von Silankupplern können z. B. Cheliermittel und andere organische Stoffe gebunden werden.
Durch einfache Modifizierung der Iminogruppen an der Oberfläche können Träger mit bestimmten umsetzungsbereiten Gruppen, oder Stellen ander Oberfläche geschaffen werden, beispielsweise solche, die mit bestimmten, für die Aktivität nicht benötigten Stellen des organischen Materials eine Bindung eingehen.
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NACHaEREICHT
nachträglich geändert
Die porösen anorganischen Träger können amorph oder kristallin sein und zur Schaffung von Oberflächen mit umsetzungsbereiten Hydroxyl- oder Oxidgruppen gereinigt und getrocknet werden, z. B. durch Waschen mit einer schwachen Säure und Erhitzen auf etwas über 100°. Sie werden dann mit einer Lösung eines Cyanogenhalids, vorzugsweise Oyanogenbromid, bei pH 9 - 12 und O - 25° für eine zur Bildung von Iminogruppen auf einem grösseren Teil oder der gesamten Oberfläche ausreichende Zeitdauer behandelt. Die Behandlungsdauer beträgt vorzugsweise wenigstens 5 Min., am besten etwa 1 Std. Der pH-Wert kann mit ITaOH eingestellt und aufrechterhalten werden. Die optimale Konzentration der Oyanogenhalidlösung hängt von der Menge des porösen Trägers und der Gesamtoberfläche ab und wird meist etwa 0,2 - 1 g Cyanogenhalid pro g trockenes anorganisches Material (also 20 - 100% Trockengewicht) betragen.
Nach Entstehung der Iminogruppen wird der Träger entnommen und mit dest. Wasser oder einer Bikarbonatlösung bei pH 5 - 8,5 gründlich gewaschen. Er ist dann fertig zur Modifizierung durch bestimmte umsetzungsbereite Gruppen oder zur unmittelbaren Verwendung, d. h. der chemischen Bindung bestimmter organischer Stoffe, Proteine, Enzyme, iminogruppen usw., vorzugsweise bei pH 7 - 9 und 0^25°. Die zu bindende Menge des organischen Stoffs wird im Hinblick auf das nach Träger und
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Oberfläche bindungsfähige Maximum gewählt. Die Bindung erfolgt vorzugsweise aus einer dünnen, wässerigen Aufschlämmung .
BEISPIEL I Oberflächenaktiviertes poröses Glas
Auf porösem Glas grosser Oberfläche wurden auf folgende Weise Iminogruppen gebildet: 20 g poröses 96% Kieselsäureglas (Coming GZO 3900) mit durchschnittlicher Porengrösse von 550 1 und Teilchengrössen von 0,177 - 0,84- mm (20 - 80 mesh) wurden 50 ml einer 5 g Cyanogenbromid mit pH 11 und einer Temperatur von 0 enthaltenden wässerigen Lösung zugesetzt« Die Glasteilchen wurden mit der Lösung 1 Std. in Kontakt belassen und der pH-Wert durch tropfenweisen Zusatz von NaOH Lösung aufrecht erhalten.· Die Glasteilchen wurden dann aus der Lösung genommen und mit kaltem, dest. Wasser gewaschen. Sie waren nunmehr für die Bindung von Enzymen fertig behandelt,
Die behandelten Glasteilchen wurden in eine wässerige Lösung gegeben, die 2 g kristallines Trypsin in genügend dest. Wasser zur Bildung einer dünnen Aufschlämmung enthielt. Der pH-Wert wurde auf 8,5 eingestellt und gehalten und die Mischung 2 Std. gerührt und umsetzen gelassen. Das Endprodukt in Form von immobilisiertem Trypsin wurde mit dest. Wasser gewaschen und 1 Std. lang in 6 M Harnstofflösung zur Entfernung von
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adsorbiertem Enzym getränkt. Eine Vergleichsprobe wurde aus gleichem porösen Glas aber ohne Oberflächenbehandlung mit Cyaniogenbromin bereitet. Für beide Proben wurde das Enzym Trypsin gewählt, weil frühere Arbeiten gezeigt hatten, dass auf porösem Glas nur adsorbiertes Trypsin mit der Zeit seine durch nach der Harnstofftränkung dennoch verbleibendes, etwa adsorbiertes Trypsin verfälscht werden.
Beide Proben wurden auf Trypsinaktivität mit 1% Casein, pH als Substrat nach bekannter Ausfallmethode geprüft und die Aktivität in Standardeinheiten ausgedrückt. Beide Proben hatten ein Trockengewicht von 5 ig. Nach der ersten Prüfung wurden beide Proben erneut 1 Std. lang in 6 M Harnstofflösungen getränkt, erneut geprüft, getränkt und geprüft. Die Tabelle verzeichnet die Aktivität nach jeder Tränkung in mg Trypsin pro g Träger auf Trockengewichtsbasis.
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TABELLE I
Trypsinaktivität nach 1 Std. Tränkung in 6 M Harnstoff Beobachtete Aktivität in mg/g Träger behandelter Träger
Vergleichsträger
(unbehandelt)		 10,8
Tränkungs—Hr. 1,0 7,4
1 - 6,4
2 1,0 -
3 0,6 7,4
4 <0,2 6,4
■5 - 6,0
6 * _
7
Aus der Tabelle ist auf eine kovalente (atomare) Bindung des Trypsins an den behandelten Träger zu schliessen.
BEISPIEL II
Oberflächenaktiviertes, mit Zirkonoxid überzogenes poröses
Glas
Wie im Beispiel I wurde die Oberfläche eines gleichen, jedoch dünn mit Zirkonoxid überzogenen Trägers mit Cyanogenbromid aktiviert (Corning MZO 3900 Glas, mit Zirkonoxid überzogenes poröses Glas als Ausgangsmaterial; der Überzug verbessert die Alkalienbeständigkeit). Nach der Oberflächenbehandlung wurden je 5 g des behandelten und eines unbehandelten Vergleichs-
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glases wie im Beispiel I mit Trypsin umgesetzt. Fach insgesamt sieben 1-stündigen Waschen mit 6 M Harnstofflösungen wurden die Proben auf Aktivität geprüft und zeigten eine Trypsinaktivität von 2,6 mg Trypsin pro g Träger für die behandelte Probe, dagegen nur 0,4- mg Trypsin p'ro g des unbehandelten Trägers.
BEISPIEL III Oberflächenaktiviertes poröses Glas
Beispiel I wurde wiederholt. Nach drei 1-stündigen Waschen mit der Harnstofflösung wurden die behandelte und die Vergleichsprobe geprüft. Die Aktivität der behandelten Probe betrug 1 mg Trypsin pro g Träger, die der Vergleichsprobe dagegen 6,4 mg Trypsin pro g Träger, also eine Bestätigung von Beispiel I.
BEISPIEL IV Oberflächenaktiviertes poröses Glas
Der nach Beispiel I präparierte Träger und eine unbehandelte Vergleichsprobe wurden mit einer Glueοseisomeraselosung in Kontakt gebracht, gewaschen und unter Standardbedingungen auf Aktivität geprüft, wobei eine Aktivitätseinheit die Darstellung von 1 Ai Mol/Min. Fructose bei 60°, pH 6,85 bezeichnet. Das behandelte Präparat hatte eine Aktivität von 800 Einheiten
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pro Träger, die unbehandelte Probe dagegen nur 50 Einheiten pro g Träger.
BEISPIEL V
Oberflächenbehandeltes poröses Aluminiumoxid 10 g poröse Aluminiumoxidkörper der Korngrösse 0,42 - 0,84 mm (20 - 40 mesh) und einer durchschnittlichen Porengrösse von 400 S wurden nach Beispiel I behandelt, mit Glucoseisomeraselösung in Kontakt' gebracht und geprüft. Die Aktivität betrug 280 Einheiten pro g Aluminiumoxid.
BEISPIEL VI
Qberflächenbehandeltes poröses Titanoxid 10 g poröse Titanoxidkörper der Korngrösse 0,25 - 0,84 mm (20 - 60 mesh) wurden wie im Beispiel V nach dem Verfahren der US-PS (Ser. No. 344,964) hergestellt. Ihre durchschnittliche Porengrösse betrug 185 &. Sie wurden 1 Std. mit einer Cyanogehbromidlösung bei pH 11 behandelt. Dieses Präparat sowie eine gleiche, aber unbehandelte Vergleichsprobe wurden 1-2 Std. mit Glucoseisomeraselösungen in Kontakt gebracht. Die Prüfung ergab eine Aktivität von 680 Einheiten für das behandelte Präparat. Die vergleichsweise hohe Aktivität der Vergleichsprobe von 380 Einheiten beruht wahrscheinlich auf starker Adsorption ohne sofortigen Aktivitätaverlust, vgl. jedoch das nächste Beispiel.
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BEISPIEL VII
Oberflächenaktiviertes poröses Titanoxid - Prüfling der
■ Halbwertszeit
Die porösen Titanoxidkörper nach Bexspiel 71 wurden 1 Std. "bei pH 11 mit Oyanogenbromidlösung behandelt und 2 Std. bei 0 und pH 8,5 niit Glucoseisomeraselösungen in Eontakt gebracht. 10 g Mengen der beiden Proben wurden mit Harnstofflösung gewaschen und in kleine Durchlaufkolonnen gegeben. In jede Kolonne wurde zur Bestimmung der Halbwertszeit der jeweiligen Probe eine 50%ige Glucoselösung mit pH 7,8 in 0,005 M MgSO^ und 0,005 M Ka2SO5 kontinuierlich eingeleitet. Die behandelten Präparate hatten.bei einer anfänglichen Enzymbeschickung von 221 Einheiten pro g eine enzymatisch^ Halbwertszeit von 15,3 Tagen mit einer oberen Wahrscheinlichkeitsgrenze mit 95% von 31,7 Tagen und einer unteren Grenze mit 95% von 10,3 Tagen. Die Vergleichsprobe hatte eine anfängliche Beschickung von 525 pro g (adsorbiertes Enzym), jedoch ging alle Aktivität nach drei Wäschen mit 6 M Harnstofflösung verloren.
BEISPIEL VIII Oberflächenaktiviertes, mit Zirkonoxid überzogenes poröses
Glas
Nach Bexspiel II behandelte Träger wurden zusammen mit unbehandelten Vergleichsproben 2 Std. mit einer Glucoseamylase-
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lösung in Kontakt gebracht und nach Standardmetho&e auf GIucoseamylaseaktivität geprüft. Die behandelten Träger besassen eine Aktivität von 792 Einheiten pro g, wobei 1 Einheit die Darstellung von 1 /u- Mol/Min. Glucose bei 60°, pH 4 bezeichnet. Die Vergleichsproben hatten eine Aktivität von 1859 Einheiten pro g Träger, was wieder auf eine kurzfristige starke Aktivität durch Enzymadsorption hindeutet. Vgl. dazu das nächste Beispiel.
BEISPIEL· IX
Oberflächenaktiviertes, mit Zirkonoxid überzogenes poröses
Glas
10 g Proben nach Beispiel VIII wurden wie im Beispiel VII in kleine Durchlaufkolonnen gegeben. Eine Lösung aus" Enzym-verdünnter Maisstärke mit 30% Feststoffen, pH 4,5 wurde bei 55° kontinuierlich durch die Kolonnen geleitet und die Halbwertszeiten bestimmt. Das behandelte Präparat hatte eine Halbwertszeit von 25 Tagen mit 95% oberer Wahrscheinlichkeit von. 28,5 Tagen und 95% unterer Grenze von 21 Tagen. Die unbehandelte Vergleichsprobe hatte eine Halbwertszeit von "nur 4,9 Tagen, mit 95% oberer Grenze von 6,4 Tagen und 95% unterer Grenze von 4 Tagen.
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Claims (6)

Patentansprüche
1. Anorganischer, im wesentlichen wasserunlöslicher Träger grosser Oberfläche aus wenigstens einem Metalloxid, porösem Glas oder dergleichen, dadurch gekennzeichnet, dass er an der Oberfläche Iminogruppen aufweist.
2. Träger gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er poröses Aluminium- oder Titanoxid enthält.
3. Träger gemäss Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche wenigstens 5 qm/g und vorzugsweise wenigstens 50 qm/g beträgt.
4. Träger gemäss Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass poröses Glas mit Zirkonoxid überzogen ist.
5. Träger gemäss Anspruch 1, 1 und 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das poröse Glas eine durchschnittliche Porenweite von 200 - 1000 S und eine Partikelgrösse von 0,177 0,84 mm (20 - 80 mesh) hat.
6. Verfahren zur Herstellung des Trägers gemäss irgend einem der Ansprüche 1-5» dadurch gekennzeichnet, dass das an der Oberfläche Hydroxyl- oder Oxidgruppen aufweisende Material mit einer Zyanhalidlösung behandelt wird.
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7- Verfahren gemäss Ansprach. 6, dadurch, gekennzeichnet, dass das Trägermaterial mit Bromzyanlösung bei pH 9 - 12 "behandelt wird.
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